PRACA POGLĄDOWA Review Article Acta Haematologica Polonica 2011, 42, Nr 3, str. 435 444 EWA BROJER Mikrochimeryzm związany z transfuzją Transfusion-associated microchimerism Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytut Hematologii i Transfuzjologii, Warszawa Kierownik: Prof. dr hab. med. Ewa Brojer STRESZCZENIE Mikrochimeryzm to stan, w którym w organizmie Ŝywym występuje niewielka populacja komórek pochodzących z genetycznie róŝnej linii komórkowej (z innej zygoty). Dzięki znacznemu postępowi w metodyce badań istnieje obecnie szereg dowodów na występowanie mikriochomeryzmu z przyczyn naturalnych (po ciąŝy) jak i w wyniku działań terapeutycznych (przeszczepienia i przetoczenia krwi). W pracy omówiono metodykę tych badań oraz ich wyniki, dotyczące przede wszystkim mikrochimeryzmu poprzetoczeniowego. Analizy kinetyki leukocytów dawcy we krwi obwodowej biorcy po przetoczeniu wskazują, Ŝe leukocyty obecne w składnikach krwi mają zdolność do ekspansji, lecz ich przeŝycie jest zazwyczaj krótkie (7 lub mniej dni). U chorych po cięŝkich urazach znaleziono jednak wiele dowodów na utrzymywanie się mikrochimeryzmu przez wiele miesięcy, a nawet lat po przetoczeniu. Wykazano, Ŝe mikrochimeryzm występuje zarówno po składnikach krwi zuboŝonych, jak i niezuboŝonych w leukocyty, lecz na ogół dotyczy krwi stosunkowo świeŝej. Mikrochimeryzm poprzetoczeniowy obserwowano w róŝnych liniach komórkowych limfocytach T, B, komórkach NK i w liniach mieloidalnych. ZagnieŜdŜeniu w organizmie biorcy ulegają na ogół komórki jednego lub dwóch dawców nawet, gdy choremu przetoczono wiele jednostek krwi. Wydaje się, Ŝe stopień zgodności w HLA między biorcą i dawcą ma pewne znaczenie dla powstania mikrochimeryzmu poprzetoczeniowego, lecz dokładne mechanizmy tego zjawiska nie są poznane. Znaczenie kliniczne i patogenetyczne mikrochimeryzmu teŝ nie jest jasne. Być moŝe ma on znaczenie dla rozwoju niektórych chorób o podłoŝu autoimmunologicznym czy nowotworowym; jego rola jest korzystna w czasie ciąŝy (tolerancja immunologiczna płodu, być moŝe naprawa zranionych tkanek matki w ciąŝy). SŁOWA KLUCZOWE: Mikrochimeryzm Przetoczenie krwi CiąŜa. SUMMARY Microchimerism (MC) is the presence in a living organism of a small population of cells that originate from a genetically different cell line (from another zygote). Significant advancement in research methodology has supplied plenty of evidence on the occurrence of MC following pregnancy or as result of transplantation and blood transfusion therapy. This paper discusses methods and results of transfusion associated microchimerism ( TA MC). The analysis of the post transfusion kinetics of donor leukocytes in peripheral blood of the recipient shows that despite their ability to expand their survival time is usually short (7 days or less). There is however some evidence to support the persistence of MC in patients transfused after severe trauma up to several months or even years. MC has been reported to occur both after leukodepleted and nonleukodepleted blood components though it is generally associated with transfusion of relatively fresh blood. TA MC was observed in different cell lines of T, B lymphocytes, NK cells as well as myeloid cell lines. Even after blood transfusions from several donors the cells of one or two of them were detected in the recipient. Although it seems that the HLA donor / recipient compatibility is an important factor for TA MC, the precise mechanisms as well as immunological consequences of this phenomenon are still unkown. Unclear is also the clinical significance and pathogenicity of microchimerism. Under consideration is the importance of MC for the development of some autoimmune diseases or cancer as well as the beneficial role it plays in pregnancy (eg. for immunological tolerance of the fetus or possibly maternal tissue repair). KEY WORDS: Microchimerism Blood transfusion Pregnancy.
