OPORNOŚĆ SZCZEPÓW PSEUDOMONAS AERUGINOSA NA KARBAPENEMY PO INKUBACJI Z SUBINHIBICYJNYMI STĘŻENIAMI IMIPENEMU I MEROPENEMU

Nowiny Lekarskie 2011, 80, 4, 258 265 PAWEŁ SACHA 1, PIOTR WIECZOREK 1, DOMINIKA OJDANA 1, SŁAWOMIR CZABAN 2, DOROTA OLSZAŃ- SKA 3, ELŻBIETA TRYNISZEWSKA 1, 3 OPORNOŚĆ SZCZEPÓW PSEUDOMONAS AERUGINOSA NA KARBAPENEMY PO INKUBACJI Z SUBINHIBICYJNYMI STĘŻENIAMI IMIPENEMU I MEROPENEMU RESISTANCE OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA TO CARBAPENEMS AFTER INCUBATION WITH SUBINHIBITORY CONCENTRATIONS OF IMIPENEM AND MEROPENEM 1 Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej i Immunologii Infekcyjnej Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. Elżbieta Tryniszewska 2 Zakład Anestezjologii i Intensywnej Terapii Uniwersytet Medyczny w Białymstoku Kierownik: dr n. med. Sławomir Lech Czaban 3 Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej i Immunologii Infekcyjnej Uniwersytecki Szpital Kliniczny w Białymstoku Kierownik: prof. dr hab. Elżbieta Tryniszewska Streszczenie Wstęp. Antybiotyki z grupy karbapenemów coraz częściej są stosowane u pacjentów szpitalnych. Imipenem i meropenem jako leki oporne na większość ß-laktamaz mają zastosowanie w leczeniu zakażeń spowodowanych przez pałeczki Gram-ujemne wytwarzające ß-laktamazy o szerokim spektrum (ESBL). Tego typu postępowanie terapeutyczne przyczynia się do selekcji szczepów opornych. Cel. Celem badań jest analiza oporności szczepów Pseudomonas aeruginosa po inkubacji z subinhibicyjnymi stężeniami imipenemu i meropenemu. Materiał i metodyka. W badaniach wykorzystano 20 szczepów Pseudomonas aeruginosa (10 szczepów wrażliwych i 10 opornych na imipenem i meropenem). W pierwszym etapie zbadano występowanie różnych mechanizmów oporności (AmpC, MBL, czynne usuwanie leku z komórki) i określono wartości MIC (początkowe) dla imipenemu i meropenemu. W kolejnym etapie prowadzono przez 72 i 120 godziny indukcję subinhibicyjnymi (½ MIC i ¼ MIC) stężeniami badanych antybiotyków i ponownie oceniano wartości MIC wszystkich badanych szczepów. Wyniki. Szczepy oporne na meropenem i imipenem wykazywały istotny statystycznie wzrost oporności w wyniku hodowli z subinhibicyjnymi stężeniami imipenemu. Najwyższy wzrost wartości MIC zaobserwowano po indukcji stężeniem ½ MIC impenemu przez 120 godziny szczepów pierwotnie opornych. Z kolei meropenem indukował wzrost oporności jedynie u 4 szczepów (Psa 02, Psa 11, Psa 35 i Psa 42). Wnioski. Subinhibicyjne stężenia imipenemu silniej niż meropenem indukowały oporność pałeczek Pseudomonas aeruginosa. Istotny statystycznie wzrost wartości MIC występował w obu badanych grupach szczepów Pseudomonas aeruginosa po 120-godzinnej inkubacji ze stężeniami o wartościach ½ MIC badanych leków. SŁOWA KLUCZOWE: indukcja, oporność, Pseudomonas aeruginosa, imipenem, meropenem. Summary Introduction. Carbapenem antibiotics are more often used in hospitalized patients. Imipenem and meropenem as drugs resistant to most beta-lactamases are applicable in the treatment of infections caused by Gram-negative bacilli which produce broad spectrum beta-lactamase (ESBL). This type of therapeutic treatment contributes to selection of resistant strains. Aim. The aim of this study is to analyze resistance of Pseudomonas aeruginosa after incubation with subinhibitory concentrations of imipenem and meropenem. Method and material. The study used 20 strains of Pseudomonas aeruginosa (10 strains susceptible and 10 resistant to imipenem and meropenem). In the first phase we examined the occurrence of different mechanisms of resistance (AmpC, MBL, active removal of the drug from the cell) and determined the MIC values (initial) for imipenem and meropenem. The next stage was carried out after 72 and 120 hour induction with subinhibitory (½ and ¼ MIC) concentrations of the antibiotics tested and involved re-evaluation of MICs of all tested strains. Results. Strains resistant to meropenem and imipenem showed a statistically significant increase of resistance as a result of culture with subinhibitory concentrations of imipenem. The highest increase in MIC values was observed in strains initially resistant after induction concentration of ½ MIC impenem for 120 hours. Meropenem induced resistance increase in only 4 strains (Psa 02, Psa 11, Psa 35 i Psa 42). Conclusion. Subinhibitory concentrations of imipenem are stronger than meropenem in induction of resistance in Pseudomonas aeruginosa. Statistically significant increase of MIC values occurred in both groups of Pseudomonas aeruginosa strains after 120 hours of incubation with concentrations of ½ MIC values of tested drugs. KEY WORDS: induction, resistance, Pseudomonas aeruginosa, imipenem, meropenem.

