Analityka Zanieczyszczeń Środowiska Wykorzystanie techniki analizy fazy nadpowierzchniowej w analizie żywności Materiały do ćwiczeń mgr inż.. Justyna Gromadzka, prof. dr hab. inż. Waldemar Wardencki Katedra Chemii Analitycznej Wydział Chemiczny Politechnika Gdańska 2007
Wykorzystanie techniki analizy fazy nadpowierzchniowej w analizie żywności 1. Oleje roślinne Korzystne właściwości żywieniowe i zdrowotne tłuszczów roślinnych warunkuje przede wszystkim fakt, iż charakteryzują się one niską zawartością nasyconych kwasów tłuszczowych (wyjątkiem jest olej palmowy i kokosowy). Stwierdzono że tłuszcze, zarówno jedno- jak i wielonienasycone, chronią organizm człowieka przed rozwojem chorób układu krążenia i chorób nowotworowych. Natomiast nasycone kwasy tłuszczowe wpływają na wzrost poziomu cholesterolu we krwi, zwiększając ryzyko zachorowania na miażdżycę i choroby serca. WHO zaleca spożycie tłuszczów w ilości 15-30% spożywanych dziennie kalorii. Jak wskazują przytoczone dane statystyczne problem zagrożeń zanieczyszczeń w olejach dla zdrowia ludzkiego jest istotny i aktualny ze względu na spożywane ilości tych produktów. W celu polepszenia smaku, trwałości i wyglądu stosuje się różne substancje w tym środki konserwujące i zapachowe. Nie wszystkie używane w tym celu dodatki są korzystne dla zdrowia ludzkiego. Obecnie jakość sensoryczna i atrakcyjność żywności ustępują szeroko pojętej wartości żywieniowej. Obok substancji, które występują jako zamierzone dodatki w żywności spotyka się zanieczyszczenia. Według ustawy z dnia 11 maja 2001r. O warunkach zdrowotnych żywności i żywienia zanieczyszczeniem jest każda substancja, która nie jest celowo dodana do żywności, a jest w niej obecna w następstwie procesu produkcji, w tym czynności wykonywanych w procesie produkcji roślinnej i zwierzęcej lub nieprawidłowości występujących w obrocie, albo jest następstwem zanieczyszczenia środowiska; termin ten obejmuje obecne w żywności toksyny, substancje chemiczne lub inne substancje obce, które mogą stanowić zagrożenie dla zdrowia człowieka lub powodować nieprzydatność do spożycia. Jednym ze źródeł zanieczyszczeń żywności są nawozy sztuczne, pestycydy i regulatory wzrostu stosowane w rolnictwie. Kolejną droga przedostawania się niepożądanych związków do pokarmów jest przemysł spożywczy, który ukierunkowany jest na obniżanie kosztów wytwarzania i usprawnianie procesów technologicznych, a nie zawsze ma na względzie zapewnienie odpowiedniej jakości produktów i ochronę zdrowia konsumentów. W roku 19994 w laboratoriach w Niemczech stwierdzono obecność benzenu w oliwie z oliwek. Związki te zostały użyte w procesie ekstrakcji oliwy. Ze względu na szkodliwy wpływ rozpuszczalników organicznych na zdrowie ludzkie w wielu naukowych ośrodkach rozpoczęto badania nad oznaczaniem ich pozostałości w olejach roślinnych, używanych w celach konsumpcyjnych, w lekach i kosmetykach. Większość oliwy z oliwek obecnej na rynku otrzymywana jest w procesie ekstrakcji rozpuszczalnikami organicznymi. Względy ekonomiczne doprowadziły do zastąpienia tradycyjnego mechanizmu tłoczenia oliwy z oliwek chemiczną ekstrakcją. Do ekstrakcji najczęściej stosowane są
