5 th International Forum SPECIAL FORUM & EXHIBITION BEST OF EAST FOR EASTER PARTNERSHIP Challenges and Opportunities for Collaboration European Union Poland Eastern Europe Countries November 28-30, 2011 WARSAW, Poland Lab-on-a-chip for quality assessment of reproductive cells of breeding animals Patrycja Śniadek Wroclaw University of Technology(Poland) Forum is co-financed by European Union from European Social Fund
Lab-on-a-chip przeznaczony do jakościowej oceny komórek rozrodczych zwierząt hodowlanych Patrycja Śniadek Zakład Mikroinżynierii i Fotowoltaiki Wydział Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki
Plan prezentacji 1. Zagadnienia gospodarcze i problem naukowy 2. Mikrocytometry przepływowe typu lab-chip 3. Mikro-spektrofotometria Oocyty trzody chlewnej Transfer zarodków bydlęcych i trzody chlewnej 5. Mikro-fluorymetria Zarodki mysie 6. Podsumowanie
Wykorzystywane techniki rozrodowe Embrio transfer z zapłodnieniem in vitro Embrio transfer z zapłodnieniem in vivo
Skala problemu wg. AETE Association Europeenne de Transfert Embryonnaire 2001-2010.
Jakość oocytów i zarodków zwierząt hodowlanych istotny problem hodowcy Dobre czy złe?
Klasy oocytów wg obecnej metodologii I metoda klasyfikacji- w oparciu o ilość komórek cumulusa oraz jednorodność i przejrzystość cytoplazmy. Oocyty I klasy są najlepsze jakościowo. I klasa II klasa III klasa IV klasa A.A.C. de Wit, Y. A. Wurth, Th. A. Kruip. Effect of ovarian phase and follicle quality on morphology and developmental capacity of the bovine cumulus-oocyte complex, Journal of Animal Science. 78, 2000, s. 1277-1283. II metoda klasyfikacji względem wielkości pęcherzyka jajnikowego, z którego pochodzi pobrany oocyt: duży pęcherzyk jajnikowy, średni pęcherzyk jajnikowy, mały pęcherzyk jajnikowy. Oocyty z dużego pęcherzyka jajnikowego są najlepsze jakościowo. B. Kempisty, M. Jackowska, H. Piotrowska, P. Antosik, M. Woźna, D. Bukowska, K.P. Brussow, J.M. Jaśkowski. Zona pellucida glycoprotein 3(pZP3) and integrin B2 (ITGB2) mrna and protein expression in porcine oocytes after single and double exposure to brilliant cresyl blue test. Theriogenology. 2011, 78, strony 1524-1525.
Tradycyjna metoda oceny oocytów i zarodków Obserwacja pod mikroskopem cech morfologicznych (między innymi: kształt, kolor, przejrzystość) Zapłodnienie Różnej jakości Oocyt in vitro zwierzęta Dobry Zły Obecna metoda oceny jakości oocytów/zarodków stanowi najsłabszy punkt metody transferu. Powodem tego jest: - duży wpływ czynnika ludzkiego w ocenie jakościowej - braku możliwości automatyzacji procedury.
