KRIOKONSERWACJA ZASOBÓW GENOWYCH JABŁONI

ZESZYTY PROBLEMOWE POSTĘPÓW NAUK ROLNICZYCH 2007 z. 517: 159-166 KRIOKONSERWACJA ZASOBÓW GENOWYCH JABŁONI Maciej Niedzielski, BoŜena Buczyńska, Jerzy Puchalski Zakład Oceny i Ochrony RóŜnorodności Roślin, Ogród Botaniczny - Centrum Zachowania RóŜnorodności Biologicznej PAN w Warszawie Wstęp Zachowanie zasobów genowych w warunkach ex situ jest obecnie jedną z najpowszechniej wykorzystywanych metod ochrony starych odmian i form lokalnych roślin uprawnych. Zasoby genowe waŝnej gospodarczo grupy roślin sadowniczych utrzymywane są w formie Ŝywej kolekcji drzew i krzewów. Kolekcje takie wymagają jednak duŝych nakładów finansowych na ich utrzymanie, naraŝone są takŝe na ryzyko zniszczenia w wyniku oddziaływania czynników abiotycznych i poraŝenia patogenami. Alternatywnym lub uzupełniającym rozwiązaniem mogą być banki genów wykorzystujące techniki in vitro i/lub techniki kriogeniczne. Zastosowanie metod in vitro związane jest jednak z podwyŝszonym ryzykiem indukowania zmienności somaklonalnej, wymaga teŝ wysokich nakładów na utrzymanie kolekcji oraz zaawansowanych technik i wyposaŝenia laboratoriów. Metoda przechowywania w ciekłym azocie (LN 2 ) wydaje się najlepszą metodą zachowania plazmy zarodkowej gatunków rozmnaŝanych wegetatywnie. Przechowywanie w ciekłym azocie ogranicza ryzyko zmian genetycznych powodowanych starzeniem się materiałów, negatywnego wpływu warunków zewnętrznych czy zakaŝenie patogenami, jak równieŝ istotnie obniŝa koszty [STUSHNOFF, SEUFFERHELD 1995]. Prowadzone są badania nad moŝliwościami przechowywania m.in. merystemów, zarodków generatywnych i somatycznych, zawiesin komórkowych [HELLIOT, DE BOUCAUD 1997; WU i in. 2001]. W przypadku jabłoni i innych gatunków drzew i krzewów owocowych strefy umiarkowanej moŝliwa jest kriokonserwacja pąków spoczynkowych. Zaletami tej metody jest jej prostota i niskie koszty. Dzięki moŝliwości regeneracji pąków metodami wegetatywnymi, unikając zabiegów in vitro, ograniczono w istotnym stopniu ryzyko indukowania zmian genetycznych [STUSHNOFF 1991; SEUFFERHELD i in. 1999]. Zastosowanie metod kriokonserwacji dla ochrony zasobów genowych roślin jest obecnie przedmiotem zainteresowania wielu instytucji. Badania w tej dziedzinie prowadzone są takŝe w ramach międzynarodowych programów badawczych takich jak: CRYMCEPT (Establishing Cryopreservation Methods for Conserving European Plant Germplasm Collections) i COST (Action 871-Cryopreservation of crop species in Europe) [http://www.cost.esf.org]. W oparciu o dotychczas uzyskane wyniki prac eksperymentalnych tworzone są banki materiałów przechowywanych w ciekłym azocie, np. USDA-NCGRP (United States Departament of Agriculture - National Center for Genetic Resources Preservation, Ft. Collins, CO) [http://www.ars-grin.gov]. W Ogrodzie Botanicznym PAN znajduje się kolekcja starych odmian jabłoni, licząca ponad 340 obiektów. Pochodzą one z obszaru dzisiejszej Polski, ale takŝe z