436 E. BROJER Mikrochimeryzm [MC] występowanie Stan, w którym w jednym organizmie Ŝywym występują komórki naleŝące do więcej niŝ jednej, genetycznie róŝnej linii komórkowej, czyli pochodzące z więcej niŝ jednej zygoty nazywany jest chimeryzmem. W przypadku, gdy komórki pochodzące z jednej z zygot stanowią jedynie małą część wszystkich komórek ustroju mówimy o stanie mikrochimeryzmu. Jak wynika z definicji stan ten moŝe być obserwowany w przypadkach gdy jest moŝliwość przeniknięcia komórek jednego organizmu Ŝywego do innego. W naturze sytuacja taka występuje w czasie ciąŝy. MoŜliwość wystąpienia mikrochimeryzmu dają teŝ działania terapeutyczne takie jak przeszczepienia komórek krwiotwórczych i organów oraz w przetoczenia krwi. Zainteresowanie mikrochimeryzmem w hematologii w ciągu wielu lat dotyczyło przede wszystkim monitorowania stanu chorych po przeszczepieniach, bo jest on do tego celu uŝywany przez wszystkie zespoły zajmujące się tą dziedziną medycyny [1, 2]. Postęp w metodach badań molekularnych rozszerzył moŝliwości wykrywania mikrochimeryzmu ze względu na podwyŝszoną czułość metod [3, 4]. Dał moŝliwość badań tzw. chimeryzmu liniowego, czyli występowania komórek pochodzących z dwóch organizmów w poszczególnych liniach komórkowych, a takŝe badań wczesnego chimeryzmu. Oczekuje się, Ŝe pozwoli to na dokładniejsze monitorowanie chorych szczególnie pod względem wznowy choroby, co jest szczególnie istotne ze względu na coraz powszechniejsze stosowanie niemieloablacyjnych procedur przygotowania do przeszczepienia [5]. DuŜe zainteresowanie wzbudza chimeryzm związany z ciąŝą [6, 7], a takŝe związany z przetoczeniem krwi [8 32], który jest zasadniczym przedmiotem obecnego opracowania. RozwaŜa się czy i w jakich sytuacjach mikrochimeryzm ma działanie immunomodulacyjne, czy moŝe być podłoŝem chorób z autoagresji, czy chorób nowotworowych. DuŜo uwagi poświęca się teŝ zjawisku tolerancji immunologicznej, którą powoduje stan mikrochimeryzmu dyskutuje się nawet czy zjawisko to moŝe być wykorzystane w celach lecznicych [33]. Mikrochimeryzm po przetoczeniu krwi (TA MC) Analizy MC metodami immunologicznymi oraz klasycznymi metodami cytogenetycznymi i molekularnymi JuŜ w latach 70-tych ubiegłego pojawiły się prace wskazujące na moŝliwość występowania i długotrwałego utrzymywania się stanu chimeryzmu poprzetoczeniowego (Tabela 1). Wykazano, Ŝe podczas przetoczenia krwi dochodzi do przekazywania do organizmu biorcy z ujemnym odczynem tuberkulinowym reaktywności w stosunku do tuberkuliny [21]. Podejrzewano, Ŝe przekaźnikiem tego sygnału są limfocyty dawcy, które zagnieŝdŝają się w organizmie biorcy. W kolejnych pracach zaobserwowano, na podstawie badań kariotypu, Ŝe po przetoczeniu krwi od matki do noworodka płci męskiej komórki bez Tabela 1. Wczesne badania dotyczące mikrochimeryzmu po przetoczeniu krwi Table 1. Early studies of transfusion associated microchimerism Obserwacje Przeniesienie reaktywności w odczynie tuberkulinowym po przetoczeniu krwi osobie z ujemnym odczynem tuberkulinowym od dawcy z dodatnim (6 chorych) Wykrywanie komórek o Ŝeńskim kariotypie u dzieci płci męskiej, ktrym przetoczono krew matek; dwuletnie obserwacje Dowody na proliferację komórek dawcy w organizmie biorcy (hodowla limfocytów z zastosowaniem analizy izotopowej) Limfocyty dawcy nie przeŝywają dłuŝej niŝ 6 dni u osób bez immunosupresji; badania u 20 kobiet po zabiegach chirurgicznych Mohr i wsp. [21] Hutchinson i wsp. [12] Schechter i wsp. [23, 24] Adams i wsp. [8]
Mikrochimeryzm związany z transfuzją 437 chromosomu Y są obecne w jego organizmie przez okres obserwacji dochodzący aŝ do dwóch lat [12]. Schechter i wsp. [23, 24] wykazali przy pomocy metody mieszanej hodowli limfocytów z zastosowaniem metod izotopowych, Ŝe przetoczone leukocyty przez okres 7 dni po przetoczeniu proliferują w organizmie biorcy. Ograniczeniem badań nad mikrochimeryzmem po przetoczeniu była bardzo mała czułość dostępnych metod. Spośród dostępnych metod chimeryzm poprzetoczeniowy badano początkowo metodami klasycznymi oceny kariotypu. Wydawało się, Ŝe zastosowanie do badań technik molekularnych opartych na technice PCR zasadniczo rozszerzy moŝliwości badawcze. Okazało się jednak, Ŝe klasyczna metodologia PCR, w której oceny wyniku dokonuje się na podstawie analizy produktu amplifikacji po jego elektroforezie i wybarwieniu bromkiem etydyny jest zbyt mało czuła by wykryć stan mikrochimeryzmu obecność < 5% komórek zawierających DNA dawcy w organizmie biorcy po przetoczeniu krwi. Bardziej czułe były metody oparte na technice short tandem repeats (STR), bo umoŝliwiały wykrycie 1% komórek dawcy [14]. DuŜą czułością cechowała się teŝ metoda FISH, lecz