Tom XXVII ROŚLINY OLEISTE OILSEED CROPS 2006 Michał Starzycki, Eligia Starzycka, Małgorzata Jędryczka*, Witold Irzykowski* Jan Pszczoła**, Danuta Solecka*** Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Oddział w Poznaniu * Instytut Genetyki Roślin PAN w Poznaniu, ** Hodowla Roślin Strzelce, Oddział w Borowie *** Uniwersytet Warszawski Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not. i Leptosphaeria biglobosa (Shoemaker i Brun) po inokulacji rzepaku ozimego w warunkach polowych i laboratoryjnych * Identification and comparison of pathogenicity of Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not. and Leptosphaeria biglobosa (Shoemaker and Brun) using inoculation of winter oilseed rape under laboratory and field conditions Słowa kluczowe: metabolity wtórne, sekwencja ITS, metoda grzybniowa, zakażanie łodyg W 2004 roku z łodyg żółtonasiennych form rzepaku ozimego wyodrębniono 16 izolatów Leptosphaeria sp. Na podstawie analiz mikologicznych, metody HPLC oraz analiz DNA ustalono, że 9 izolatów należy do gatunku L. maculans a 7 do L. biglobosa. W warunkach laboratoryjnych i w polu określono chorobotwórczość izolatów. Stwierdzono, że gatunek L. maculans mocniej porażał część podliścieniową inokulowanych siewek rzepaku, zarówno podczas stosowania pojedynczych izolatów jak też mieszaniny izolatów z tego samego gatunku. W polu inokulowano rośliny odmian Bolko i Idol oraz linii podwojonych haploidów DH-1 i DH-2. Po inokulacji wykazano, że gatunek L. maculans spowodował istotnie silniejsze objawy chorobowe jedynie na roślinach linii DH-1. Key words: secondary metabolites, ITS sequence, mycelium test, stem infection test Sixteen isolates of Leptosphaeria sp. were obtained from stems of yellow seeded forms of winter oilseed rape harvested in 2004. Based on mycological analyses, High Performance Liquid Chromatography method (HPLC) and DNA studies the isolates were identified as L. maculans (9 isolates) or L. biglobosa (7). Leptosphaeria maculans formed slower growing pale colonies with sparse mycelium and numerous pycnidia. The isolates produced secondary metabolites from the group of sirodesmins, with sirodesmin PL as the major compound. Internal Transcribed Spacer fragment of L. maculans obtained using WIRZ-G1 and PN10 primers was 566 bp long. Fungal colonies of L. biglobosa were fast growing and produced a characteristic yellow-brown pigment. * Praca finansowana przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Numer projektu badawczego: 2 P06A 018 26.
52 Michał Starzycki... The main secondary metabolite was wasabidienon B and the ITS fragment was 28 bp longer than for L. maculans. Pathogenicity of isolates was studied using inoculation tests in laboratory and field conditions. It was found that L. maculans was more infective to hypocotyls of seedlings. Differences in pathogenicity of L. maculans and L. biglobosa were statistically significant both in case of single isolate treatments and the use of isolate mixtures from the same species. Inoculation tests were performed using plants of cultivars Bolko and Idol as well as doubled haploid lines DH-1 and DH-2. The inoculation under field conditions using isolate mixtures resulted in more severe symptoms on line DH-1 only, whereas on DH-2 and the cultivars the differences between both groups of isolates were insignificant. Growth stage of plants had significant effect on plant genotype resistance to studied Leptosphaeria species. Wstęp W warunkach klimatycznych Polski najgroźniejszymi patogenami rzepaku są grzyby rodzaju Leptosphaeria spp. Największe zagrożenie powodują zarodniki workowe powstające w owocnikach stadium doskonałego (pseudotecjach), tworzących się na resztkach pożniwnych roślin porażonych w poprzednim sezonie wegetacyjnym. Patogen przemieszcza się systemicznie z liści do łodyg dojrzałych roślin rzepaku (Hammond i in. 1985). W przypadku przenoszenia grzyba przez nasiona lub infekcji we wczesnej fazie rozwoju roślin można zaobserwować porażenie hypokotyli (czarna nóżka) i liścieni. Porażenie liścieni i liści rzepaku w okresie