Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Katedra Mikrobiologii Gdański Uniwersytet Medyczny 2

MED. DOŚW. MIKROBIOL., 203, 65: 39-47 Typy spa i lekooporność szczepów Staphylococcus aureus izolowanych z krwi pacjentów Uniwersyteckiego Centrum Klinicznego w Gdańsku Spa types and antibiotic resistance of Staphylococcus aureus bloodstream isolates obtained form patients of the University Clinical Center in Gdańsk Katarzyna Wiśniewska, Joanna Kasprzyk, Lidia Piechowicz, Marek Bronk 2, Krystyna Świeć Zakład Mikrobiologii Lekarskiej Katedra Mikrobiologii Gdański Uniwersytet Medyczny 2 Laboratorium Mikrobiologii Klinicznej Uniwersyteckie Centrum Kliniczne w Gdańsku Przeprowadzono retrospektywną ocenę zróżnicowania szczepów S.aureus izolowanych z krwi pacjentów hospitalizowanych w Uniwersyteckim Centrum Klinicznym w Gdańsku, w oparciu o typowanie spa i analizę profili lekooporności. Zidentyfikowano 26 typów spa, które utworzyły sześć kompleksów klonalnych i siedem singletonów. Najwięcej szczepów (38%) należało do kompleksu klonalnego spa-cc02, w którym najczęstszy był typ t02 powiązany z kompleksem klonalnym MLST-CC30. Stwierdzono obecność pojedynczych szczepów MRSA, z których żaden nie należał do spa-cc02. Słowa kluczowe: Staphylococcus aureus, typowanie spa, sepsa, zakażenia łożyska krwi ABSTRACT Introduction: Staphylococcus aureus is a leading cause of bloodstream infections. For epidemiological investigations of this bacteria spa genotyping is used as the method which has a high discriminatory power and gives results that can be easily compared between laboratories. In contrast to methicillin-resistant S.aureus (MRSA), relatively little is known about spa types among methicillin-susceptible strains (MSSA). We used spa typing and antibiotic resistance patterns analysis for retrospective study of S.aureus bloodstream isolates population from the University Clinical Centre (UCC) in Gdańsk. Methods: The study was performed on 53 isolates from patients of 9 different units/ departments of the UCC. The isolates were tested for the susceptibility to antimicrobial agents. Spa typing was performed on the basis of the sequence analysis of the polymorphic

40 K. Wiśniewska i inni Nr 3 X region of the protein A gene (spa) amplified form the isolates. Spa types were determined by Ridom Staph Type software and were clustered into spa CCs (clonal complexes) using the algorithm BURP-based upon repeat pattern. MLST (Multilocus Sequence Typing) clonal complexes were predicted from BURP analysis by the Ridom SpaServer database. In MRSA the staphylococcal chromosomal casette (SCC) mec was determined. Results: Spa typing yielded 26 types. Six spa-cc and seven singletons were identified. The most frequent was spa-cc02involving 38% of isolates. The CC02 consisted of 7 spa types and the most common was t02 corresponding with MLST-CC30. The second frequent was singleton, related to MLST-CC, with only one type t27. There were 3 MRSA isolates in the population. The MRSA strains were identified as different spa types: t003/ SCCmecII, t008/sccmeciv and clonally related to MSSA t032/sccmeciv. No one MRSA strains belonged to spa-cc02. Conclusions: The spa clonal cluster corresponding with widely distributed among invasive S.aureus strains in Europe MLST-CC30 was found as the most frequent among S.aureus bloodstream isolates from the UCC. Occurrence of spa types which had a genetic background common to well known MRSA clonal lineages was observed. Key words: Staphylococcus aureus, spa typing, sepsis, bloodstream infections WSTĘP S.aureus jest jednym z najczęściej izolowanych patogenów człowieka (7). Infekcje gronkowcowe