Glony jednokomórkowe, odciek pofermentacyjny, biomasa glonowa,fotobioreaktor Karolina KUPCZYK, Marcin ZIELIŃSKI, Marcin DĘBOWSKI, Magdalena ROKICKA* EFEKTYWNOŚĆ WYKORZYSTANIA SUBSTANCJI BIOGENNYCH POCHODZĄCYCH Z ODCIEKÓW POFERMENTACYJNYCH W PROCESIE PRODUKCJI BIOMASY MIKROGLONÓW W artykule przedstawiono wyniki badań na temat hodowli mikroglonów Chlorelli sp.w fotobioraktorze rurowym w warunkach laboratoryjnych. Zastosowano dwie formy dostarczania związków pokarmowych w formie odcieku pofermentacyjnego i pożywki syntetycznej jako próby kontrolnej. Pozyskiwanie odcieku następowało z fermentora metanowego zasilanego biomasą glonową i kiszonką kukurydzy w stosunku 1:2. Badania przeprowadzano przez 60 dni, z czterodniowymi odstępami kontrolowania wskaźników i dostarczania niezbędnych ilości składników pokarmowych. Podczas trwania eksperymentu niezależnie od zastosowanej pożywki obserwowano stały przyrost biomasy. Wielkości przyrostu były zbliżone w obu wariantach badań. Uzyskano maksymalne stężenie biomasy glonów na poziomie 1440 mg s.m. /dm 3 w reaktorze z odciekiem fermentacyjnym i 1515 mg s.m. /dm 3 z pożywką syntetyczną. Szybkość wykorzystywania biogenów przez biomasę glonową rosła wraz z trwaniem eksperyentu. Uzyskiwano zblizone wartości niezależnie od rodzaju wprowadzanej pożywki. Dla azotu amonowego było to około 40 mg/d, a dla ortofosforanów 13 mg/d. Zastosowanie odcieku pofermentacyjnego jako pożywki dało zbliżoną efektywność hodowli mikroglonów co odnośnikowa pożywka syntetyczna. 1. WSTĘP Rozwój energetyki odnawialnej w oparciu o biomasę roślinną napotyka na trudności związane z ograniczonym dostępem do surowców. Warunki ekonomiczne powodują, iż uprawy celowe roślin wyższych (np. kukurydzy) na potrzeby produkcji energii w biogazowniach są nieopłacalne [10]. Dodatkowo pojawia się silnie akcentowany * Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie, ul. Oczapowskiego 2, 10-719 Olsztyn, karolina.kupczyk@uwm.edu.pl
302 K.KUPCZYK i in. aspekt moralny, liczne środowiska odrzucają możliwość produkcji energii z roślin jadalnych wobec powszechnego głodu panującego w krajach trzeciego świata. W tym aspekcie bardzo interesujące staje się wykorzystanie mikroglonów. Z uwagi na szybkie przyrosty, mikroglony uważane są za cenne źródło biomasy [12]. Ich hodowla nie ogranicza areałów pól uprawnych i może być połączona z jednoczesnym unieszkodliwianiem zanieczyszczeń. Coraz częściej stosowane są, jako metody oczyszczania ścieków a także w unieszkodliwianiu substancji trudno rozkładalnych [4]. Ścieki przemysłowe i komunalne są dużym obciążeniem zanieczyszczającym wody będących odbiornikami [9]. Ponadto odcieki z procesu fermentacji metanowej mogą stać się pożywką w hodowli glonów, które z kolei będą wykorzystywane, jako kosubstrat w fermentacji [2]. Dostarczanie składników odżywczych powinno odbywać się w sposób kontrolowany, tak, aby glony miały zawsze optymalną ilość pokarmu. Nie można doprowadzać ani do zagłodzenia, ani do przenawożenia hodowli (ryzyko powstawania niekontrolowanych zakwitów). Grobellar zaproponował model formuły cząsteczkowej, która jest następująca: CO 0,48 H 1,83 N 0,11 P 0,01 [5]. Eukariotyczne glony są heterotroficzne pod względem azotu i muszą mieć do niego dostęp w formie stałej, jak azotany, sole amonowe lub aminokwasy. Wymagania odnośnie aminokwasów, jako czynników wzrostowych jest powszechne wśród