Oporność szczepów Pseudomonas aeruginosa na karbapenemy po inkubacji z subinhibicyjnymi 259 Wstęp Bardzo często w praktyce klinicznej do leczenia zakażeń wywołanych przez pałeczki Gram-ujemne z rodziny Enterobacteriaceae, stosowane są cefalosporyny III generacji. Z kolei w przypadku szczepów wytwarzających ß-laktamazy o rozszerzonym spektrum substratowym (ESBL) oraz pałeczek Pseudomonas aeruginosa są to antybiotyki z grupy karbapenemów imipenem i meropenem. Tego typu postępowanie terapeutyczne sprzyja kolonizacji środowiska szpitalnego przez szczepy wielooporne. Przyczyną występowania w środowisku szpitalnym szczepów Pseudomonas aeruginosa jest również ich naturalna oporność na szereg grup antybiotyków [1 3]. W związku ze stosowaniem karbapenemów w leczeniu pacjentów szpitalnych istnieje uzasadniona obawa dotycząca możliwości indukowania oporności i rozprzestrzeniania się tej cechy wśród szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie wrażliwych na imipenem i/lub meropenem. Cel Celem pracy była ocena oporności wśród szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie wrażliwych lub opornych na imipenem i meropenem po indukcji subinhibicyjnymi stężeniami tych leków. Materiał i metody Szczepy bakteryjne Do badań związanych z indukcją oporności przez imipenem i meropenem wybrano 20 szczepów Pseudomonas aeruginosa (10 wrażliwych oraz 10 opornych). Szczepy identyfikowano z zastosowaniem kart GNI i systemu VI- TEK (biomérieux) postępując zgodnie z instrukcją producenta. Wszystkie szczepy izolowano z materiałów otrzymanych z oddziału intensywnej opieki medycznej Uniwersyteckiego Szpitala Klinicznego w Białymstoku. Do kontroli prowadzonych badań stosowano szczepy wzorcowe: ATCC 27853 Pseudomonas aeruginosa, ATCC 25922 Escherichia coli, ATCC 35218 Escherichia coli. Antybiotyki Do indukowania oporności in vitro na karbapenemy oraz oznaczania wartości MIC (najmniejsze stężenie hamujące wzrost bakterii; mg/l) zastosowano preparaty handlowe do stosowania dożylnego zawierające imipenem (Thienam; Merc&Co., Inc.) i meropenem (Meronem; AstraZeneca). Badanie wrażliwości na antybiotyki metodą krążkowodyfuzyjną Badania wrażliwości na antybiotyki Pseudomonas aeruginosa przeprowadzono na podłożu agarowym Mueller-Hintona (Oxoid), z zastosowaniem krążków bibułowych (BD BBL) z następującymi antybiotykami: tikarcylina, tikarcylina/kwas klawulanowy, piperacylina, piperacylina/tazobaktam, ceftazydym, cefepim, aztreonam, gentamycyna, netilmycyna, amikacyna, tobramycyna, ciprofloksacyna, imipenem, meropenem. Badania wykonano postępując zgodnie z zaleceniami CLSI [4]. Oznaczanie