AUTOREFERAT dotyczący osiągnięć w pracy naukowo-badawczej, organizacyjnej i dydaktycznej

Transkrypt

1 dr Ewa Zabłocka-Godlewska Politechnika Śląska w Gliwicach Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki Katedra Biotechnologii Środowiskowej AUTOREFERAT dotyczący osiągnięć w pracy naukowo-badawczej, organizacyjnej i dydaktycznej Gliwice 23 marzec Imię i nazwisko Ewa Zabłocka-Godlewska 2. Posiadane dyplomy, stopnie naukowe z podaniem nazwy, miejsca i roku ich uzyskania oraz tytułu rozprawy doktorskiej 2001 Stopień doktora nauk technicznych w dyscyplinie inżynieria środowiska (specjalność mikrobiologia środowiskowa). Politechnika Śląska w Gliwicach, Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki. Tytuł rozprawy doktorskiej: Dynamika zmian w biocenozach gleb naturalnych i modyfikowanych skażonych substancjami ropopochodnymi. Promotor prof. dr hab. inż. Korneliusz Miksch Tytuł zawodowy magister biologii, specjalność biologia środowiskowa. Uniwersytet Śląski w Katowicach Wydział Biologii i Ochrony Środowiska

2 3. Informacje o dotychczasowym zatrudnieniu w jednostkach naukowych asystent Politechnika Śląska w Gliwicach Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki Katedra Biotechnologii Środowiskowej 2001-nadal adiunkt Politechnika Śląska w Gliwicach Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki Katedra Biotechnologii Środowiskowej 4. Wskazanie osiągnięcia wynikającego z art. 16 ust. 2 ustawy z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz. U Nr 65, poz. 595 ze zm.) a) Tytuł osiągnięcia naukowego 1. Zabłocka-Godlewska E.: Bakterie w dekoloryzacji barwników syntetycznych. Monografia 596, Wydawnictwo Politechniki Śląskiej, Gliwice 2016, ISBN Recenzenci: Prof. dr hab. inż. Krystyna Olańczuk-Neyman Prof. dr hab. inż. Tomasz Winnicki 2. Zabłocka-Godlewska E., Przystaś W., Grabińska-Sota E.: Decolourization of Diazo Evans Blue by Two Strains of Pseudomonas fluorescens Isolated from Different Wastewater Treatment Plants, Water Air and Soil Pollut. Vol 223, nr 8, 2012, p Zabłocka-Godlewska E., Przystaś W., Grabińska-Sota E.: Decolourisation of Different Dyes by two Pseudomonas Strains Under Various Growth Conditions Water Air and Soil Pollut. Vol. 225, 2014, p ; DOI /s Zabłocka-Godlewska E., Przystaś W., Grabińska-Sota E.: Dye Decolourisation Using Two Klebsiella Strains, Water Air and Soil Pollut. Vol. 226, 2015, p , DOI /s

3 b) Omówienie celu naukowego ww. pracy i osiągniętych wyników wraz z omówieniem ich ewentualnego wykorzystania w praktyce Wprowadzenie Trudno współcześnie znaleźć dział gospodarki, w którym nie wykorzystuje się barwników syntetycznych. Szacuje się, że od 1856 roku (synteza pierwszego barwnika syntetycznego) na świecie wytworzono 100 tysięcy różnorodnych związków tego typu. Powszechność ich stosowania oraz oferowana obszerna gama kolorystyczna wynikają z wysokich wymagań współczesnego konsumenta, dotyczących estetyki produktu, a zamierzona stabilność chemiczna z pożądanej trwałości wybarwienia. O skali zapotrzebowania na barwniki może świadczyć wielkość światowej ich produkcji. Szacuje się, że rocznie wytwarzane jest ponad 7*10 5 ton. Barwniki azowe to ponad 3000 różnych związków, wagowo stanowiących około 70% wszystkich globalnie stosowanych substancji barwnych. Barwniki syntetyczne uznaje się współcześnie za jedną z głównych grup substancji zanieczyszczających środowisko przyrodnicze, zwłaszcza wody powierzchniowe. Emisja zanieczyszczeń barwnych ma miejsce zarówno na etapie wytwarzania barwników, ich aplikacji, jak również użytkowania zabarwionych już produktów. Współcześnie produkowane barwniki syntetyczne konstruowane są w sposób zapewniający ich stabilność chemiczną i odporność na działanie czynników fizycznych, chemicznych i biologicznych. W procesach barwienia nigdy nie uzyskuje się związania całości użytego barwnika przez materiał barwiony, co generuje liczne problemy środowiskowe, wynikające z powstawania dużych ilości silnie zabarwionych, trudnych do oczyszczenia ścieków. Szacuje się, że z samego przemysłu włókienniczego, rocznie w skali globalnej, ze ściekami odprowadzanych jest ton tych ksenobiotyków, z istotnym udziałem powszechnie stosowanych barwników azowych. Złożony i zmienny skład ścieków barwnych oraz ksenobiotyczny charakter barwników generują liczne problemy w konwencjonalnych procesach ich oczyszczania. Niedoskonałość procesów barwienia w połączeniu z niewystarczającą efektywnością wspomnianych konwencjonalnych systemów powodują, że wraz z oczyszczonymi ściekami część ładunku zanieczyszczeń w formie niezmienionych lub częściowo naruszonych cząsteczek barwników, trafia do środowiska i przyczynia się do wzrastającego zanieczyszczenia wód powierzchniowych i gruntowych. Słaba podatność tych związków na biodegradację skutkuje możliwością kumulowania ich w środowisku. Niewielkie stężenia tych substancji obecnych w wodach zmieniają ich barwę, co bezpośrednio wpływa na przenikalność światła, poziom produkcji pierwotnej oraz deficyt tlenu. Barwniki mogą wywoływać ostre efekty toksyczne u organizmów eksponowanych na ich obecność. W przypadku dużej części tych substancji oraz produktów ich transformacji stwierdzono właściwości kancerogenne i mutagenne. Należy również pamiętać o zagrożeniach dla środowiska glebowego, związanych z rolniczym wykorzystywaniem osadów ściekowych, zawierających zasorbowane barwniki. Wobec 3