pozwalała tylko oceniać pary dawca biorca róŝniące się płcią. Techniki RQ PCR w badaniach chimeryzmu poprzetoczeniowego W latach 90-tych weszły do uŝycia techniki real-time PCR (tzw. RQ-PCR) o znacząco większej czułości niŝ klasyczna reakcja PCR, które pozwalają dodatkowo na ilościową ocenę liczby kopii badanego DNA w próbce. RQ-PCR stanowi obecnie podstawową metodę amplifikacji kwasów nukleinowych. W laboratoriach IHiT jest ona stosowana od roku 1998, między innymi do nieinwazyjnych badań wykrywania genów kodujących antygeny płodu w wolnym DNA płodu krąŝącym w osoczu kobiety cięŝarnej [34, 35], a takŝe do badań chimeryzmu poprzeszczepowego [4]. Przy obu zastosowaniach waŝnym i trudnym do rozwiązania zagadnieniem jest znalezienie sekwencji nukleotydów DNA, którymi róŝnią się dwa organizmy poddawane badaniom. Dla wykrywania mikrochimeryzmu (definiowanego jako odsetek komórek <5%) konieczne jest zastosowanie metody czułej i bardzo swoistej. WaŜne jest by zastosowane startery i sondy nie powodowały nieswoistej, nawet na śladowym poziomie, amplifikacji DNA, który obecny jest w przewaŝającej ilości, (czyli DNA biorcy krwi, gdy badamy TA-MC, DNA matki gdy szukamy u niej komórek płodu lub DNA dziecka gdy badamy u niego chimeryzm od matki). Badania chimeryzmu techniką RQ- PCR, najczulsze i najbardziej swoiste z dotychczas stosowanych oparte są na analizie polimorfizmów typu inercja/delecja genu lub fragmentu genu [2, 4, 16]. Prowadzi się ją w oparciu o tzw. technologię TaqMan. Powszechnie stosowanymi polimorfizmami, do których projektuje się sondy i startery pochodzą z chromosomu Y. Przy braku róŝnicy płci koniczne jest znalezienie polimorfizmu typu delecja/inercja genu lub fragmentu genu, który odróŝnia dawcę i biorcę, czy matkę i dziecko. Strategię taką opisali Alizadeh i wsp. [3]. Jest ona stosowana w badaniach TA-MC [9, 16, 19, 22, 26 30]. W badaniach prowadzonych w IHiT zestaw primerów i sond uŝywanych dla rozróŝnienia dwóch badanych organizmów uŝywany przez Alizadeh i wsp. [3] został rozszerzony do 21 polimorfizmów tego typu [4, 34]. Inni autorzy badający chimeryzm potransfuzyjny dodatkowo stosują startery i sondy dla polimorfizmów genu HLA DR [13, 17, 18 26, 30]. NaleŜy brać pod uwagę, Ŝe badania chimeryzmu poprzetoczeniowego oparte na róŝnicach w HLA DR mogą mieć istotne ograniczenia, ze względu na udział cząsteczek HLA w odpowiedzi immunologicznej. Zgodność antygenów HLA DR jest istotna dla powstawania tolerancji immunologicznej, które to zjawisko powinno sprzyjać powstawaniu chimeryzmu. Zastosowanie analizy polimorfizmów HLA DR do wykrywania chimeryzmu w takich przypadkach moŝe spowodować jego nie wykrycie wyniki badań mogą więc być zaniŝone. Wykazano to w pracy Lee i wsp. [16]. Chimeryzm poprzetoczeniowy badano teŝ przy pomocy techniki opartej na analizie polimorfizmów STR (short tandem repeats) z zastosowaniem automatycznego sekwenatora. Jej czułość określano na ok. 1% [14].
438 E. BROJER Wykrywanie leukocytów dawcy we krwi obwodowej biorcy po przetoczeniu Obserwacje dotyczące wczesnego okresu po przetoczeniu krwi (wczesny chimeryzm poprzetoczeniowy) Pierwsze badania z zastosowaniem metody RQ PCR do badań nad kinetyką zmian liczby leukocytów dawców w krwi obwodowej biorcy były wykonywane przez stosunkowo krótki okres po przetoczeniu składników krwi nie poddawanych leukoredukcji, bo takie były ówcześnie stosowane (Tabela 2). Wykazano, Ŝe w ciągu pierwszych kilku dni po przetoczeniu zostaje usuniętych z krwiobiegu biorcy 99,9% przetoczonych leukocytów dawcy [17]. W kolejnych kilku dniach (na ogół od 3 7 dnia) dochodzi do przejściowego, trwającego kilka dni ~10 krotnego wzrostu koncentracji tych komórek, po czym następuje całkowite ich usuniecie z krwioobiegu biorcy [17]. Tabela 2. Mikrochimeryzm poprzetoczeniowy (TA-MC) wybrane dane literaturowe Table 2. Transfusion associated microchimerism selected literature data Badani chorzy Wystąpienie TA-MC; podsumowanie obserwacji 5 kobiet po operacjach 99.9% leukocytów dawcy zostaje ortopedycznych usuniętych w 2 dni po przetoczeniu, a po 3 5 dniach następuje przejściowy 10 krotny wzrost liczby leukocytów dawcy 93 kobiet zakaŝonych u 5/47 u chorych, które otrzymały HIV niefiltrowane KKCz wykrywano MC przez 2 tygodnie, ale nie wykrywano po 4 tygodniach. U Ŝadnej z 46 kobiet, które otrzymywały filtrowane KKCz nie wykrywano MC 8 kobiet po operacjach -u 6/ 8 kobiet po przetoczeniu w CD4 + w dniu 3 lub 5 (od 0,01 1 komórki/µl), komórki dawcy zanikały w 14 dniu. 10 chorych po cięŝkich urazach i transfuzjach 4-8 jednostek stosunkowo świeŝej krwi 45 chorych po cięŝkich urazach 67 chorych po cięŝkich urazach u 7/ 10 kobiet we wszystkich liniach komórkowych (CD4, CD8, CD15, CD19) przez 6-18 miesięcy po przetoczeniu (od 10 do 100 komórek/µl). U 2 badanych stwierdzono brak lub bardzo niską odpowiedź w MLC na limfocyty dawcy, który był źródłem chimeryzmu. u 24/45 (53%); Brak wpływu wieku, płci chorych, rodzaju składnika (filtrowane/niefiltrowane) czas od przetoczenia splenektomia, liczba jednostek. u 9/ 32 (28%) chorych otrzymujących niepoddawane filtracji KKCz i u 13/35 (37%) chorych otrzymujących zuboŝone KKCz. Obserwacje 40 dni (116 360) Metoda wykrywania TA-MC i badań dodatkowych RQ PCR do genów chromosomu Y i alleli HLA klasy II; obserwacje do 5 dni po transfuzji RQ PCR do genów chromosomu Y i alleli HLA klasy II; obserwacje do 5 dni po przetoczeniu RQ PCR do genów chromosomu Y i alleli HLA klasy II; badano kinetykę chimeryzmu w 1-14 dni po przetoczeniu w CD4, CD8 (limf T), CD15 (linia mieloidalna) i CD19 (limf B) RQ PCR do genów chromosomu Y i alleli HLA klasy II; badano MC przez 6-18 miesięcy po przetoczeniu w CD4, CD8 (limf T), CD19 (limf B) i CD15; Typowanie HLA -PCR HLA; Reaktywność w MLR (mixed leukocyte reaction) między biorcą, a dawcą, którego linfocyty uległy wszczepieniu RQ PCR do genów chromosomu Y i alleli HLA klasy II; RQ PCR z primerami do polimorfizmów typu ins/del albo HLA-DR Literatura Lee i wsp. [17] Kruskall i wsp. [13] Lee i wsp. [18] Utter i wsp. [30] Utter i wsp. [26]
Mikrochimeryzm związany z transfuzją 439 Chore po operacjach z powodu nowotworu 163 weteranów wojen w Wietnamie, Korei i II Wojny Światowej u 8/18 chorych; obserwacje do 28 dni po przetoczeniu. TA-MC obserwowano tylko po nieubogoleukocytarnych KKCz u 16/163 (9,8%) weteranów u 7% weteranów II Wojny Swiatowej, 18% weteranów wojny w Korei i 7% wojny w Wietnamie u 1/150 (0,7%) dawców krwi w tym samym wieku bez transfuzji TA MC wykrywa się nawet po 60 latach po przetoczeniu > wskazuje to na wszczepienie; u osob którzy nie mieli transfuzji MC jest rzedko obserwowany. 26 rannych Ŝołnierzy u 10/22 (45%); TA-MC zarówno po świeŝej pełnej krwi i płytkach z aferezy jak i po KKCz STR sekwenator kapilarny RQ PCR z primerami do polimorfizmów ins/del lub z locus HLA-DR. RQ PCR z primerami do polimorfizmów ins/del lub z locus HLA-DR. Lapierre i wsp. [14] Utter i wsp. [29] Dunne i wsp. [9] Przejściowy charakter stanu mikrochimeryzmu potwierdzano teŝ w innych pracach. Kruskall i wsp. [13] u chorych poddanych transfuzji składnikami niezuboŝonymi w leukocyty, w tym u osób z upośledzona odpornością wykazywali, Ŝe 4 tygodnie po przetoczeniu, u biorcy nie wykrywa się leukocytów dawcy. Lapierre i wsp. [14] obserwowali wczesny chimeryzm (obserwacje prowadzono tylko do 28 dnia po przetoczeniu) u 8 z 18 chorych u chorych po zabiegach chirurgicznych z powodu nowotworu, po przetoczeniach nieubogoleukocytarnych koncentratów krwinek czerwonych. W tych badaniach u Ŝadnego z chorych leczonych koncentratem ubogoleukocytarnym nie wykryto DNA dawcy w DNA izolowanym z krwi biorcy. Zespół kierowany przez M. Buscha [18] analizował chimeryzm liniowy (wykrywanie leukocytów dawcy w róŝnych subpopulacjach komórek) u kobiet po zabiegach chirurgicznych, które otrzymały transfuzje. Obserwacje prowadzono do 14 dnia po przetoczeniu. Wykazano, Ŝe krótkotrwałe przetrwanie i ekspansja komórek dawcy w organizmie biorcy dotyczyła przede wszystkim limfocytów T CD4+. U niektórych chorych obserwowano teŝ krótkotrwałą ekspansję limfocytów T CD8+ i limfocytów B CD19+ w okresie między 3 a 5 dniem po przetoczeniu, a u części z nich nastąpiła teŝ ekspansja w populacji komórek linii mieloidalnej CD15+ (w 3 lub 4 dniu po transfuzji); zanikła ona w 7 dniu po przetoczeniu. Wszystkie subpopulacje limfocytów dawcy przestały być wykrywalne po 14 dniach po przetoczeniu. Długo utrzymujący się mikrochimeryzm po przetoczeniu krwi Zespół kierowany przez M. Buscha [18] zajmował się kinetyką zmian liczby leukocytów dawcy w organizmie biorcy nie tylko we wczesnym okresie po przetoczeniu, lecz prowadził obserwacje w okresie odległym. Zaskakujące były wyniki badań u kobiet po cięŝkich urazach. Chore obserwowano aŝ do 1,5 roku po zabiegu i wykazano utrzymywanie się mikrochimeryzmu przez wiele miesięcy po przetoczeniu krwi. Wykazano, Ŝe u 7 spośród 10 kobiet, które otrzymały przetoczenie od >2 dawców komórki dawcy naleŝące do wszystkich linii (CD4, CD8, CD15, CD19) przetrwały przez 6 miesięcy do 1,5 roku. Liczba komórek z DNA dawcy wzrastała od 1/10 000 1/1 milion w momencie, gdy chora opuszczała szpital do 0,4 4,9/ 100 w okresie następnych kilkudziesięciu miesięcy (mediana obserwacji 25 miesięcy) [18]. W ostatnio opublikowanych pracach dotyczących chorych po urazach wykazano, Ŝe TA MC wykrywa się nawet po 60 latach po przetoczeniu [29].
