Małgorzata Zalewska, Dariusz Kulus Współczesne strategie ochrony zasobów genetycznych chryzantem

Transkrypt

1 Małgorzata Zalewska, Dariusz Kulus Współczesne strategie ochrony zasobów genetycznych chryzantem Mimo, iż jesienią w ostatnim tchnieniu natury chryzantemy kwitną długo i cechują się dużą odpornością, to jednak nawet one ostatecznie ulegają destrukcyjnemu wpływowi czasu a przynamniej ulegały, aż do tej pory. Najnowsze rozwiązania biotechnologiczne, pozwalają zatrzymać czas i w stanie hibernacji przechowywać cenne genotypy w nieskończoność. Wydaje się, że przyszłość niezliczonych odmian chryzantem leży w rękach kriobiologów. Chryzantemy dzięki ogromnej różnorodności pokroju oraz barw i kształtów kwiatów zaliczane są do najpopularniejszych roślin ozdobnych. Historia ich uprawy liczy sobie tysiące lat, sięgając czasów Konfucjusza. Starożytni Chińczycy wierzyli, iż rośliny te skrywają klucz do nieśmiertelności. W średniowiecznej Japonii kolejne dynastie cesarskie zasiadały na chryzantemowym tronie. Na przestrzeni czasu za sprawą działalności człowieka z rodzimej, górzystej Azji chryzantemy rozprzestrzeniły się na cały świat, znajdując zastosowanie nie tylko jako roślina ozdobna będąca inspiracją poetów, ale także w gastronomii i medycynie. Mimo, iż uważane są za symbol jesieni, to jednak dzięki rozwojowi produkcji ogrodniczej możliwym stało się wprowadzenie całorocznej produkcji tych wspaniałych kwiatów. W efekcie niegasnącej popularności potęgującej wysiłki hodowców tych roślin na całym świecie, każdego roku powstają setki nowych odmian. Wielokrotnie one same lub odmiany wyjściowe, z których powstały stanowią cenny materiał genetyczny. Zwiększająca się sukcesywnie pula dostępnych odmian wymaga opracowania efektywnych metod długotrwałego ich przechowywania. Tradycyjne metody ochrony uprawy w gruncie i pod osłonami, wymagają jednak znacznych przestrzeni oraz nakładów finansowych i czasowych (związanych z prowadzeniem zabiegów pielęgnacyjnych). Ponadto istnieje duże ryzyko utraty takich kolekcji w skutek rozwoju chorób, aktywności patogenów lub z powodu niekontrolowanych czynników klimatycznych. Do niedawna najlepszą alternatywą dla tych metod wydawało się zastosowanie kultur tkankowych. W technologii tej eksplantaty niewielkie fragmenty roślin (w przypadku chryzantem fragmenty pędów) uprawiane są na syntetycznych, odżywczych pożywkach w warunkach spowolnionego wzrostu, które uzyskuje się po przez zastosowanie czynników fizycznych, chemicznych lub obu jednocześnie. Ograniczenie rozwoju roślin z wykorzystaniem pierwszej grupy czynników zapewnia inkubacja kultur in vitro w odpowiednich warunkach: świetlnych (ciemności, zredukowanym oświetleniu lub wykorzystując takie barwy światła, na które rośliny są najmniej wrażliwe żółte i zielone), termicznych (stosując obniżoną temperaturę) i/lub tlenowych (przez imersję eksplantatów w olejach mineralnych). Chemiczne spowolnienie wzrostu uzyskuje się po przez podniesienie zawartości cukru w pożywce, dodatek retardantów wzrostu (np. ancymidolu) lub ograniczenie zawartości makroelementów. W ten sposób kultury tkankowe mogą być prowadzone nawet kilka lat bez konieczności wcześniejszego pasażu. Pozwala to na redukcję przestrzeni oraz kosztów w porównaniu do tradycyjnych metod uprawy. Wciąż jednak, technologia ta wymaga specjalistycznych laboratoriów, wykwalifikowanego personelu, przygotowywania pożywek oraz okresowych pasaży, co także generuje koszty. Ponadto materiał taki narażony jest na straty w skutek rozwoju zakażeń oraz wystąpienia zmienności somaklonalnej (indukowanej w 9