4 powyższego istnieje potrzeba opracowania technologii oczyszczania ścieków barwnych, które będą bardziej efektywne od stosowanych dotychczas i umożliwią całkowitą eliminację zanieczyszczeń barwnikowych. Szacuje się, że wybarwienie ton tekstyliów wiąże się z wytworzeniem m 3 ścieków dziennie, a należy pamiętać, że przemysł włókienniczy nie jest jedynym źródłem ich powstawania. Wobec konieczności oczyszczania ogromnych objętości ścieków barwnych, powstających w wodochłonnych procesach barwienia, istotnym kryterium przy wyborze technologii oczyszczania, oprócz jej skuteczności, są aspekty ekonomiczne oraz brak generowania dużych ilości, często toksycznych, trudnych do zagospodarowania odpadów poprocesowych. Kryteria te częściowo dyskwalifikują niektóre, efektywne w usuwaniu barwników, metody fizyczne czy chemiczne. Badania nad metodami dekoloryzacji zanieczyszczeń barwnych są obecnie skoncentrowane na poszukiwaniu rozwiązań zarówno efektywnych jak tanich i środowiskowo bezpiecznych. Duże nadzieje wiąże się z udoskonaleniem niskokosztowych i bezpiecznych dla środowiska biologicznych metod dekoloryzacji. Wykorzystanie w tych procesach odpowiednio wyselekcjonowanych szczepów bakterii może stanowić atrakcyjną alternatywę. Biologiczne metody odbarwiania stwarzają możliwość całkowitej mineralizacji organicznych zanieczyszczeń, są uznawane za przyjazne dla środowiska i bardziej akceptowalne społecznie. W porównaniu z fizycznymi czy chemicznymi systemami oczyszczania ścieków barwnych, towarzyszy im produkcja znacznie mniejszych ilości kłopotliwych w zagospodarowaniu odpadów poprocesowych. Bardzo istotnym atutem procesów biologicznych są również nieporównywalnie niższe koszty. Prowadzone obecnie badania nad metodami bakteryjnej dekoloryzacji koncentrują się głównie na poszukiwaniu i doborze szczepów mikroorganizmów skutecznych w usuwaniu określonych barwników, zbadaniu mechanizmów ich dekoloryzacji oraz optymalizacji warunków prowadzenia procesu odbarwiania. Pomimo złożonego charakteru ścieków barwnych i obecności w nich licznych substancji barwnych, należących często do różnych grup chemicznych, zdecydowana większość badań nad procesami biologicznej, w tym bakteryjnej dekoloryzacji, koncentruje się na określeniu możliwości usuwania pojedynczych barwników. Ponadto najczęściej oceniany jest potencjał dekoloryzacyjny pojedynczych szczepów bakterii z pominięciem możliwości zastosowania ich mieszanych kultur czy konsorcjów. Bardzo istotnym, ale często pomijanym elementem badań nad dekoloryzacją ścieków barwnych jest szacowanie bezpieczeństwa środowiskowego stosowanej technologii. Ocena ekotoksykologiczna substancji trafiających do wód powierzchniowych, a niewątpliwie takimi są wnoszone wraz z oczyszczonymi ściekami pozostałości barwników oraz produkty ich biotransformacji, jest zawarta w wytycznych Ramowej Dyrektywy Wodnej. Uzasadniona zatem jest podjęta w pracy próba częściowego wypełnienia tej luki. 4

