1 Zakład Mikrobiologii

Nowiny Lekarskie 2008, 77, 4, 265 272 TAMARA DANILUK 1, MAŁGORZATA ŚCIEPUK 1, KRZYSZTOF FIEDORUK 1, MARIA LUCYNA ZAREMBA 1, DOROTA ROŻKIEWICZ 2, ELŻBIETA OŁDAK 2 CZĘSTOŚĆ WYSTĘPOWANIA I WRAŻLIWOŚĆ NA ANTYBIOTYKI SZCZEPÓW ESCHERICHIA COLI I KLEBSIELLA PNEUMONIAE IZOLOWANYCH OD DZIECI HOSPITALIZOWANYCH W UNIWERSYTECKIM SZPITALU DZIECIĘCYM W LATACH 2004 2007 PREVALENCE RATE AND ANTIBIOTIC SUSCEPTIBILITIES OF ESCHERICHIA COLI AND KLEBSIELLA PNEUMONIAE STRAINS ISOLATED FROM HOSPITALIZED CHILDREN IN THE UNIVERSITY CHILDREN S HOSPITAL DURING 2004 2007 1 Zakład Mikrobiologii Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik Zakładu: prof. dr hab. n. med. Maria Lucyna Zaremba 2 Klinika Obserwacyjno-Zakaźna Dzieci Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik Kliniki: dr hab. n. med. Elżbieta Ołdak Streszczenie Cel pracy. Analiza częstości wykrywania i wrażliwości na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae izolowanych od dzieci hospitalizowanych w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku w latach 2004 2007. Materiał i metody. Z 26 723 próbek materiałów klinicznych od hospitalizowanych dzieci wyosobniono i zidentyfikowano łącznie 4558 szczepów i 475. Wrażliwość na antybiotyki oceniano metodą krążkowo-dyfuzyjną, a do wykazania β-laktamazy typu ESBL stosowano specyficzne testy fenotypowe (DDST, kombinacje metody krążkowej i/lub Etest ESBL). Wyniki. Około 40% szczepów było wrażliwych na wszystkie antybiotyki, 20% było opornych tylko na ampicylinę i 40% na ampicylinę i/lub inne klasy antybiotyków. Szczepy ESBL(+) występowały z częstością 2,6% (120/4558) wśród i 24,4% (116/475) wśród. Szczepy ESBL(+) i często były wielooporne; odpowiednio 69,2% i 79,3%. Oporność na ciprofloksacynę istotnie częściej stwierdzano wśród szczepów ESBL(+) niż ESBL( ). Tylko jeden szczep izolowany w 2006 roku był oporny na imipenem (MBL+) i wytwarzał β-laktamazę typu ESBL. Szczepy ESBL(+) najczęściej izolowano z próbek materiałów od dzieci leczonych na oddziałach onkologii, intensywnej terapii i dziecięcym zakaźnym. Wnioski. 1. Generalnie wykazano niską częstość szczepów i opornych na różne klasy antybiotyków i jeszcze niższą częstość szczepów wieloopornych wśród tych gatunków. 2. W ostatnich latach odnotowano jednak wzrost częstości szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) i Escherichia coli ESBL(+) wieloopornych, w tym z opornością na ciprofloksacynę. SŁOWA KLUCZOWE: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, lekooporność, ESBL. Summary Aim of the study. Analysis of frequencies and antibiotic susceptibilities of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains isolated from hospitalized children in the University Children s Hospital during 2004-2007. Material and methods. A total of 4558 Escherichia coli and 475 Klebsiella pneumoniae strains from 26 723 various clinical specimens obtained from hospitalized children were isolated and identified. Antibiotic susceptibility with disk diffusion methods and specific phenotypes tests (DDST and combination disk method and/or ESBL Etest) were used to detect ESBL types of β-lactamases. Results. About 40% strains of were sensitive to all tested antibiotics, 20% were resistant to ampicillin only, and 40% were resistant to ampicillin and/or other group of antibiotics. ESBL(+) types were found in 120 (2.6%) and in 116 (24.4%) isolates. ESBL producing strains of and were frequently multidrug resistant (MDR); 69.2% and 79.3% respectively. Resistance to ciprofloxacin was significantly (p < 0.05) higher in ESBL(+) than ESBL( ) of isolated from hospitalized children (mainly from ICU, oncology and children infectious diseases wards). Except of one strain (2006), no carbapenem resistant isolates in examined strains were observed. Conclusions. 1. Generally, low frequencies of and strains with resistance to various classes of antibiotics were observed, and even lower frequency of multidrug resistance among strains of these species. 2. However, lately increased frequency of multidrug resistant strains of ESBL(+) and ESBL(+), including those resistant to ciprofloxacin were found. KEY WORDS: Escherichia coli, Klebsiella pneumoniae, drug resistance, ESBL. Wstęp Liczne gatunki rodzajów z rodziny Enterobacteriaceae są rozpowszechnione w środowisku naturalnym i wy- stępują w przewodzie pokarmowym zwierząt i człowieka, a kilka z nich, w tym Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae, są dominującymi i uznanymi patogenami w zakażeniach pozaszpitalnych i szpitalnych [1 5].