2 warunkach in vitro), niepożądanej w przypadku elitarnego materiału. Z tych względów, za najbardziej wydajną metodę długotrwałego przechowywania materiału roślinnego uważana jest obecnie krioprezerwacja. W technologii tej materiał biologiczny przechowywany jest w ultra niskich temperaturach, zazwyczaj wrzenia ciekłego azotu (-196 o C) lub rzadziej w jego fazie gazowej (-150 o C), w specjalistycznych zbiornikach tzw. naczyniach Dewara. Tak niskie temperatury powodują zatrzymanie aktywności podziałowej oraz metabolicznej komórek, pozwalając na ich nieskończenie długie przechowywanie, bez zmiany ich właściwości (pod warunkiem uzupełniania poziomu ciągle parującego ciekłego azotu). Kriobiologia jest nauką stosunkowo młodą. Początki krioprezerwacji sięgają lat 30. ubiegłego stulecia, kiedy to pojawiły się wyniki udanych badań nad mrożeniem w ciekłym azocie fragmentów tkanek mchów. Następnie w latach 50. zwrócono uwagę na możliwość kriokonserwacji tkanek roślin drzewiastych. Materiał pochodzący z kultur in vitro (zawiesiny komórkowe lnu) po raz pierwszy poddano mrożeniu dopiero w II. połowie XX w. W trakcie kolejnych dekad udoskonalano techniki mrożenia materiału roślinnego [Mikuła i Rybczyński 2006]. Najwcześniejsze doniesienia o mrożeniu w ciekłym azocie eksplantatów roślin ozdobnych pochodzą z końca lat 80. XX wieku i dotyczą goździków [Fukai 1989]. Pierwsze raporty o krioprezerwacji chryzantem pochodzą z 1990 roku [Fukai 1990]. W przypadku tego gatunku materiałem najczęściej poddawanym mrożeniu są kilkutygodniowe pąki wierzchołkowe o długości ok. 0,5 4,0 mm. Zanim jednak zostaną umieszczone w ciekłym azocie muszą zostać wcześniej odpowiednio przygotowane, bowiem bezpośrednie zamrożenie dla większości tkanek (z wyjątkiem nasion, ziaren pyłku oraz pąków spoczynkowych niektórych gatunków) jest letalne. Hartowanie materiału wiąże się na ogół z odwadnianiem komórek. Już bowiem w trakcie pionierskich badań z tkankami mchów dowiedziono, iż żywotność komórek w trakcie mrożenia zależy w głównej mierze od stopnia ich uwodnienia. Woda bowiem, która stanowi główny składnik komórki, zamarza w ujemnych temperaturach tworząc kryształy lodu. Te z kolei cechują się większą objętością niż woda w stanie ciekłym i w konsekwencji, mogą rozrywać komórki. W związku z tym, pierwszym etapem procedury krioprezerwacji jest indukowanie odporności mrozowej i/lub desykacyjnej roślin. W warunkach naturalnych, latem odporność poszczególnych gatunków roślin na chłód jest podobna. W okresie jesiennym pod wpływem bodźca fotoperiodycznego i termicznego, w różnym stopniu nabierają one tolerancji na mróz, co wiąże się z szeregiem przemian fizjologicznych i biochemicznych, w które zaangażowane są m. in. białka z grupy AFP (ang. antifreeze proteins), LEA (ang. late-embryogenesis abundant), ABA (kwas abscysynowy), prolina i inne komponenty, które zmieniają dynamikę krystalizacji wody, hamują rozrost kryształów lodu i tym samym zwiększają odporność roślin na mróz. W warunkach kultur in vitro odporność na stres indukowana jest przez zastosowanie kilkutygodniowej prekultury na pożywce z podwyższoną zawartością cukru, dodatkiem ABA (hormonu stresu) i/lub proliny. Prekultura znacząco zwiększa lub wręcz warunkuje przeżywalność mrożonych komórek. Na przestrzeni czasu opracowano kilka technik mrożenia materiału roślinnego. Większość z nich została pomyślnie zastosowana w przypadku chryzantem [Halmagyi i in., 2004], [Martin, Gonzalez-Benito 2005]. Poszczególne techniki różnią się między sobą detalami technicznymi, większość z nich łączy jednak konieczność stosowania substancji 10