wartości MIC (mg/l) imipenemu i meropenemu z zastosowaniem metody mikrorozcieńczeniowej w bulionie Mueller-Hintona wśród szczepów poddanych indukcji Z hodowli Pseudomonas aeruginosa na agarze Mueller-Hintona bez antybiotyków i zawierającym różne stężenia subinhibicyjne (½ MIC, ¼ MIC) imipenemu lub meropenemu sporządzano zawiesinę bakterii w bulionie Mueller-Hintona (Oxoid) o gęstości 0,5 w skali MacFarlanda (~108 cfu/ml). Następnie rozcieńczano ją w stosunku 1:100 w bulionie Mueller-Hintona, uzyskując zawiesinę o gęstości 105 cfu/ml, którą stosowano do oznaczania wartości MIC (imipenem i meropenem) badanych szczepów przed i po indukcji badanymi antybiotykami. Badania dotyczące oznaczania wartości MIC wykonywano w jałowych płytkach titracyjnych (typu U) zgodnie z metodyką i zaleceniami NCCLS/CLSI [5]. Indukowanie in vitro oporności na karbapenemy z zastosowaniem subinhibicyjnych stężeń (½ MIC i ¼ MIC) imipenemu i meropenemu. W pierwszym etapie, przed indukowaniem oporności, wszystkim wybranym szczepom oznaczono wartość początkową MIC (pierwotną) imipenemu (MICIMP/P) i meropenemu (MICMEM/P). Do indukowania oporności wykorzystano podłoża z agarem Mueller-Hintona zawierające subinhibicyjne stężenia imipenemu lub meropenemu (½ i ¼ MIC badanych szczepów). Do przygotowania tych podłóż wykorzystano preparaty handlowe imipenemu (Thienam; Merc&Co.Inc.) i meropenemu (Meronem; AstraZeneca). Przed przystąpieniem do badań związanych z indukowaniem oporności szczepy hodowano 18 godzin w bulionie Mueller-Hintona, w temperaturze 35 C. Następnie na środek płytki z odpowiednim agarem Mueller- Hintona nanoszono 100 μl zawiesiny (o gęstości ~108 cfu/ml) badanego szczepu w bulionie Mueller-Hintona. Każdy z badanych szczepów posiewano każdorazowo w 2 seriach na 5 płytkach Petriego zawierających agar Mueller-Hintona z imipenem (w stężeniu ½ MIC 1 płytka, ¼ MIC 1 płytka), agar Mueller-Hintona z meropenemem (w stężeniu ½ MIC 1 płytka, ¼ MIC 1 płytka) oraz agar Mueller-Hintona bez antybiotyków (1 płytka). Szczepy po 24-godzinnej hodowli pasażowano na świeże podłoża według powyżej opisanego schematu. Pasaże wykonywano przez kolejne 4 doby (przesiew po 24 godzinach inkubacji). Po 72 i 120 godzinach hodowli dokonywano oznaczenia wartości MIC indukowanych szczepów z zastosowaniem metody mikrorozcieńczeniowej. Po zakończeniu badań wszystkie szczepy indukowane przez 120 godziny subinhbicyjnymi stężeniami (½ i ¼ MIC) imipenemu i meropenemu pasażowano 3-krotnie po 24 godziny hodowli na podłożu Mueller-Hintona bez antybiotyku i po ostatnim pasażu oznaczano wartość MIC imipenemu i meropenemu.