glonów. Słaba dostępność azotu jest często czynnikiem limitującym wzrost glonów, zwłaszcza morskich. Dostępność węgla w przeciwieństwie do azotu i fosforu, rzadko ogranicza wzrost glonów. Produktywność w wodach słodkich jest często ograniczana przez dostępność fosforanów. Dostępność krzemu jest natomiast czynnikiem ograniczającym wzrost okrzemek w ubogich jeziorach oligotroficznych. Większości innych substancji odżywczych występuje w środowisku wodnym w nadmiarze [9]. Chociaż niektóre glony są bezwzględnymi autotrofami, wiele z nich wymaga zewnętrznego źródła witamin, często tiaminy, biotyny, B 12 i ryboflawiny, puryn, pirymidyn i innych czynników wzrostowych [11]. Wymagania tego rodzaju określa się mianem auksotrofii, która odzwierciedla bogactwo rozpuszczonej materii organicznej w środowisku i jest wynikiem selekcji populacji glonów niesyntezujących wszystkich składników potrzebnych do metabolizmu komórkowego. Większość glonów toleruje szeroki zakres ph. Wśród nich wykształciły się jednak organizmy znoszące krańcowo niekorzystne warunki, zamieszkujące środowiska silnie kwasowe np. gorące źródła siarkowe. Jednakże gwałtowne zmiany stężenia CO 2 w silnie nasłonecznionych powodują gwałtowne zmiany ph, co wywiera szkodliwy wpływ na populacje glonów. Celem badań było określenie możliwości wykorzystania odcieków z bioreaktora, w którym prowadzono proces fermentacji metanowej, jako pożywki do hodowli glonów w fotobioreaktorze.
Efektywność wykorzystania substancji biogennych pochodzących z odcieków 303 2. METODYKA Badania przeprowadzono w skali laboratoryjnej przy wykorzystaniu fotobioreaktora rurowego wykonanego z przeźroczystego pleksiglasu (rysunek 1). W dolnej stożkowej części reaktora znajdował się zawór spustowy oraz system doprowadzający sprężone powietrze. Dzięki napowietrzaniu zapobiegano opadania biomasy i osadzaniu się glonów na ściankach oraz dostarczano do układu niezbędnej ilości CO 2. W górnej części reaktor był otwarty istniała możliwość swobodnej wymiany gazowej pomiędzy reaktorem i otoczeniem. Wysokość całkowita kolumny wynosiła H c =1,0 m, natomiast średnica wewnętrzna ϕ=0,2 m. Kolumna wypełniona była do wysokości H cz =0,64 m co daje objętość czynną około 20 dm 3. Reaktor naświetlany był za pomocą sztucznego, zewnętrznego źródła światła, znajdującego się za obiektem w pozycji pionowej. Natężenie oświetlenia mierzone za fotobioreaktorem po przejściu światła przez reaktor było na poziomie 700 lux±76 lux. Badania prowadzono w stałych warunkach temperaturowych 20±1 C. Glony wykorzystane do zaszczepienia hodowli pochodziły z reaktora otwartego typu tor wyścigowy. Wyjściowo 70% populacji stanowiły glony Chlorella sp. oraz 29,9% glony Scenedesmus sp.. Rys. 1. Schemat fotobioreaktora Badania przeprowadzono w dwóch wariantach różniących się rodzajem stosowanej pożywki. W wariancie pierwszym (W 1 ) wykorzystywano odciek z fermentora meta-