stanowią poważny problem, zwłaszcza w szpitalach, gdzie często dochodzi do zagrażających życiu zakażeń, które mogą przejść w postać sepsy (6). Co więcej, wzrasta liczba pacjentów o skrajnie obniżonej odporności, u których często nie rozwija się pełen obraz choroby, a dla których obecność bakterii w krwioobiegu jest wyjątkowo groźna. Szczególnie dotyczy to osób z chorobami nowotworowymi, po przeszczepach, poddawanych terapii lekami immunosupresyjnymi (2). W leczeniu gronkowcowych zakażeń krwi największym problemem są szczepy oporne na metycylinę MRSA (ang. methicillin-resistant Staphylococcus aureus). Średni udział szczepów MRSA w zakażeniach powodowanych przez S.aureus w Polsce sięga 22% (4). W zakażeniach łożyska krwi przekracza 24% (4). W badaniach epidemiologicznych ocena lekowrażliwości szczepów S.aureus może być traktowana jako badanie wstępne, wymagające weryfikacji przy użyciu metod pozwalających na ustaleniu pokrewieństwa między szczepami. Do tego celu wykorzystywane są metody typowania molekularnego, takie jak elektroforeza w zmiennym polu elektrycznym fragmentów genomowego DNA trawionego enzymem restrykcyjnym SmaI (REA-PFGE ang. restriction enzyme analysis pulsed field gel electrophoresis) oraz metody oparte na sekwencjonowaniu DNA, w tym MLST (ang. multi locus sequence typing) i typowanie spa (3). Z techniką MLST wiążą się stosunkowo duże koszty. Typowanie spa jest metodą szybszą i prostszą, o potencjale różnicującym podobnym do REA-PFGE i stwarzającą możliwość interpretacji wyników badań przy pomocy bazy danych MLST (20). Typowanie spa opiera się na badaniu polimorfizmu powtarzalnych regionów genu spa, kodującego białko A (8). Produkt otrzymany w wyniku reakcji amplifikacji poddawany jest

Nr 3 Typy spa i lekooporność S. aureus izolowanych z krwi 4 sekwencjonowaniu, a uzyskane sekwencje tandemowych powtórzeń są analizowane z wykorzystaniem programu Ridom Staph Type. Każdej sekwencji przypisany jest określony numer, a powstały kod numeryczny oznacza typ spa. Ogólnie dostępna strona internetowa zawiera dane dotyczące typów spa i sekwencji poszczególnych regionów. Typowanie spa jest obecnie podstawową metodą epidemiologicznych badań szczepów MRSA (3). Stosunkowo rzadziej natomiast badaniom takim poddawane są wrażliwe na metycylinę szczepy tego gatunku (MSSA), które w określonych warunkach mogą stanowić rezerwuar dla pojawiających się klonów MRSA. Wyjątkowej uwagi pod tym względem wymagają szczepy odpowiedzialne za zakażenia inwazyjne, a szczególnie zakażenia krwi. Celem prezentowanej pracy była zatem retrospektywna ocena zróżnicowania szczepów S.aureus izolowanych z krwi pacjentów hospitalizowanych w Uniwersyteckim Szpitalu Klinicznym w Gdańsku (UCK), w oparciu o typowanie spa i analizę profili lekooporności. MATERIAŁ I METODY Szczepy bakteryjne. Badania przeprowadzono na 53 szczepach S.aureus izolowanych z krwi obwodowej od pacjentów hospitalizowanych w 9 klinikach i oddziałach UCK, w tym: kardiologii - 2; nefrologii, transplantologii i chorób wewnętrznych 6; hematologii 4; chorób wewnętrznych, endokrynologii i zaburzeń homeostazy 4; gastroenterologii i hepatologii 3; nadciśnienia tętniczego i diabetologii 3; neurologii dorosłych 3; intensywnej opieki medycznej 3; onkologii i radiologii 2; chorób wewnętrznych i zatruć 2; chorób zakaźnych 2; kardiochirurgii ; nadciśnienia, chorób wewnętrznych, hemodializy i medycyny transplantacyjnej ; wenerologii i alergologii ; rehabilitacji ; nefrologii dziecięcej ; onkologii dziecięcej, hematologii i endokrynologii ; neurochirurgii ; nie sklasyfikowane - 2. Szczepy były izolowane w Laboratorium Mikrobiologii UCK w okresie 2 miesięcy, między 2008 a 2009, i