jesiennym i wiosennym stanowi zatem bardzo duże zagrożenie dla plonowania roślin (Jędryczka 2006). Doświadczenie inokulacyjne wykazało dużą zależność pomiędzy zmniejszeniem plonu nasion a fazą rozwojową roślin. Im wcześniej grzyb porażał rośliny rzepaku, tym większa była strata plonu. Doświadczenie wykonane na roślinach po jaryzacji wykazało, że największe obniżenie plonu nasion rzepaku stwierdzono, kiedy patogen porażał rośliny w stadium przed kwitnieniem, mniejsze podczas kwitnienia, a nieznaczne, gdy inokulację wykonano po kwitnieniu (Starzycki 1998). Na polach rzepaku corocznie występuje sucha zgnilizna kapustnych powodowana przez gatunki Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not. oraz Leptosphaeria biglobosa (Shoemaker i Brun 2001). Ze względu na podobieństwo owocników i zarodników oraz objawów chorobowych na roślinach rzepaku do niedawna oba gatunki traktowano jako tożsame. Choć już wiele lat wcześniej kwestionowano ich przynależność do tego samego taksonu (Petrie 1969), dopiero przy użyciu nowoczesnych metod badawczych, w tym kariotypowania (Taylor i in. 1991, Morales i in. 1993, Voigt i in. 2001) oraz badania i sekwencjonowania fragmentów DNA (Johnson i Lewis 1990, Patterson i Kapoor 1995, Jędryczka i in. 1999, Mendes-Pereira i in. 2003), jednoznacznie rozdzielono ten gatunek na L. maculans i L. biglobosa. Pomocne okazały się także metody chemiczne umożliwiające oznaczanie metabolitów wtórnych. Po zastosowaniu metody wysokosprawnej chromatografii cieczowej (HPLC) ustalono, iż gatunek L. maculans wytwarza
Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków... 53 substancje z grupy sirodesmin, gdy tymczasem gatunek L. biglobosa nie jest zdolny do wytwarzania tego metabolitu (Badawy i Hoppe 1989, Pedras i Séguin-Swartz 1992, Kachlicki i Jędryczka 1994), lecz tworzy inne fitotoksyczne związki (Kachlicki i in. 1996) i barwniki (Pedras i in. 1995, Karolewski i in. 1998). Badania chemotaksonomiczne potwierdziły zatem wyniki uzyskane metodami mikologicznymi i molekularnymi. Dla potrzeb hodowli odpornościowej niezbędne są wszechstronne badania chorobotwórczości różnych izolatów grzyba. W celu przeprowadzenia testów inokulacyjnych wskazane jest zastosowanie możliwie najbardziej zróżnicowanych izolatów patogena, ze szczególnym uwzględnieniem dominujących na terenie, dla którego prowadzona jest hodowla. Przed zastosowaniem w testach odpornościowych patogeny należy scharakteryzować pod względem polimorfizmu DNA oraz zdolności tworzenia mikotoksyn. W niniejszej pracy wykonano powyższe badania wykorzystując pojedyncze izolaty, a także porównano agresywność mieszaniny patotypów L. maculans i L. biglobosa po inokulacji roślin w warunkach laboratoryjnych i polowych. Materiał i metody Pochodzenie izolatów Izolaty Leptosphaeria spp. wyodrębniono z roślin żółtonasiennych form rzepaku ozimego rosnących na poletkach doświadczalnych Oddziału IHAR w Poznaniu w 2004 roku. Izolacje wykonano z łodyg dojrzałych roślin rzepaku, pobierając porażone tkanki znajdujące się na wysokości około 10 cm od ich podstawy. Grzyby izolowano na pożywkę glukozowo-ziemniaczaną (PDA) dodatkiem siarczanu streptomycyny (0,02%). Poszczególne izolaty uzyskano z różnych roślin lub ich fragmentów. Izolaty kilkukrotnie pasażowano na świeże pożywki, aż do uzyskania kultur wolnych od zanieczyszczeń bakteryjnych. Izolaty do badań pobierano z brzeżnych fragmentów rozwijającej się kolonii grzyba. Analiza mikologiczna Izolaty jednozarodnikowe hodowano w trzech powtórzeniach na pożywce PDA oraz pożywce V1, którą wykonano poprzez dodanie agaru do rozcieńczonego soku pomidorowego (Starzycki 1998). Izolaty hodowano przez trzy tygodnie w temperaturze pokojowej, po czym oznaczono obfitość grzybni powietrznej i piknidiów (owocniki stadium niedoskonałego) oraz zabarwienie pożywki pod koniec hodowli. Ponadto izolaty hodowano przez 6 tygodni na płynnej pożywce Czapka-Doxa. Procedura ta służyła sprawdzeniu czystości izolatu oraz pozwalała na oznaczenie jego zdolności do pozakomórkowego wydzielania żółto-brązowego pigmentu (Jędryczka 2006).