304 K.KUPCZYK i in. nowego, w wariancie drugim (W 2 ) stosowano pożywkę syntetyczną. Fermentator, z którego pobierano odcieki pracował w warunkach mezofilowych, zasilany był biomasą glonową oraz kiszonką kukurydzy w stosunku 1:2. W reaktorze fermentacyjnym stosowano obciążenie ładunkiem substancji organicznej na poziomie A =1kg s.m.o. /m 3 d, przy hydraulicznym czasie zatrzymania HRT=40 d. Charakterystykę odcieku przedstawiono w tabeli 1. Odciek przed każdorazowym podaniem był sączony i wirowany w wirówce przez 10 minut przy prędkości 2500 obr/min. Dopiero w takiej postaci był dodawany do fotobiorektora. Tabela 1. Charakterystyka odcieku z reaktora fermentacyjnego Oznaczenie Jednostka Wartość ChZT mg O 2 /dm 3 465,0±23,19 Azot ogólny mg N/dm 3 52,5±12,45 Azot amonowy mg N-NH 4 /dm 3 41,3±6,85 Fosfor ogólny mg P/dm 3 11,0±4,31 Jednorazowo do reaktora wprowadzono 18 dm 3 mieszaniny glonów oraz 2 dm 3 odcieku pofermentacyjnego (tabela 2). Analizowano stężenia azotu amonowego oraz ortofosforanów, a także wartość ChZT. W trybie ciągłym za pomocą sondy Zolitax (Hach-Lange Niemcy) analizowano stężenie zawiesin. Oznaczenia wykonywane były, co cztery dni, tak, aby stale monitorować zmiany zawartości poszczególnych biogenów. Próbki do analiz pobierano przed ponownym zasileniem reaktora w pożywkę. Jednorazowo odbierano z reaktora 2 dm 3 cieczy, a następnie wprowadzano 2 dm 3 odcieku fermentacyjnego. Odciek fermentacyjny dodawany był w pięciodniowych odstępach czasu tak być zapewnić poziom biogenów zawartych w hodowli zbliżony do wartości wyjściowej na początku badań (tab.2). Badania prowadzono przez 60 dni, w tym czasie jednokrotnie wymieniono całą objętość cieczy w reaktorze. Tabela 2. Zawartość wskaźników na poziomie wyjściowym w reaktorze Oznaczenie Jednostka Wartość ChZT mg O 2 /dm 3 42±6,84 Azot ogólny mg N/dm 3 7,8±2,12 Azot amonowy mg N-NH 4 /dm 3 6,8±1,61 Fosfor ogólny mg P/dm 3 2,8±0,72 Jako badania porównawcze przeprowadzono analogiczne pomiary z zastosowaniem pożywki syntetycznej. Częstotliwość i sposób wprowadzania pożywki syntetycznej był taki sam jak w przypadku odcieku. Odczynniki chemiczne składające się na pożywkę (tab. 3) rozpuszczano w 2 dm 3 wody destylowanej. Masę wprowadzanego NH 4 Cl oraz Na 2 HPO 4 12H 2 O korygowano w trakcie badań tak, aby uzyskać stężenia podstawowych biogenów zbliżone do wartości wyjściowych.
Efektywność wykorzystania substancji biogennych pochodzących z odcieków 305 Tab. 1 Skład pożywki syntetycznej Odczynnik NH 4 Cl Na 2 HPO 4 12H 2 O NaCl KCl CaCl 2 2H 2 O MgSO 4 7H 2 O NaHCO 3 Na 2 CO 3 (FeCl 3 6H 2 O, ZnSO 4, MnSO 4 H 2 O, CuSO 4 ) CH 4 N 2 O Dawka 76,1 mg/dm 3 46,2 mg/dm 3 10,1 mg/dm 3 4,7 mg/dm 3 4,7 mg/dm 3 16,7 mg/dm 3 243,3 mg/dm 3 162,2 mg/dm 3 < 0,2 mg/dm 3 80 mg/dm 3 3. WYNIKI BADAŃ Wykonane badania miały na celu określenie możliwości hodowli glonów w fotobioreaktorze przy użyciu odcieku fermentacyjnego, jako pożywki. Zgodnie z założeniami eksperymentu, dostępność biogenów oraz światła i CO 2 nie powinna limitować wzrostu glonów. W obu reaktorach początkowa wartość stężenia biomasy była na poziomie 290 mg/dm 3. Pierwsze 20 dni prowadzenia chodowli cechowało się powolnym wzrostem glonów. Średnio w ciągu tego okresu przyrastało 7,5 mg s.m. /dm 3 d glonów w reaktorze karmionym odciekiem z fermentora i 10,5 mg s.m. /dm 3 d glonów w reaktorze kontrolnym. W okresie kolejnych 20 dni zaobserwowano znaczący wzrost szybkości namnażania biomasy. W przypadku serii badań z odciekiem fermentacyjnym stwierdzno 22,5 mg s.m. /dm 3 d, w układzie kontrolnym szybkość przyrostu była zbliżona i wyniosła 21,55 mg s.m. /dm 3 d. W ostatniej części badań również obserwowano zbliżone wartości szybkości produkcji biomasy niezależnie od rodzaju dostarczanej pożywki. Było to odpowiednio 27,5 mg s.m. /dm 3 d pożywka fermentacyjna, 29,25 mg s.m. /dm 3 d pożywka syntetyczna.