440 E. BROJER W szeregu prac dotyczących TA MC wykazywano, mimo, Ŝe biorcy krwi otrzymywali składniki krwi od wielu dawców, wśród komórek biorcy znajdowano na ogół komórki tylko jednego lub dwóch z nich [19, 22]. Wykazano, Ŝe dawca, którego komórki znajdowano we krwi biorcy miał te same allele HLA DR, co biorca. Nie znaleziono Ŝadnego czynnika predykcyjnego dla rozwoju TA-MC nie była nim liczba transfuzji, płeć chorego, cięŝkość urazu, wykonanie splenektomii [18, 22]. Jedynym czynnikiem zwiększającym ryzyko powstania chimeryzmu poprzetoczeniowego był wiek składnika krwi czas miedzy pobraniem krwi od dawcy, a przetoczeniem składnika krwi. Składniki krwi, z których pochodziły limfocyty, które uległy wszczepieniu i spowodowały mikrochimeryzm były stosunkowo świeŝe [< 14 dni od pobrania]. W innej pracy MC obserwowano teŝ po przetoczeniu trzytygodniowych koncentratów krwinek czerwonych (KKCz) podanych leukoredukcji [15]. To, Ŝe TA-MC występuje równieŝ po transfuzji składników krwi poddanych leukoredukcji [22, 26, 30] podkreśla się w większości prac na ten temat. TA-MC był obserwowany u 28% chorych, którzy dostali składniki krwi niepoddane leukoredukcji i u 37% chorych, którzy otrzymali składniki filtrowane [26]. Osobnej uwagi wymaga analiza występowania u analizowanych chorych mikrochimeryzmu pochodzącego z okresu płodowego lub z okresu ciąŝy. W większości prowadzonych badań u Ŝadnego z chorych nie wykrywano mikrochimeryzmu przed przetoczeniem, co wyklucza takie zjawisko. W pracy Fiesland i wsp [15] u 3/20 badanych chorych stwierdzono przed przetoczeniem obecność komórek nienaleŝących do biorcy krwi i pochodzących prawdopodobnie z okresu płodowego. W ostatnio opublikowanej pracy dotyczącej MC u weteranów wojen (II światowej, wojny w Korei i w Wietnamie) u 0,7% dawców krwi z grupy kontrolnej, którzy nigdy nie mieli przetoczeń wykryto komórki świadczące o istnieniu u nich chimeryzmu [29]. Mechanizmy immunologiczne związane z mikrochimeryzmem poprzetoczeniowym Mechanizmy immunologiczne, które prowadzą do TA-MC i zjawiska immunologiczne, będące jego skutkiem są, jak dotąd, mało poznane. Stwierdzono, Ŝe chorzy z mikrochimeryzmem poprzetoczeniowym w porównaniu z tymi, u których go nie obserwowano mają upośledzoną immunologiczną odpowiedź komórkową, co objawia się obniŝoną odpowiedzią ich limfocytów na mitogeny [28]. W badaniach przy pomocy mieszanej hodowli limfocytów wykazano, Ŝe limfocyty od biorców krwi, u których po transfuzji doszło do mikrochimeryzmu cechowały się obniŝoną aktywnością w stosunku do limfocytów tych dawców, których komórki ulegały wszczepieniu [18, 22] w porównaniu do ich aktywności do limfocytów pozostałych dawców. Są pewne przesłanki, Ŝe czynniki genetyczne dotyczące białek uczestniczących w odpowiedzi immunologicznej np TNF (polimorfizm nukleotydu w pozycji 308) [10] mogą odgrywać rolę w powstawaniu chimeryzmu. Lapierre i wsp. [14] stwierdzili, Ŝe po przetoczeniach nieubogoleukocytarnych koncentratów krwinek czerwonych u chorych po zabiegach chirurgicznych z powodu nowotworu następowało przejściowe, krótko trwające zmniejszenie produkcji produkcji IL-10 przez limfocyty stymulowane fitohemaglutyniną (PHA), po czym autorzy wykazali zwiększenie jej produkcji, ale tylko u chorych z TA-MC. Wskazuje to na stymulację komórek regulatorowych T typu Tr1, które moŝe mieć znaczenie immunosupresyjne poprzez hamowanie limfocytów Th Typu 1, a tym samym moŝe wpływać na wywoływanie zjawiska tolerancji immunologicznej. Dodatkowo u chorych, u których wykryto mikrochimeryzm wykazano obniŝone zróŝnicowanie repertuaru TCR, co wskazuje na obniŝoną zdolność do pobudzenia układu immunologicznego. Wykazano teŝ zmniejszenie liczby komórek CD56+ (NK natural killer). Autorzy omawianej pracy prowadzili obserwacje chorych tylko do 28 dnia po przetoczeniu. Badania Kruskall i wsp. [13] techniką mieszanej hodowli leukocytów (MLR mixed lymplocyte reaction) wykazały, Ŝe komórki biorcy w bardzo niskim stopniu ulegały stymulacji pod wpływem limfocytów dawcy, którego komórki uległy wszczepieniu po transfuzji. Wskazywało to, Ŝe długotrwały chimeryzm potransfuzyjny powoduje powstanie wzajemnej tolerancji między leukocytami dawcy i biorcy.