przesyłane do Zakładu Mikrobiologii Lekarskiej Gdańskiego Uniwersytetu Medycznego do dalszych badań. Badano szczepy uzyskane z pierwszej hodowli próbki krwi pacjenta, wykluczając powtarzające się izolaty. Za powtórne uznawano izolaty uzyskane z kolejnej hodowli, o takim samym antybiogramie, w ciągu całego badanego okresu. Izolaty pochodziły od pacjentów z klinicznie potwierdzoną infekcją. Bakterie hodowano na agarze z krwią baranią (Oxoid) i re-identyfikowano przy użyciu testów biochemicznych API ID32 Staph (bio Mérieux). Do czasu przeprowadzenia badań szczepy były przechowywane na podłożach z gliceryną w temperaturze - 70 C. Izolacja DNA bakterii. DNA szczepów S.aureus, użyte jako matryca w reakcjach amplifikacji, uzyskiwano z hodowli bakterii wykorzystując zestaw Gene MATRIX Bacterial & Yeast Genomic DNA Purification Kit (EURx Ltd.), zgodnie z instrukcją producenta. Oznaczanie lekooporności. Oporność na metycylinę oceniano na agarze Mueller- -Hinton (Oxoid), używając krążka z cefoksytyną 30µg (Becton Dickinson), a następnie potwierdzano wykryciem genu mec metodą PCR (ang. polymerase chain reaction ) (2). Wrażliwość na pozostałe antybiotyki oznaczano metodą dyfuzyjno-krążkową, zgodnie z wytycznymi CLSI (3) i rekomendacjami KORLD (). Badano wrażliwość na: penicylinę, erytromycynę, klindamycynę, ciprofloksacynę, kotrimoksazol, tetracyklinę, gentamycynę, wankomycynę, teikoplaninę, kwas fusydowy, rifampicynę, linezolid, chinupristynę/dalfopristynę, chloramfenikol (Becton Dickinson) i mupirocynę (Oxoid). Mechanizm oporności

42 K. Wiśniewska i inni Nr 3 na na makrolidy, linkosamidy i streptograminy B określano metodą dwóch krążków (6). Wrażliwość na wankomycynę potwierdzano wartością minimalnego stężenia hamującego (MIC). Wartości MIC oznaczono za pomocą E-testów, zgodnie z procedurą opisaną przez producenta (AB Biodisc). Typowanie spa i analiza BURP. Polimorficzny region X genu spa amplifikowano metodą PCR zgodnie z opisaną procedurą (8). Typy spa określano przy użyciu oprogramowania Ridom Staph Type (http://spaserver.ridom.de) (8) i grupowano w kompleksy klonalne (spa-cc) przy użyciu algorytmu BURP (ang. based upon repeat pattern) (8). Oznaczenie kompleksów klonalnych MLST. Przynależność szczepów do kompleksów klonalnych MLST została oszacowana na podstawie wyników typowania spa, przy użyciu bazy danych Spa Server Ridom (www.spaserver.ridom.de) (4). Typowanie SCCmec. Typowanie gronkowcowych kaset chromosomalnych SCCmec (ang. staphylococcal casette chromosome mec) u szczepów MRSA przeprowadzano zgodnie z opisaną metodyką (5). WYNIKI Typy spa z podziałem na kompleksy klonalne przedstawiono w Tabeli I. Wśród badanych szczepów występowało 26 typów spa, w tym pięć nowych, których kody numeryczne nie odpowiadały żadnemu typowi z bazy danych. Poszczególne typy spa utworzyły sześć kompleksów klonalnych spa i siedem singletonów. Zidentyfikowano jedenaście klonalnych kompleksów MLST-CC. Przynależności do kompleksu MLST nie udało się oszacować jedynie w przypadku dwóch typów, które w typowaniu spa utworzyły odrębne singletony, reprezentowane przez pojedyncze szczepy. Najwięcej, bo 38% szczepów, należało do kom- Tabela I. Występowanie kompleksów klonalnych i typów spa wśród izolatów Staphylococcus aureus z krwi. spa-cc Liczba (%) szczepów Liczba (%) typów spa typ spa (liczba szczepów) MLST-CC CC02 20 (38 ) 7 (26) t02(7); t02 (3); t342 (2); t22 (); t300 (); t07(); t649 (); nowe (4) CC30 CC085 5 (9) 3 () t084 (3); t085 (); t335 () CC5 CC775 4 (8) 3 () t078 (2); t056 (); t775 () CC25 No founder 4 4 (8) 2 (7) t05 (3); t050 () CC45 No founder 5 3 (6) 2 (7) t645 (2); t4495 () CC2 No founder 6 3 (6) 3 () t005 (); t032 (); t30 () CC22 Singleton # 2 (4) (4) t008 (2) CC8 Singleton #2 7 (3) (4) t27 (7) CC Singleton #3 (2) (4) t48 () CC72 Singleton #4 (2) (4) t64 () CC20 Singleton #5 (2) (4) t508 () - Singleton #6 (2) (4) t003 () CC5 Singleton #7 (2) (4) nowy () - Razem: 53 (00) 27 (00) - - CC kompleks klonalny; No founder kompleks klonalny niesklasyfikowany