160 M. Niedzielski, B. Buczyńska, J. Puchalski terenów ościennych. Stare odmiany ze względu na przystosowanie do polskich warunków glebowo-klimatycznych, są waŝnym źródłem cech przydatnych w hodowli. W roku 2003 rozpoczęto w OB-CZRB PAN (Ogród Botaniczny - Centrum Zachowania RóŜnorodności Biologicznej Polskiej Akademii Nauk) prace nad moŝliwością zastosowania metod kriogenicznych dla zachowania zasobów genowych jabłoni. W badaniach prowadzonych przez FORSLINE i in. [1998] Ŝywotność i zdolność regeneracyjna pąków spoczynkowych jabłoni zamraŝanych w LN 2 determinowane były wilgotnością materiału, warunkami zamraŝania i przechowywania. Występowała wyraźna zmienność międzyodmianowa w reakcjach na zamraŝanie do temperatury ciekłego azotu. Wskazuje to na konieczność optymalizacji warunków zbioru pąków oraz ich zamraŝania i przechowywania w ciekłym azocie. Celem badań było określenie wpływu kontrolowanego odwadniania, szybkości zamraŝania i warunków przechowywania na Ŝywotność i zdolności regeneracyjne pąków spoczynkowych wybranych odmian jabłoni. Materiały i metody Jednoroczne pędy jabłoni pozyskiwano z drzew rosnących w kolekcji starych odmian jabłoni OB-CZRB PAN w grudniu i/lub styczniu. Termin zbioru warunkowany był przebiegiem pogody, głównie temperaturami panującymi w tym okresie. Konieczny jest co najmniej kilkudniowy okres temperatur ujemnych, co gwarantuje właściwy stopień spoczynku pąków. W roku 2004 pędy jabłoni odmiany Landsberska, Oliwka i Pepina Ribstona zebrano w styczniu i po przechowaniu w temperaturze -4 C przez okres kilku dni cięte były na fragmenty o długości 1,5-2 cm zawierające jeden pąk. Fragmenty pędów suszono w komorze z wymuszonym obiegiem powietrza w temperaturze -4 C. Przebieg suszenia kontrolowany był przez pomiar ubytku masy. Zawartość wody obliczano na podstawie oznaczonej wagowo suchej masy pędów. Proces suszenia kończono w momencie osiągnięcia 30% zawartości wody. Fragmenty pędów zamraŝano w polipropylenowych probówkach. Dla oceny wpływu warunków zamraŝania i przechowywania na Ŝywotność i zdolności regeneracyjne pąków badanych odmian zastosowano dwie metody zamraŝania i dwa warianty przechowywania: a. w warunkach kontrolowanych metodą wolnego zamraŝania w urządzeniu minicool LC 40 (l Air Liquide). Najpierw obniŝano temperaturę od 0 C do -30 C z szybkością 0,1 C/min, następnie utrzymywano pąki w temperaturze -30 C przez 24 godz. i przenoszono do zbiornika przechowalniczego (-150 C - temperatura par ciekłego azotu) lub do fazy ciekłej (-196 C); b. immersyjnie, przez bezpośrednie zanurzenie w ciekłym azocie. Pąki zamroŝone immersyjnie przechowywano w fazie gazowej lub ciekłej LN 2. Materiał po zamroŝeniu przechowywano przez okres, co najmniej 3 tygodni. śywotność pąków oznaczano laboratoryjnie po rozmroŝeniu w łaźni wodnej w temperaturze 35 C i uwodnieniu w torfie w temperaturze pokojowej przez okres 5 dni. śywotność pąków i sąsiednich tkanek fragmentu pędu oceniono wizualnie na podstawie barwy tkanki na przekroju podłuŝnym. W ocenie Ŝywotności wyróŝniono trzy klasy materiałów: + fragmenty w pełni zachowujące naturalną barwę pąków i tkanek przyległych, ± fragmenty z niewielkimi przebarwieniami pąków, ciemnienie obserwowane w peryferyjnych częściach pąków i/lub tkanek przyległych, - fragmenty zbrązowiałe.