54 Michał Starzycki... Analiza HPLC Poszczególne izolaty hodowano na pożywce płynnej Fries a (Adriaensen i in. 2005). Metabolity izolowano poprzez ekstrakcję w fazie stałej (SPE) i poddawano analizie metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej. Stosowano HPLC-UV z detekcją absorpcji światła i rejestracją widm w zakresie UV i widzialnym oraz HPLC-MS z użyciem spektrometru mas Esquire 3000 (Bruker-Daltonik, Niemcy) umożliwiającego rejestrację widm fragmentacyjnych MS n uzyskiwanych metodą CID (Collision Induced Decomposition). Sekwencjonowanie fragmentu ITS Amplifikowano fragment DNA obejmujący 3 koniec genu 18S rrna, ITS1, gen 5.8S rrna, ITS2 i koniec 5 genu 26S rrna. Do amplifikacji regionu ITS oraz sekwencjonowania zastosowano startery: WIRZ-G1 (5'-GTAACAAGGTTTCCGTAGGTG-3 ) (Irzykowski i in. 2005) i PN10 (5 -TCCGCTTATTGATATGCTTAAG-3 ) (Balesdent i in. 1998). Amplifikację DNA i nieradioaktywne sekwencjonowanie przeprowadzono zgodnie z procedurą podaną przez Irzykowskiego i in. (2005) w sekwenserze typu Perkin Elmer ABI Prism 310 Genetic Analyzer. Reakcję przeprowadzono przy zastosowaniu zestawu ABI PRISM BigDye V3.0 Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit oraz polimerazy AmpliTaq DNA, zgodnie z instrukcją producenta. Sekwencje DNA odczytywano przy pomocy programu Chromas 1.43, natomiast do ich porównania wykorzystano program Clustal X 1.81. Określenie chorobotwórczości Badania patogeniczności izolatów prowadzono: a) metodą grzybniową na siewkach rzepaku (2005 i 2006), b) metodą pinezkową poprzez sztuczne zakażenie dojrzałych roślin w warunkach polowych (2006). Do inokulacji zastosowano 5 izolatów L. maculans i 5 izolatów L. biglobosa oraz mieszaninę izolatów każdego z wymienionych gatunków. Badano reakcję dwóch odmian i dwóch linii podwojonych haploidów (DH). Wytypowano odmiany zróżnicowane pod względem odporności na L. biglobosa. Odmiana Bolko (HR Strzelce) charakteryzowała się podwyższoną odpornością, natomiast odmiana Idol (Monsanto) była mniej odporna (Jędryczka 2006). Linię DH-1 w warunkach polowych oceniono jako nieodporną, natomiast linia DH-2 wykazywała w warunkach polowych podwyższony poziom odporności na Leptosphaeria spp. (dane niepublikowane). Inokulacja siewek Inokulację siewek prowadzono metodą grzybniową (Starzycki i in. 1994, Starzycki 1998). Zakażano siewki odmiany rzepaku ozimego Bolko hodowane na dziesięciokrotnie rozcieńczonej pożywce agarowej B 5 (Gamborg i in. 1968). Dla
Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków... 55 wzrostu patogenów stosowano pożywkę V 1 (Starzycki 1998). Każdym izolatem zakażano 153 lub 204 rośliny (3 4 powtórzenia 51 siewek). Łącznie przebadano 1734 siewki inokulowane i 306 siewek kontrolnych. Obserwację porażenia poszczególnych siewek wykonano 14 dni po inokulacji. Inokulacja dojrzałych roślin Badania wykonano w 2006 roku na poletkach doświadczalnych HR Strzelce w Borowie koło Czempinia. Inokulowano rośliny tuż po kwitnieniu. Zastosowano metodę pinezkową opracowaną przez Starzyckiego (1998). Inokulacja polegała na przytwierdzaniu pinezką ziarniaków żyta przerośniętych grzybnią mieszaniny izolatów gatunku L. maculans lub L. biglobosa. Ziarniaki przyczepiano na wysokości około 10 cm od podstawy łodygi na roślinach odmian Bolko i Idol oraz roślinach linii podwojonych haploidów DH-1 i DH-2. W każdym przypadku inokulowano po 20 roślin w trzech powtórzeniach. Izolatami obu gatunków inokulowano te same rośliny, lecz po przeciwnych stronach łodygi. Po upływie 21 dni mierzono długość wszystkich plam infekcyjnych. Wyniki Z porażonych łodyg rzepaku wyodrębniono 16 kultur Leptosphaeria sp., które następnie poddano charakterystyce pod względem mikologicznym, oznaczono obecność wybranych metabolitów, polimorfizm regionu ITS oraz