306 K.KUPCZYK i in. Rys. 2. Zmiany w czasie zawartości w reaktorach suchej masy organicznej w zależności od stosowanej pożywki Wraz z ciągłym procesem namnażaniem komórek mikroglonów, wzrastała szybkość wykorzystania azotu amonowego. W pierwszym etapie analiz zużycie azotu rozpoczynało się od wartości 3 mg N-NH 4 /d. Rosnące wykorzystanie następowało do 25 dnia, po czym przy kolejnych pomiarach, aż do końca badań, odnotowywano jego stabilizację na poziomie około 40 mg N-NH 4 /d. Przyswajalność amoniaku wiąże się bezpośrednio z procesami rozwojowymi glonów. Im większa liczba komórek alg w mieszaninie, tym większe zapotrzebowanie na składniki pokarmowe, do których zalicza się amoniak. Zarówno w próbie z pożywką syntetyczną jak i odciekiem z fermentora zauważalne są niemal pokrywające się wyniki. Zależność ta świadczy o możliwości zaspokojenia podstawowych zapotrzebowań pokarmowych poprzez dostarczanie substancji wraz z odciekiem pofermentacyjnym. Rys. 3. Wykorzystany ładunek N-NH 4 w procesie namnażania glonów
Efektywność wykorzystania substancji biogennych pochodzących z odcieków 307 Podobna sytuacja występowała podczas analizowania zawartości fosforu. Szybkość zużywania ilości fosforu wzrastała aż do 20 dnia badań. Z 2 mg P-PO 4 zwiększyła się do wartości około 13 mg P-PO 4, po czym nastąpiła stabilizacja na tym poziomie, aż do 55 dnia analiz. Tylko w 60 dniu można zaobserwować różnice w szybkości przyswajania tego biogenu, gdzie w hodowli z odciekiem z fermentora nastąpił spadek. Wiązać może się to, z obumieraniem glonów w związku ze zbytnim zagęszczeniem komórek. Na podstawie przedstawionych wyników (rysunek 4) zauważa się, że algi hodowane w reaktorze zasilanym odciekiem, tylko w nieznacznym stopniu wykazują mniejszą przyswajalność fosforu w pierwszych 20 dniach. W kolejnych pomiarach przyswajalność utrzymywała się na stałym poziomie. Korelacja ta potwierdza zakładaną hipotezę, iż dozowanie odcieku jako pożywki stymulującej wzrost glonów jest uzasadnione. Rys. 4. Wykorzystany ładunek P-PO 4 w procesie namnażania glonów 4. DYSKUSJA Przeprowadzone badania udowodniły możliwość przyrosty biomasy glonów Chlorelli sp. w fotobioreaktorze. Dzięki ustaleniu odpowiednich warunków rozwojowych uzyskano stały przyrost biomasy glonów. Zapewnienie ciągłego wymieszania oraz dostarczanie pożywki w postaci odcieku pofermentacyjnego skutkowało namnażaniem się komórek mikroglonów. Udowodniono, że odciek z reaktora fermentacji metanowej, nie tylko zaspokajał potrzeby pokarmowe istniejących już komórek, ale powodował dalszy rozwój organizmów. Szybkość przyrostu biomasy w próbie kontrolnej
308 K.KUPCZYK i in. wynosiła 29,25 mg s.m. /dm 3 d i nieznacznie przewyższała wartość uzyskną w próbie z odciekiem, która wynosiła 27,5 mg s.m. /dm 3 d. Porównując wyniki innych badaczy zauważa się znaczną rozbierzność. Przykładowo Chiu i inni [1] dzięki prowadzeniu hodowli Chlorelli sp.w skali półciągłej uzyskali przyrost biomasy na poziomie 0,37-0,53 g/dm 3 d. Różnice te mogą być spowodowane dodatkowym zasilaniem hodowli w czysty CO 2. Tymczasem Wang i inni [13] prowadząc badania nad Neochloris oleoabundans uzyskali wydajność biomasy na poziomie 350 mg/dm 3 d i z końcowym poziomem stężenia 3,15 g/dm 3. Badacze Ci udowodnili, że glony posiadają duże możliwości przyswajania