KRIOKONSERWACJA ZASOBÓW GENOWYCH JABŁONI 161 Zdolności regeneracyjne oceniano przez szczepienie pąków metodą oczkowania na podkładkach (siewki odmiany Antonówka) po uwodnieniu w torfie w temperaturze 2 C przez okres 10 dni. Zaszczepione podkładki hodowano w szklarni. W drugim roku doświadczeń oceniono wpływ zamraŝania na Ŝywotność pąków spoczynkowych 12 odmian jabłoni (tab. 4). Materiał do doświadczeń pobrano w optymalnym według danych literaturowych terminie [STUSHNOFF 1991], tj. w grudniu (23.12.04). Jednak ze względu na nietypowo wysokie temperatury w tym okresie, co mogło skutkować niepełnym spoczynkiem pąków, pobrano pędy po raz drugi 31.01.05 po dłuŝszym okresie ujemnych temperatur (rys. 1). W oparciu o wyniki doświadczenia z roku poprzedniego fragmenty jednopąkowe odwadniano do zawartości wody 30%, zamraŝano wolno do temperatury -30 C i umieszczano w zbiorniku z LN 2 (w fazie gazowej). C 12 10 8 6 4 2 0-2 -4-6 1 4 7 10 13 1619 22 2528 31 Gru/Dec Sty/Jan Rys. 1 Średnie dzienne temperatury w grudniu 2004 i styczniu 2005 Fig. 1. Average daily temperature in December 2004 and January 2005 Fragmenty pędów odmiany Pepina Ribstona zebrane 31.01.05 poddano traktowaniu wstępnemu roztworami sacharozy 0,5 mol dm -3 ; 0,75 mol dm -3 i 1 mol dm -3 przez 24 godz. przy temperaturze -4 C lub poddano witrifikacji w roztworze złoŝonym z 180 g sacharozy, 120 ml glikolu etylenowego i 100 ml wody, w czasie 30 min, w temperaturze -4 C. Pąki po traktowaniu sacharozą i odwodnieniu do zawartości wody 30% zamraŝano według trybu wolnego, a pąki witrifikowane zamraŝano przez immersję w LN 2. śywotność pąków oznaczono testem laboratoryjnym.

162 M. Niedzielski, B. Buczyńska, J. Puchalski Wyniki i dyskusja Wszystkie odmiany jabłoni badane w pierwszym roku wykazały pełną Ŝywotność pąków spoczynkowych (tab. 1). Po ich odwodnieniu do około 30% zawartości wody stwierdzono róŝnice między odmianami. Najbardziej wraŝliwa na odwodnienie była odmiana Pepina Ribstona, a najbardziej odporna odmiana Landsberska. Nasze badania, podobnie jak badania TAYLER, STUSHNOFF [1988a, 1988b] wykazały, Ŝe wraŝliwość na odwadnianie pąków była skorelowana z mrozoodpornością odmian jabłoni. Tabela 1; Table 1 śywotność pąków po zbiorze i podsuszeniu do zawartości wody 30% Viability of buds after collecting and dehydration to moisture content 30% Odmiana; Cultivar Po zbiorze; After collecting Suszone; Dehydrated - ± + - ± + Landsberska 10* 10 Oliwka 10 1 9 Pepina Ribstona 10 1 2 7 - pąki martwe; dead buds ± częściowo zbrązowaiłe pąki i/lub przylegające tkanki; partially buds and/or attached tissues + pąki Ŝywotne; fully viable buds * liczba ocenianych fragmentów; no. of evaluated fragments Tabela 2; Table 2 Odmiana Cultivar śywotność pąków spoczynkowych jabłoni oceniana po zamroŝeniu Viability of dormant apple buds evaluated after freezing Szybkość zamraŝania Rate of freezing Przechowywanie Storage -* ± + Landsberska LN 2; immersed LN 2; liquid phase 5** wolne; slow LN 2 5 Oliwka LN 2; immersed LN 2 5 pary; vapour phase 4 1 wolne; slow LN 2 5 Pepina Ribstona LN 2; immersed