węglowodory alifatyczne, głównie heksan i benzyna ekstrakcyjna. Spośród chlorowcopochodnych węglowodorów alifatycznych najczęściej stosowany jest trichloroetylen. Te ostatnie łatwo rozpuszczają tłuszcze, ich straty w procesie destylacji są nieznaczne, a zawartość w śrucie nie jest duża. Wskutek złej selektywności rozpuszczania chlorowcopochodne węglowodorów nie rozpowszechniły się w przemysłowej ekstrakcji nasion oleistych. Zastosowanie ekstrakcji umożliwia zwiększenie stopnia wydobycia tłuszczu przy jednoczesnym zmniejszeniu kosztów związanych z robocizną. Niekorzystnym elementem tej metody jest palność i toksyczność rozpuszczalników oraz ich straty. Alternatywą do tradycyjnej ekstrakcji jest zastosowanie metody biotechnologicznej. Ekstrakcja olejów przy pomocy metod enzymatycznych umożliwia eliminację niekorzystnych zjawisk związanych z ekstrakcją. Preparaty do ekstrakcji są kompozycją enzymów takich jak: celulazy, hemicelulozy, pektyny, glukanazy. Wydajność procesu jest wyższa w porównaniu z tradycyjną metodą. Otrzymywany olej ma lepsze właściwości organoleptyczne i niektóre parametry i, co jest bardzo istotne, pozbawiony jest zanieczyszczeń w postaci rozpuszczalników oraz pestycydów. Jest to metoda nie wymagająca dużych nakładów energetycznych i kosztów rozpuszczalnika. Do tej pory metoda ta nie znalazła uznania ze względu na problemy związane z suszeniem pozostałości przeznaczonej na paszę. Uzyskany jedną z powyższych metod olej surowy poddawany jest następnie procesowi rafinacji. Rafinacja polega na oczyszczaniu surowca w celu otrzymania produktu bardziej uszlachetnionego, choć nie zawsze całkowicie pozbawionego substancji ubocznych. Składa się z kilku operacji fizykochemicznych (etapów): filtracja w celu oddzielenia wytłoczonego oleju od stałych pozostałości, hydratacja = odśluzowanie na tym etapie z oleju usuwane są fosfolipidy poprzez zakwaszenie kwasami organicznymi lub H 2 SO 4, odkwaszenie polega na zobojętnieniu oleju przy pomocy roztworu wodorotlenku sodu, bielenie = odbarwianie najczęściej w procesie tym stosuje się ziemię bielącą lub węgiel aktywny, odwanianie =dezodoryzacja, odwoskowanie etap często pomijany. Rafinowane oleje roślinne podczas przeróbki tracą wiele swoich wartości, nie posiadają prawie w ogóle zapachu i smaku, które są tak charakterystyczne dla olejów surowych tłoczonych na zimno. Przewagą olejów rafinowanych jest to, że są odporne na wysokie temperatury, a ponadto dużo tańsze od olejów tłoczonych. Poprzez rafinację usuwa się z oleju niepożądane składniki (wolne rodniki, pestycydy, metale ciężkie i inne zanieczyszczenia), co podnosi przydatność oleju do celów spożywczych, polepsza jego walory zdrowotne i cechy organoleptyczne oraz poprawia stabilność. Jeśli jednak temperatura procesu jest zbyt niska, niektóre rozpuszczalniki o wyższej temperaturze wrzenia, użyte wcześniej, np. do ekstrakcji, mogą pozostawać w oleju. Otrzymany w ten sposób produkt jest zanieczyszczony toksycznymi rozpuszczalnikami.