chorobotwórczość. Analiza mikologiczna W wyniku analizy mikologicznej stwierdzono występowanie dwóch grup izolatów różniących się pod względem morfologicznym. Izolaty zidentyfikowane jako L. maculans rosły wolniej, tworzyły skąpą grzybnię powietrzną i liczne piknidia, kształt kolonii był często nieregularny, nie obserwowano barwnika ani na pożywce agarowej PDA, ani też na pożywce płynnej Czapka-Doxa. Do grupy o wymienionych cechach charakterystycznych należało 9 izolatów. Pozostałe izolaty, w liczbie 7, charakteryzowały się szybszym tempem wzrostu i obfitszą grzybnią powietrzną (rys. 1), tworzyły mniej liczne owocniki, a kolonie posiadały regularny okrągły kształt. Na rewersie pożywki PDA obserwowano żółtobrązowe zabarwienie, natomiast pożywka Czapka-Doxa po upływie 6 tygodni hodowli zmieniła kolor na brązowy. Zgodnie z tą charakterystyką izolaty zaklasyfikowano do gatunku L. biglobosa. Analiza HPLC Wszystkie izolaty oznaczone jako L. maculans (9) były zdolne do tworzenia metabolitów z grupy sirodesmin. Najbardziej charakterystycznym związkiem była sirodesmina PL (λ max = 210 nm, [M+H-2S] + = 423 m/z).
56 Michał Starzycki... L. biglobosa L. maculans Rys. 1. Różnice w obfitości grzybni powietrznej po hodowli izolatu L. biglobosa i L. maculans na pożywce glukozowo-ziemniaczanej (PDA) Differences in abundance of aerial mycelium after culturing of L. biglobosa and L. maculans on potato-glucose medium (PDA) Izolaty L. biglobosa tworzyły wasabidienon B (λ max = 220, 255, 330 i 405 nm, [M+H] + = 268 m/z). Związek ten był obecny w płynie pohodowlanym wszystkich siedmiu izolatów należących do tego gatunku. Dla obu wymienionych związków uzyskiwano powtarzalne i charakterystyczne widma fragmentacyjne MS n. Sekwencjonowanie regionu ITS W wyniku reakcji PCR z zastosowaniem starterów WIRZ-G1 oraz PN10 każdorazowo uzyskiwano jeden produkt o długości pomiędzy 500 a 600 pz, przy czym w dziewięciu przypadkach fragment ten był krótszy, a w siedmiu dłuższy. W wyniku sekwencjonowania stwierdzono, że dla izolatów oznaczonych jako L. maculans długość fragmentu DNA wynosiła 566 pz, natomiast dla L. biglobosa amplifikowany odcinek DNA miał 594 pz. Pojedyncze zsekwencjonowane fragmenty DNA gatunku L. biglobosa w porównaniu do L. maculans różniły się 30 insercjami, 2 delecjami i 46 substytucjami (rys. 2). Chorobotwórczość izolatów Siewki z objawami porażenia przez L. maculans były znacznie słabiej wykształcone, niższe i miały silnie przebarwioną część podliścieniową. Siewki porażone przez L. biglobosa charakteryzowały się podobnymi, choć zazwyczaj słabszymi, objawami porażenia. Na siewkach kontrolnych nie obserwowano objawów porażenia przez grzyby rodzaju Leptosphaeria spp. Izolaty należące do gatunku L. maculans wywołały objawy na prawie wszystkich siewkach odmiany Bolko (94,29%), gdy tymczasem grzyb L. biglobosa
Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków... 57 Rys. 2. Porównanie sekwencji ITS gatunków L. maculans (L.m.) i L. biglobosa (L.b.) Comparison of ITS sequence of L. maculans (L.m.) and L. biglobosa (L.b.) * oznacza występowanie tego samego nukleotydu u L. maculans i L. biglobosa the same nucleotide for L. maculans and L. biglobosa podkreślono fragment ITS1 oraz ITS2 (w podanej kolejności) ITS1 and ITS2 fragments are underlined (in a given order) porażał średnio jedynie 26,53% siewek. Poszczególne izolaty L. maculans wywoływały objawy na podobnej liczbie siewek, natomiast izolaty L. biglobosa były znacznie zróżnicowane pod względem chorobotwórczości; procent siewek z objawami przebarwień na hypokotylu wahał się od 9,1 do 47,1% (tab. 1). Na podstawie otrzymanych wyników i po zastosowaniu do obliczeń statystycznych testu t-studenta stwierdzono wysoce istotne różnice pomiędzy patogenicznością obu gatunków grzyba (test t; 10 1,2087-17 ).