LN 2 5 wolne; slow LN 2 5 * objaśnienia pod tabelą 1; explanations see Table 1 ** liczba ocenianych fragmentów; no. of evaluated fragments Uzyskane wyniki potwierdziły wcześniejsze badania innych autorów [FORSLINE i in. 1998], Ŝe mrozoodpornść odmian jabłoni ma istotny wpływ na ich wraŝliwość na zamraŝanie w ciekłym azocie. Pąki odmiany Pepina Ribstona, o niskiej mrozoodporności, wyraźnie negatywnie reagowały na częściowe odwodnienie, jak i zamraŝanie. W naszych badaniach na Ŝywotność zamraŝanych pąków jabłoni miała równieŝ istotny wpływ szybkość zamraŝania (tab. 2). Pąki badanych odmian reagowały negatywnie na zamraŝanie przez bezpośrednie zanurzenie w ciekłym azocie. RównieŜ negatywny wpływ miało przechowywanie próbek w ciekłym azocie, szczególnie materiałów zamraŝanych wcześniej przez immersję w LN 2. Korzystniejsze było zamraŝanie wolne i przechowywanie pąków w fazie gazowej. Negatywny wpływ przechowywania w fazie ciekłej wynikał prawdopodobnie z nieszczelności zamknięć

KRIOKONSERWACJA ZASOBÓW GENOWYCH JABŁONI 163 probówek. Ciekły azot, wnikając do probówek, moŝe w wyniku gwałtownego wzrostu objętości w trakcie rozmraŝania powodować mechaniczne zniszczenie materiału. Po laboratoryjnej oceny Ŝywotności, pąki zamraŝane wolno lub bezpośrednio w LN 2, a przechowywane w parach ciekłego azotu szczepiono na podkładkach i uprawiano w warunkach szklarniowych. Przedstawione w tabeli 3 wyniki dotyczą oceny stopnia regeneracji po 4 miesiącach uprawy. Widoczne jest zróŝnicowanie zdolności regeneracyjnych badanych odmian jabłoni. Zdolność regeneracji pąków suszonych i zamroŝonych (szczepiono 15 pąków) Regeneration ability of dehydrated buds after freezing (grafted 15 buds) Odmiana Cultivar MroŜone bezpośr. LN 2 Immersed to LN 2 Tabela 3; Table 3 MroŜone wolno Slow freezing regener.* % regener.* % Landsberska 2 1 8 53 Oliwka 0 0 6 40 Pepina Ribstona 0 0 1 7 * liczba regenerujących pąków; no. of regenerating buds Stopień mrozoodporności odmiany wyraźnie determinuje moŝliwość efektywnego zamraŝania w ciekłym azocie pąków spoczynkowych jabłoni. W drugim roku badań wraŝliwość badanych odmian jabłoni na zamraŝanie pąków spoczynkowych do temperatury ciekłego azotu zaleŝała od terminu zbioru pędów. Średnia przeŝywalność pąków zebranych w drugim terminie, po dłuŝszym okresie temperatur ujemnych, wzrosła z 45,9 do 82,5% (tab. 4). Wzrost przeŝywalności obserwowany był w odniesieniu do wszystkich odmian. Był on największy u odmian Kosztela i Spasówka. Odmiany te zebrane w terminie wcześniejszym, po rozmroŝeniu nie wykazywały Ŝywych pąków. PrzeŜywalność pąków zebranych w drugim terminie dla odmiany Kosztela przekroczyła 50%, a dla odmiany Spasówka wynosiła 100%. RównieŜ w badaniach STUSHNOFF [1991] przebieg pogody przed zbiorem pędów warunkował w wyraźny sposób stan ich spoczynku, co miało wpływ na odporność na zamraŝanie w ciekłym azocie. W doświadczeniu prowadzonym w pierwszym roku odmiana Pepina Ribstona wykazała niską tolerancję na zamraŝanie pąków w ciekłym azocie. Dlatego teŝ pąki tej odmiany były materiałem dla oceny skuteczności