Klasy zarodków wg obecnej metodologii Klasa zarodka Klasa I doskonałe Klasa II dobre Klasa III zadowalające Klasa IV słabe Klasa V zdegenerowane Klasa VI niezdolne do zapłodnienia Kwalifikacja wg Schneidera okrągły zarodek z komórkami o takim samym rozmiarze, kolorze i zagęszczeniu blastomerów nieznaczne nieprawidłowości, na przykład, izolacja jednego blastomeru, nieregularny rozmiar struktury komórkowej w blastomerach więcej nieprawidłowości, niektóre komórki lub blastomery w wolnej przestrzeni, zdegenerowane struktury komórek, granulki w cytoplazmie utrata części blastomerów, zdegenerowane komórki, przerwana błona komórkowa, różny rozmiar komórek, zmiana koloru, część komórek utrzymuje prawidłowy wygląd masa komórkowa całkowicie zdegenerowana Kwalifikacja wg Eldsena doskonale rozwijający się zarodek niewielkie niedoskonałości w owalu osłonki przejrzystej, odłączenie kilku małych blastomerów lub lekko asymetryczny kształt zdecydowane, ale nie poważne nieprawidłowości, takie jak umiarkowana ilość odłączonych komórek, niewielki rozmiar, małe ilości degeneratów, do jednego dnia opóźnione w rozwoju znaczna degeneracja, znaczne różnice w wielkości komórek, brak kompaktacji, komórki bardzo małe i / lub opóźnione o dwa dni w rozwoju Silnie zdegenerowany, nie nadaje się do implantacji niezapłodnione lub dwu-/trzykomórkowe
Błędy obecnej metody oceny jakości zarodków Różnice w ocenie zarodków między sześcioma doświadczonymi w ocenie materiału rozrodczego osobami. Pierwszy oceniający wyznaczył standard, do którego zostały porównane klasyfikacje pozostałych oceniających. Każdy z oceniających inaczej zakwalifikował badane zarodki. Największe różnice występowały w klasach średnich, co mogło skutkować odrzuceniem dobrych zarodków. P. W. Farin, B. D. Slenning, J. H. Britt. Estimates of pregnancy outcomes based on selection of bovine embryos produced in vivo or in vitro. Theriogenology. 52, 1999, strony 659-670.
Cechy idealnej metody: nieinwazyjna, parametryczna i jednoznaczna ocenę badanego materiału, badanie każdej komórki osobno - sztuka po sztuce, uzyskanie kwalifikacji natychmiast, dostosowanie metody do przyzwyczajeń personelu weterynaryjnego, aplikacja w rzeczywistych warunkach: chlewnia, obora, stacja inseminacji, niski koszt pojedynczego badania. Metodą, która mogłaby spełnić wymienione wymagania jest mikrocytometria przepływowa.
Liczba publikacji z użyciem słowa kluczowego microcytometry w zasobach konferencji µtas Tematyka bardzo żywa naukowo
Mikrocytometry służące do badania oocytów oraz zarodków ssaków wybrane i nieliczne przykłady literaturowe Metoda mechaniczna Metoda elektryczna Metoda biochemiczna Metoda optyczna - badano oocyty ludzkie -chip wykonano z krzemu i SU-8 - pomiar deformacji badanej komórki pod wpływem nacisku mikropipetą -badano oocyty świńskie -chip wykonano ze szkła - pomiar prędkości poruszania się oocytów pod wpływem przyłożonej siły dielektroforetycznej -badano zarodki mysie - chip wykonano z PDMSu - analiza produktów metabolizmu komórki (glukoza, pirogronian i mleczan) -badano oocyty ludzkie - chip krzemowoszklany - analiza widm transmisji komórek w świetle widzialnym B. Wacogne i współpracownicy W. Choi i współpracownicy J.P. Urbanski i współpracownicy 54. R. Zeggari i współpracownicy
Metody detekcji w przedstawionych mikrocytometrach Metoda mechaniczna, za pomocą której badana jest elastyczność komórki, może być niszcząca ponieważ przyłożenie zbyt dużej siły nacisku na osłonkę przejrzystą może spowodować jej pęknięcie. Metoda elektryczna; badane komórki poddawane są działaniu napięcia elektrycznego i generowane jest ciepło wewnątrz kanału cieczowego. Występowanie tych dwóch czynników jednocześnie może powodować uszkodzenia badanej komórki. Metoda biochemiczna jest metodą pośrednią bazującą na analizie płynów, w których zanurzony jest zarodek i wymaga ona skomplikowanego osprzętu analitycznego. Czas jej trwania jest bardzo długi, co uniemożliwia zastosowanie jej w szybkiej ocenie badanego materiału (np. transfer zarodków). Metoda optyczna, która jak się wydaje nie wnosi skutków ubocznych.
Ilustracja metody badania jakości oocytów i zarodków zwierzęcych Pomiary optyczne Oocyt Instrument Optyczna Detekcja Lab-on-chip Oprogramowanie Parametryczna ocena Dobrej jakości zwierzęta Zły Dobry Zapłodnienie in vitro Pomysł: zastąpić wyczucie obserwatora przez pomiar wybranych parametrów optycznych zarodków w lab-chipie bez naruszania ich stanu.
