MED. DOŚW. MIKROBIOL., 2009, 61: 167-174 Alicja Budak 1,2, Marianna Tokarczyk 1, Paweł Nowak 1, Małgorzata Skałkowska 2, Bożena Bogusz 2, Małgorzata Zwolińska-Wcisło 3, Marek Wilk 1 OCENA PRZYDATNOŚCI CHROMOGENNYCH PODŁOŻY W DIAGNOSTYCE MIKROBIOLOGICZNEJ 1 Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej Wydział Farmaceutyczny UJ CM, Kraków 2 Pracownia Mikrobiologii ZDL, Wojewódzki Szpital Specjalistyczny im. L. Rydygiera, Kraków Kierownik: prof. dr hab. A. Budak 3 Klinika Gastroenterologii, Hepatologii i Chorób Zakaźnych UJ CM Kraków Celem badań była ocena stosowania podłoży chromogennych: chromid S.aureus, chromid MRSA, chromid CPS3 oraz chromid ESBL firmy bio- Merieux (Polska), jako przesiewowych, w diagnostyce mikrobiologicznej. Porównano wyniki identyfikacji bakterii oraz występowania wybranych mechanizmów oporności na antybiotyki przy użyciu podłoży chromogennych oraz klasycznych metod diagnostycznych. Największą czułość diagnostyczną wykazało podłoże chromid MRSA i chromid CPS3. Swoistość wszystkich testowanych podłoży była wysoka. Diagnostyka mikrobiologiczna opiera się na badaniach mikroskopowych, izolacji i identyfikacji drobnoustrojów patogennych oraz ocenie lekowrażliwości, z uwzględnieniem występowania mechanizmów oporności. Ich przeprowadzenie wymaga określonego czasu, co może w niektórych przypadkach, spowolnić włączenie celowanej antybiotykoterapii. Wprowadzenie do badań mikrobiologicznych podłoży chromogennych, jako przesiewowych, znacznie ułatwiło dalsze postępowanie diagnostyczne. Zawierają one substancje odżywcze oraz specyficzne substraty chromogenne. Pozwalają na wykrycie aktywności enzymatycznej drobnoustrojów, umożliwiając jednoczesną izolację oraz identyfikację. Opracowano również podłoża chromogenne wykrywające określone mechanizmy lekooporności bakterii odgrywających istotną rolę w zakażeniach szpitalnych. Obecnie stosowane podłoża mają szeroki profil. Dostępne są pożywki umożliwiające wybiórczą izolację oraz bezpośrednią identyfikację bakterii z gatunków: Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, a także Listeria monocytogenes. Podłoża chromogenne użyte do badania patogenów izolowanych z moczu, wstępnie identyfikują obecne w materiale niektóre pałeczki, z rodziny Enterobacteriaceae oraz z rodzaju Enterococcus. Dostępne są także, pożywki różnicujące grzyby z rodzaju Candida.