metod traktowania wstępnego dla podwyŝszenia odporności na zamraŝanie w LN 2, w drugim roku badań. Tabela 4; Table 4 Odmiana Cultivar śywotność (%) pąków jabłoni po odwodnieniu i zamroŝeniu Viability (%) of apple buds after dehydration and freezing odwadniane dehydrated Termin zbioru; Collecting date 23.12.04 31.01.05 po zamroŝeniu after freezing odwadniane dehydrated po zmroŝeniu after freezing Rarytas Śląski 87,5 75 81,8 76,2 Landsberska 92,5 35,7 100 88,9 Titówka 92,5 78,6 100 69,2 Oliwka Inflancka 100 61,9 100 83,3

164 M. Niedzielski, B. Buczyńska, J. Puchalski Grafsztynek Inflancki 80 45,8 100 57,1 Antonówka 100 60,9 91,7 60 Charłamowskie 80 33,3 100 100 Kosztela 100 0 100 55,6 Spasówka 100 0 90 100 Ananas BerŜenicki 100 52,4 100 100 Rajewskie 100 61,5 100 100 Cynamonówka 100 100 Średnia; Average 93,9 45,9 97 82,5 Zastosowano traktowanie wstępne roztworami sacharozy oraz witrifikację. Traktowane pąki zamraŝano według trybu wolnego (po odwodnieniu i traktowaniu sacharozą) lub przez immersję w LN 2 po witrifikacji. Zarówno traktowanie sacharozą jak i bardziej złoŝonym roztworem witrifikacyjnym miało za zadanie zmodyfikować skład cytoplazmy komórek pąka tak, aby procesy odwodnienia i zamraŝania nie powodowały uszkodzeń. Traktowanie pąków spoczynkowych jabłoni roztworami sacharozy o wzrastającym stęŝeniu nie spowodowało spadku Ŝywotności pąków, jednakŝe nie poprawiło ich odporności na zamraŝanie. Działanie krioochronne sacharozy okazało się niedostateczne. Witrifikacja pąków jabłoni roztworem sacharozy wzbogaconym glikolem etylenowym istotnie poprawiła krioodporność nie obniŝając istotnie Ŝywotności materiału (tab. 5). Tabela 5; Table 5 śywotność (%) pąków jabłoni odm. Pepina Ribstona traktowanych sacharozą lub witrifikowanych Viability (%) of apple buds cv. Pepina Ribstona treated with sucrose or vitrified Zabieg; Treatment Po traktowaniu; After treatment Po zamroŝeniu; After freezing Pąki suszone; Dehydrated 100 50 Traktowane sacharozą; Sucrose 100 50 Witrifikowane; Vitrified 90 100 W badaniach innych autorów pozytywne rezultaty traktowania wstępnego występowały w odniesieniu do izolowanych merystemów lub stoŝków wzrostu pędów hodowanych in vitro [SEUFFERHELD i in. 1999; PAUL i in. 2000; WU i in. 2000]. Wnioski i podsumowanie śywotność i zdolności regeneracyjne pąków spoczynkowych jabłoni zamra- Ŝanych w LN 2 determinowane są stopniem mrozoodporności odmian, szybkością zamraŝania i warunkami przechowywania. Optymalne jest wolne zamraŝanie i przechowywanie pąków w fazie gazowej ciekłego azotu. Dla uzyskania wysokiej odporności pąków na częściowe odwodnienie i zamraŝanie konieczny jest kilkunastodniowy okres stabilnych temperatur ujemnych poprzedzający zbiór pędów. W przypadku odmian wraŝliwych wstępne traktowanie pąków substancjami krioochronnymi pozwala podwyŝszyć oporność pąków. Literatura HELLIOT B., DE BOUCAUD M.T. 1997. Effect of parameters on survival of cryopreserved Prunus Ferlenian in vitro shoot tips. CryoLetters 18(3): 133-142. FORSLINE P.L., TOWILL L.E., WADDELL J.W., STUSHNOFF C., LAMBOY W.F., MCFERSON J.R.