Nr 3 Typy spa i lekooporność S. aureus izolowanych z krwi 43 pleksu spa-cc02/mlst-cc30, który składał się z siedmiu typów. Wśród nich najczęściej obserwowano typ t02 (7/20 = 35%). W obrębie kompleksu spa-cc02 znalazły się także cztery nowe typy. Szczepy należące do kompleksu spa-cc02 pochodziły od pacjentów 6 oddziałów i były izolowane podczas całego okresu badań (nie podane w tabeli). Drugim pod względem częstości występowania był jeden z singletonów, do którego należało 3% szczepów. Singleton ten odpowiadał kompleksowi MLST-CC30, a tworzyły go szczepy wyłącznie jednego typu t27. Na trzecim miejscu znalazł się kompleks klonalny spa-cc85, reprezentowany przez 9% szczepów i złożony z trzech typów: t084, t085 i t355. Odsetek szczepów reprezentujących trzy pozostałe kompleksy, w tym spa-cc775/mlst-cc25 oraz dwa niesklasyfikowane, odpowiadające MLST-CC45 i CC2, nie przekroczył 8%. W obrębie sześciu pozostałych singletonów znalazły się pojedyncze szczepy. Tabela II. Lekooporne szczepy S.aureus w obrębie poszczególnych typów spa. spa MLST Antybiotyk / liczba szczepów opornych (%) Typ spa CC CC Fox Pe E Cc Cip Te C CC02 CC30 t02(7) 7 t02 (3) t342 (2) t22 () t300 () t07() t649 () 3 2 novel (4) 4 2 CC085 CC5 t084 (3) t085 () t335 () 3 CC775 CC25 t078 (2) 2 t056 () t775 () Nf 4 CC45 t05 (3) t050 () Nf 5 CC2 t645 (2) 2 t4495 () Nf 6 CC22 t005 () t032 () * t30 () S # CC8 t008 (2) * 2 S #2 CC t27 (7) 6 S #3 CC72 t48 () S #4 CC20 t64 () S #5 - t508 () S #6 CC5 t003 () * S #7 - Novel () Razem: 53 (00%) 3 (6) 43 (8) 0 (9) 9 (7) 5 (9) 8 (6) 3 (6) Nf no founder; S singleton; Fox cefoksytyna; Pe penicylina; E erytromycyna; Cc klindamycyna; Cip ciprofloksacyna; Te tetracyklina; C chloramfenikol; Sxt kotrimoksazol;, Ge gentamycyna; Rf - rifampicyna *t032/sccmec IV; t008/ Sccmec IV; t003 Sccmec/ II

44 K. Wiśniewska i inni Nr 3 Oceny częstości występowania szczepów opornych na antybiotyki w obrębie poszczególnych typów i kompleksów klonalnych dokonano w oparciu o dane przedstawione w Tabeli II. Wynika z niej, że w badanej populacji były tylko 3 szczepy oporne na metycylinę (6%). Szczepy MRSA reprezentowane były przez różne kompleksy klonalne i typy spa, w tym tworzący singleton typ t032/mlst-cc22, u którego stwierdzono obecność IV typu kasety SCCmec, typ t008/mlst-cc8, także wyodrębniony jako singleton i także posiadający IV typ kasety SCCmec oraz t003/mlst-cc5 należący do niesklasyfikowanego kompleksu klonalnego spa, niosący II typ kasety SCCmec. Najwięcej, bo 8% szczepów charakteryzowało się opornością na penicylinę. Szczepów opornych na ten antybiotyk nie było tylko w obrębie jednego, niesklasyfikowanego kompleksu klonalnego spa, spokrewnionego z MLST-CC45 i singletonu, z nieokreślonego kompleksu MLST. Na penicylinę opornych było 95% szczepów należących do kompleksu spa-cc02. Oporność na erytromycynę i klindamycynę wykryto u, odpowiednio, 9% i 7% szczepów. Były wśród nich, odpowiednio, 5 i 4 szczepy kompleksu spa-cc02 (25% i 20%) oraz pojedyncze szczepy należące do rzadziej występujących kompleksów lub singletonów, w tym szczep MRSA t003. Szczepy oporne na tetracyklinę stanowiły 6%. Były wśród nich 2 szczepy z kompleksu spa-cc02 oraz pojedyncze, niespokrewnione z nim szczepy, w tym jeden z drugiego pod względem częstości występowania typu t27 i szczep MRSA t008. Odsetek szczepów