168 A. Budak i inni Nr 2 Określenie mechanizmów oporności u bakterii ważnych w środowisku szpitalnym, ułatwiają podłoża chromogenne, selektywne dla szczepów MRSA (ang. methicillin resistant S. aureus), VRE (vancomycin resistant Enterococcus) oraz ESBL (extended spectrum beta-lactamases). Ich zastosowanie nie zastępuje rutynowych metod oznaczania lekowrażliwości, jednak uzyskany wynik wskazuje na możliwość wystąpienia danego mechanizmu oporności. Celem badań była ocena przydatności podłoży chromogennych w prowadzonej przez nas diagnostyce, w porównaniu do klasycznych metod diagnostycznych. MATERIAŁ I METODY Przedmiotem badań przesiewowych były próbki materiału klinicznego kierowane do Pracowni Mikrobiologii ZDL z oddziałów oraz poradni przyszpitalnych Wojewódzkiego Szpitala Specjalistycznego im. Ludwika Rydygiera w Krakowie w okresie od marca do kwietnia 2008 roku. Zbadano 627 próbek materiału, w tym: 250 próbek moczu, 207 wymazów (z rany, jamy ustnej, gardła, nosa, oka, ucha, ropnia, jamy brzusznej, zatoki szczękowej, zębodołu), 66 wydzielin z dolnych dróg oddechowych, 52 próbki krwi, 30 - cewników, CVP, rurek tracheostomijnych oraz 22 innych. W badaniu użyto podłoży chromogennych firmy biomerieux Polska Sp. z o.o.. Uzyskane wyniki interpretowano wg zaleceń producenta. Na podłoże chromid S.aureus oraz chromid MRSA wysiewano wszystkie próbki (377 materiałów klinicznych), pochodzące z zakażeń, w których czynnikiem etiologicznym mógł być S. aureus. Zastosowanie podłoża chromid MRSA miało na celu wstępne wykazanie w materiałach obecności szczepów S. aureus opornych na metycylinę. Próbki moczu (252) badano ilościowo przy użyciu ezy kalibrowanej (10 µl) na podłożach chromid CPS3. Wszystkie próbki materiału klinicznego, w których przyczyną zakażeń mogły być pałeczki z rodziny Enterobacteriaceae (mocz oraz wydzieliny z dróg oddechowych - 221) posiewano na podłoża chrom ID ESBL i inkubowano przez 18-24h w 37 C. Równolegle prowadzono diagnostykę z użyciem standardowych metod izolacji oraz identyfikacji drobnoustrojów patogennych wykorzystując metody manualne lub automatyczne. Szczepy MRSA określano w metodzie dyfuzyjno-krążkowej, na podstawie oporności na cefoksytynę. Bakterie Gram-dodatnie oraz Gram-ujemne identyfikowano w aparacie Vitek 2 Compact (biomerieux, Polska Sp. z o.o.) przy użyciu kart GP i GN. Wrażliwość na antybiotyki określano zgodnie z rekomendacjami Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Lekowrażliwości Drobnoustrojów metodą dyfuzyjno-krążkową oraz w aparacie Vitek 2 Compact przy użyciu kart AST-N041. WYNIKI W 49 materiałach klinicznych, spośród 377 badanych, wykryto obecność S. aureus (13%) na podstawie wytwarzania przez szczepy koagulazy. Natomiast, na podłożu chromid S.aureus, wzrost kolonii zabarwionych na zielono, charakterystyczny dla bakterii z gatunku S. aureus, uzyskano tylko w przypadku 35 próbek (9,3%). Z dwóch materiałów, wyhodo-
Nr 2 Chromogenie podłoża w diagnostyce mikrobiologicznej 169 wano na podłożu przesiewowym, kolonie kremowo-białe, które w metodzie klasycznej zidentyfikowano odpowiednio, jako szczepy S. aureus oraz MRSA. Wszystkie materiały równolegle wysiewano na podłoże chromid MRSA. Kolonie zabarwione na zielono, charakterystyczne dla metycylinoopornych szczepów S. aureus, wyhodowano z 19 próbek (5%). Natomiast, przy użyciu metody dyfuzyjno-krążkowej z cefoksytyną, obecność szczepów MRSA odnotowano w 21 materiałach (5,6%). Zaobserwowano, że z jednego materiału na podłożu przesiewowym wyrosły kolonie kremowo-białe, które zidentyfikowano w metodzie dyfuzyjno-krążkowej jako MRSA. W badaniach opracowano 252 próbki moczu. W 85 materiałach, zdiagnozowanych w aparacie Vitek 2 Compact, stwierdzono obecność patogenów odpowiedzialnych za zakażenia w układzie moczowym (Escherichia coli - 48, Proteus mirabilis - 12, Klebsiella pneumoniae - 10, Enterobacter cloacae - 2, Citrobacter freundii - 1, Citrobacter koseri - 1, Enterococcus faecalis - 10 oraz Enterococcus faecium - 1). Natomiast na podłóżach chromid CPS3, z 83 materiałów wyhodowano kolonie różowe, brązowe, zielone i turkusowe wstępnie różnicujące odpowiednio pałeczki E. coli, Proteus sp., grupę KESC oraz enterokoki. W 46 hodowlach przesiewowych, izolowano kolonie różowe, charakterystyczne dla pałeczek z gatunku Escherichia coli. Tylko w jednym przypadku uzyskanego wyniku nie potwierdzono w aparacie Vitek 2. Na podłożu CPS3 z czterech próbek wyhodowano kolonie mleczno-kremowe, które metodą automatyczną zidentyfikowano jako E. coli (3) oraz C. freundii (1). W jednym przypadku wyrosły kolonie turkusowe, typowe dla enterokoków, ale zidentyfikowane jako Streptococcus agalactiae. Na podstawie wyników identyfikacji szczepów w aparacie Vitek 2 Compact przeprowadzono ocenę wartości diagnostycznej podłoża chromid CPS3 (Tab. I). Tabela I. Ocena wartości diagnostycznej podłoża chromid CPS3 w porównaniu do metody automatycznej Vitek 2 Compact. Escherichia coli Proteus sp. Enterococcus sp. KESC Vitek 2 46 12 12 13 ChromID CPS3: 48 12 11 14 PP* 45 12 11 13 FP** 1 0 0 1 FN*** 3 0 1 0 * wyniki prawdziwie pozytywne ** wyniki fałszywie pozytywne *** wyniki fałszywie negatywne Na podłożach chromid ESBL zbadano 221 próbek materiału. Spośród, wszystkich zidentyfikowanych w aparacie Vitek 2 Compact, pałeczek z rodziny Enterobacteriaceae, u 26 (11,8%) izolatów stwierdzono mechanizm oporności związany z wytwarzaniem enzymów ESBL (Proteus mirabilis - 8, Escherichia coli - 7, Enterobacter cloacae - 6, Klebsiella pneumoniae - 3, Serratia marcescens - 2). Na podłożu chromid ESBL również z 26 materiałów wyhodowano kolonie różowe (9), brązowe (8) oraz zielone (9), sugerujące pałeczki Enterobacteriaceae ESBL dodatnie. Spośród 9 materiałów, z których wyizolowano kolonie różowe, jedynie w przypadku siedmiu, potwierdzono metodą automatyczną obecność E.coli
170 A. Budak i inni Nr 2 ESBL-dodatnich. W przypadku 3 hodowli z których izolowano kolonie brązowe oraz 1 hodowli, której izolowano kolonie o zabarwieniu zielonym, nie potwierdzono wytwarzania enzymów ESBL. Natomiast 6 szczepów ESBL-dodatnich (P. mirabilis ESBL - 3 oraz E. cloacae ESBL 3) nie wyrosło na podłożu chromid ESBL. Ocenę trafności diagnostycznej podłoża chromid ESBL przeprowadzoną w oparciu o wyniki uzyskane przy użyciu aparatu Vitek 2 Compact, przedstawiono w tabeli II. Tabela II. Ocena wartości diagnostycznej podłoża chromid ESBL w porównaniu do metody automatycznej Vitek 2 Compact. Escherichia coli Proteus sp. KESC Vitek 2 7 8 11 ChromID ESBL: 9 8 9 PP* 7 5 8 FP** 2 3 1 FN*** 0 3 3 * wyniki prawdziwie pozytywne ** wyniki fałszywie pozytywne *** wyniki fałszywie negatywne Łącznie w ocenie podłoży przesiewowych użyto 627 próbek klinicznych. Porównano wyniki identyfikacji bakterii oraz występowania wybranych mechanizmów oporności, uzyskane przy zastosowaniu podłoży chromogennych oraz klasycznych metod diagnostycznych (Ryc.1) Ryc.1. Porównanie wyników identyfikacji bakterii i obecności mechanizmu oporności przy użyciu podłóż chromogennych oraz metod rutynowych. MR metoda rutynowa PChr podłoże chromogenne * wyniki dodatnie dotyczą bakterii identyfikowanych bezpośrednio na danym podłożu chromogennym ** liczba prawidłowo zidentyfikowanych szczepów