KRIOKONSERWACJA ZASOBÓW GENOWYCH JABŁONI 165 1998. Recovery and longevity of cryopreserved dormant apple buds. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 123: 365-370. PAUL H., DAIGNY G., SANGWAN-NORREEL B.S. 2000. Cryopreservation of apple (Malus domestica Borkh.) shoot tips following encapsulation-dehydration or encapsulationvitrification. Plant Cell Reports 19: 768-774. STUSHNOFF C. 1991. Cryopreservation of fruit crop genetic resources - Implication for maitenance and diversity during conservation. Hort-Science 26: 518-522. STUSHNOFF C., SEUFFERHELD M. 1995. Cryopreservation of apple(malus species) genetic resources, w: Biotechnology in Agriculture and Forestry. Cryopreservation of Plant Germplasm I. Bajaj Y.P.S. (Red.) Springer-Verlag, Berlin Heidelberg, Vol. 32: 87-101. SEUFFERHELD M.J., STUSHNOFF C., FORSLINE P.L., TERRAZAS GONZALES G.H. 1999. Cryopreservation of cold-tender apple germplasm. J. Amer. Soc. Hort. Sci. 124: 612-618. TAYLER N., STUSHNOFF C. 1988a. The effects of prefreezing and controlled dehydration on cryopreservation of dormant vegetative apple buds. Can. J. Plant Sci. 68: 1163-1167. TAYLER N., STUSHNOFF C. 1988b. Dehydration of dormant apple buds at different stages of cold acclimation to induce cryopreservability in different cultivars. Can. J. Plant Sci. 68: 1169-1176. WU J., ZHAO Y., ENGELMAN F., ZHOU M., ZHANG D., CHEN S. 2001. Cryopreservation of apple dormant buds and shoot tipps. CryoLetters 22: 375-380. Słowa kluczowe: zasoby genowe, Malus domestica, jabłonie, kriokonserwacja, pąki spoczynkowe Streszczenie Zachowanie zasobów genowych w warunkach kolekcji ex situ jest jedną z najpowszechniej wykorzystywanych obecnie metod ochrony starych odmian i form lokalnych roślin uprawnych. W przypadku jabłoni i innych gatunków drzew i krzewów owocowych strefy umiarkowanej alternatywną metodą jest kriokonserwacja pąków spoczynkowych. Zaletami tej metody jest jej prostota i niskie koszty. śywotność i zdolności regeneracyjne pąków spoczynkowych jabłoni zamraŝanych w LN 2 determinowane są stopniem mrozoodporności odmian, szybkością zamraŝania i warunkami przechowywania. Optymalne jest wolne zamraŝanie i przechowywanie pąków w fazie gazowej ciekłego azotu. Istotny jest równieŝ termin zbioru, który determinuje stan fizjologiczny pąków. Dla uzyskania wysokiej odporności pąków na częściowe odwodnienie i zamraŝanie konieczny jest kilkunastodniowy okres stabilnych temperatur ujemnych. Obserwowano wyraźne zróŝnicowanie międzyodmianowe w odniesieniu do wraŝliwości na zamraŝanie w ciekłym azocie. W przypadku odmian wraŝliwych wstępne traktowanie pąków substancjami krioochronnymi pozwala podwyŝszyć oporność pąków. CRYOPRESERVATION OF MALUS GENETIC RESOURCES Maciej Niedzielski, BoŜena Buczyńska, Jerzy Puchalski Department of Plant Diversity Evaluation and Conservation, Botanical Garden - Center for Biodiversity Conservation, Polish Academy of Sciences, Warszawa

166 Key words: M. Niedzielski, B. Buczyńska, J. Puchalski genetic resources, Malus domestica, apple, cryopreservation, dormant winter buds Summary Conservation of genetic resources ex-situ has, up to now, been the most popular method of protection of old varieties and local landraces collections. In the case of apple and other orchard species of temperate climatic zone a cryopreservation of dormant winter buds might be an alternative method of genetic resources conservation. It is a simple and low-cost method. Viability and regeneration ability of buds after freezing in liquid nitrogen depends on the cultivar frost resistance, low freezing rate and storage in LN 2 vapour phase. Physiological state of buds, strongly affected by environmental factors, mainly temeperature, is also important for the maintenance of a high viability after dehydration and freezing. A few day period of constant negative temperature is essential for a high regeneration rate after freezing. A substantial intervarietal variability has been observed. In the case of LN 2 -tender cultivars pretreatment with cryoprotectants might be helpful for maintenance of buds viability after freezing. Mgr Maciej Niedzielski Ogród Botaniczny Centrum Zachowania RóŜnorodności Biologicznej Polska Akademia Nauk ul. Prawdziwka 2 02-973 WARSZAWA e-mail: mniedz@ob.neostrada.pl