opornych na ciprofloksacynę nie przekroczył 9%, przy czym oporność na ten lek, na ogół, towarzyszyła oporności na metycylinę, a w przypadku kompleksu spa-cc02 występowała tylko u jednego szczepu. U 6% szczepów stwierdzono oporność na chloramfenikol. Był wśród nich szczep MRSA t008, nie było natomiast szczepów z kompleksu spa-cc02. Oporności na pozostałe antybiotyki nie stwierdzono. DYSKUSJA Jak wykazały przeprowadzone badania, szczepy S.aureus izolowane z krwi pacjentów UCK w Gdańsku w latach 2008-2009 najczęściej należały do kompleksu klonalnego spa- -CC02, w obrębie którego najczęściej występował typ spa t02 reprezentujący kompleks klonalny MLST-CC30. Taki wynik uzyskali także autorzy innych prac (7,7). Wieloośrodkowe badania przeprowadzone w Europie i opublikowane w 200 roku wykazały, że t02 należał do 20 typów najczęściej występujących wśród szczepów S.aureus odpowiedzialnych za zakażenia inwazyjne (7). W badaniach przeprowadzonych na szczepach S.aureus izolowanych z krwi w laboratoriach w Polsce rejonu wschodniego Pomorza, także najczęściej obserwowano kompleks MLST-CC30 i należący do niego typ spa t02 (9). Co ciekawe jednak, opisane w nich szczepy CC30 częściej spotykane były wśród izolatów z nosa niż z krwi. Z doniesień wynika, że w innych krajach europejskich było odwrotnie, a CC30 był bardziej charakterystyczny dla szczepów inwazyjnych (2). Na komentarz zasługuje także częstość występowania niespokrewnionych z CC30 typów spa. W 200 roku typy t002 i t084 zostały uznane za najczęściej występujące wśród szczepów MSSA powiązanych z zakażeniami inwazyjnymi w Europie (7). Wśród szczepów izolowanych w polskich laboratoriach biorących udział w tych badaniach, najczęstsze były t27, t084 i t05 (7). W naszej pracy, t27 występował równie często jak t02, ale nie był klonalnie spokrewniony z żadnym innym typem. Typu t002, z kolei, w ogóle nie zaobserwowano.

Nr 3 Typy spa i lekooporność S. aureus izolowanych z krwi 45 Powiązane z kompleksem klonalnym MLST-CC30 typy spa, których obecność wykazano w niniejszej pracy, znajdowano także wśród szczepów MSSA odpowiedzialnych za zakażenia inwazyjne w szpitalach uniwersyteckich na terenach Szwajcarii i Holandii (5,7). Badania przeprowadzone w Norwegii wykazały, że MLST-CC30 był najczęściej spotykanym klonem wśród kompleksów reprezentujących szczepy MSSA izolowane z ran pacjentów po zabiegach ortopedycznych, z infekcjami głębokich ran chirurgicznych (). Także w naszych badaniach, typy spa przypisane do tego kompleksu, odnosiły się wyłącznie do MSSA. Mało prawdopodobne jednak, aby częstość izolacji szczepów z nim związanych była spowodowana selektywnym oddziaływaniem któregokolwiek antybiotyku. W badanej przez nas kolekcji, szczepy MRSA występowały sporadycznie, co najprawdopodobniej ma związek ze stosowaniem procedur epidemiologicznych na terenie UCK. Na zjawisko zmniejszania się liczby szczepów MRSA wśród izolatów S.aureus pochodzących z krwi pacjentów hospitalizowanych w tym ośrodku zwrócono uwagę już przed kilku laty (2). Zaobserwowana wtedy tendencja spadkowa do występowania szczepów wieloopornych wśród MRSA znalazła potwierdzenie w niniejszej pracy. Może to mieć związek ze zmianami, jakie zaszły w strukturze MRSA na przestrzeni lat, a które doprowadziły do tego, iż w szpitalach na całym świecie, z końcem lat 90-tych ubiegłego wieku, zaczęły pojawiać się tzw. pozaszpitalne szczepy MRSA (CA-MRSA; ang. community acquired MRSA) (9). Szczepy CA-MRSA najczęściej odpowiadają za pierwotne infekcje skóry i tkanek miękkich oraz martwicze zapalenie płuc, któremu towarzyszy bakteriemia (22). W przeciwieństwie do zakażeń z udziałem szczepów szpitalnych, tzw. HA-MRSA (ang. hospital acquired MRSA), zakażenia te na ogół dotyczą osób młodych, bez współistniejących czynników ryzyka. Początkowo, szczepy CA-MRSA, w odróżnieniu od HA-MRSA, poza opornością na antybiotyki β-laktamowe, na ogół, wykazywały oporność tylko na tetracykliny i niekiedy makrolidy (9). Obecnie jednak, coraz częściej zdarzają się wśród nich szczepy oporne także na inne antybiotyki (4 ). Istnieje wiele doniesień na temat ognisk epidemicznych wywoływanych przez CA-MR- SA na terenie szpitali (4, 22). Nasze wcześniejsze badania przeprowadzone na szczepach MRSA izolowanych od pacjentów UCK w Gdańsku w latach 2008-2009 wykazały dominację kompleksu klonalnego spa-cc00, w obrębie którego najczęściej spotykany był typ t003 (23). Opisane dotychczas w bazie danych typy spa, które należały do tego kompleksu, w większości reprezentują klon MLST-CC5, jeden z najczęściej wykrywanych w Polsce (4). Z obecnej pracy wynika, że we wspomnianym okresie, szczep t003 spowodował zakażenie krwi zaledwie u jednego pacjenta i nie wykazał pokrewieństwa klonalnego z żadnym innym szczepem wyizolowanym z krwi. Fakt, iż t003 posiadał II typ kasety chromosomalnej SCCmec wskazywałby, iż reprezentuje HA-MRSA. Typowe szczepy HA-MRSA niosą duże kasety SCCmec typu I III, nadające im, obok metycyliny, często oporność na inne antybiotyki (5). Z naszej pracy wynika jednak, że szczepy o podobnym do t003 profilu lekooporności, pomijając oporność na metycylinę, występowały także wśród izolatów MSSA reprezentujących inne typy spa i kompleksy klonalne, w tym spa-cc02. Z kolei u pozostałych szczepów MRSA izolowanych z krwi wykryto obecność IV typu kasety SCCmec charakterystycznej dla CA-MRSA. Niepokojące jest to, że w przypadku jednego z tych szczepów, t032/mlst-22, zaobserwowano pokrewieństwo klonalne z niektórymi szczepami MSSA, mimo tego, iż posiadał on odrębny profil lekooporności. Większość wykrywanych dotychczas na świecie szczepów MRSA należy do pięciu kompleksów klonalnych MLST:

46 K. Wiśniewska i inni Nr 3 CC5, CC8, CC22, CC30 i CC45 (4). W toku niniejszych badań wykazano obecność typów spa reprezentujących każdy z tych kompleksów, choć w badanej populacji były zaledwie pojedyncze szczepy MRSA. Oznacza to, że część zidentyfikowanych przez nas szczepów MSSA miała wspólne podłoże genetyczne ze znanymi obecnie szczepami MRSA. Istnieje zatem ryzyko, że nabycie kasety SCCmec przez wrażliwe dotychczas na metycylinę szczepy S.aureus reprezentujące wyżej wymienione kompleksy klonalne, w połączeniu z antybiotykoterapią, może doprowadzić do wzrostu liczby szczepów MRSA, które w badanej przez nas populacji występowały sporadycznie. PIŚMIENNICTWO. Aamot HV, Blomfeldt A, Skramm I i inni. Molecular characterization of methicillin-sensitive Staphylococcus aureus from deep surgical site infections in orthopaedic patients. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 202; 3: 999-2004. 2. Barski P, Piechowicz L, Galiński J i inni. Rapid assay for detection of methicillin resistant Staphylococcus aureus using multiplex PCR. Molec Cellul Probs 996; 0: 47 5. 3. CLSI: Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing; sixteenth informational supplement. 2006. M00-S6. Vol. 26, No.3 4. Enright MC, Day NP, Davies CE i inni. Multilocus sequence typing for characterization of methicillin-resistant and methicillin-susceptible clones of Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2000; 38:008-5. 5. Fenner L, Widmer F, Frei R. Molecular epidemiology of invasive methicillin-susceptible Staphylococcus aureus strains circulating at a Swiss University Hospital. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2003; 27: 623 6. 