Nr 2 Chromogenie podłoża w diagnostyce mikrobiologicznej 171 Największą czułość diagnostyczną wykazało podłoże chromid MRSA, chromid CPS3 (>90%) oraz kolejno chromid ESBL i chromid S.aureus (>70%). Swoistość wszystkich, testowanych podłoży chromogennych była wysoka (>97%), a w przypadku podłoży chromid S.aureus i chromid CPS3 osiągnęła 100% (Tab. III). Tabela III. Czułość oraz swoistość podłoży chromogennych chromid S.aureus, chromid CPS3, chromid MRSA oraz chromid ESBL w identyfikacji drobnoustrojów. Liczba badanych Czułość Swoistość Podłoże szczepów (%) (%) ChromID S.aureus 441 71,4 100 ChromID CPS3 448 90,5 100 ChromID MRSA 258 95,3 99,4 chromid ESBL 275 76,9 97,6 DYSKUSJA Bakterie należące do rodzaju Staphylococcus, Enterococcus oraz rodziny Enterobacteriaceae są często przyczyną ciężkich infekcji. Biorąc pod uwagę konieczność zapewnienie szybkiej oraz wiarygodnej diagnostyki, opracowano podłoża chromogenne, stosowane zarówno do identyfikacji wybranych patogenów, jak również do określania groźnych mechanizmów oporności. Podłoża chromid MRSA oraz chromid ESBL, dzięki zawartości substratów chromogennych oraz antybiotyków takich jak cefoksytyna i cefpodoksym, są przydatne do wykrywania metycylinoopornych szczepów S.aureus oraz pałeczek Gramujemnych wytwarzających beta-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym. Szybkie i dokładne wykrycie bakterii wieloopornych spełnia ważną rolę w zapobieganiu powstawania oraz rozprzestrzeniania się zakażeń szpitalnych. Ponadto, podłoże chrom ID MRSA jest wykorzystywane do wykrywania nosicielstwa MRSA, zarówno u personelu medycznego jak i u chorych. Podłoża chromogenne cechuje wiele zalet: są gotowe do użycia, posiew materiału wykonywany jest bezpośrednio na podłoże, a wynik w postaci wzrostu barwnych kolonii jest łatwy do odczytu oraz interpretacji. Na podłożu chromid S.aureus zbadaliśmy 377 materiałów klinicznych. Uzyskane wyniki określiły jego swoistość na pozomie 100%, a czułość w zakresie 71,4%. Perry i wsp. którzy opracowali 350 wymazów z ran, uzyskali dla tego podłoża, zarówno wysoką swoistość jak i czułość, odpowiednio 97,4 oraz 96,8% [5]. Czułość zastosowanego również w badaniach, podłoża chromogennego BBL CHROMagar Staph aureus (BD Diagnostics, USA), była niższa na poziomie 91,1%. Stwierdzili również, że na podłożu chromid S.aureus, w odróżnieniu od podłoża BBL CHROMagar Staph aureus, był efektywnie hamowany wzrost bakterii z rodzaju Enterococcus. W naszej ocenie, również podłoże chromid MRSA cechowała wysoka czułość oraz swoistość na poziomie, odpowiednio, 95,3% oraz 99,4%. Z 19 materiałów wyhodowano zielone kolonie charakterystyczne dla szczepów MRSA, u których w metodzie dyfuzyjno-krążkowej potwierdzono oporność na cefoksytynę. Tylko w przypadku 2 próbek stwierdzono wynik fałszywie ujemny, związany z brakiem wzrostu oraz wzrostem kolonii