266 Tamara Daniluk i inni Gatunek Escherichia coli należy do stałych mikrobiontów jelita zdrowych ludzi, jednak liczne szczepy mogą wywoływać pozajelitowe i jelitowe zakażenia zarówno u zdrowych osobników (kompetentnych), jak i z obniżoną odpornością (ang. immunocompromised) [1, 2, 4, 5]. Zakażenia dróg moczowych, bakteriemia, zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i choroba biegunkowa są najczęstszymi zespołami chorobowymi, które są wywołane przez ograniczoną liczbę patogennych klonów [2, 4 10]. Pałeczki Escherichia coli oprócz zakażeń dróg moczowych (cystitis, pyelonephritis) wywołują zakażenia wewnątrzbrzuszne (cholangitis/cholecystitis, appendicitis, peritonitis i inne), często też uczestniczą w zapaleniach płuc i bakteriemiach, zwłaszcza szpitalnego pochodzenia oraz w zapaleniach opon mózgowo-rdzeniowych u noworodków i niemowląt i rzadziej w ropnych zakażeniach z inną lokalizacją [2, 5]. Escherichia coli była dominującym czynnikiem wśród wszystkich nabytych w szpitalach w USA zakażeniach dróg moczowych (25 26%) [1, 7, 8]. Prawie 6,5% 10% zakażeń śródchirurgicznych lub ran było również wywołanych przez, co jest zbliżoną częstością do Pseudomonas aeruginosa (8,1% 9,5%). Pałeczki są również najczęściej izolowane z krwi (około 3 5%) wśród innych gatunków Enterobacteriaceae oraz zajmują czwarte miejsce wśród Gram-ujemnych bakterii; w tych zakażeniach dominują Coag NS (29 43%), S. aureus (14 16%) i Enterococcus spp. (9 14,5%) [1, 7]. Pałeczki Klebsiella pneumoniae wywołują u ludzi zakażenia w szerokim zakresie od bezobjawowej kolonizacji jelitowej, dróg moczowych i oddechowych do zapalenia płuc, posocznicy i zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych o przebiegu śmiertelnym [1, 3, 5, 7 10]. Z badań NNISS (National Nosocomial Infections Surveillance System) w USA wiadomo, że Klebsiella pneumoniae znajduje się pomiędzy miejscem piątym a siódmym wśród licznych czynników szpitalnych zakażeń układu moczowego, łożyska krwi i układu sercowo-naczyniowego oraz zakażeń dróg oddechowych [7, 8]. Na miejscu drugim (7,2%) bakterie te znajdują się wśród czynników zapalenia płuc nabytego w szpitalu, a w tej lokalizacji szacowana jest na miejscu trzecim (5,0%); zakażenia Enterobacter spp. w szpitalnych zapaleniach płuc są dominujące (10,0%). Pomimo że Klebsiella pneumoniae wywołuje bakteriemię/posocznicę cztery do 10 [7, 8] razy rzadziej niż bakterie Gram-dodatnie, to takie zakażenia dwukrotnie częściej kończą się zgonem pacjentów [3, 9]. Pałeczki Klebsiella mogą wywoływać zakażenia śródoperacyjne i pooperacyjne, szacowane na 68%; częstość ta dla Escherichia coli lub Staphylococcus aureus określona była przez Twum-Danso i wsp. [10] odpowiednio na 31% i 55%. Pałeczki Klebsiella w 1997 roku były odpowiedzialne za 7% zakażeń dróg moczowych w Europie [11] i 12% w Ameryce Północnej [12], a w roku 2003 około 10% zakażeń szpitalnych w USA z taką lokalizacją wywołanych było przez [7]. Ze względu na ciężki przebieg zakażeń, niekiedy zagrażających życiu, wywoływanych przez i, zwłaszcza posocznicy (sepsis), zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych i zapalenia płuc, które często są nabywane podczas hospitalizacji [1, 5, 7 10], istotne znaczenie mają badania bakteriologiczne połączone z izolacją, identyfikacją i oceną wrażliwości tych bakterii na chemioterapeutyki [13, 14, 15]. Zakażenia z udziałem tych dwóch gatunków często są epidemiczne i wywoływane przez szczepy oporne na większość antybiotyków β-laktamowych, z mechanizmem wytwarzania beta-laktamazy o szerokim spektrum substratowym znanym jako typ ESBL i niekiedy z opornością także na inne grupy chemiczne antybiotyków (szczepy wielooporne) [5, 11 16]. Epidemiczne zakażenia wieloopornymi szczepami i K. pneumoniae występują często na oddziałach intensywnej opieki (ICU), w tym na oddziałach wcześniaków, noworodkowych i niemowlęcych oraz dziecięcych oddziałach onkologicznych [5, 7 9, 17]. Celem obecnej pracy była retrospektywna analiza częstości wykrywania i wrażliwości na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae izolowanych od dzieci leczonych w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku w latach 2004 2007. Materiał i metody W latach 2004 2007 wykonano 26 723 badań próbek materiałów klinicznych pochodzących od dzieci leczonych w różnych oddziałach szpitalnych Uniwersyteckiego Szpitala Dziecięcego Uniwersytetu Medycznego w Białymstoku. Z 15 088 (56,5%) próbek wyosobniono łącznie 17 371 szczepów bakteryjnych, wśród których 7790 (44,8%) należało do rodziny Enterobacteriaceae. Łącznie 4558 szczepów zidentyfikowano jako należące do gatunku Escherichia coli (4558/7790; 58,5%) i 475 (6,1%) do gatunku Klebsiella pneumoniae. Do hodowli bakterii stosowano standardowe procedury. Identyfikację pałeczek Gram-ujemnych do poziomu gatunku prowadzono w oparciu o konwencjonalne biochemiczne testy i komercyjne identyfikacyjne zestawy API 20E dla automatycznego systemu ATB Expression (bio-mérieux). Wrażliwość na antybiotyki oceniano metodą dyfuzyjnokrążkową przy użyciu krążków firmy BBL, Becton- Dickinson. Szczepy klasyfikowano jako wrażliwe lub oporne (włączono kategorię średniowrażliwych) według kryteriów CLSI [13, 18], wcześniej znane jako NCCLS [13]. Do kontroli jakości wykorzystano referencyjne szczepy ATCC (American Type Culture Collection): Escherichia coli ATCC 25922, Escherichia coli ATCC 35 218 oraz Klebsiella pneumoniae ATCC 700603 (dla potwierdzenia szczepów wytwarzających ESBL). Zdolność wytwarzania enzymów ESBL przez szczepy badano przy użyciu testu DDST (double-disk synergy test), stosując krążki z cefotaksymem (30 µg), ceftazydymem (30 µg), aztreonamem (30 µg) oraz amoksycyliną z kwasem klawulanowym (20/10 µg) [13, 14, 18]. Dla każdego szczepu ESBL(+) w teście DDST wykonano test potwierdzający według CLSI (CDM; combination disk method), z krążkami z cefotaksymem (CTX) (30 µg) i ceftazydymem (CAZ) (30 µg) oraz w połączeniu z kwasem klawulanowym (CTX/CLA i CAZ/CLA) [14].

Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 267 Stosowano też Etesty ESBL oraz Etest MBL (AB Biodisk, Solna, Szwecja) [13, 14]. Analizę statystyczną wykonano przy użyciu programu Statistica 8.0. Do wykazania różnic istotnych statystycznie stosowano test χ 2 i poziom istotności p = 0,05. Wyniki Z łącznej liczby 4558 szczepów Escherichia coli wyizolowanych w latach 2004 2007 3755 (82,4%) wyosobniono z próbek kału (53,7%) od dzieci hospitalizowanych z powodu ostrej biegunki pozaszpitalnej i z moczu (28,7%) od dzieci leczonych z powodu infekcji dróg moczowych (tab. 1.). Tylko 82 (1,8%) szczepy izolowano z ropy (77/4558; 1,7%) i krwi (5/4558; 0,1%). Jeden tylko szczep wyosobniono spośród 359 (0,02%) próbek badanych płynu mózgowo-rdzeniowego (1/114; 0,9% 2005 rok). Szczepy izolowano również z wymazów z rurek tracheostomijnych (57/4558; 1,3%) od dzieci hospitalizowanych w oddziale intensywnej opieki medycznej (OIT). W kolejnych latach nie odnotowano zwiększonej ogólnej liczby izolowanych szczepów (tab. 1). W roku 2007 w porównaniu do roku 2004 znamiennie częściej izolowano z treści ropnej (p = 0,0054; p < 0,05), natomiast istotny statystycznie spadek w kolejnych latach dotyczył częstości izolacji tych bakterii z jamy nosowo-gardłowej (139 szczepów; 12,3% w roku 2004 i 58; 5,2% w roku 2007) (p = 0,00000; p < 0,05). Pałeczki z gatunku Klebsiella pneumoniae, podobnie jak i Escherichia coli, najczęściej izolowane były z próbek kału (40%), moczu (20%), wymazów z gardła (18,1%) oraz rurki tracheostomijnej (11,2%) (tab. 1.). Łącznie wyizolowano 475 szczepów tego gatunku, wśród których 424 szczepy (89,3%) pochodziły z tych czterech materiałów. Pozostałe szczepy wyosobniono z płynu mózgowordzeniowego (8/359 próbek 2,2%; 7/114 6,1% w 2005 Tab. 1. Częstość występowania Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae w próbkach materiałów klinicznych od dzieci hospitalizowanych w latach 2004 2007 Table 1. The prevalence of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolates in clinical samples of children hospitalized during 2004 2007 2004 2005 2006 2007 Razem Materiały kliniczne Płyny ustrojowe: 402 39 347 35 303 11 337 21 1389 (30,5%) krew 3 0 0 0 2 0 0 1 5 (0,1%) płyn mózgowo- 0 1 1 7 0 0 0 0 1 rdzeniowy (0,02%) mocz 388 38* 325 26 284 11* 309 20* 1306 (28,7%) ropa 11* 0 21 2 17 0 28* 0 77 (1,7%) Wymazy: 219 72 174 37 120 35 149 27 662 (14,5%) gardło 125 41* 87 16 47 17 57 12* 316 (6,9%) nos 14 0 4 2 9 4 1 4 28 (0,6%) rurka 16 24* 12 11 9 8 20 10* 57 tracheostomijna (1,3%) pochwa 43 5 52 5 33 4 24 0 152 (3,3%) inne 21 2 19 3 22 2 47 1 109 2,4%) Kał 491 41* 680 28* 658 52 620 69* 2449 (53,7%) Inne 17 2 21 3 10 0 10 3 58 (1,3%) Razem 1129 154 1222 103 1091 98 1116 120 4558 (100%) 106 (22,3%) 1 (0,2%) 8 (1,7%) 95 20,0%) 2 (0,4%) 171 (36,0%) 86 (18,1%) 10 (2,1%) 53 (11,2%) 14 (2,9%) 8 1,7%) 190 (40,0%) 8 (1,7%) 475 (100%) * p < 0,05

268 Tamara Daniluk i inni roku), wymazów z pochwy (14/1195 1,2%), z nosa (10/1012 1,0%) i innych. Sporadycznie były izolowane z krwi (1/2076 prowadzonych hodowli krwi; 0,05%) i z treści ropnej (2/716 próbek; 0,3%). Zwraca uwagę istotnie statystyczny spadek częstości izolacji K. pneumoniae z próbek moczu w 2006 roku (11/98 11,2%) w porównaniu z pierwszym analizowanym 2004 rokiem (38/154 24,7%) (p < 0,05). Istotnie statystycznie częściej szczepy były izolowane w 2004 roku (41/154; 26,6%) również z wymazów z gardła w porównaniu do 2007 roku (12/120 10%) (p = 0,0005; p < 0,05) (tab. 1.). Wśród 4558 szczepów 1786 (39,2%) było wrażliwych na wszystkie antybiotyki stosowane w badaniach, a 904 (19,8%) wykazywało oporność tylko na ampicylinę (tab. 2). Odnotowano istotnie statystyczny spadek częstości występowania szczepów opornych tylko na ampicylinę w roku 2007 (107/1116 9,6%) w porównaniu do lat wcześniejszych 2004 2006 (p = 0,0000; p < 0,05) i wzrost oporności na ampicylinę i/lub inne antybiotyki (57,9%) w porównaniu do lat wcześniejszych (33,9% 37,7%) (tab. 2.). U 1868 (41%) szczepów wykazano oporność na ampicylinę i/lub inne