260 Paweł Sacha i inni Wykrywanie mechanizmów oporności Obecność wytwarzania cefalosporynazy (AmpC) badano z zastosowaniem metody opisanej przez Black i wsp. [6]. Zdolność wytwarzania metalobetalaktamaz (MBLs) oceniano z zastosowaniem E-testów (IP/IPI; AB Biodisk) w oparciu o kryteria producenta E-testów. W badaniach dotyczących wykrywania mechanizmu czynnego usuwania antybiotyku z komórki wykorzystano PaβN (Phe-Arg-β-naphthylamide; Sigma), inhibitor tego mechanizmu. Zawiesinę szczepów (0,5 w skali MacFarlanda) opornych na imipenem i meropenem posiewano jałową wymazówką na agarze Mueller-Hintona oraz agarze Mueller-Hintona zawierającym w swoim składzie PaβN w stężeniu 50 mg/l [7]. Następnie na powierzchni obu podłóż umieszczano krążki zawierające imipenem, meropenem oraz ciprofloksacynę. Po 18-godzinnej inkubacji dokonywano pomiaru stref zahamowania wzrostu dookoła krążków z antybiotykami na agarze Mueller-Hintona z PaβN i agarze Mueller-Hintona bez PaβN i porównywano wyniki pomiaru tych stref obliczając różnicę. Za wynik dodatni badania przyjęto różnicę w wielkości stref zahamowania wzrostu na agarze Mueller- Hintona z PaβN i agarze Mueller-Hintona bez PaβN, wynoszącą 5 mm. Ocena statystyczna W analizie statystycznej, porównując niezależne zmienne porządkowe, zastosowano nieparametryczny test U Manna-Whitneya w przypadku dwóch grup. Porównując zmienne zależne wykorzystano test kolejności par Wilcoxona dla dwóch zmiennych. Wyniki istotne statystycznie uznano na poziomie p < 0,05. W obliczeniach wykorzystano pakiet Statistica 8.0 (StatSoft; Polska) Wyniki Wrażliwość na antybiotyki szczepów Pseudomonas aeruginosa wybranych do badań indukowania oporności przez imipenem i meropenem przedstawiono na rycinie 1. W grupie szczepów opornych na karbapenemy (Rycina 1A) aż 90% szczepów było opornych na antybiotyki aminoglikozydowe, ciprofloksacynę, piperacylinę i tikarcylinę (także w połączeniu z inhibitorami β-laktamaz). Z kolei szczepy wrażliwe na karbapenemy (Rycina 1B) były w 100% wrażliwe na cefepim. Najwyższą oporność obserwowano wobec ciprofloksacyny 40% szczepów opornych. Przeprowadzone badania dotyczące wytwarzania metalo-β-laktamaz (z zastosowaniem E-testów) i/lub obecności mechanizmu czynnego usuwania karbapenemów z komórki (z zastosowaniem inhibitora PaβN) nie potwierdziły udziału tych mechanizmów w oporności wybranych do badań szczepów na imipenem i meropenem. Zastosowanie krążka z ciprofloksacyną pozwoliło wykazać obecność mechanizmu czynnego usuwania fluorochinolonów u 69,2% (9/13) szczepów opornych na ten antybiotyk. Ponadto u 80% szczepów opornych i 40% szczepów wrażliwych na karbapenemy wykazano zdolność wytwarzania cefalosporynazy typu AmpC. W tabelach 1 i 2 przedstawiono wyniki dotyczące uzyskanych wartości MIC szczepów Pseudomonas aeruginosa przed i po inkubacji (72 i 120 godzin) z subinhibicyjnymi (½ MIC i ¼ MIC) stężeniami imipenemu lub meropenemu. Szczepy oporne na meropenem i imipenem (Tabela 1) wykazywały silną tendencję do ekspresji oporności w wyniku hodowli z subinhibicyjnymi stężeniami imipenemu. Aż u 9 z 10 szczepów poddanych indukowaniu różnymi stężeniami imipenemu wykazano wzrost wartości MIC imipenemu po 120 godzinach indukcji. Z kolei meropenem indukował wzrost oporności jedynie u 4 szczepów (Psa 02, Psa 11, Psa 35 i Psa 42). W przypadku szczepów pierwotnie wrażliwych (Tabela 2) tylko u jednego szczepu (Psa 40) stwierdzono po 120 godzinach inkubacji istotną zmianę oporności na imipenem (szczep wrażliwy; MIC = 4 mg/l 16 mg/l; szczep oporny). Ten sam szczep wykazywał również zmiany w oporności na meropenem (MIC= 2 mg/l 4 mg/l). Zmiany oporności na meropenem nie były na tyle silnie wyrażone, ażeby zakwalifikować ten szczep jako klinicznie oporny na meropenem. Z kolei inny szczep Pseudomonas aeruginosa (Psa 72), pomimo iż prezentował po indukcji silniejszą ekspresję oporności związaną z tolerancją wyższych stężeń imipenemu (MIC= 0,125 mg/l 1 mg/l), również nie kwalifikował się jako oporny na ten lek. Żaden z pierwotnie wrażliwych na oba karbapenemy szczepów po indukcji ze stężeniem ¼ MIC meropenemu nie zmienił poziomu (MIC) pierwotnej oporności na meropenem (Tabela 2). Na rycinie 2 i 3 przedstawiono zmiany wartości MIC (wielokrotność) badanych szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie opornych (Rycina 2) i wrażliwych (Rycina 3) na karbapenemy. Najwyższy wzrost wartości MIC zaobserwowano po indukcji stężeniem ½ MIC impenemu przez 120 godziny szczepów pierwotnie opornych (Rycina 2A). U 50% badanych szczepów zaobserwowano 2-krotny i u 20% 4-krotny i 8-krotny wzrost wartości MIC. Nie zaobserwowano zmian wartości MIC po indukcji stężeniem o wartości ¼ MIC meropenem przez 72 godziny w grupie szczepów opornych (Rycina 2B) i wrażliwych (Rycina 3B) na meropenem. Przedłużenie procesu indukcji do 120 godzin tym antybiotykiem (Rycina 2B) spowodowało 2-krotny wzrost wartości MIC u 20% badanych szczepów. Najsilniejszy efekt ekspresji oporności wśród wszystkich użytych w badaniach szczepów Pseudomonas aeruginosa, stwierdzono po zastosowaniu przez 120 godziny subinhibicyjnych stężeń o wartościach ½ MIC imipenemu. U 90% szczepów pierwotnie opornych (Rycina 2A) i 70% szczepów pierwotnie wrażliwych (Rycina 3A) wykazano istotny wzrost oporności na imipenem. Znacznie słabszy efekt indukcyjny obserwowano stosując indukcję stężeniami o wartościach ½ i ¼ MIC meropenemu. Tylko u 40% pierwotnie opornych i 30% wrażliwych szczepów obser-

Oporność szczepów Pseudomonas aeruginosa na karbapenemy po inkubacji z subinhibicyjnymi 261 wowano niewielki wzrost wartości MIC (2-krotny lub 4- krotny) meropenemu (Rycina 2B i 3B). Wykonane po zakończeniu badań 3-krotne pasaże (72 godziny) szczepów na podłożu Mueller-Hintona bez antybiotyku i oznaczenia wartości MIC imipenemu i meropenemu wykazały, że wartości MIC po pasażach na podłożach bez antybiotyków odpowiadają takim samym wartościom MIC jak po 120-godzinnej hodowli szczepów indukowanych subinhibicyjnymi stężeniami (½ lub ¼ MIC karbapenemów). Ciprofloksacyna Tobramycyna Amikacyna Netilmycyna Gentamycyna Aztreonam Cefepim Ceftazydym Piperacylina/tazobaktam Piperacylina Tikarcylina/kwas klawulanowy Tikarcylina 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Szczepy wrażliwe Szczepy średniowrażliwe Szczepy oporne A. Szczepy Pseudomonas aeruginosa pierwotnie oporne na imipenem i meropenem Ciprofloksacyna Tobramycyna Amikacyna Netilmycyna Gentamycyna Aztreonam Cefepim Ceftazydym Piperacylina/tazobaktam Piperacylina Tikarcylina/kwas klawulanowy Tikarcylina 0% 10% 20% 30% 40% 50% 60% 70% 80% 90% 100% Szczepy wrażliwe Szczepy średniowrażliwe Szczepy oporne B. Szczepy Pseudomonas aeruginosa pierwotnie wrażliwe na imipenem i meropenem Rycina 1. Porównanie wrażliwości na antybiotyki szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie opornych (A) lub wrażliwych (B) na imipenem i meropenem Figure 1. Antibiotic susceptibility of Pseudomonas aeruginosa strains initially resistant (A) or susceptible (B) to imipenem and meropenem