3 ochronnych, tzw. krioprotektantów. Związki te odwaniają komórki, stabilizują błony komórkowe, obniżają temperaturę zamarzania oraz hamują krystalizację wody. Tym samym są one kluczowe dla powodzenia procedury mrożenia. Do najczęściej stosowanych krioprotektantów zalicza się cukry (głównie sacharozę), glicerol, EG (glikol etylenowy) oraz popularny rozpuszczalnik DMSO (dimetylosulfotlenek). Optymalne stężenie krioprotektantów i czas inkubacji muszą być eksperymentalnie dostosowane do potrzeb nie tylko gatunku, ale nawet odmiany. Należy pamiętać bowiem, że także zbyt długa/intensywna dehydratacja może prowadzić do śmierci komórek. Najwcześniej opracowane techniki krioprezerwacji opierały się na powolnym, kontrolowanym schładzaniu. Zwane są one technikami klasycznymi (lub dwustopniowymi). Pierwszym etapem procedury kriokonserwacji pąków wierzchołkowych chryzantem metodą klasyczną jest ich przedtraktowanie roztworem krioprotektantów (glukoza + DMSO). Tak przygotowany materiał (zamknięty w słomce lub kriofiolce) poddawany jest powolnemu, kontrolowanemu schładzaniu (w tempie 0,2-0,25 o C dm -3 ) do określonej temperatury granicznej (-40 o C), co stymuluje jego mrozową dehydratację na drodze osmozy. Kolejno eksplantaty wprowadzane są bezpośrednio do ciekłego azotu. Istota tej techniki opiera się na fakcie, iż temperatura krystalizacji wody zależy od stopnia jej czystości. Im większe stężenie soli (fazy rozpuszczonej) tym temperatura krzepnięcia rozpuszczalnika jest niższa. Cytoplazma stanowi wodny roztwór cukrów, białek, kwasów organicznych i in. Cechuje się zatem niższą temperaturą krzepnięcia, niż czyściejsza woda międzykomórkowa. Powoduje to, iż w trakcie powolnego schładzania, w temperaturze ok. -9 o C, dochodzi najpierw do krystalizacji wody w przestworach międzykomórkowych. Obecność ściany komórkowej chroni plazmalemmę przed destrukcyjnym wpływem zewnątrzkomórkowego lodu. W trakcie dalszego schładzania cytoplazma ulega jeszcze silniejszemu zagęszczeniu, gdyż woda usuwana jest na drodze osmozy i bierze udział w dalszej rozbudowie pozakomórkowych kryształów lodu. Sama treść komórkowa nie ulega zamarznięciu, zabezpieczona przez krioprotektanty. Technika klasyczna okazała się być bardzo skuteczna dla licznych przedstawicieli rodzaju Chrysanthemum, zwłaszcza chryzantemy wielkokwiatowej, zapewniając przeżywalność na poziomie ponad 80%. Znaczącym minusem tej metody jest jednak jej kosztowność, gdyż wymaga ona specjalistycznej aparatury do powolnego schładzania. Ponadto nie znajduje zastosowania w przypadku odmian wrażliwych na chłód. Z tych względów obecnie techniki klasyczne spotykają się z coraz mniejszym zainteresowaniem. Ich miejsce zajęła bowiem grupa tzw. technik nowoczesnych, opartych na zjawisku witryfikacji. Polegają one na ultra szybkim schładzaniu materiału, przez bezpośrednią imersję w ciekłym azocie. Tak gwałtowna zmiana temperatury powoduje nagłe zatrzymanie ruchu molekuł i przejście wody oraz roztworów krioprotektantów do stanu tzw. stabilnej szklistości (witryfikacji), z pominięciem rozwoju kryształów lodu, które nie mają czasu się uformować. W tworzenie się biologicznego szkła zaangażowane są głównie cukry. Woda w stanie zeszklenia zachowuje zarówno właściwości fizyczne cieczy jak i ciała stałego. W trakcie typowej procedury witryfikacji, w celu zapewnienia maksymalnej ochrony wrażliwym tkankom, materiał biologiczny traktowany jest nie jednym, lecz mieszaniną kilku krioprotektantów. Początkowo jest on przedtraktowany tzw. roztworem wstępnym LS (ang. loading solution). Stanowi on mieszaninę rozcieńczonych, mniej toksycznych 11

4 krioprotektantów (sacharozy i glicerolu). Traktowanie LS ma na celu przygotowanie eksplantatów na działanie roztworu witryfikacyjnego PVS (ang. plant vitrification solution), który stanowi mieszaninę wysoko stężonych, silniejszych krioprotektantów (m. in. glikolu etylenowego i DMSO). Po odwodnieniu i zabezpieczeniu materiału roztworami witryfikacyjnymi, może on być umieszczony w kriofiolce i wprowadzony do ciekłego azotu. Czasem, aby poprzez zwiększenie tempa schładzania (i rozmrażania) poprawić wydajność krioprezerwacji, stosuje się tzw. technikę kropli-witryfikacji. W trakcie tej procedury eksplantaty po opisanej wyżej