Mikrochimeryzm związany z transfuzją 441 Mikrochimeryzm w czasie ciąŝy Mikrochimeryzm występujący naturalnie, czyli ten związany z ciąŝą musi być zawsze brany pod uwagę, jaki czynnik interferujący przy badaniach chimeryzmu poprzetoczeniowego, dlatego ostatni rozdział tego opracowania będzie mu poświęcony. Zagadnienia dotyczące chimeryzmu związanego z ciąŝą poruszone w tym rozdziale szczegółowo opisują Gammill i wsp. [7]. W czasie ciąŝy następuje przechodzenie i zagnieŝdŝanie się komórek matki w organizmie płodu [MM maternal microchimerism] i odwrotnie komórek płodu w organizmie matki [FM fetal microchimerism]. W przypadkach ciąŝy mnogiej moŝe dodatkowo dochodzić do wzajemnego zagnieŝdŝania się komórek pochodzących od płodów, a takŝe zagnieŝdŝenie się u płodu komórek wcześniej urodzonego przez kobietę dziecka. Są teŝ doniesienia o mikrochimeryzmie u kobiet, które nigdy nie urodziły dziecka, lecz które przeszły aborcję. Nie jest do końca wyjaśnione, w jaki sposób i kiedy komórki płodu przechodzą do matki. Nie jest teŝ jasne, jaki stopień zróŝnicowania mają komórki, które zagnieŝdŝają się w jej organizmie. Mikrochimeryzm zarówno matczyny jak i płodowy jest obserwowany w róŝnych liniach komórkowych (limfocytarnej B CD19+, monocytarno makrofagowej CD14+, NK CD56+/CD16+ i wśród komórek progenitorowych CD34+). Nie wiadomo, czy te właśnie komórki przechodzą z organizmu matki do płodu i odwrotnie, czy powstają one w wyniku róŝnicowania komórek o niskim stopniu zróŝnicowania, które ulegają zasiedleniu. Są prace wykazujące, Ŝe proces przechodzenia komórek przez łoŝysko nasila się w czasie trwania ciąŝy i jest związany z uszkodzeniami łoŝyska. Są teŝ jednak doniesienia mówiące o tym, Ŝe większość komórek płodowych, które wykrywa się u matki przechodzi do jej organizmu w bardzo wczesnych etapach ciąŝy, kiedy znaczną część komórek płodu stanowią komórki o niskim stopniu zróŝnicowania, które wykazują oporność na proces apoptozy. Liczba takich komórek spada wraz z wiekiem ciąŝy. ZagnieŜdŜają się one w szpiku skąd mogą migrować do róŝnych narządów i podlegać róŝnicowaniu. Mogą odgrywać rolę w naprawie uszkodzonych narządów cięŝarnej. Interesującą pracę na ten temat opublikowali ostatnio Sunami i wsp. [6]. W określonych dniach od początku ciąŝy myszom usuwano macice wraz z płodem. Bez względu na to, w którym dniu ciąŝy dokonano tego zabiegu, przed jego wykonaniem w organizmie matki wykrywano komórki płodu jedynie w szpiku. Większość komórek płodowych miało cechy komórek hematopoetycznych linii neutrofili, ale były wśród nich teŝ komórki o niskim stopniu zróŝnicowania. U określonej grupy myszy dokonano podwiązania lewej tętnicy wieńcowej i tętnicy szyjnej, co prowadziło do utworzenia modeli niedokrwiennego uszkodzenia prowadzącego do zawału i udaru mózgu. Uszkodzone i zagroŝone zawałem tkanki, bez względu na to, w jakim czasie u myszy dokonano usunięcia macicy naciekały komórkami pochodzącymi od płodu, które ulegały róŝnicowaniu w kierunku komórek odpowiednich organów; stawały się hepatocytami, komórkami mięśnia serca, czy komórkami nerwowymi. Wyniki te wskazują, Ŝe komórki płodu dostają się do organizmu matki we wczesnym okresie ciąŝy. Mogą się one następnie gromadzić w tkankach matki i uczestniczyć w ich naprawie, co moŝe mieć znaczenie w leczeniu pewnych chorób, które wystąpiły w czasie ciąŝy. Konsekwencje długotrwałego mikrochimeryzmu Utrzymywanie allogenicznych leukocytów po ciąŝy, a prawdopodobnie teŝ po przetoczeniach, mo- Ŝe mieć prawdopodobnie wielostronne, odległe skutki. Nie są one jeszcze dostatecznie poznane. Podejrzewa się, Ŝe mikrochimeryzm moŝe prowadzić do powstawania autoimmunizacji, choć mechanizm tego zjawiska jest niejasny [7, 36, 37]. Być moŝe obecność populacji komórek immunologicznie aktywnych pochodzących z róŝnych organizmów moŝe wywoływać rozregulowanie układu odpornościowego jedynie w pewnych warunkach zewnętrznych, takich jak na przykład jednoczesne zakaŝenie. Wydaje się, Ŝe komórki, które w wyniku mikrochimeryzmu znalazły się w tkankach gospodarza mogą stać się celem lub wyzwalaczem chorób autoimmunologicznych [7, 16]. Zjawisko tolerancji immunologicznej związane z MC moŝe teŝ odgrywać rolę w autoimmunizacji.