58 Michał Starzycki... Tabela 1 Procent siewek odmiany Bolko z objawami porażenia hypokotylu po inokulacji metodą grzybniową (2005) Percent of Bolko seedlings with infected hypocotyls following inoculation with a mycelium test (2005) Powtórzenie Symbol izolatu L. maculans Isolate symbol Replication Lm-1 Lm-2 Lm-3 Lm-4 Lm-7 1 92,2 92,2 98,0 90,2 94,1 2 94,1 96,1 94,1 92,2 92,2 3 92,2 98,0 92,2 94,1 96,1 4 96,1-96,1-98,0 Średnia Mean 93,65 95,43 95,1 92,17 95,1 Powtórzenie Symbol izolatu L. biglobosa Isolate symbol Replication Lb-5 Lb-17 Lb-18 Lb-22 Lb-23 1 13,7 25,5 47,1 21,6 15,7 2 5,9 33,3 51,0 19,6 19,6 3 7,8 41,2 52,9 29,4 23,5 4 37,3 Średnia Mean 9,13 33,33 47,08 23,53 19,60 Wystąpiły także istotne różnice pomiędzy reakcją odmian i linii hodowlanych rzepaku na infekcję. Różnice te były statystycznie istotne zarówno po inokulacji przez L. maculans, jak też przez L. biglobosa. W badanym zestawie obiektów odmiana Bolko charakteryzowała się najwyższą odpornością na zainfekowanie części podliścieniowej przez L. maculans; porażeniu uległo jedynie 37,2% siewek, natomiast w przypadku pozostałego materiału badawczego było to 52,0 do 69,6% siewek (tab. 2). Reakcja genotypów roślinnych na inokulację przez L. biglobosa była odmienna niż dla L. maculans; spośród trzech odmian podatnych na L. maculans Tabela 2 Procent siewek odmian i linii rzepaku ozimego z objawami porażenia hypokotylu po inokulacji metodą grzybniową, traktowanych mieszaniną izolatów danego gatunku Leptosphaeria sp. (2006) Percent of seedlings of winter oilseed rape cultivars and lines with infected hypocotyls following inoculation with a mycelium test, treated with mixtures of a given species of Leptosphaeria sp. isolates (2006) Gatunek Species Odmiana/linia rzepaku ozimego Cultivar/line of winter oilseed rape Bolko Idol DH-1 DH-2 Średnia Mean L. maculans 37,2 55,9 69,6 52,0 53,7 L. biglobosa 14,7 10,8 68,6 25,5 29,9
Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków... 59 dwie były stosunkowo odporne na porażenie przez L. biglobosa. Najniższy procent roślin z objawami L. biglobosa na podliścieniowej części siewek zaobserwowano u odmiany Idol. W zastosowanym teście inokulacyjnym nie wystąpiły różnice pomiędzy reakcją odmiany Bolko i odmiany Idol. Natomiast pomiędzy reakcją linii podwojonych haploidów była statystycznie istotna różnica; siewki linii DH-1 uległy porażeniu w 68,6%, a siewki linii DH-2 jedynie w 25,5%. W wyniku inokulacji łodyg dojrzałych roślin rzepaku uzyskano plamy infekcyjne o długości od 19 do 37 mm. Przebarwienia na łodygach rzepaku odmian Bolko i Idol oraz linii DH-2 powodowane przez L. maculans i L. biglobosa nie różniły się od siebie w sposób statystycznie istotny. W przypadku linii DH-1 średnia długość plamy infekcyjnej wywołanej przez L. maculans wynosiła 37 mm, natomiast dla L. biglobosa średnie przebarwienie było o 11 mm krótsze, a różnica pomiędzy reakcją roślin na inokulację była statystycznie istotna (tab. 3). Tabela 3 Długość plamy infekcyjnej (mm) powodowanej przez mieszaniny izolatów Leptosphaeria spp. po inokulacji łodyg dojrzałych roślin rzepaku The length of discolouration (mm) on adult plant stems of oilseed rape treated with Leptosphaeria spp. isolate mixtures Odmiana/linia Cultivar/line Gatunek Leptosphaeria spp. Species of Leptosphaeria spp. L. maculans L. biglobosa Test t-studenta