inkubacji w LS i PVS umieszcza się w kropli tego ostatniego na niewielkim pasku folii aluminiowej, a następnie wprowadzane bezpośrednio do ciekłego azotu. Istota tej techniki polega na wykorzystaniu bardzo dużej przewodności cieplnej aluminium. Jedna z naczelnych zasad technik opartych na witryfikacji głosi bowiem, że im szybsze zadane tempo schładzania i rozmrażania, tym większa jest efektywność procedury, co wiąże się z ograniczeniem ryzyka wytworzenia kryształów lodu. Dodatkową zaletą techniki kropli-witryfikacji jest ułatwienie manipulacji niewielkimi fragmentami roślin oraz ich jednoczesna ochrona przed uszkodzeniami mechanicznymi. Technika witryfikacji oraz kropli-witryfikacji okazały się wysoce efektywne w przypadku wielu gatunków roślin ozdobnych. Ich zastosowanie u chryzantem jest jednak ograniczone. Związane jest to z faktem, iż obecnie nowe odmiany często uzyskuje się na drodze hodowli mutacyjnej (indukowania zmienności czynnikami mutagennymi, na ogół promieniowaniem jonizującym X lub gamma). Efektem tych zabiegów w ok. 50% przypadków są odmiany będące chimerami (roślinami o niejednorodnej strukturze genetycznej kolejnych warstw histogenowych merystemu apikalnego). Rośliny takie są szczególnie narażone na wystąpienie zmienności [Zalewska i in. 2010]. Niektóre popularne krioprotektanty (np. DMSO, EG) natomiast są toksyczne i mogą uszkadzać komórki lub działać mutagennie. Uszkodzenie chemiczne tkanek eksplantatów może prowadzić do reorganizacji warstw histogenowych i w konsekwencji doprowadzić do zmiany barwy kwiatów lub kształtu liści, co zaobserwowano już w przypadku chryzantem [Fukai i in. 1994]. Rozwiązaniem problemu toksyczności krioprotektantów jest technologia kapsułkowania eksplantatów opracowana pierwotnie do produkcji sztucznych nasion. Po dodaniu etapu dehydratacji może być ona z powodzeniem wykorzystana w krioprezerwacji (Ryc. 1). W technice tej pąki wierzchołkowe (lub inne eksplantaty, np. zawiesiny komórkowe, zarodki somatyczne) zamykane są w ochronnej alginianowej otoczce. Alginian jest kopolimerem otrzymywanym z wyrzucanych na brzeg Atlantyku wodorostów (stanowi składnik ich ścian komórkowych). Kwas ten żeluje w obecności dwuwartościowych kationów. Alginian jest nietoksyczny (znajduje zastosowanie jako dodatek do żywności) i tańszy w porównaniu do krioprotektantów. W celu uformowania otoczki eksplantaty najpierw inkubowane są w alginianie sodu, a następnie utwardzane w roztworze chlorku wapnia (CaCl 2 ). Otoczkowany materiał biologiczny, poddawany jest dehydratacji osmotycznej w roztworach sacharozy, a następnie suszeniu (dehydratacji fizycznej) w sterylnych warunkach. Tak przygotowane eksplantaty mogą być umieszczone w jałowej, polipropylenowej kriofiolce i wprowadzone do ciekłego azotu. Istnieją też techniki kombinowane, które łączą zalety poszczególnych metod. Przykładem jest technika kapsułkowania-witryfikacji, polegająca na zamykaniu eksplantatów w alginianowej otoczce, a następnie dehydratacji w LS oraz PVS. 12

5 Techniki oparte na witryfikacji są bardziej pożądane, gdyż umożliwiają przechowywanie bardziej zróżnicowanego materiału, gwarantują szybsze tempo schładzania oraz są tańsze w porównaniu do metod klasycznych. Ryc. 1. Etapy krioprezerwacji materiału roślinnego metodą kapsułkowania-dehydratacji na przykładzie chryzantemy wielkokwiatowej: 1 mikrosadzonki w kulturze in vitro, 2 wierzchołek pędu, 3 zamknięty w ochronnej otoczce pąk wierzchołkowy, 4 kriofiolka z umieszczonym odwodnionym materiałem biologicznym, 5 naczynie Dewara (po lewej) służące do przechowywania schłodzonych prób z automatycznym dozownikiem ciekłego azotu (po prawej), 6 łaźnia wodna do szybkiego odtajania prób, 7 wzrost mikrosadzonek, 8 rośliny przeniesione do warunków in vivo [Zalewska i Kulus 2012]. Przyjmuje się, że odpowiednio