442 E. BROJER Wiadomo, Ŝe skutkiem mikrochimeryzmu moŝe być bardzo rzadko występujące, lecz często śmiertelne powiklanie poprzetoczeniowe TA-GVHD [38]. Jego podloŝem patofizjologicznym jest zasiedlenie immunokompetentnych limfocytów T dawcy w organizmie biorcy. TA-GvHD grozi głównie chorym z obniŝona odpornością, ale moŝe wystąpić teŝ u pacjentów immunokompetentnych, których HLA jest wystarczająco zgodny z HLA dawcy by układ immunologiczny nie rozpoznał go jako obcy i nie zniszczył przy pomocy mechanizmów odporności komórkowej. Praktycznie, taka sytuacja jest moŝliwa, gdy dawca jest homozygotą pod względem haplotypu HLA, w którym biorca jest heterozygotą. Kierunki dalszych badań W dziedzinie badań nad chimeryzmem istnieje wiele zagadnień czekających na wyjaśnienie. Zespół pracujący pod kierunkiem M Buscha [22], który najszerzej się tym zagadnieniem zajmuje zadaje na ten temat następujące pytania: 1. Dlaczego mikrochimeryzm potransfuzyjny obserwowano z tak duŝą częstością u chorych po cięŝkich urazach, a nie u innych grup chorych; czy jest to wynikiem zbyt małej czułości metod? 2. Dlaczego TA MC obserwuje się tylko u niektórych chorych, a u innych komórki dawcy ulegają szybkiemu zniszczeniu? 3. Jakie są skutki TA MC czy u chorych występuje przewlekle GvHD, czy obserwuje się u nich zwiększoną zapadalność na choroby autoimmunologicznme, czy obserwuje się upośledzenie układu immunologicznego? 4. Czy TA-MC u chorych po cięŝkich urazach wynika ze wszczepienia na poziomie krwiotwórczych komórek macierzystych, czy moŝe nawet bardziej prymitywnych mezenchymalnych komórek macierzystych? Praca w ramach grantu MNiSW Nr NN 402285236 PIŚMIENNICTWO 1. Dawidowska M, Wachowiak J, Witt M. Molecular methods for diagnostics and assessment of treatment effectiveness in modern pediatric hematooncology. Postępy Biochem 2006; 52: 408-16. 2. Dawidowska M, Guz K, Brojer E, Wachowiak J, Witt M. Chimeryzm po alogenicznej transplantacji macierzystych komórek krwiotwórczych. Hematologia molekularna patogeneza, patomechanizmy i metody badawcze. Red. Witt M, Szczepański T, Dawidowska M. Ośrodek Wyd Nauk 2009; 177-194. 3. Alizadeh M, Bernard M, Danic B i wsp. Quantitative assessment of hematopoietic chimerism after bone marrow transplantation by real-time quantitative polymerase chain reaction. Blood 2002; 99: 4618 4625. 4. Guz K, Smalarczyk-Wodzyńska J, Dawidowska M i wsp. Ocena chimeryzmu po przeszczepieniu allogenicznych komórek krwiotwórczych przy pomocy metody RQ-PCR standaryzacja metody i porównanie z techniką STR-PCR. Acta Haematol Pol 2010; 41: 4. 5. Baron F, Sandmaier B M. Chimerism and outcomes after allogeneic hematopoietic cell transplantation following nonmyeloablative conditioning. Leukemia 2006; 20: 1690 1700. 6. Sunami R, Komuro M, Tagaya H, Hirata S. Migration of microchimeric fetal cells into maternal circulation before placenta formation. Chimerism 2010; 1: 66-68. 7. Gammill HS Nelson J. Lee NJ. Naturally acquired microchimerism. Int J Dev Biol 2010; 54: 531 543. 8. Adams PT, Davenport RD, Reardon DA, Roth MS. Detection of circulating donor white blood cells in patients receiving multiple transfusions. Blood 1992; 80: 551 5. 9. Dunne JR, Lee TH, Burns C, Cardo LJ, Curry K, Busch MP. Transfusion-associated microchimerism in combat casualties. J Trauma 2008; 64: S92-7. 10. Gill RM, Lee TH, Utter GH i wsp. TNF (-308A) polymorphism is associated with microchimerism in transfused trauma patients. Blood 2008; 111: 3880-3.