262 Paweł Sacha i inni Tabela 1. Wartości MIC (mg/l) szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie opornych na imipenem i meropenem po inkubacji z subinhibicyjnymi stężeniami tych leków Table 1. MIC values (mg/l) of Pseudomonas aeruginosa strains initially resistant to imipenem and meropenem after incubation with subinhibitory concentrations of these drugs Szczep MIC IMP/P 72 godz. MIC T (mg/l) ½ MIC IMP/P ¼ MIC IMP/P ½ MIC MEM/P ¼ MIC MEM/P 120 72 120 MIC MEM/P 72 120 72 godz. godz. godz. godz. godz. godz. Psa 01 16 16 32 16 16 16 16 16 16 16 Psa 02 16 32 64 16 32 16 32 32 16 32 Psa 11 16 32 128 32 32 32 32 64 32 32 Psa 13 16 32 64 32 32 16 16 16 16 16 Psa 35 16 32 128 32 32 32 64 64 32 64 Psa 39 16 32 32 16 16 16 16 16 16 16 Psa 42 32 32 64 32 32 16 16 32 16 16 Psa 46 16 16 32 16 16 16 16 16 16 16 Psa 47 16 32 32 16 16 16 16 16 16 16 Psa 50 32 32 32 32 32 32 32 32 32 32 120 godz. Objaśnienia: MIC T wartości MIC (mg/l) imipenemu lub meropenemu oznaczone po 72- lub 120-godzinnej indukcji z subinhibicyjnymi stężeniami tych antybiotyków, MIC IMP/P wartość początkowa MIC (mg/l) imipenemu oznaczona dla szczepów przed indukcją, ½ MIC IMP/P, ¼ MIC IMP/P subinhibicyjne stężenia imipenemu stosowane do indukcji oporności, MIC MEM/P wartość początkowa MIC (mg/l) meropenemu oznaczona dla szczepów przed indukcją, ½ MIC MEM/P, ¼ MIC MEM/P subinhibicyjne stężenia meropenemu stosowane do indukcji oporności. Tabela 2. Wartości MIC (mg/l) szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie wrażliwych na imipenem i meropenem po inkubacji z subinhibicyjnymi stężeniami tych leków Table 2. MIC values (mg/l) of Pseudomonas aeruginosa strains initially susceptible to imipenem and meropenem after incubation with subinhibitory concentrations of these drugs MIC T (mg/l) Szczep MIC IMP/P ½ MIC IMP ¼ MIC IMP ½ MIC MEM ¼ MIC MEM MIC MEM/P 72h 120h 72h 120h 72h 120h 72h 120h Psa 03 4 4 8 4 4 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 Psa 29 4 4 4 4 4 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Psa 34 2 2 4 2 2 2 2 4 2 2 Psa 40 4 4 16 4 8 2 4 4 2 2 Psa 41 1 1 1 1 1 0,250 0,5 1 0,250 0,250 Psa 43 0,5 2 2 1 1 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 Psa 72 0,125 1 1 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 0,125 Psa 93 1 1 1 1 1 0,5 0,5 0,5 0,5 0,5 Psa 110 0,5 0,5 1 0,5 1 2 2 2 2 2 Psa 118 0,5 1 1 0,5 0,5 4 4 4 4 4 Objaśnienia: MIC T wartości MIC (mg/l) imipenemu lub meropenemu oznaczone po 72- lub 120-godzinnej indukcji z subinhibicyjnymi stężeniami tych antybiotyków, MIC IMP/P wartość początkowa MIC (mg/l) imipenemu oznaczona dla szczepów przed indukcją, ½ MIC IMP/P, ¼ MIC IMP/P subinhibicyjne stężenia imipenemu stosowane do indukcji oporności, MIC MEM/P wartość początkowa MIC (mg/l) meropenemu oznaczona dla szczepów przed indukcją, ½ MIC MEM/P, ¼ MIC MEM/P subinhibicyjne stężenia meropenemu stosowane do indukcji oporności.

Oporność szczepów Pseudomonas aeruginosa na karbapenemy po inkubacji z subinhibicyjnymi 263 100% szczepów 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 72 godz. 120 godz. 72 godz. 120 godz. ½ MIC ¼ MIC MIC (bez zmian) 2 x MIC 4 x MIC 8 x MIC A. MIC imipenem szczepów 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 72 godz. 120 godz. 72 godz. 120 godz. ½ MIC ¼ MIC MIC (bez zmian) 2 x MIC 4 x MIC 8 x MIC B. MIC meropenem Rycina 2. MIC (wielokrotność) szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie opornych na imipenem (A) i meropenem (B) po 72- i 120-godzinnej indukcji subinhibicyjnymi stężeniami tych antybiotyków. Figure 2. MIC (multiplicity) of Pseudomonas aeruginosa strains initially resistant to imipenem (A) and meropenem (B) after 72 and 120 hours of induction with subinhibitory concentrations of these antibiotics.