azotu i fosforu poprzez modyfikowanie dawek dostarczanych do hodowli. Odmienne wratości przyrostu masy komórek glonowych w powyższym artykule wynikają z zastosowania innych szczepów glonów. Samą zależność między przyrostem biomasy glonów, a rodzajem mikroglonów zauważył Erikson i in [3]. Natomiast Jinsoo Kim i inni [6] prowadzili hodowlę Chlorelli vulgaris w układzie zamkniętym. Jako pożywkę stosowali ścieki o stężeniu azotu 7,7±0,19 mg/dm 3 w amoniaku (NH 3 ) i / lub jonów amonowych (NH 4 + ) i całkowitego węgla nieorganicznego w ilości 58,6±0,28mg/dm 3. W przeciągu 216 h uzyskali spadek zawartości azotu do ok. 2 mg/dm 3 przy jednoczesnym przyroście biomasy, udowadniając możliwość wykorzystania odcieku do wzrostu Chlorelli vulgaris. Podobne badania prowadzili Changling i inni [8] wykorzystując również szczep Chlorelli vulgaris. Prowadząc uprawę w fotobioreaktorach w sposób ciągły i quasi-ciągły z dozowaniem CO 2, dostarczając jednocześnie ścieki komunalne uzyskali biomasę na poziomie 0,528-0,760 g/dm 3. Ponadto wykazali możliwość skutecznego usuwania amoniaku, azotu, fosforu całkowitego, ChZT Cr i BZT 5 odpowiednio w ilości około 98,0%, 90,9-93,6%, 89,9-91,8%, 60,7-90,0% i 83,4-88,4%. Kwong-Yu Chan i inni wykorzystywali komórki Chlorelli saliny do procesu oczyszczania ścieków bytowych. Po 8 dniach eksperymentu prowadzonego w warunkach laboratoryjnych nastąpiło usunięcie 86% do 100% NH 3 -N, 98% NO 3 - N i 98% PO 4 3 P [7]. 5. WNIOSKI Przeprowadzone badania potwierdziły, iż możliwa jest hodowla biomasy w fotobioreaktorze rurowym z zastosowaniem odcieku pofermentacyjnego. W czasie trwania ekspermentu zanotowano stały przyrost biomasy mikroglonów wynoszący odpowiednio po 60 dniach prowadzenia badań 1440 mg s.m. /dm 3 w reaktorze z odciekiem fermentacyjnym i 1515 mg s.m. /dm 3 z pożywką syntetyczną. Zasilanie hodowli odciekiem z fermentora zwierającym 41,3±6,85 mg N-NH 4 /dm 3 i 11,0±4,31 mg P/dm 3 zaspokajało potrzeby pokarmowe mikroglonów, jednocześnie powodując rozwój komórek w sposób porównywalny do prowadzonej równolegle hodowli kon-
Efektywność wykorzystania substancji biogennych pochodzących z odcieków 309 trolnej z pożywką syntetyczną. Zużycie tych biogenów przekładało się bezpośrednio na wzrost zawartości biomasy. Wykazano, iż odpad będący produktem ubocznym procesu fermentacji, w postaci odcieku można wykorzystać do hodowli glonów. Jednocześnie związki występujące w odcieku w takich ilościach są w stanie zaspokoić potrzeby pokarmowe hodowli nie powodując jej zahamowania. LITERATURA [1] CHIU S.Y., KAO C.Y., CHEN C.H., KUAN T.C., ONG S.C., LIN C.S., Reduction of CO 2 by a high-density culture of Chlorella sp. in a semicontinuous photobioreactor. Bioresource Technol. 99, 3389 3396, 2008. [2] DOUSKOVA I., KASTANEK F., MALETEROVA Y, JIRI P., KASTANEK D., ZACHLEDER V., Utilization of distillery stillage for energy generation and concurrent production of valuable microalgal biomass in the sequence: Biogas-cogeneration-microalgae-products, Energy Conversion and Management, 2010, 606 611 [3] ERIKSEN N.T. i in., On-line estimation of O 2 production, CO 2 uptake, and growth kinetics of microalgal cultures in a gastight photobioreactor, Journal of Applied Phychology 19, 2007 [4] GRAY K.A., ZHAO L., EMPTAGE M., Bioethanol. Current Opinion in Chemical Biology, 10:141 146, 2006 [5] GROBBELAR J.U. Algal nutrition. In: Richmond A., editor. Handbook of microalgal culture: biotechnology and applied phycology. Blackwell; 2004, 97 11 [6] KIM J., LINGRARAJU B. P., RHEAUME R., LEE J.