zabezpieczony materiał może być przechowywany w ciekłym azocie bez strat, czy zmian właściwości przez nieokreślenie długi czas (podlega wówczas działaniu jedynie nieszkodliwego promieniowania ziemskiego). Po okresie przechowywania może zostać rozmrożony i odtworzony w kulturze in vitro. W tym celu kriofiolki wyjęte z naczynia Dewara umieszcza się w łaźni wodnej o temperaturze ok. 40 o C (szybkie tempo rozmrażania oraz wysoka temperatura są niezbędne dla uniknięcia rekrystalizacji lodu). Następnie eksplantaty wykładane są na pożywkę suplementowaną regulatorami wzrostu, w celu pobudzenia ich rozwoju. Wysoka efektywność różnych technik krioprezerwacji potwierdza możliwość wykorzystania tej technologii dla długotrwałego przechowywania cennych zasobów genetycznych chryzantem, po odpowiednim dobraniu parametrów gwarantujących wysoką przeżywalność i późniejszą zdolność wzrostową eksplantatów. 13

6 Krioprezerwacja ma wiele cennych z komercyjnego punktu widzenia zalet. W rezultacie, zwraca się ku niej (z powodzeniem) coraz więcej laboratoriów produkcyjnych. Technologia ta pozwala na redukcję kosztów (pracowniczych i produkcyjnych) związanych z prowadzeniem kultur in vitro (przygotowania pożywek i pasażowania) oraz potrzebnego na to czasu, który może zostać efektywniej wykorzystany np. na zwiększenie produkcji, a tym samym zysków przedsiębiorstw. Ponadto zmniejsza ryzyko utraty materiału w skutek rozwoju zakażeń (będących częstym problemem laboratoriów produkcyjnych) lub awarii aparatury kontrolnej w pokojach wzrostowych oraz umożliwia przechowywanie cennych (oraz cieszących się mniejszym zainteresowaniem lub nie będących aktualnie w produkcji) genotypów przez nieokreśloną długość czasu, przy jednoczesnej minimalizacji niezbędnej do tego przestrzeni. W przyszłości więcej uwagi należałoby poświęcić wpływowi krioprezerwacji na zjawisko chimeryzmu, a tym samym stabilność genetyczną przechowywanych chryzantem. Szczególnie interesujące pod tym względem są chimery peryklinalne u których jeden komponent genotypowy otacza drugi (zmieniona jest cała warstwa histogenowa). Taka niejednorodność nie może być stwierdzona wizualnie. Dopiero w efekcie reorganizacji warstw, np. na skutek uszkodzeń mrożeniowych, dochodzi do rozszczepienia poszczególnych komponentów genotypowych i zmiany barwy kwiatów. Rośliny takie wymagają zatem szczególnie dobrego zabezpieczenia przed zabiegiem mrożenia, które zagwarantuje przeżywalność całych merystemów. Fukai S Plant regeneration from shoot tips of Dianthus hybrid cryopreserved in liquid nitrogen up to 2 years. Plant Tissue Cult. Lett. 6: Fukai S Cryopreservation of chrysanthemum shoot tips. Sci. Hortic. 45: Fukai S., Goi M., Tanaka M The chimeric structure of the apical dome of chrysanthemum (Dendranthema grandiflorum (Ramat.) Kitam.) is affected by cryopreservation. Sci. Hortic. 57: Halmagyi A., Fischer-Kluver G., Mix-Wagner G., Schumacher H.M Cryopreservation of Chrysanthemum morifolium (Dendranthema grandiflora Ramat.) using different approaches. Plant Cell Rep. 22: Martin C., Gonzalez-Benito M.E Survival and genetic stability of Dendranthema grandiflora Tzvelev shoot apices after cryopreservation by vitrification and encapsulationdehydration. Cryobiology 51: Mikuła A., Rybczyński J.J Cryopreservation as a tool for long-term storage of cells, tissues and organs from in vitro culture derived. Biotechnologia 4(75): Murashige T., Skoog F A revised medium for rapid growth and bio assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant. 15: Zalewska M., Kulus D Wszystko boi się czasu, a czas boi się kriobiologów. Format UTP 3(4): Zalewska M., Miler N., Tymoszuk A., Drzewiecka B., Winiecki J Results of mutation breeding activity on Chrysanthemum x grandiflorum /Ramat./ Kitam. in Poland. Electron. J. Pol. Agric. Univ. 13(4) #27. 14