6. Fiebelkorn KR, Crawford SA, Mc Elmeel ML i inni. Practical disc diffusion method for detection of inducible clindamycin resistance in Staphylococcus aureus and coagulase- negative staphylococci. J Clin Microbiol 2003; 4: 4740-4. 7. Grundmann H, Aanensen DM, van den Wijngaard CC i inni. Geographic distribution of Staphylococcus aureus causing invasive infections in Europe: a molecular-epidemiological analysis. PLoS Med 200. http//www.plosmedicine.org/7(): e00025.doi:0.37/journal. pmed. 00025. 8. Harmsen D, Claus H, Witte W i inni. Typing of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in a university hospital setting by using novel software for spa repeat determination and database management. J Clin Microbiol 2003; 4: 5442-8. 9. Holtfreter S, Grumann D, Schmuldde M i inni. Clonal distribution of superantigen genes in clinical Staphylococcus aureus isolates. J Clin Microbiol 2007; 45: 2669-80. 0. Hryniewicz W. Epidemiology of MRSA. Infections 999;.27( 2): 3-6.. Hryniewicz W, Sulikowska A, Szczypa K i inni. Recommendations for susceptibility testing to antimicrobial agents of selected bacterial species. Post Mikrobiol 2005; 44: 75-92. 2. Kicińska AM, Lichodziejewska-Niemierko M, Śledzińska A i inni. Ocena częstości występowania drobnoustrojów izolowanych z krwi pacjentów hospitalizowanych w Szpitalu Klinicznym Akademii Medycznej w Gdańsku w latach 2000-2002. Przegl Epidemiol 2007; 6: 465-75. 3. Krawczyk B, Leibner-Ciszak J. Międzynarodowe standardy w typowaniu Staphylococcus aureus MRSA. Aktualności biomérieux (55). Wyd. biomérieux Polska Sp. z o.o. Warszawa 200. 4. Łuczak-Kadłubowska A, Sulikowska A, Empel J. Countrywide molecular survey of methicillinresistant Staphylococcus aureus strains in Poland. J Clin Microbiol. 2008. 2930-7. 5. Milheiriço C, Oliveira DC, de Lancastre H. Update to the multiplex PCR strategy for assigment of mec element types in Staphylococcus aureus. Ant Agents Chemother 2007;5: 3374-7.

Nr 3 Typy spa i lekooporność S. aureus izolowanych z krwi 47 6. Naber CK. Staphylococcus aureus bacteremia: epidemiology, pathophysiology and management strategies. Clin Infect Dis 2009;48: 23-7. 7. Nulens E, Stobberingh EE, van Dessel H i inni. Molecular characterization of Staphylococcus aureus bloodstream isolates collected in a Dutch University Hospital between 999 and 2006. J Clin Microbiol 2008;46: 2438-4. 8. Rupptisch W, Indra A, Stoger A i inni. Classifying spa types in complexes improves interpretation of typing results for methicillin-resistant Staphylococcus aureus. J Clin Microbiol 2006; 44: 2442-8. 9. Rybak MJ, La Plante KL. Community-associated methicillin-resistant Staphylococcus aureus: a review. Pharmacotherapy 2005; 25: 74-85. 20. Strommenger B, Braulke C, Heuck D i inni. Spa typing of Staphylococcus aureus as a frontline tool in epidemiological typing. J Clin Microbiol 2008;46: 574-8. 2. Wertheim HF, van Leeuwen WB, Snijders MC i inni. Associations between Staphylococcus aureus genotype, infection, and in- hospital mortality: a nested case-control study. J Infect Dis 2005;92: 96-200. 22. Witte W, Braulke C, Cuny C i inni. Emergence of methicillin-resistant Staphylococcus aureus with Panton-Valentine leukocidin in central Europe. Eur J Clin Microbiol Infect Dis 2005; 34:-5. 23. Wiśniewska K, Szewczyk A, Piechowicz L i inni. The use of spa and phage typing for characterization of clinical isolates of methicillin-resistant Staphylococcus aureus in the University Clinical Centre in Gdańsk, Poland. Folia Microbiol 202;57(3): 243-9. Otrzymano: 2 IX 203 r. Adres Autora: 80-227 Gdańsk, ul. Do Studzienki 38, Zakład Mikrobiologii Lekarskiej, Katedra Mikrobiologii, Gdański Uniwersytet Medyczny