Kolejnym źródłem zanieczyszczeń w olejach roślinnych są stosowane opakowania. Dotyczy to szczególnie opakowań plastykowych, które są używane powszechnie ze względu na ich niską cenę, a ponadto są lekkie i niełamliwe. Z opakowań do oleju przechodzić mogą monomery żywic i dodatków stosowanych przy wytłaczaniu butelek. Dużą uwagę przywiązuje się obecnie do przemieszczania się pozostałości monomerów, plastyfikatorów, antyoksydantów z plastikowych opakowań przez bezpośredni kontakt z żywnością jak i poprzez zetkniecie się z fazą gazową. Wedle prawa Unii Europejskiej nie należy dopuszczać do przenikania substancji z opakowań do żywności, które mogłyby zmienić jej skład lub mogłyby pogorszyć właściwości smakowe produktów spożywczych. Źródłem zanieczyszczeń oleju może być także proces jego transportu. Chlorowcopochodne węglowodory alifatyczne dobrze rozpuszczają tłuszcze, dlatego czasem zwane są cieczami czyszczącymi. Odtłuszczanie przy ich pomocy stosowane jest najczęściej do usuwania dużych i trudnych do usunięcia zabrudzeń, często jest zabiegiem wstępnym przed zastosowaniem innych metod oczyszczania. Bywają również stosowane do mycia powierzchni o bardzo wysokich wymaganiach co do czystości, m.in. do czyszczenia aparatury w olejarniach czy cystern transportujących. Niedokładne usunięcie rozpuszczalników z powierzchni zbiorników może powodować zanieczyszczenia olejów w procesie ich wytwarzania lub transportu. 2. Metody analizy fazy nadpowierzchniowej (Headspace Analysis HSA) Oznaczanie lotnych związków organicznych stanowiących zanieczyszczenia w skomplikowanej matrycy, np. oleju roślinnym, wymaga od procedury analitycznej spełnienia następujących warunków: zapewnienie możliwości oznaczania anlitów na bardzo niskim poziomie stężeń, przygotowanie próbki do analizy nie powinno wprowadzać do środowiska dodatkowych substancji. Powyższe wymagania spełnia technika analizy fazy nadpowierzchniowej. Ze względu, że technika ta nie wymaga do ekstrakcji rozpuszczalników jest ona bezpieczna dla środowiska jak również mniej kosztowna. Daje również możliwość oznaczania analitów występujących na niskich poziomach stężeń. Metodę tę zalicza się do technik ekstrakcji gazem. Analiza fazy nadpowierzchniowej (Headspace Analysis) polega na analizowaniu par (G) będących w równowadze z ciekłą lub stałą próbką (S) zamkniętą w szczelnej fiolce(rys. 1.). Próbkę po zamknięciu w szczelnej fiolce umieszcza się w termostacie i ogrzewa do określonej stałej temperatury, aż do osiągnięcia równowagi międzyfazowej. Rys.1. Osiąganie stanu równowagi pomiędzy fazą gazową (G) a fazą ciekłą lub stałą (S) w szczelnie zamkniętej fiolce
Warunkiem równowagi wieloskładnikowego układu dwufazowego, przy stałej temperaturze i ciśnieniu, jest równość potencjałów chemicznych każdego składnika w obu fazach. Czas potrzebny na osiągnięcie równowagi zależy od szybkości dyfuzji lotnych składników próbki i ich powrotu do próbki. W przypadku, gdy nie znamy składu próbki określamy go empirycznie. Czas do uzyskania równowagi powinien być jak najkrótszy. Należy unikać nadmiernie długiego czasu termostatowania, ponieważ próbka może być wrażliwa na przedłużające się ogrzewanie, często nie poprawia to wyników analitycznych, a tylko wydłuża czas trwania całej analizy. Czas potrzebny do osiągnięcia równowagi fazowej można skrócić poprzez zapewnienie ciągłego mieszania próbki w fiolce, umieszczając ją w wytrząsarce. Aby uzyskać pożądany efekt mieszania, ważne jest, aby próbka była w rezonansie z częstotliwością wytrząsarki. Po ustaleniu równowagi pomiędzy fazą ciekłą (stałą) a faza gazową, pobierana jest znana ilość par i przenoszona do analizy do kolumny chromatograficznej. Tę odmianę techniki nazywa się statycznym HS. Technika analizy fazy nadpowierzchniowej od lat 70-tych, kiedy to została po raz pierwszy zastosowana, bardzo się rozwinęła. W ciągu tego czasu powstało wiele jej odmian i modyfikacji mających na celu dostosowanie jej do różnych warunków analizy, specyficznych analitów i matryc. Na Rys. 2. schematycznie przedstawiono klasyfikację metod analizy fazy nadpowierzchniowej. Rys.2. Klasyfikacja metod analizy fazy nadpowierzchniowej (SHS statyczny headspace, SPME mikroekstrakcja do fazy stacjonarnej, SDE ekstrakcja do pojedynczej kropli, DHS dynamiczny headspace, TLHS analiza fazy nadpowierzchniowej nad cienkim filmem cieczy, PT wymywanie z jednoczesnym wychwytywaniem analitów, CLSA wychwytywanie analitów w zamkniętym układzie gazu płuczącego) Poprzez opracowywanie modyfikacji rozwiązań przedstawionych w literaturze ciągle obserwuje się rozszerzanie zakresu stosowalności omawianej techniki analitycznej w nowych dziedzinach oraz wprowadzanie nowych rozwiązań metodycznych i aparaturowych.