antybiotyki. W latach 2004 2007 wyosobniono łącznie 120 (2,6%) szczepów wytwarzających β-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL), wśród których 29 (24,2%) nie było wrażliwych na skojarzony preparat amoksycyliny z kwasem klawulanowym. Wśród wszystkich ESBL(+) 88 (70,4%) było z opornością również na inne niż β-laktamy klasy antybiotyków (szczepy wielooporne MDR; multidrug resistance). Statystycznie częściej szczepy ESBL-dodatnie (ESBL(+)) wykrywano w 2005 roku (50/1222 4,1%) w porównaniu do roku 2006 (18/1091 1,6%) i 2007 (21/1116 1,9%) (tab. 1. i 3.). Szczepy wytwarzające betalaktamazy ESBL izolowano najczęściej z moczu (30%), kału (28,3%), wymazów z gardła (18,3%) i rurki tracheostomijnej (8,3%). Wśród 5 szczepów izolowa- Tab. 2. Lekooporność szczepów Escherichia coli wyizolowanych z próbek materiałów klinicznych w latach 2004 2007 Table 2. The drug resistance of Escherichia coli strains isolated from clinical samples during 2004 2007 Rok Liczba szczepów Wrażliwe na wszystkie antybiotyki Oporne tylko na ampicylinę Oporne na ampicylinę i/lub inne antybiotyki 2004 1129 455 (40,3%) *248 (21,9%) *426 (37,7%) 2005 1222 496 (40,6%) *312 (25,5%) *414 (33,9%) 2006 1091 472 (43,3%) *237 (21,7%) *382 (35,0%) 2007 1116 363 (32,5%) *107 (9,6%) *646 (57,9%) Razem 4558 1786 (39,2%) 904 (19,8%) 1868 (41,0%) * p < 0,05 Tab. 3. Szczepy Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae wytwarzające β-laktamazy typu ESBL Table 3. ESBL-producing strains of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Materiały kliniczne 2004 2005 2006 2007 Razem Płyny ustrojowe: 12 6 16 17 8 1 7 1 43 25 krew 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 płyn mózgowo- 0 0 1 3 0 0 0 0 1 3 rdzeniowy mocz 11 6 12 12 6 1 7 1 36 20 ropa 0 0 3 2 0 0 0 0 3 2 Wymazy: 12 16 21 22 3 11 7 18 43 67 gardło 9 4 10 8 0 4 3 3 22 19 nos 2 0 0 1 0 1 1 4 3 6 rurka tracheostomijna 0 11 7 10 1 6 2 10 10 37 pochwa 1 0 0 0 2 0 0 0 3 0 inne 0 1 4 3 0 0 1 1 5 5 Kał 7 2 13 3 7 6 7 9 34 20 Inne 0 0 0 1 0 0 0 3 0 4 Razem 31 24 50 43 18 18 21 31 120 116

Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 269 nych z krwi 3 z nich były ESBL (+). Piętnaście szczepów ESBL (+) pochodziło z próbek innych materiałów, takich jak: treść ropna, wymazy z nosa, pochwy i płyn mózgowo-rdzeniowy. Wśród ogólnej liczby 475 szczepów Klebsiella pneumoniae wyizolowanych w latach 2004 2007 116 (24,4%) wytwarzało enzymy ESBL (tab. 3). Szczepy K. pneumoniae ESBL(+) izolowano najczęściej z wymazów z rurek tracheostomijnych (31,9%), z moczu (17,2%), wymazów z gardła (16,4%) oraz kału (17,2%). Pozostałe szczepy (20/116; 17,2%) izolowano z płynu mózgowordzeniowego (3x), ropy (2x), wymazów z nosa (6x) i innych materiałów (9x). Wszystkie szczepy ESBL(+) charakteryzowały się opornością na ampicylinę, cefazolinę, cefuroksym, cefotaksym i aztreonam (tab. 4.). Oporność na ceftazydym stwierdzono wśród 90 (77,6%) szczepów, a oporność na Augmentin u 35 (30,2%); szczepy te wytwarzały β-laktamazy oporne na inhibitor. Odsetki szczepów opornych na antybiotyki inne niż betalaktamowe były istotnie statystycznie wyższe dla szczepów ESBL(+) w porównaniu do szczepów ESBL( ). Dotyczyło to oporności na gentamycynę, amikacynę, doksycyklinę i trimetoprim/sulfametoksazol (SXT). Trzy szczepy Klebsiella pneumoniae ESBL(+) oporne na ciprofloksacynę (2,6%) wyosobniono z rurek tracheostomijnych (2x) i wymazu z gardła (1x) tylko w 2007 roku. Nie stwierdzono występowania szczepów opornych na karbapenemy. Wśród 116 szczepów ESBL(+) 92 (79,3%) były wielooporne (MDR); oporność dotyczyła nie tylko antybiotyków β-laktamowych, ale również gentamycyny, amikacyny i SXT (56/92; 60,9%) lub dodatkowo jeszcze oporności na doksycyklinę (30/92; 32,6%). Dwa szczepy MDR ESBL(+) były oporne na wszystkie antybiotyki β-laktamowe łącznie z ceftazydymem, SXT i doksycykliną, a jeden szczep był oporny na β-laktamy (bez ceftazydymu), gentamycynę i doksycyklinę. Trzy szczepy ESBL(+) oporne na ciprofloksacynę były oporne na wszystkie uwzględnione w badaniach klasy