264 Paweł Sacha i inni szczepów 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 72 godz. 120 godz. 72 godz. 120 godz. ½ MIC ¼ MIC MIC (bez zmian) 2 x MIC 4 x MIC 8 x MIC A. MIC imipenem 100% szczepów 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 72 godz. 120 godz. 72 godz. 120 godz. ½ MIC ¼ MIC MIC (bez zmian) 2 x MIC 4 x MIC 8 x MIC B. MIC meropenem Rycina 3. MIC (wielokrotność) szczepów Pseudomonas aeruginosa pierwotnie wrażliwych na imipenem (C) i meropenem (D) po 72- i 120-godzinnej indukcji subinhibicyjnymi stężeniami tych antybiotyków. Figure 3. MIC (multiplicity) of Pseudomonas aeruginosa strains initially susceptible to imipenem (A) and meropenem (B) after 72 and 120 hours of induction with subinhibitory concentrations of these antibiotics Dyskusja Obserwowany w ostatnich latach sukcesywny wzrost izolacji z materiałów klinicznych pałeczek Pseudomonas aeruginosa związany jest w dużej mierze z nieracjonalnym stosowaniem leków o szerokim spektrum. Problem ten staje się tym groźniejszy, że brak jest perspektyw wprowadzenia nowych, skutecznych leków do zwalczania zakażeń, za które odpowiedzialne są wielooporne szczepy Pseudomonas aeruginosa. Fakt naturalnej oporności tych bakterii i możliwość nabywania oporności na antybiotyki przyczynia się do rozprzestrzeniania takich szczepów w środowisku szpi- talnym, co z kolei stwarza olbrzymie problemy w terapii zakażeń [3, 8]. Przeprowadzone w ostatnich latach badania oporności pałeczek Pseudomonas aeruginosa na meropenem i imipenem wykazały niepokojący wzrost oporności na ten antybiotyk [9, 10]. W Polsce badania wykonane przez Patzera i wsp. [11] wykazały występowanie oporności na imipenem u 15% badanych szczepów Pseudomonas aeruginosa. Oporność pałeczek Pseudomonas aeruginosa na antybiotyki (w tym na karbapenemy) może być uwarunkowana przez wiele mechanizmów. Należą do nich utra-

Oporność szczepów Pseudomonas aeruginosa na karbapenemy po inkubacji z subinhibicyjnymi 265 ta białek porynowych (OprD), obecność systemów czynnego usuwania leków, modyfikacja receptorów wiążących antybiotyk (PBP3 i PBP4) oraz zdolność wytwarzania β-laktamaz [2, 3, 8]. Bardzo często wśród szczepów Pseudomonas aeruginosa opornych na karbapenemy obserwuje się również oporność na antybiotyki aminoglikozydowe, cefalosporyny, fluorochinolony i połączenia antybiotyków β-laktamowych z inhibitorami β-laktamaz [11, 12]. Potwierdzają to spostrzeżenia wynikające z przeprowadzonych przez nas badań dotyczących oporności na inne antybiotyki (90% szczepów opornych) wśród szczepów opornych na imipenem i meropenem. Uzyskany w badaniach własnych wzrost wartości MIC (od 2- do 8-krotny) oraz potwierdzenie wytwarzania AmpC wskazuje, iż mechanizmem odpowiedzialnym za oporność użytych w badaniach pałeczek Pseudomonas aeruginosa jest prawdopodobnie utrata białek OprD w połączeniu z wytwarzaniem (derepresja) cefalosporynazy AmpC. Powyższe wnioski wynikają z danych literaturowych [13 18] oraz z faktu, iż nie wykazaliśmy w populacji badanych szczepów udziału innych mechanizmów, tj. metalo-β-laktamaz i czynnego usuwania karbapenemów z komórki. Przeprowadzone przez nas badania oporności szczepów (wcześniej indukowanych) po pasażach bez antybiotyków pozostają w dużej zgodności z badaniami Pournarasa i wsp. [12] i pozwalają na postawienie wniosku, że indukcja subinhibicyjnymi stężeniami imipenemu wyzwala trwałą oporność na ten antybiotyk. Podsumowując wyniki naszych badań można stwierdzić, iż nadużywanie w terapii zakażeń szpitalnych imipenemu może być przyczyną narastania oporności wśród szczepów Pseudomonas aeruginosa występujących w środowisku szpitalnym. Wnioski 1. Subinhibicyjne stężenia imipenemu silniej niż meropen indukowały oporność pałeczek Pseudomonas aeruginosa. 