Mikrochimeryzm związany z transfuzją 443 11. Giroti RI, Biswas R, Mukherjee K. Restriction fragment length polymorphism and polymerase chain reaction: HLA- DQA1 and polymarker analysis of blood samples from transfusion recipients. Am J Clin Pathol 2002; 118: 382 387. 12. Hutchinson DL, Turner JH, Schlesinger ER. Persistence of donor cells in neonates after fetal and exchange transfusion. Am J Obstet Gynecol 1971; 109: 281 284. 13. Kruskall MS, Lee TH, Assmann SF, Laycock M, Kalish LA, Lederman MM, Busch MP: Survival of transfused donor white blood cells in HIV-infected recipients. Blood 2001; 98: 272 279. 14. Lapierre V, Aupérin A, Robinem E i wsp. Immune modulation and microchimerism after unmodified versus leukoreduced allogeneic red blood cell transfusion in cancer patients: results of a randomized study. Transfusion 2007; 47: 1691 1699. 15. Flesland O, Ip LS, Storlien AS, Spurkland A, Larsen J, Solheim BG. Microchimerism in immune competent patients related to the leukocyte content of transfused red blood cell concentrates. Transfusion and Apheresis Science 2004; 31: 173-180. 16. Lee TH, Chafets DM, Reed W, Wen L, Yang Y, Chen J, Utter GH, Owings JT, Busch MP. Enhanced ascertainment of microchimerism with real-time quantitative polymerase chain reaction amplification of insertion-deletion polymorphisms. Transfusion 2006; 46: 1870 1878. 17. Lee TH, Donegan E, Slichter S, Busch MP. Transient increase in circulating donor leukocytes after allogeneic transfusions in immunocompetent recipients compatible with donor cell proliferation. Blood 1995; 85: 1207 14. 18. Lee TH, Paglieroni T, Ohto H, Holland PV, Busch MP. Survival of donor leukocyte subpopulations in immunocompetent transfusion recipients: frequent long-term microchimerism in severe trauma patients. Blood 1999; 93: 3127 3139. 19. Lee TH, Paglieroni T, Utter GH, Chafets D, Gosselin RC, Reed W, Owings JT, Holland PV, Busch MP. High-level longterm white blood cell microchimerism after transfusion of leukoreduced blood components to patients resuscitated after severe traumatic injury. Transfusion 2005; 45: 1280 1290 20. Lee TH, Reed W, Mangawang-Montalvo L, Watson J, Busch MP. Donor WBCs can persist and transiently mediate immunologic function in a murine transfusion model: effects of irradiation, storage, and histocompatibility. Transfusion 2001; 41: 637 642. 21. Mohr J, Killebrew L, Muchmore H, Felton F, Rhoades E. Transfer of delayed hypersensitivity: the role of blood transfusions in humans. JAMA 1969; 207: 517 519. 22. Reed W, Lee TH, Norris PJ, Utter GH, Busch MP. Transfusion-associated microchimerism: a new complication of blood transfusions in severely injured patients. Semin Hematol 2007; 44: 24 31. 23. Schechter GP, Soehnlen F, McFarland W. Lymphocyte response to blood transfusion in man. N Engl J Med 1972; 287: 1169 73. 24. Schechter GP, Whang-Peng J, McFarland W. Circulation of donor lymphocytes following blood transfusion in man. Blood 1977; 49: 651 6. 25. Turner JH, Hutchinson DL, Petricciani JC. Chimerism following fetal transfusion. Report of leucocyte hybridization and infant with acute lymphocytic leukaemia. Scand J Haematol 1973; 10: 358 366. 26. Utter GH, Nathens AB, Lee TH, Reed WF, Owings JT, Nester TA, Busch MP. Leukoreduction of blood transfusions does not diminish transfusion-associated microchimerism in trauma patients. Transfusion 2006; 46: 1863 1869. 27. Utter GH, Owings JT, Lee TH, Paglieroni TG, Reed WF, Gosselin RC, Holland PV, Busch MP. Blood transfusion is associated with donor leukocyte microchimerism in trauma patients. J Trauma 2004; 57: 702 707. 28. Utter GH, Owings JT, Lee TH, Paglieroni TG, Reed WF, Gosselin RC, Holland PV, Busch MP: Microchimerism in transfused trauma patients is associated with diminished donor-specific lymphocyte response. J Trauma 2005; 58: 925 931. 29. Utter GH, Lee TH, Rivers RM, Montalvo L, Wen L, Chafets DM, Reed WF, Busch MP. Microchimerism decades after transfusion among combat-injured US veterans from the Vietnam, Korean, and World War II conflicts. Transfusion 2008; 48: 1609-15. 30. Utter GH, Owings JT, Lee TH, Paglieroni TG, Reed WF, Gosselin RC, Holland PV, Busch MP. Blood transfusion is associated with donor leukocyte microchimerism in trauma patients. J Trauma 2004; 57: 702-7. 31. Vervoordeldonk SF, Doumaid K, Remmerswaal EB, Ten Berge IJ, Wilmink JM, De Waal LP, Boog CJ. Long-term detection of microchimaerism in peripheral blood after pretransplantation blood transfusion. Br J Haematol 1998; 102: 1004 1009. 32. Vietor HE, Hallensleben E, Van Bree SP, Van Der Meer EM, Kaal SE, Bennebroek-Gravenhorst J, Kanhai HH, Brand A, Claas FH. Survival of donor cells 25 years after intrauterine transfusion. Blood 2000; 95: 2709 2714. 33. Baranyi U, Pilat N, Gattringer M, Wekerle T. A chimerism-based approach to induce tolerance in IgE-mediated allergy. Crit Rev Immunol 2009; 29: 379-97. 34. Guz K, Orzińska A, Kopeć I, Krzemienowska I, Smolarczyk-Wodzyńska J, Brojer E. Aktualny stan i perspektywy nieinwazyjnej diagnostyki prenatalnej w konfliktach matczyno-płodowych. Journal of Transfus Medicine 2010; 3: 144-154.
444 E. BROJER 35. Brojer E, śupanska B, Guz K, Orzińska A, Kalińska A. Non-invasive determination of fetal RHD status by examination of cell-free DNA in maternal plasma. Transfusion 2005; 45: 1473-80. 36. Adams KM, Nelson JL. Microchimerism: an investigative frontier in autoimmunity and transplantation. JAMA 2004; 291: 1127 1131. 37. Nelson JL. Microchimerism: incidental byproduct of pregnancy or active participant in human health? Trends Mol Med 2002; 8: 109 113. 38. Pogłód R. Poprzetoczeniowa choroba przeszczep przeciw gospodarzowi. Acta Hemat Pol 2009; 40: 425 434. Praca wpłynęła do Redakcji 20.06.2011 r. i została zakwalifikowana do druku 29.06.2011 r. Adres Autora: Zakład Immunologii Hematologicznej i Transfuzjologicznej Instytut Hematologii i Transfuzjologii. Siedziba Zakładu: Chocimska 5 00-957 Warszawa Adres do korespondencji: Gandhi 14 02-776 Warszawa