Aby uzyskiwać jak najlepsze wyniki przy korzystaniu z techniki HS ciągle prowadzi się badania nad lepszym poznaniem mechanizmu równowagi faz na poziomie cząsteczkowym. Pozwoli to na lepsze sterowanie tym zjawiskiem i bardziej efektywne jej wykorzystanie w procesach technologicznych. Zaletą metody jest to, że do kolumny przechodzą tylko lotne substancje, a nielotne pozostają w fiolce. Tym samym wyeliminowane zostają problemy związane z kondensacją rozpuszczalnika i osadzaniem się ciężkich składników, co wspomaga również ogrzewanie igły i przewodu transportującego. Kolejną korzyścią jest możliwość zautomatyzowania tej metody. Poza tym metoda ta zapewnia wysoką czułość analizy. Wadą analizy fazy nadpowierzchniowej jest niedostateczna w niektórych przypadkach czułość metody. Ograniczeniem jest również możliwość analizowania tylko lotnych i średnio lotnych substancji. Problemem jest również przeprowadzenie analiz ilościowych, co jest czasochłonne i nie zawsze daje zadowalające wyniki. Kolejną wadą metody HSA jest zależność wyników analizy od rodzaju matrycy. Prowadzić to może do fałszywych wyników, gdy więcej niż jeden rozpuszczalnik znajduje się w próbce. Rys.3. Połączenie przystawki do HS z chromatografem gazowym. Statyczny HS-GC zalecany jest jako najbardziej odpowiednia metoda do badania zawartości pozostałości rozpuszczalników w produktach farmakologicznych. Przeszkodami w powszechnym użyciu tej metody jest brak odpowiednio opracowanych metod analizy dostosowanych do właściwości poszczególnych rozpuszczalników. Najczęściej bowiem pracuje się z mieszaniną rozpuszczalników o różnej polarności i lotności. Analiza fazy nadpowierzchniowej może być też zastosowana do wzbogacania próbek, których nie można wprowadzić bezpośrednio do kolumny, takich jak: polimery, tworzywa sztuczne, ciecze o bardzo dużej lepkości, czy też matryce o skomplikowanym składzie ( krew, kosmetyki, napoje i inne produkty spożywcze). W ostatnich latach popularność tej techniki wzrosła znacznie po zastosowaniu jej do analizy alkoholu we krwi z użyciem wzorca wewnętrznego, czy też pozostałości rozpuszczalników w produktach farmaceutycznych. Znajduje ona również zastosowanie w analityce środowiskowej. Jako przykłady posłużyć mogą badania przemian soli metali ciężkich w lotne związki przez anaerobowe bakterie oraz
opracowane metody do indywidualnego biomonitoringu narażenia na działanie halogenowych związków służących do narkozy. Dbałość o zdrową żywność obejmuje również eliminowanie z niej toksyn będących produktami metabolizmu grzybów, tzw. mykotoksyn oraz innych substancji powodujących psucie się żywności i mogących być przyczyną reakcji alergicznych. Przy użyciu metody analizy fazy nadpowierzchniowej identyfikuje się obecność grzybów w żywności poprzez wykrywanie lotnych metabolitów charakterystycznych dla danego gatunku grzybów. Metoda ta znajduje również zastosowanie w przemyśle. Jako przykład może posłużyć zastosowanie metody DHS w systemie on-line do monitoringu i kontroli przepływu płynów. Ciągle obserwuje się poszerzenie zakresu stosowalności omawianej techniki analitycznej w nowych dziedzinach. 3. Cel ćwiczenia W ramach ćwiczenia studenci zapoznają się z techniką analizy fazy nadpowierzchniowej i jej zastosowaniem do analizy żywności. W ramach ćwiczenia należy oznaczyć pozostałość rozpuszczalników organicznych w jadalnych olejach roślinnych. 