5 Omówienie celu naukowego Celem badań przedstawionych w monografii było określenie możliwości dekoloryzacji barwników syntetycznych, należących do różnych grup chemicznych (trifenylometanowej zieleni brylantowej (ZB) i disazowego błękitu Evansa (BE)), przez specjalnie wyselekcjonowane gatunki bakterii o udowodnionym potencjale dekoloryzacyjnym. Ocenie poddano efektywność bakteryjnej dekoloryzacji barwników użytych zarówno pojedynczo jak w mieszaninie. Wykorzystane szczepy bakteryjne zastosowano w postaci czystych oraz mieszanych kultur. Oceniono wpływ zróżnicowanego poziomu wytrząsania hodowli na efektywność procesów odbarwiania roztworów. Innym aspektem przeprowadzonych badań było określenie mechanizmu dekoloryzacji (sorpcja i/lub biotransformacja) oraz jego zależności od struktury usuwanego barwnika, zastosowanego szczepu oraz warunków prowadzenia procesu. Uzyskane wyniki były przesłanką do realizacji kolejnego celu, jakim było określenie możliwości zastosowania badanych mieszanych kultur bakteryjnych w układach hodowli półokresowej w reaktorach porcjowych w celu dekoloryzacji kolejnych wprowadzanych porcji mieszaniny barwników (ZB+BE). W tej części badań oceniono wpływ korekty ph oraz dostarczenia uzupełniających porcji składników pokarmowych na efektywność bakteryjnych procesów dekoloryzacji. Istotnym elementem prowadzonych badań była ocena ekotoksykologiczna roztworów poprocesowych po zakończeniu bakteryjnej dekoloryzacji, której celem było określenie bezpieczeństwa środowiskowego procesów. Omówienie osiągniętych wyników i wskazanie możliwości ich wykorzystania Realizacja wytyczonych celów wymagała przeprowadzenia obszernych badań laboratoryjnych, które obejmowały: screening szczepów bakterii aktywnych w dekoloryzacji barwników syntetycznych różnych grup oraz określenie potencjału dekoloryzacyjnego wyselekcjonowanych szczepów, procesy bakteryjnej dekoloryzacji wybranych barwników (azowego BE i trifenylometanowej ZB) zastosowanych pojedynczo i w mieszaninie przez czyste i mieszane kultury bakteryjne, w zróżnicowanych warunkach hodowli, ocenę ekotoksykologiczną roztworów poprocesowych uzyskanych po zakończeniu bakteryjnej dekoloryzacji, obejmującą testy fito- i zootoksyczności, w celu określenia bezpieczeństwa środowiskowego procesów. Na potrzeby badań przeprowadzono screening zanieczyszczonych wód rzecznych Górnego Śląska oraz ścieków komunalnych, pochodzących z dopływów i komór napowietrzania kilku oczyszczalni ścieków województwa śląskiego. Screening prowadzono w kierunku pozyskania szczepów bakteryjnych, wykazujących potencjał dekoloryzacyjny 5