Projekt APOZAR APOZAR - przyrząd diagnostyczny do szybkiej i taniej oceny jakości zarodków zwierząt hodowlanych Subiektywna ocena jakości oocytów/zarodków bydła/świń jest istotną kwestią dla właściwej i wysokiej jakości hodowli zwierząt. Celem projektu APOZAR jest opracowanie nowej metody parametrycznej selekcji jakościowej zarodków bydła/świń, metodą mikrocytometryczną z wykorzystaniem detekcji optycznej. Czas trwania: 2008-2012
Lab-chip I przeznaczony do badania oocytów trzody chlewnej - konstrukcja a) b) Schemat lab-chipa krzemowo-szklanego: a) widok z góry, b) przecięcie Wymiary chipa: 35x35 mm 2 Szerokość komory pomiarowej:130 µm Długość drogi optyczne: 750 µm Światłowody: Ocean Optics 125/100 µm, złącza SMA
Etapy wytwarzania Etap I - podłoże krzemowe Podłoże krzemowe 3, typu n, grubość 380 µm Utlenianie termiczne (grubość SiO 2 1,5 µm) Fotolitografia jednostronna Etap II podłoże szklane Etap III łączenie podłoży Bonding anodowy podłoża krzemowego i szklanego (T=450 ºC, U=1,5 kv) Szkło Borofloat 3.3, 35x35 mm 2, grubość 1 mm Wiercenie otworów w pokrywie szklanej (φ = 0,8 mm) Montaż struktury na płytce PCB Trawienie kanałów metodą DRIE Usunięcie warstw maskujących Utlenianie termiczne (grubość SiO 2 0,3 µm) Montaż światłowodów i NanoPortu
Lab-chip I Lab-chip ze zintegrowanymi światłowodami Lab-chip w obudowie
Konfiguracja układu pomiarowego Schemat blokowy układu pomiarowego Rzeczywisty układ pomiarowy
Materiał biologiczny pozyskiwanie oocytów trzody chlewnej Jajnik trzody chlewnej
Wprowadzanie/wyprowadzanie oocytu do lab-chipa Wprowadzanie 1 2 Wyprowadzanie 1 2
Wprowadzanie/wyprowadzanie oocytu do lab-chipa
Analiza otrzymanych danych pomiarowych; metoda absorbancji
Charakteryzacja oocytów trzody chlewnej W tej metodzie, miarą jakości oocytów jest stosunek absorbancji mierzonej dla 550 nm i 850 nm (współczynnik AR) oraz długości fali odpowiadające maksymalnej absorbancji (APP).
Charakteryzacja oocytów trzody chlewnej Oocyty świńskie przedstawione według rosnącego współczynnika AR AR=A 550 /A 850 Badane oocyty podzielone wstępnie z zastosowaniem klasycznej metody morfologicznej zostały przyporządkowane do nowych klas względem współczynnika AR. Lepsze oocyty charakteryzował mniejszy współczynnik AR.
Charakteryzacja oocytów trzody chlewnej pole jakości Poukładano oocyty względem współczynników AR i APP. Wykazano, że w obszarze na lewo od średniej wartości AR znajdują się dobre i bardzo dobre oocyty, a na prawo słabe.
Krótkie podsumowanie Zaprezentowano nową metodę parametrycznej oceny jakości oocytów zwierząt hodowlanych Przeprowadzona klasyfikacja oocytów świńskich jest zgodna z dotychczas stosowaną oceną Wyznaczono stosunek absorbancji dla długości fali 550 nm i 850 nm (AR), który odzwierciedla budowę morfologiczną oocytu Oocyty bardziej zdegenerowane charakteryzowały się większą wartością współczynnika AR Dokonano drugiego podziału oocytów świńskich według obrazu morfologicznego i wartości współczynnika AR
Lab-chip II przeznaczony do badania zarodków bydlęcych i trzody chlewnej w metodzie transferu - konstrukcja Schemat chipa krzemowo-szklanego Cela pomiarowa Wymiary chipa: 35x35 mm 2 Wymiary kanału fluidycznego: szerokość 120 µm Długość drogi optycznej: 120 µm Światłowody: Ocean Optics 125/100 µm, złącza SMA
Lab-chip II Kanały dla światłowodów Pułapka dla zarodka Chip z wytrawionymi kanałami Widok centralnej części chipa z wytrawionymi kanałami cieczowymi oraz zaworami Tesla.