Value of Student t-test Bolko 22 25 0,16325 Idol 33 29 0,15012 DH-1 37 26 0,00138 ** DH-2 19 19 0,32039 ** różnice istotne statystycznie statistically significant differences Dyskusja Na żółtonasiennych roślinach rzepaku ozimego z objawami suchej zgnilizny kapustnych, uprawianych na poletkach hodowlanych IHAR w Poznaniu, stwierdzono występowanie izolatów należących zarówno do gatunku L. maculans, jak też do L. biglobosa. Oba gatunki porażały szyjkę korzeniową i dolną część łodyg rzepaku. Izolaty należące do obu gatunków znacznie różniły się pod względem morfologicznym, a wygląd kultur na pożywkach agarowych i płynnych odpowiadał wcześniejszym opisom (Williams i Fitt 1999, Jędryczka 2006). Prawidłowość identyfikacji mikologicznej potwierdzono metodą chemiczną oraz metodą molekularną. W wyniku badań chemicznych prowadzonych przy zastosowaniu wysokosprawnej chromatografii cieczowej stwierdzono, iż głównym metabolitem wytwarzanym przez L. maculans była sirodesmina PL, natomiast izolaty L. biglobosa tworzyły
60 Michał Starzycki... wasabidienon B. Uzyskane dane w pełni znajdują swoje potwierdzenie w literaturze naukowej, zarówno w przypadku gatunku L. maculans (Badawy i Hoppe 1989, Kachlicki i Jędryczka 1994), jak również w odniesieniu do gatunku L. biglobosa (Pedras i in. 1995, Kachlicki 2004), które przed 2001 rokiem klasyfikowano jako nieagresywne lub mało agresywne szczepy L. maculans (Shoemaker i Brun 2001). Skład metabolitów wtórnych tworzonych przez badane izolaty jest cechą na tyle niezmienną i charakterystyczną dla każdego z wymienionych gatunków, że stanowi podstawę klasyfikacji chemotaksonomicznej (Pedras i Biesenthal 2000). Także różnice genetyczne pomiędzy gatunkiem L. maculans i L. biglobosa uzasadniają ich rozróżnienie w klasyfikacji mikologicznej. W niniejszych badaniach pomiędzy izolatami należącymi do L. maculans i L. biglobosa stwierdzono aż 78 różnic w obrębie sekwencji ITS, co potwierdza ich przynależność do różnych gatunków. W badaniach nad chorobotwórczością stwierdzono znacznie silniejsze porażenie części podliścieniowej siewek przez L. maculans. Udział roślin porażonych przez L. biglobosa był niższy. Izolaty L. maculans powodowały prawie całkowite porażenie części podliścieniowej i zamieranie roślin odmiany Bolko, natomiast izolaty L. biglobosa powodowały średnie porażenie siewek. Zastosowanie do inokulacji mieszaniny izolatów w istotny sposób ograniczyło chorobotwórczość L. maculans. Inokulacja poszczególnymi izolatami grzyba spowodowała zdecydowanie silniejsze porażenie roślin. W naturalnych warunkach w polu spotykamy się z infekcją mieszaniną izolatów grzyba (Stachowiak i in. 2006). Izolaty te mogą posiadać zróżnicowaną wirulencję względem określonych genotypów rzepaku, a ich łączne zastosowanie może spowodować odmienną reakcję roślin niż zastosowanie każdego izolatu oddzielnie. Działanie mieszaniną izolatów L. biglobosa spowodowało prawie dwukrotne zmniejszenie procentu roślin z objawami porażenia części podliścieniowej w stosunku do traktowania roślin izolatami gatunku L. maculans. Różnica pomiędzy udziałem chorych roślin po sztucznym zakażeniu przez L. maculans i L. biglobosa była uzależniona od genotypu rośliny. W przypadku odmiany Idol różnica ta była ponad 5-krotna (mocniej porażały izolaty L. maculans), natomiast dla odmiany Bolko oraz linii DH-2 