antybiotyków, tj. β-laktamowe, aminoglikozydowe, tetracykliny i trimetoprim/sulfametoksazol (SXT); szczepy te były wrażliwe na cefoksytynę, amoksycylinę w skojarzeniu z kwasem klawulanowym (Augmentin) oraz na imipenem. Szczepy ESBL( ), które były w 100% oporne na ampicylinę w 93,6% odzyskiwały wrażliwość na skojarzony preparat amoksycylinę i kwas klawulanowy (Augmentin). Wykazano oporność na cefazolinę (3,3%), gentamycynę i amikacynę (po 5%) oraz na doksycyklinę (12%) i na SXT (27,3%) (tab. 4.). Wszystkie szczepy ESBL( ) były wrażliwe na ciprofloksacynę i imipenem oraz na cefalosporyny II i III generacji i na aztreonam. Wszystkie szczepy ESBL(+) były oporne na ampicylinę, cefazolinę, cefuroksym, cefotaksym i aztreonam (tab. 4). Wśród 120 szczepów ESBL(+) 10 (8,3%) było wrażliwych na ceftazydym. Ponadto, 83 (69,2%) szczepy ESBL(+) były MDR z różnymi wzorami oporności na co najmniej trzy różne klasy chemioterapeutyków, wśród których 12 (14,5%) było opornych na ciprofloksacynę. Siedem szczepów opornych na ciprofloksacynę było także opornych na doksycyklinę i SXT, u 3 występowała oporność na aminoglikozydy i SXT i u pojedynczych oporność na gentamycynę i amikacynę (aminoglikozydy) lub na doksycyklinę. Jeden szczep oporny na imipenem był jednocześnie oporny na doksycyklinę i SXT; był wyosobniony z moczu dziewczynki leczonej w klinice z powodu zakażenia dróg moczowych. Wszystkie ESBL(+) były hamowane przez cefoksytynę i w 75,8% przez kwas klawulanowy (amoksycylina + kwas klawulanowy) (tab. 4.). Tab. 4. Porównanie wzorów lekooporności szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae Table 4. Comparison of drug resistance patterns of Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains Liczba (%) szczepów opornych Chemioterapeutyk ESBL (+) ESBL ( ) (n = 120) (n = 116) (n = 1748) (n = 359) Ampicylina 120 (100,0) 116 (100,0) 1184 (67,7) 359 (100,0) Amoksycylina/ 29 (24,2) 35 (30,2) 8 (0,5) 23 (6,4) kwas klawulanowy Cefazolina 120 (100,0) 116 (100,0) 8 (0,5) 12 (3,3) Cefuroksym 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Cefotaksym 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Ceftazydym 110 (91,7) 90 (77,6) 0 0 Aztreonam 120 (100,0) 116 (100,0) 0 0 Cefoksytyna 0 0 0 0 Imipenem 1 (0,8) 0 0 0 Ciprofloksacyna 12 (10,0) 3 (2,6) 13 (0,7) 0 Gentamycyna 73 (60,8) 99 (85,3) 38 (2,2) 18 (5,0) Amikacyna 72 (60,0) 95 (81,9) 3 (0,2) 18 (5,0) Doksycyklina 57 (47,5) 37 (31,9) 1075 (61,5) 43 (12,0) Trimetoprim/ Sulfametoksazol 81 (67,5) 93 (80,2) 1154 (66,0) 98 (27,3)

270 Tamara Daniluk i inni Wśród szczepów ESBL( ) 67,7% było opornych na ampicylinę, które w większości (99,5%) odzyskiwały wrażliwość na skojarzony preparat Augmentin (tab. 4.). Oporność na gentamycynę (2,2%) i amikacynę (0,2%) była wykazywana wśród ESBL( ) istotnie statystycznie rzadziej w porównaniu do szczepów ESBL(+) z wysokimi odsetkami oporności odpowiednio 60,8% i 60% (p = 0,0000). Oporność na SXT występowała ze zbliżoną, wysoką częstością zarówno wśród szczepów ESBL( ) (66%), jak i ESBL(+) (67,5%) (p > 0,05). Oporność na doksycyklinę występowała statystycznie częściej wśród ESBL( ) (61,5%) niż ESBL(+) (47,5%) (p = 0,0000). Zwraca uwagę występowanie oporności na ciprofloksacynę wśród ESBL(+) istotnie statystycznie częściej (12/120; 10%) w porównaniu do szczepów ESBL(+) (3/116; 2,6%) (p = 0,0196) oraz w porównaniu do szczepów ESBL( ) (13/1748; 0,7%) (p = 0,0000) (tab. 4.). Wykazano też, że chociaż częstość oporności na ciprofloksacynę wśród ogólnej liczby badanych szczepów wynosiła 0,5% (25/4558), to w 2007 roku była statystycznie wyższa (16/1116; 1,4%) w porównaniu do 2004 (1/1129; 0,09%) i 2005 roku (1/1222; 0,08%) (p < 0,05). Dyskusja Jeszcze nie tak dawno, pod koniec lat 80. XX w., wybór przez lekarzy praktykujących w szpitalach antybiotyku do terapii poważnych zakażeń wywoływanych przez Enterobacteriaceae był prosty. Bakterie te bowiem, wraz z głównymi gatunkami Klebsiella pneumoniae i Escherichia coli, odznaczały się wrażliwością na antybiotyki stosowane zazwyczaj w terapii