2. Istotny statystycznie wzrost wartości MIC występował w obu badanych grupach szczepów Pseudomonas aeruginosa po 120-godzinnej inkubacji ze stężeniami o wartościach ½ MIC badanych leków. Piśmiennictwo 1. Cornaglia G., Hryniewicz W., Jarlier V. et al.: European recommendations for antimicrobial resistance surveillance. Clin. Microbiol. Infect., 2004, 10, 349-383. 2. Kattan J.N., Villegas M.V., Quinn J.P.: New developments in carbapenems. Clin. Microbiol. Infect., 2008, 14, 1102-1111. 3. Strateva T., Yordanov D.: Pseudomonas aeruginosa a phenomenon of bacterial resistance. J. Med. Microbiol., 2009, 58,1133-1148. 4. Clinical and Laboratory Standards Institute: Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Seventeenth Informational Supplement: M100-S17. NCCLS 2007, Wayne, PA, USA. 5. National Committee for Clinical Laboratory Standards: Methods for Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically-Fifth Edition: Approved Standard M7-A5. NCCLS 2000, Wayne, PA, USA. 6. Black J.A., Thomson K.S., Buynak J.D. et al.: Evaluation of β-lactamase inhibitors in disk tests for detection of plasmid-mediated AmpC beta-lactamases in wellcharacterized clinical strains of Klebsiella spp. J. Clin. Microbiol., 2005, 43, 4168-4171. 7. Mesaros N., Glupczynski Y., Avrain L. et al.: A combined phenotypic and genotypic method for the detection of Mex efflux pumps in Pseudomonas aeruginosa. J. Antimicrob. Chemother., 2007, 59, 378-386. 8. Sacha P., Wieczorek P., Hauschild T. et al.: Metallo-betalactamases of Pseudomonas aeruginosa a novel mechanism resistance to beta-lactam antibiotics. Folia Histochem. Cytobiol.. 2008, 46, 137-42. 9. Lepper P.M., Grusa E., Reichl H. et al.: Consumption of imipenem correlates with β-lactam resistance in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother., 2002, 46, 2920-2925. 10. Turner P.J.: MYSTIC Europe 2007: activity of meropenem and other broad-spectrum agents against nosocomial isolates. Diagn. Microbiol. Infect. Dis., 2009, 63, 217-222. 11. Patzer J.A, Dzierzanowska D.: Increase of imipenem resistance among Pseudomonas aeruginosa isolates from a Polish paediatric hospital (1993-2002). Int. J. Antimicrob. Agents, 2007, 29, 153-8. 12. Pournaras S., Ikonomidis A., Markogiannakis A. et al.: Characterization of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa heterogeneously resistant to carbapenems. J. Med. Microbiol., 2007, 56, 66-70. 13. Ballestero S., Fernández-Rodríguez A., Villaverde R. et al.: Carbapenem resistance in Pseudomonas aeruginosa from cystic fibrosis patients. J. Antimicrob. Chemother., 1996, 38, 39-45. 14. Farra A., Islam S., Strålfors A. et al.: Role of outer membrane protein OprD and penicillin-binding proteins in resistance of Pseudomonas aeruginosa to imipenem and meropenem. Int. J. Antimicrob. Agents, 2008, 31, 427-33. 15. Köhler T., Michea-Hamzehpour M., Epp S.F. et al.: Carbapenem activities against Pseudomonas aeruginosa: respective contributions of OprD and efflux systems. Antimicrob. Agents Chemother., 1999, 43, 424-427. 16. Pai H., Kim J., Kim J. et al.: Carbapenem resistance mechanisms in Pseudomonas aeruginosa clinical isolates. Antimicrob. Agents Chemother., 2001, 45, 480-484. 17. Tausk F., Evans M.E., Patterson L.S. et al.: Imipeneminduced resistance to antipseudomonal β-lactams in Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother., 1985, 28, 41-45. 18. Zhou X.Y., Kitzis M.D., Gutmann L.: Role of cephalosporinase in carbapenem resistance of clinical isolates of Pseudomonas aeruginosa. Antimicrob. Agents Chemother., 1993, 37, 1387-1389. Adres do korespondencji: Paweł Sacha Zakład Diagnostyki Mikrobiologicznej i Immunologii Infekcyjnej Uniwersytet Medyczny w Białymstoku ul. Waszyngtona 15A 15-269 Białystok e-mail: sachpt@umb.edu.pl