odpowiednio 2,5-krotna (także mocniej porażały izolaty L. maculans). Linia DH-1 była podatna zarówno na L. maculans, jak też na L. biglobosa. Reakcja rzepaku na porażenie przez grzyby rodzaju Leptosphaeria spp. była silnie uzależniona od fazy rozwojowej roślin. Porażenie roślin w warunkach polowych, mierzone długością plamy infekcyjnej po inokulacji roślin w fazie tworzenia łuszczyn, było odmienne od wykazanego testem grzybniowym. W tym przypadku nie odnotowano statystycznie istotnych różnic pomiędzy reakcją odmian Bolko i Idol oraz linii DH-2, natomiast stwierdzono statystycznie istotną różnicę pomiędzy porażeniem linii DH-1. O ile w przypadku testu grzybniowego w fazie siewki linia ta była podatna na oba gatunki grzyba, o tyle w fazie dojrzewania obserwowano znacznie silniejsze porażenie przez L. maculans. Podczas oceny
Identyfikacja i porównanie patogeniczności gatunków... 61 wyniku testu inokulacyjnego ważną informacją jest zatem faza rozwojowa roślin poddanych zakażeniu. Zakażenie roślin przed okresem wernalizacji i po tym okresie to oddziaływanie na rośliny w odmiennej fazie rozwojowej i w różnym stanie fizjologicznym, prawdopodobnie uruchamiające inne geny odporności i odmienne reakcje odpornościowe roślin. Wnioski 1. Żółtonasienne formy rzepaku, podobnie jak formy o ciemnym zabarwieniu nasion, są porażane zarówno przez gatunek L. maculans, jak też przez L. biglobosa. 2. Izolaty L. maculans i L. biglobosa różnią się pod względem morfologicznym, wytwarzają zróżnicowane metabolity wtórne i są odmienne genetycznie. 3. Genotypy rzepaku znacznie różnią się pod względem podatności na L. maculans i L. biglobosa. 4. Gatunek L. maculans silnie poraża podliścieniowe części rzepaku. 5. Faza rozwojowa w istotny sposób wpływa na reakcję odpornościową roślin rzepaku ozimego na suchą zgniliznę kapustnych. Literatura Adriaensen K., Vrålstad T., Noben J.-P., Vangronsveld J., Jcolpaert V. 2005. Copper-Adapted Suillus luteus, a Symbiotic Solution for Pines Colonizing Cu Mine Spoils. Applied Environ. Microbiology, 71 (11): 7279 7284. Badawy H.M.A., Hoppe H.H. 1989. Production of phytotoxic sirodesmins by aggressive strains of Leptosphaeria maculans differing in interactions with oil seed rape genotypes. Journal of Phytopathology, 127: 146-57. Balesdent M.H., Jędryczka M., Jain L., Mendes-Pereira E., Bertrandy J., Rouxel T. 1998. Conidia as a substrate for internal transcribed spacer-based PCR identification of members of the Leptosphaeria maculans species complex. Phytopathology, 88: 1210-1217. Gamborg O.L., Miller R.A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158. Hammond K.E., Lewis B.G., Musa T.M. 1985. A systemic pathway in the infection of oilseed rape plants by Leptosphaeria maculans. Plant Pathology, 34: 557-565. Irzykowski W., Soldatova V., Gasich E., Razgulaeva N., Jędryczka M. 2005. RAPD analysis of Russian and Polish isolates of Sclerotinia sclerotiorum from crucifers. International Organisation for Biological Control Bulletin, 28 (10): 69-82. Jędryczka M. 2006. Epidemiologia i szkodliwość suchej zgnilizny kapustnych na rzepaku ozimym w Polsce. Rozprawy i Monografie, nr 17, IGR PAN, Poznań. Jędryczka M., Rouxel T., Balesdent M.H. 1999. Rep-PCR based genomic fingerprinting of a Polish population of Leptosphaeria maculans. European Journal of Plant Pathology, 105: 813-823.