empirycznej lub też wykazywały przewidywalne wzory lekooporności [2 5, 11, 12, 15 17, 19, 20]. Pałeczki z gatunku należały do najczęściej izolowanych z różnych próbek materiałów od chorych leczonych w latach 1998 2003 w szpitalach i poradniach miasta Białegostoku i województwa [19, 20], podobnie jak na to wskazują badania prezentowane w obecnej pracy pochodzące z ostatnich czterech lat 2004 2007. Wiadomo też, że pałeczki i pod koniec lat 80. charakteryzowały się niższym stopniem lekooporności wobec licznych antybiotyków w porównaniu do końca lat 90. ubiegłego wieku [19]. W 1998 roku odnotowano prawie dwukrotny wzrost oporności na ampicylinę (66,4%) wśród szczepów w porównaniu do ocenianych 10 lat wcześniej (36,7%) [21]. W kolejnych latach nie obserwowano wzrostu częstości oporności szczepów na ampicylinę (2003 51,8%) [20]. Z aktualnych danych wynika, że odsetki szczepów opornych na ampicylinę utrzymują się na niezmiennym, porównywalnym poziomie około 50% (2004 51,5% i 2007 50,4%). W latach 1998 2003 [19, 20] nie odnotowano też istotnego wzrostu oporności wśród szczepów na cefalosporyny I, II (cezuroksym) i III generacji (cefotaksym, ceftazydym) oraz na aztreonam, których wartości wynosiły w granicach 5 10%. Wśród szczepów izolowanych w latach 2004 2007 oporność na cefalosporyny I, II i III generacji (cefotaksym) oraz na aztreonam wykryto u łącznej liczby 120 (2,6%) spośród ogólnej liczby 4558 ocenianych izolatów; szczepy te wytwarzały beta-laktamazę typu ESBL. Częstość ESBL(+) izolatów jest istotnie statystycznie wyższa, gdy będzie odniesiona tylko do szczepów opornych na ampicylinę i/lub inne antybiotyki beta-laktamowe i z innych grup chemicznych (120/1868 6,4% lub 120/2772 4,3%). Wśród szczepów generalnie odnotowano spadek częstości oporności na gentamycynę (2,5% 2004 i 1,5% 2007) i na amikacynę (1% 2004 i 1,1% 2007) w porównaniu do lat 1998 2003 [19, 20], chociaż istotne różnice dotyczą szczepów ESBL(+) i ESBL( ) ; wrażliwe na aminoglikozydy są tylko szczepy ESBL( ). Wysokie, jakkolwiek niższe w porównaniu do 1998 2003 (37,6%) odsetki szczepów dotyczyły oporności na tetracykliny (19,9% 2004 i 24,1% 2007). Odnotowano istotnie statystyczny wzrost oporności na trimetoprim/sulfametoksazol (SXT) wśród szczepów izolowanych w 2007 roku (51,8%) w porównaniu do 2004 (21,7%), 2005 (18,9%) i 2006 (16,9%) roku. Wśród szczepów ESBL(+) i ESBL( ) wykrywano jednak wysokie porównywalne odsetki oporności na SXT (odpowiednio 67,5% i 66%). Zwraca uwagę wzrost oporności wśród szczepów na ciprofloksacynę w 2006 (7/1091; 0,6%) i 2007 roku (16/1116; 1,4%) w porównaniu do 2004 (1/1129; 0,08%) i 2005 roku (1/1222; 0,08%). Szczepy oporne na ciprofloksacynę istotnie częściej wykrywano wśród ESBL(+) niż ESBL( ) izolatów. Na 12 szczepów ESBL(+) opornych na ciprofloksacynę 8 (66,7%) z nich izolowano z kału od dzieci leczonych w oddziale intensywnej terapii (4x) (OIT), klinice onkologii (2x) i w klinice chorób zakaźnych dzieci (2x). Dwa szczepy izolowano z krwi od dzieci z kliniki onkologicznej i kolejne dwa z rurki tracheostomijnej od dzieci z OIT. Szczepy oporne na ciprofloksacynę ESBL( ) izolowano z moczu (4x), wymazów ze skóry (3x), rurki tracheostomijnej (2x) i innych (2x), głównie od dzieci z OIT i kliniki onkologicznej. Szczepy dziesięciokrotnie rzadziej niż były izolowane z różnych próbek materiałów od dzieci leczonych w latach 2004 2007. Takie częstości były podobne do lat wcześniejszych (1997 2003) [19, 20]. Wśród wszystkich szczepów 24,4% było opornych na wszystkie antybiotyki beta-laktamowe, które wytwarzały β-laktamazę typu ESBL. Szczepy ESBL(+) izolowano z częstością 15,6% (24/154) w 2004 roku i 25,8% (31/120) w 2007 roku; nie odnotowano istotnego wzrostu częstości ESBL(+) w porównaniu do lat wcześniejszych [20]. Szczepy generalnie były bardziej oporne na aminoglikozydy niż ; oporność na gentamycynę i amikacynę wykazywano z podobną częstością (odpowiednio 24,7% i 26,6%) w 2004 roku i 2007 roku (22,5% i 21,7%). Podobna sytuacja rejestrowana była w latach 1998 2003 [19, 20].