-Y, SIDDIQUI K. F., Removal of Ammonia from Wastewater Effluent by Chlorella Vulgaris, Bioresource Technology, August 2010, Pages 391 396 [7] KWONG-YU CH., WONG K.H., WONG P.K., Nitrogen and phosphorus removal from sewage effluent with high salinity by Chlorella salina, Biosource, Environmental Pollution, February 1979, 139 146 [8] LI Ch., YANG H., XIA X., LI Y, CHEN L., ZHANG M., ZHANG L., WANG W., Novel Bioconversions of Municipal Effluent and CO 2 into Protein Riched Chlorella vulgaris Biomass, Bioresource Technology, December 2012 [9] MOLINA GRIMA E., ACIEN F., GARCIA CAMACHO F., CHISTI Y., Photobioreactors: light regime, mass transfer, and scaleup. J. Biotechnol. 1999, 70: 231-247. [10] PETERSSON A., THOMSEN M. H., HAUGGAARD-NIELSEN H., THOMASEN A. B., 2007. Potential bioethanol and biogas production using lignocellulosic biomass from winter rye, oilseed rape and faba bean, Biomass and Bioenergy 31, 812-819; [11] PULZ O., GROSS W. Valuable products from biotechnology of microalgae. Appl Microbiol Biotechnol 2004; 65(10), 635-48 [12] TSUKAHARA K, SAWAYAMA S., Liquid fuel production using microalgae. J Jpn Petrol Inst; 2005, 48(5), 251 9. [13] WANG B., LAN Ch. Q., Biomass production and nitrogen and phosphorus removal by the green alga Neochloris oleoabundans in simulated wastewater and secondary municipal wastewater effluent, Department of Chemical and Biological Engineering, Bioresource Technology 102 (2011) 5639 5644
310 K.KUPCZYK i in. EFFICIENT USE OF NUTRIENTS FROM THE EFFLUENTS POST-FERMENTATION IN THE PRODUCTION OF MICROALGAE BIOMASS This paper describes the possibility of using a tubular photobioreactor for the cultivation of unicellular algae. This study performed two options for different kinds of distributed media. The first option (W 1 ) was established to provide for the effluent derived from methane fermentation, the second option (W 2 ) focused on dispensing to culture the medium synthetic. Development processes were carried out in reactors with a capacity of about 20 dm 3 active. Established effluent contains ammonium nitrogen in an amount of 41,3±6,85 mg N-NH 4 /dm 3 and phosphorus in the range 11,0 ±4,31 mg P- PO 4 /dm 3. Within 60 days of the experiment, which was carried out 5 days physico-chemical analysis of breeding and introduced the relevant portions of the medium in an amount of 2 dm 3 leachate and analogous synthetic compounds. During the experiment, regardless of the medium observed a steady increase in biomass. The size of the increase was similar in the two study options. Resulting in a maximum concentration of the algal biomass in 1440 mg s.m./dm 3 fermentation reactor effluent and 1515 mg s.m./ dm 3 the synthetic medium. The rate of use of nutrients for algae biomass increased with the duration of the experiment. Similar values were obtained regardless of the input medium. The ammonium nitrogen was about 40 mg/d, and for the orthophosphates 13 mg/d The use of effluent as a growth medium after fermentation gave similar efficiency microalgae culture which links synthetic medium.