62 Michał Starzycki... Johnson R.D., Lewis B.G. 1990. DNA polymorphism in Leptosphaeria maculans. Physiol. Molec. Plant Pathol., 37: 417-424. Kachlicki P. 2004. Rola metabolitów wtórnych w interakcji grzyba Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. i roślin rzepaku (Brassica napus L.). Rozprawy i Monografie, nr 12, IGR PAN. Kachlicki P., Jędryczka M. 1994. Properties of Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. isolates from Poland. I. Secondary metabolites production. Phytopathologia Polonica, 7 (XIX): 81-86. Kachlicki P., Stobiecki M., Jędryczka M. 1996. Kwas benzoesowy fitotoksyczny metabolit szczepu Tox 0 grzyba Phoma lingam. Rośliny Oleiste Oilseed crops, XVII: 193-198. Karolewski Z., Goliński P., Wnuk S., Li O., Weber Z. 1998. Chemical and biological characteristics of metabolite of non-aggressive Phoma lingam isolate. Phytopathologia Polonica, 15: 15-23. Mendes-Pereira E., Balesdent M-H., Brun H., Rouxel T. 2003. Molecular phylogeny of the Leptosphaeria maculans L. biglobosa species complex. Mycol. Res., 107: 1287 1304. Morales V., Séguin-Swartz G., Taylor J.L. 1993. Chromosome length polymorphism in Leptosphaeria maculans. Phytopathology, 83: 503-509. Patterson N.A., Kapoor M. 1995. Detection of additional restriction fragment length polymorphisms among the weakly virulent (nonaggressive) and highly virulent (aggressive) isolates of Leptosphaeria maculans. Can. J. Microbiol., 41: 1135-1141. Pedras M.S.C., Séguin-Swartz G. 1992. The blackleg fungus: phytotoxins and phytoalexins. Can. J. Plant Pathol., 14: 67-75. Pedras M.S.C., Taylor J.L., Morales V.M. 1995. Phomaligin A and other yellow pigments in Phoma lingam and P. wasabiae. Phytochemistry, 38: 1215-1222. Pedras M.S.C., Biesenthal C.J. 2000. HPLC analyses of cultures of Phoma spp.: differentiation among groups and species through secondary metabolites profiles. Can. J. Microbiol., 46: 685-691. Petrie G.A. 1969. Variability in Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces et de Not., the cause of blackleg of rape. PhD. Thesis, University of Saskatchewan, Canada. Shoemaker R.A., Brun H. 2001. The teleomorph of the weakly aggressive segregate of Leptosphaeria maculans. Canadian J. Bot., 79: 412 419. Stachowiak A., Olechnowicz J., Jedryczka M., Rouxel T., Balesdent M.H., Happstadius I., Gladders P., Latunde-Dada A., Evans N. 2006. Frequency of avirulence alleles in field populations of Leptosphaeria maculans in Europe. Eur. J. Plant Pathol., 114: 67-75. Starzycki M. 1998. Badania nad odpornością rzepaku ozimego (Brassica napus L.) na patogena Leptosphaeria maculans (Desm.) Ces. et de Not. / Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm., powodującego suchą zgniliznę kapustnych. Monografie i Rozprawy Naukowe, nr 1, IHAR, Radzików. Starzycki M., Starzycka E., Pszczoła J. 1994. Evaluation of resistance of winter oilseed rape seedlings to Phoma lingam (Tode ex Fr.) Desm. using mycelium test. Rapeseed meeting, 13-16.06, Dania. Biuletyn GCIRC: 48-52. Taylor J.L., Borgmann I., Séguin-Swartz G. 1991. Electrophoretic karyotyping of Leptosphaeria maculans differentiates highly virulent from weakly virulent isolates. Current Genetics, 19: 273-277. Voigt K., Jędryczka M., Wöstemeyer J. 2001. Strain typing of Polish Leptosphaeria maculans isolates supports at the genomic level the multi-species concept of aggressive and non-aggressive strains. Microbiological Research, 156 (2): 169-177. Williams R.H., Fitt B.D.L. 1999. Differentiating A and B groups of Leptosphaeria maculans, causal agent of stem canker (blackleg) of oilseed rape. Plant Pathology, 48: 161-175.