Częstość występowania i wrażliwość na antybiotyki szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae 271 Odnotowano spadek oporności na doksycyklinę w 2007 roku (15%) w porównaniu do 2004 roku (20,1%) oraz wzrost oporności na SXT z 40,9% (2004) do 61,7% (2007), wśród szczepów (głównie izolowane z moczu i kału). Szczepy oporne na ciprofloksacynę izolowano w roku 2007 (3/120; 2,5%); dwa szczepy pochodziły z rurki tracheostomijnej i jeden z wymazu z gardła od dzieci leczonych na oddziale intensywnej terapii. Istotne jest, że od 1998 roku, kiedy to po raz pierwszy wykazano oporność na imipenem (karbapenem) wśród szczepów (1%) izolowanych od dzieci leczonych w oddziale onkologii [19], jak dotąd szczepy takie nie rozprzestrzeniły się wśród dzieci leczonych w różnych oddziałach szpitalnych. W 2006 roku tylko jeden szczep był oporny na imipenem (MBL+), który jednocześnie wytwarzał β-lakatamazę o rozszerzonym spektrum działania (ESBL+). Szczepów opornych na imipenem jak dotąd nie wykryto wśród badanych izolatów Klebsiella pneumoniae. Taka sytuacja jest bardzo korzystna, gdyż karbapenemy mogą być lekami stosowanymi z powodzeniem w leczeniu zakażeń wywoływanych przez patogeny bakteryjne wielooporne (MDR), w tym wytwarzające β-laktamazy typu ESBL. Niepokojący jest jednak odnotowany wzrost oporności na ciprofloksacynę, zwłaszcza wśród szczepów. Zakażenia wywołane przez szczepy i oporne na fluorochinolony i wytwarzające ESBL występują aktualnie na terenie całego świata. Wykazano, że około 20 60% szczepów i ESBL(+) jest opornych na fluorochonolony i że oporność na fluorochinolony jest ściśle związana z wytwarzaniem ESBL [5, 15, 22 25]. Zwrócono uwagę, że nabycie oporności na ciprofloksacynę przez szczepy i wytwarzające typ ESBL β-laktamazy, pozostawał w silnym związku z wcześniejszym stosowaniem fluorochonolonów [23 25]. Szczepy wytwarzające β-laktamazy typu ESBL izolowane od dzieci często były oporne nie tylko na wszystkie antybiotyki β-laktamowe (wyjątek karbapenemy i Augmentin), lecz także na inne niepokrewne związki takie jak aminoglikozydy, tetracykliny i trimetoprim-sulfametoksazol, podobnie jak na to wskazują badania z innych ośrodków [5, 15, 17, 23]. Taka oporność może być problemem ze względu na ograniczenie opcji terapeutycznych [5, 22]. Obecność oporności na ciprofloksacynę i wytwarzanie ESBL może być konsekwencją wcześniej stosowanych antybiotyków β-laktamowych (głównie cefalosporyn II i III generacji) lub ciprofloksacyny, które mogły spowodować selekcję i umożliwić rozprzestrzenienie bakterii wieloopornych (MDR) pomiędzy pacjentami, podobnie jak wskazywali inni [5, 23]. Chociaż generalnie fluorochinolony nie są stosowane w leczeniu dzieci do lat 16, to potrzeba ich włączenia do terapii na niektórych oddziałach dziecięcych była niekwestionowana. W związku z tym w roku 2005 ponad dwukrotnie wzrosło zużycie chinolonów, głównie ciprofloksacyny (z 0,5 do 1,14 DDD/100 osobodni) w porównaniu do 2004 roku w Uniwersyteckim Dziecięcym Szpitalu w Białymstoku [26]. Odnotowano wyraźne zróżnicowanie ilości stosowanych antybiotyków w zależności od specyfiki oddziałów; w 2004 r. najwięcej antybiotyków stosowano na oddziale intensywnej terapii (3,6 DDD/100 osobodni), chirurgii (3,1) i onkologii dziecięcej (3,0). Ograniczenia zużycia drogich antybiotyków w większości z 12 klinik szpitala poza onkologią (3,26 DDD/100 osobodni), laryngologią (wzrost z 2,3 do 2,86) i alergologią dziecięcą (wzrost z 0,53 do 2,33) nie miały zasadniczego wpływu na ich zużycie. Związek pomiędzy stosowaniem antybiotyków i występowaniem oporności na te leki jest złożony i trudny do oceny. Ocena zużycia antybiotyków w szpitalu może być dokonywana w oparciu o nadzór na poziomie pacjenta lub w oparciu o nadzór populacyjny zebrany na poziomie oddziału szpitalnego lub szpitala [27]. W celu ograniczenia presji selekcyjnej prowadzącej do rozwoju oporności powinny być stosowane różne działania (edukacyjne, organizacyjne, restrykcyjne) zmierzające do standaryzowanego systemu nadzoru zużycia antybiotyków, który to został wprowadzony ostatnio w Uniwersyteckim Szpitalu Dziecięcym w Białymstoku [26]. Należy się spodziewać, że monitorowanie zużycia antybiotyków i ograniczenie ich stosowania nie tylko spowoduje zmniejszenie kosztów leczenia, ale także będzie stanowić ważny element działań zapobiegających selekcji i narastaniu antybiotykooporności wśród bakterii kolonizujących i/lub uczestniczących w zakażeniach u dzieci. Wnioski 1. Wyniki obecnych badań retrospektywnych wskazują generalnie na niską częstość szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae opornych na różne klasy antybiotyków i jeszcze niższą częstość szczepów wieloopornych wśród tych gatunków. 2. W ostatnich latach odnotowano jednak wzrost częstości szczepów Klebsiella pneumoniae ESBL(+) i Escherichia coli ESBL(+) wieloopornych, w tym z opornością na ciprofloksacynę. Piśmiennictwo 1. Farmer III J.J.: 41. Enterobacteriaceae: Introduction and identification. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R., i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, 636-53. 2. Bopp C.A., Brenner F.W., Fields P.J. et al.: 42. Escherichia, Shigella, and Salmonella. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, 654-71. 3. Abbott S.L.: 44. Klebsiella, Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Plesiomonas, and other Enterobacteriaceae. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. i in. (eds), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, 684-700. 4. Scheutz F., Strockbine N.A.: Genus I. Escherichia Castellani and Chalmers 1919, 941 TAL. W: Bergey s manual of systematic bacteriology, Second Edition, 2005, 2, 607-24. (The Proteobacteria. Part B,,The Gammaproteobacteria, Brenner DJ, Krieg NR, Stanley J.T. eds. volume two). 5. Denton M.: Enterobacteriaceae. Int. J. Antimicrob. Agents, 2007, Suppl.3, 9-22.