Instrumentarium z lab-chipem Lab-chip gotowy do użycia. Instrumentarium w trakcie pomiarów.
Transfer zarodków trzody chlewnej; (Lebnitz Institute, Institute of Farm Animals Biology, Dummerstorf, Niemcy)
Transfer zarodków bydlęcych; (Stacja Hodowlana w Dłoniach, Polska)
Wprowadzanie zarodka Mierzony zarodek wprowadzany jest do układu przy pomocy standardowej pipety laboratoryjnej, Zarodek jest unieruchomiony podczas pomiarów pomiędzy dwoma czołami światłowodów
Wprowadzanie/wyprowadzanie zarodka do lab-chipa
Charakteryzacja zarodków trzody chlewnej wybrane wyniki Przykładowe charakterystyki absorbancji zarodków trzody chlewnej. Zarodki rozmieszczone w polu jakości. Numer biorczyni Liczba przeniesionych zarodków Liczba narodzonych zwierząt Wydajność transferu 1 21 10 47 % (dobra)
Wynik hodowlany Przeprowadzono charakteryzację zarodków trzody chlewnej, wykorzystujące pomiary spektrofotometryczne w czasie rzeczywistym. Zarodki znajdujące się w I i II ćwiartce pola jakości prawidłowo zagnieździły się w matce biorczyni. Urodziło się 10 prosiąt. Potwierdzono nieinwazyjność metody spektrofotometrycznej wykorzystującej mikrocytometr weterynaryjny typu LOC. Otrzymano dobrą zgodność metody i wyniku hodowlanego.
Charakteryzacja zarodków bydlęcych wybrane wyniki Przykładowe charakterystyki absorbancji zarodków bydlęcych (morule). Poukładane zarodki względem Współczynnika AR i APP.
Wynik hodowlany Przeprowadzono charakteryzacje spektralną zarodków bydlęcych. Pomiary zostały przeprowadzono w warunkach typowego gospodarstwa hodowlanego. Zaimplantowano 4 zarodki, określone jako dobre metodą optyczną Narodziły się 3 cielaki. Potwierdzono nieinwazyjność wybranej metody badawczej. Otrzymano bardzo dobrą korelację metody i wyniku hodowlanego
Krótkie podsumowanie Przedstawiono nową spektrofotometryczną metodę parametrycznej oceny jakości oocytów i zarodków zwierząt hodowlanych. Wprowadzono dwa współczynniki AP oraz APP, które w sposób parametryczny odzwierciedlały budowę morfologiczną oocytów. Dzięki czemu dokonano nowego podziału jakościowego oocytów świńskich. Przeprowadzono ocenę materiału rozrodczego w rzeczywistym transferze zarodków. Narodziło się 10 zdrowych prosiąt oraz 3 zdrowe cielaki. Potwierdzono nieinwazyjność wybranej metody badawczej oraz prawidłową parametryczną ocenę jakościową oocytów i embrionów zwierząt hodowlanych.
Poza wykonanymi badaniami spektrofotometrycznymi, Poza wykonanymi badaniami spektrofotometrycznymi, wykonano również badania fluorymetryczne pozwalające na określenie apoptozy w zarodkach mysich.
Apoptosis testy przeżywalnościowe Apoptoza jest specyficzną formą zaprogramowanej śmierci komórki, dzięki której eliminowane są z organizmu niechciane komórki. Budowa nowego układu, który umożliwia wykrywanie apoptozy dzięki zastosowaniu fluorymetrycznej metody detekcji.