4. Opis wykonywanego ćwiczenia przygotowanie próbek i identyfikacja Należy sporządzić dwa roztwory wzorcowe zawierające w jednym 40 ppm heksanu, w drugim 160 ppm toluenu, korzystając z przygotowanego przez asystenta prowadzącego ćwiczenie roztworu wyjściowego, który jest mieszaniną heksanu, toluenu i benzenu w stosunku objętościowym 7:5:5 (v:v:v). Roztwory wzorcowe sporządzić należy w zlewkach, w których do 50 ml oleju roślinnego (pobranego jednorazową strzykawką o pojemności 50 ml) należy dodać (przy pomocy mikrostrzykawki) odpowiednią, obliczoną przez studentów, objętość roztworu wyjściowego tak aby uzyskać próbki zawierające odpowiednio 40 ppm heksanu i 160 ppm toluenu. Tak przygotowane próbki należy starannie wymieszać a następnie przy pomocy jednorazowej strzykawki z każdej próbki pobrać 8 ml i przenieść do fiolek do analizy fazy nadpowierzchniowej o pojemności 15 ml. Fiolki należy starannie szczelnie zamknąć przy pomocy membrany silikonowej i aluminiowego kapsla i umieścić w podajniku próbek. Kolejne etapy ćwiczenia odbywają się automatycznie. Próbki są termostatowane do uzyskania równowagi międzyfazowej. Następnie określona objętość fazy nadpowierzchniowej podawana jest na kolumnę, w której następuje rozdzielenie składników próbki. Studenci wykonują zadanie w grupach 3-4 osobowych. Każda grupa dostaje od prowadzącego inną nieznaną próbkę do zanalizowania. Należy w danej próbce określić zawartość poszczególnych rozpuszczalników wykorzystując metodę roztworów ograniczających (do dyspozycji są próbki z roztworami wzorcowymi wykonanymi przez studentów).
Tab.1. Parametry pracy układu. Parametry podajnika HS Objętość fiolki Objętość próbki Temperatura termostatowania Temperatura igły Temperatura linii przesyłowej Czas termostatowania Czas podwyższonego cisnienia Czas wprowadzania próbki Czas wysunięcia igły Gaz nośny Detektor Gazy do palnika Dozownik Kapilarna kolumna chromatograficzna Długość Grubość filmu Średnica wewnętrzna Program temperaturowy 15ml 8ml 120 0 C 125 0 C 130 0 C 10 min 2 min 0,05 min 0,5 min Hel 1,3 cm 3 /min FID; 230 0 C wodór 45 cm 3 /min powietrze 450 cm 3 /min Typu: Split/splitless; 170 0 C z podziałem strumienia: 1:3 SPB 20 poli(20% difenyl/80% dimetylsiloksane), Supelco 30 m 1 µm 0,25 mm Temperatura początkowa 70 0C przez 1 min, przyrost 10 0C/min do 130 0C, przyrost 20 0C/min do 180 0C przez 1,5 min całkowity czas analizy 11 min 5. Zagadnienia na kartkówkę surowce olejarskie do produkcji tłuszczów spożywczych, skład tłuszczów i ich podział proces wydobywania tłuszczów etapy rafinacji tłuszczów metody analizy fazy nadpowierzchniowej zalety i wady techniki HSA, i jej zastosowania metoda roztworów ograniczających zasada działania detektora płomieniowo-jonizującego FID 6. Literatura [1] Drozdowki B. (2002) Lipidy, w Chemia Żywności (Sikorski Z.E. red.), Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 2002 [2] Janicki W (1998) Technika analizy fazy nadpowierzchniowej, w Fizykochemiczne metody kontroli zanieczyszczeń środowiska (Namieśnik J., Jamrógiewicz Z. red.), Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 1998 [3] Michulec M., Wardencki W., (2004) Determination of Solvents Residues In Vegetable Oils and Pharmaceuticals by Headspace Analysis and Capilary Gas Chromatography, Chromatographia, 60 (2004), 273-277 [4] Niewiadomski H., (1993), Technologia tłuszczów jadalnych, Wydawnictwa Naukowo-Techniczne, Warszawa 1984 7. Wytyczne do sprawozdania W sprawozdaniu należy: opisać cel ćwiczenia i jego przebieg, podać parametry pracy układu (headspace i GC), przedstawić obliczenia dotyczące sporządzonych roztworów wzorcowych, przedstawić obliczenia i podać zawartość heksanu, benzenu i toluenu w analizowanej próbce, przedstawić wnioski, zacytować literaturę, z której korzystano przy przygotowaniu sprawozdania