272 Tamara Daniluk i inni 6. Nataro J.P., Kaper J.B.: Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev., 1998, 11, 142-201. 7. Gaynes R., Edwards J.R., and the National Nosocomial Infections Surveillance System: Overview of nosocomial infections caused by Gram-negative bacilli. Clin. Infect. Dis., 2005, 41, 848-54. 8. Richards M.J., Edwards J.R., Culver D.H. et al..: Nosocomial infections in medical intensive care units in the United States. Crit. Care Med., 1999, 27, 887-92. 9. Vallis J., Leōn C., Alvarez-Lerma F.: Nosocomial bacteremia in critically ill patients: a multicenter study evaluating epidemiology and prognosis. Clin. Infect. Dis., 1997, 24, 387-95. 10. Twum-Danso K., Grant C., Al-Suleiman S.A. et al.: Microbiology of postoperative wound infections: a pro-spective study of 1770 wounds. J. Hosp. Infect., 1992, 21, 29-37. 11. Fluit A.C., Jones M.E., Schmitz F.J. et al..: Antimicrobial resistance among urinary tract infections (UTI) isolates in Europe: results from the SENTRY antimicrobial surveillance program 1997. Antonie Leeuwenhoek 2000, 77, 147-52. 12. Jones R.N., Kugler K.C., Pfaller M.A., Winokur P.L., and the SENTRY Surveillance Group, North America: Characteristics of pathogens causing urinary tract infections in hospital in North America: results from the SENTRY antimicrobial surveillance program, 1997. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 1999, 35, 55-63. 13. Jorgensen J., Turnidge J.D.: 70. Susceptibility test methods. W: Manual of clinical microbiology, 8th edition, Murray P.R. et al.: (eds.), ASM Press, Washington, D.C. 2003, 1, 1108-27. 14. Drieux L., Brossier F., Sougakoff W. et al.: Phenotypic detection of extended-spectrum β-lactamase production in Enterobacteriaceae: review and bench guide. Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14 (Suppl. 1), 90-103. 15. Bradford P.A.: Extended-spectrum β-lactamases in the 21st Century: characterization, epidemiology, and detection of this important resisitance threat. Clin. Microbiol. Rev., 2001, 14 (4), 933-51. 16. Rossolini G.M., D Andrea M.M., Mugnaioli C.: The spread of CTX-M-type extended spectrum β-lactamases. Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14 (Suppl. 1), 33-41. 17. Grisaru-Soen G., Sweed Y., Lerner-Geva L. et al.: Nosocomial bloodstream infection in a pediatric intensive care unit: 3-year survey. Med. Sci. Monit., 2007, 13 (6), CR 251-57. PMID: 17534230. 18. Clinical and Laboratory Standards Institute. Performance standards for antimicrobial susceptibility testing. 16th Informational Supplement. Document M100-S16. Wayne, PA: CLSI, 2006. 19. Zaremba M.L.: Antybiotykooporność bakterii w regionie wschodnim Polski. Prz. Epidemiol., 2000, 54, 65-75. 20. Zaremba M.L., Ściepuk M., Daniluk T. et al.: Częstość występowania i lekooporność szczepów Escherichia coli i Klebsiella pneumoniae w materiałach klinicznych (1998-2003). Post. Mikrobiol., 2004, 43 (Sup1), 139. 21. Rożkiewicz M., Zaremba M.L., Rożkiewicz D. et al.: Sensitivity rates to Augmentin and Unasyn among Gramnegative bacilli and staphylococci. J. Chemother., 1993, 5 (Suppl n. 1), 24-26. 22. Hyle E.P., Lipworth A.D., Zaoutis T.E. et al.: Risk factors for increasing multidrug resistance among extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella species. Clin. Infect. Dis., 2005, 40, 1317-24. 23. Paterson D.L., Mulazimoglu L., Casellas J.M. et al.: Epidemiology of ciprofloxacin resistance and its relationship to extended-spectrum beta-lactamase production in Klebsiella pneumoniae isolates causing bacteremia. Clin. Infect. Dis., 2000, 30, 473-8. 24. Lautenbach E., Strom B.L., Bilker W.B. et al.: Epidemiological investigation of fluoroquinolone resistance in infections due to extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae. Clin. Infect. Dis., 2001, 33, 1288-94. 25. Tolun V., Kucukbasmaci O., Torumkuney-Akbulut D. et al.: Relationship between ciprofloxacin resistance and extendedspectrum beta-lactamase production in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae strains. Clin. Microbiol. Infect., 2004, 10, 72-5. 26. Ołdak E., Rożkiewicz D., Domański M. et al.: Stosowanie antybiotyków w Dziecięcym Szpitalu Klinicznym z północno-wschodniej Polski w latach 2004-2005. Prz. Pediatr., 2007, 37, 195-200. 27. Kritsotakis E.J., Gikas A.: Surveillance of antibiotic use in hospitals: methods, trends and targets. Clin. Microbiol. Infect., 2006, 12, 701-4. Adres do korespondencji: dr n. med. Tamara Daniluk Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Zakład Mikrobiologii ul. A. Mickiewicza 2C 15-222 Białystok e-mail: mikrob@umwb.edu.pl