Pomiar fluorescencji pojedynczego zarodka
Lab-chip III przeznaczony do badania zarodków mysich - konstrukcja Schemat chipa krzemowo-szklanego Przekrój przez strukturę chipa krzemowo-szklanego Wymiary chipa: 35x35 mm 2 Wymiary kanału fluidycznego: szerokość 70 µm Długość drogi optycznej: 70 µm Światłowody: Ocean Optics 125/50 µm, złącza SMA
Lab-chip III Chip z wytrawionymi kanałami Zarodek w lab-chipie w trakcie pomiarów
Konfiguracja układu pomiarowego Schemat budowy układu pomiarowego Rzeczywisty układ
Wprowadzanie/wyprowadzanie zarodka do lab-chipa
Pozyskiwanie zarodków mysich Zarodek bez aktynomycyny D, bez barwnika Zarodek bez aktynomycyny D, z barwnikiem Pozyskiwanie zarodków Zarodek z aktynomycyną D, z barwnikiem
Badanie apoptozy w zarodkach mysich wybrane wyniki Średnia intensywność fluorescencji [j.u.] Średnie wartości intensywności fluorescencji zarodków mysich pochodzących z trzech grup pomiarowych. Grupy badanych zarodków Zarodki z aktynomycyną D i barwnikiem Zarodki bez aktynomycyny D z barwnikiem Ilość zarodków n Uzyskane blastocysty n (%) Ilość zarodków n Uzyskane blastocysty n (%) Badane na chipie 28 0 14 12 (85,7) referencja 26 0 14 11 (78,6)
Podsumowanie badań wykorzystujących metodę fluorymetryczną Aktynomycyna D z Annexin V Komórki rozrodcze myszy Aktynomycyna D bez Annexin V Alkohol z Annexin V Alkohol bez Annexin V 137 53 204 146 Przeprowadzono pomiar intensywności fluorescencji zarodków mysich podzielonych na trzy grupy: I - z wyindukowaną apoptozą i zabarwionych barwnikiem, II z samoistną apoptozą i zabarwionych barwnikiem, III zarodki niebarwione Zgodnie z przewidywaniami największą fluorescencję wykazała grupa zarodków z wyindukowaną apoptozą. Zarodki z grupy II poddane ocenie w LOC wykazywały progresję rozwoju do stadium blastocysty porównywalną z zarodkami grup kontrolnych, co potwierdza brak szkodliwości tej metody oceny w przedimpalntacyjnym rozwoju w hodowli in vitro
Podsumowanie i wnioski Opracowano wstępnie metodologię spektrofotometrycznej i fluorymetrycznej charakteryzacji oocytów/zarodków bydlęcych, świńskich i mysich wykorzystującą dedykowane chipy mikrofluidczne tworzące nową klasę mikrocytometrów weterynaryjnych. Opracowano i wykonano krzemowo-szklane struktury lab-chipów umożliwiających optyczną charakteryzację oocytów/zarodków. Opracowano i zestawiono przenośne stanowiska do optycznej charakteryzacji oocytów/zarodków (testy wykonywano w terenie). Przeprowadzono optyczną charakteryzację: - Oocytów świńskich metodą spektrofotometryczną wraz z ich wstępną klasyfikacją, - Zarodków świńskich (metodą spektrofotometryczną) wraz z ich selekcją i transferem, - Zarodków bydlęcych (metodą spektrofotometryczną) wraz z ich transferem, - Zarodków mysich (metoda fluorymetryczną) wraz z ich po-ewaluacyjną hodowlą in vitro. Potwierdzono: - Możliwość spektrofotometrycznej charakteryzacji oocytów/zarodków bydlęcych i świńskich, - Nieinwazyjny charakter opracowanej metodologii spektrofotometrycznej narodziny prosiąt i cielaków - Możliwość fluorymetrycznej oceny stanu apoptozy zarodków mysich, - Nieinwazyjny charakter metody fluorymetrycznej hodowla in vitro zarodków.
Finansowanie badań Prace były finansowane z projektu POIG 01.03.01-00-014/08 podprojekt 2B APOZAR oraz grantu promotorskiego 350938. Instytucje zaangażowane w realizację projektu:
Dziękuję za uwagę
5 th International Forum SPECIAL FORUM & EXHIBITION BEST OF EAST FOR EASTER PARTNERSHIP Challenges and Opportunities for Collaboration European Union Poland Eastern Europe Countries November 28-30, 2011 WARSAW, Poland Lab-on-a-chip for quality assessment of reproductive cells of breeding animals Patrycja Śniadek Wroclaw University of Technology(Poland) Forum is co-financed by European Union from European Social Fund