172 A. Budak i inni Nr 2 kremowo-białych, które w metodzie rutynowej określono jako MRSA. Nasze obserwacje są zgodne z wynikami innych autorów. Ponadto, Diederen wsp. (2) oraz Perry i wsp. (4, 5) zaobserwowali wzrost czułości podłoża chromid MRSA, po przedłużeniu czasu inkubacji z 24 do 48 godz., odpowiednio z 96,4% do 98,8% oraz z 80 do 89% (2). Również, wartą do odnotowania zaletą podłoży chromid S.aureus oraz chromid MRSA była identyfikacja S.aureus z materiałów klinicznych, w których współwystępowały z pałeczkami Proteus sp. Należy zaznaczyć, że mgławicowy wzrost Proteus utrudniał izolację gronkowców w hodowli prowadzonej na agarze Columbia z dodatkiem krwinek baranich. Podłoże chromogenne chromid CPS3, w porównaniu do podłoża MacConkeya czy agaru CLED, umożliwia izolację najczęstszych etiologicznych czynników zakażeń układu moczowego, obejmujących zarówno, bakterie Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae, jak również Gram-dodatnie enterokoki. W naszych badaniach, spośród 252 próbek moczu, z 83 materiałów wyhodowano szczepy, wyrosłe w postaci charakterystycznie zabarwionych kolonii pozwalających na ustalenie ich przynależności do określonego gatunku lub rodzaju. Uzyskano cztery wyniki fałszywie ujemne, w przypadku 3 szczepów E. coli oraz 1 C. freundii, wyrosłych w postaci kremowo-białych kolonii. Czułość i swoistość podłoża CPS3 oszacowano odpowiednio na poziomie 90,5% oraz 100%. Zaletą podłoża jest możliwość izolacji oraz identyfikacji pałeczek z gatunku E. coli, co skraca czas oczekiwania na wynik. Aspevall i wsp. (1) w badaniu 1200 próbek moczu zastosowali trzy różne podłoża chromogenie jak: BBL CHROMagar Orientation (BD Diagnostics, USA), CHROMagar Orientation (CHROMagar, Francja), Chromogenic UTI Medium (Oxoid, Wielka Brytania) oraz chromid CPS2 (biomerieux, Francja). Wykazali oni wysoką zdolność różnicującą badanych podłoży w przypadku mieszanych hodowli. Również Fallon i wsp., (3) stwierdzili większą czułość wymienionych podłóż chromogennych w porównaniu do podłoża CLED. W badaniach Perry i wsp. czułość dla podłoża CPS ID2 była nawet o 20% wyższa (4). Uzyskane wyniki własne oraz cytowanych autorów, potwierdzają korzyść z zastosowania podłoża chromid CPS jako podłoża przesiewowego, do diagnostyki mikrobiologicznej materiałów z dróg moczowych. Spośród 221 materiałów klinicznych posianych na podłoże chromid ESBL, z 26-ciu próbek (11,8%) uzyskano wzrost bakterii w kolorze sugerującym pałeczki wytwarzające enzymy ESBL. W naszych badaniach otrzymaliśmy jednak stosunkowo dużą liczbę wyników fałszywie dodatnich oraz fałszywie ujemnych, co wpłynęło na obniżenie czułości podłoża chromid ESBL (76,9%). W badaniach Reglier-Poupet i wsp. (6) czułość zastosowanych podłoży przesiewowych chromid ESBL oraz BLSE agar (AES, Francja) po 24 godzinach inkubacji wynosiła odpowiednio 88 i 85%. Podobnie wysoką czułość podłoży wykrywających szczepy ESBL dodatnie, ocenioną w zakresie od 88 do 100%, potwierdziły badania Sturenburga i wsp. [7]. Należy jednak zaznaczyć, że w naszych badaniach swoistość podłoża chrom ESBL wyniosła 97,6%. Uwzględniając wyniki własne oraz innych autorów, można zalecać stosowanie podłoża chromid ESBL, w rutynowej diagnostyce mikrobiologicznej do wstępnego wykrywania, bezpośrednio z materiałów klinicznych, bakterii z rodziny Enterobacteriaceae wytwarzających enzymy ESBL. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują na celowość wykorzystania podłoży chromogennych do badań przesiewowych. Ich zastosowanie w wybranych procedurach diagnostycznych pozwala na skrócenie czasu uzyskania wyniku, jak również umożliwia skuteczniejszy nadzór nad patogenami alarmowymi oraz zakażeniami szpitalnymi.
Nr 2 Chromogenie podłoża w diagnostyce mikrobiologicznej 173 WNIOSKI 1. Podłoże chromid MRSA i chromid CPS3, jako podłoża przesiewowe, wykazały największą czułość (> 90%). 2. Swoistość testowanych podłoży była wysoka (>97%), a w przypadku podłoża chromid S.aureus i chromid CPS3 na poziomie 100%. 3. Wyniki badań wskazują na przydatność podłoży chomogennych do badań przesiewowych, które w wybranych procedurach diagnostycznych pozwalają na skrócenie czasu oczekiwania na wynik oraz skuteczniejszy nadzór nad patogenami alarmowymi oraz zakażeniami szpitalnymi. A. Budak, M. Tokarczyk, P. Nowak, M. Skałkowska, B. Bogusz, M. Zwolińska-Wcisło, M. Wilk EVALUATION OF CHROMOGENIC MEDIA IN MICROBIOLOGICAL DIAGNOSTICS SUMMARY The aim of the study was the evaluation of chromogenic agars as a screening media in the routine microbiological diagnostics. 627 clinical samples were cultured on the chromogenic media: chromid S.aureus, chromid MRSA, chromid CPS3 and chromid ESBL from biomerieux. The results of presumptive identification and detection of selected resistance mechanisms by chromogenic media were compared with results obtained with the conventional methods. Our studies revealed the highest sensitivities of chromid MRSA and chromid CPS3 (>90%). The sensivities for chromid ESBL and chromid S.aureus were >70%. All media were also highly specific (97%). This specificity for chromid S.aureus and chromid CPS3 was 100%. We conclude, that all tested media showed good performance in presumptive identification and detection of resistance mechanisms. PIŚMIENNICTWO 1. Aspevall O, Osterman B, Dittmer R i inni. Performance of four chromogenic urine culture media after one or two days of incubation compared with reference media. J Clin Microbiol 2002; 40:1500-3. 2. Diederen BMW, van Leest M, van Duijn I i inni. Performance of MRSA ID, a new chromogenic medium for detection of methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2006; 44:586-8. 3. Fallon D, Ackland G, Andrews N i inni. A comparison of the performance of commercially available chromogenic agars for the isolation and presumptive identification of organisms from urine. J Clin Pathol 2003; 56: 608 12. 4. Perry JD, Butterworth LA, Nicholson A i inni. Evaluation of a new chromogenic medium, Uriselect 4, for the isolation and identification of urinary tract pathogens. J Clin Pathol 2003; 56:528 31. 5. Perry JD, Rennison C, Butterworth LA i inni. Evaluation of S.aureus ID, a new chromogenic agar medium for detection of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2003; 41:5695-8.
174 A. Budak i inni Nr 2 6. Réglier-Poupet H, Naas T, Carrer A i inni. Performance of chromid ESBL, a chromogenic medium for detection of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases; J Med Microbiol 2008; 57:310-15. 7. Sturenburg E, Sobottka I, Laufs R, Mack D. Evaluation of a new screen agar plate for detection and presumptive identification of Enterobacteriaceae producing extended-spectrum β-lactamases. Diagn Microbiol Infect Dis 2005; 51:51-5. Otrzymano: 15 V 2009 r. Adres Autora: 30-688 Kraków, ul. Medyczna 9, Zakład Mikrobiologii Farmaceutycznej, Uniwersytetu Jagiellońskiego e-mail: budak@cm-uj.krakow.pl