6 względem barwników syntetyczych różnych grup (azowych, trifenylometanowych, fluorenowych, antrachinonowych). Spośród wyizolowanych 106 szczepów, wykazujących zróżnicowany potencjał dekoloryzacyjny, do dalszych badań wytypowano 5 szczepów o wysokiej efektywności i szerokim spektrum dekoloryzacji barwników syntetycznych. Bakterie te zidentyfikowano jako: względnie beztlenowe Klebsiella sp. (Bz4) i Klebsiella planticola (Rz7), oraz tlenowe Pseudomonas fluorescens (Sz6), Pseudomonas fluorescens (SDz3) oraz Burkholderia cepacia (s45). Wyniki przeprowadzonych badań wstępnych wykazały zależność efektywności dekoloryzacji od struktury chemicznej barwnika jego stężenia oraz zastosowanego w procesie dekoloryzacji szczepu bakterii. Wymienione szczepy bakteryjne zostały zastosowane w dalszych badaniach w postaci czystych i mieszanych kultur. Do badań głównych wytypowano dwa barwniki syntetyczne należące do różnych grup chemicznych: disazowy błękit Evansa (BE) oraz trifenylometanową zieleń brylantową (ZB). Barwniki zastosowano pojedynczo oraz w mieszaninie (1:1). Bakteryjnej dekoloryzacji poddano roztwory barwników o stężeniach: BE 0,05 g/dm 3, ZB 0,1 g/dm 3, mieszanina 0,08 g/dm 3 (0,04 g/dm 3 BE + 0,04 g/dm 3 ZB). Stężenia barwników w roztworach poddawanych dekoloryzacji dobrano na podstawie przeprowadzonych wcześniej testów stężeniowych. Inokula do zaszczepienia hodowli, przygotowane z 48-godzinnych hodowli szczepów, doprowadzono do mętności na poziomie 5 w skali Mc Farlanda (~15*10 8 CFU/cm 3 ). Biomasę w postaci zawiesiny wprowadzano do prób badawczych w objętościach gwarantujących identyczne jej stężenie początkowe we wszystkich hodowlach. Po namnożeniu biomasy (inkubacja 48 h w temp. 26 C faza stacjonarna) do prób wprowadzono barwniki. Do oceny udziału sorpcji w procesie dekoloryzacji wykorzystano namnożoną biomasę badanych szczepów autoklawowaną przed wprowadzeniem barwników. Badania bakteryjnej dekoloryzacji prowadzono w warunkach zróżnicowanego poziomu wytrząsania hodowli (statyczne brak wytrząsania; półstatyczne 12 h wytrząsania/12 h brak wytrząsania; dynamiczne całodobowe wytrząsanie ( rpm)). Wykonywane w trakcie badań analizy obejmowały: określenie zawartości barwników w roztworach na podstawie pomiaru absorbancji (UV Vis Hitachi U-1900) przy długościach fal wyznaczonych dla poszczególnych barwników lub ich mieszaniny, odpowiadających wartościom maksymalnej absorbancji (BE 606 nm, ZB 624 nm, mieszanina barwników 591 nm); skanowanie roztworów poprocesowych po zakończeniu procesu dekoloryzacji w zakresie UV-Vis; analizę mikrobiologiczną obejmującą określenie stężenia żywej biomasy w hodowli [CFU/cm 3 ] oraz kontrolę jej czystości; analizę ekotoksykologiczną mieszaniny poreakcyjnej otrzymanej po zakończeniu badań testy fitotoksyczności (z użyciem Lemna minor) i zootoksyczności (z użyciem Daphnia magna). 6

7 W celu określenia istotności wpływu badanych parametrów, na efektywność dekoloryzacji, przeprowadzono analizę statystyczną uzyskanych wyników. Zastosowano analizę wariancji ANOVA/MANOVA (test NIR test wielokrotnych porównań), testującą istotność różnic pomiędzy średnimi oraz jej nieparametryczny odpowiednik, czyli test rangowy Kruskala-Wallisa. Przyjęto poziom istotności statystycznej p<0,05. Obliczenia wykonano w programie Statistica ver.5. Badania dekoloryzacji błękitu Evansa (BE), zieleni brylantowej (ZB) i ich mieszaniny (BE+ZB) przez czyste kultury bakteryjne wykazały, że pomimo złożonej struktury chemicznej disazowego błękitu Evansa, biostatycznych właściwości trifenylometanowej zieleni brylantowej oraz wysokiej, a nawet ekstremalnej toksyczności obu pojedynczych barwników i ich mieszaniny (wykazanej w testach toksyczności), biologiczna dekoloryzacja ich roztworów możliwa była przy właściwie ustalonych stężeniach początkowych tych substancji. W odpowiednio dobranych warunkach hodowli, wszystkie badane szczepy bakteryjne (zastosowane w postaci czystych kultur) usuwały wymienione barwniki i ich mieszaninę z wysoką efektywnością (po 120 h od 73,21 do 100%). Procesy odbarwiania roztworów były wynikiem dwóch mechanizmów fizycznej sorpcji na biomasie oraz procesów enzymatycznej biotransformacji (wyjątkiem był wyłącznie sorpcyjny mechanizm usuwania BE stwierdzony w przypadku szczepu s45). Sorpcja stanowiła pierwszy etap bakteryjnej dekoloryzacji, pozwalający na związanie na powierzchni komórek barwników, które następnie podlegały procesom biotransformacji, o czym świadczyło stwierdzone odbarwienie biomasy w kolejnych godzinach badań. Udział sorpcji w procesie dekoloryzacji był bardzo zróżnicowany (po 120 h od 8,4% do 77,78%). Zależał od rodzaju barwnika, jak też indywidualnych właściwości sorpcyjnych badanych szczepów bakterii. Największe zdolności sorpcyjne stwierdzono w przypadku dwóch szczepów: Klebsiella sp. (Bz4) - usunięcie barwników na drodze sorpcji po 120 h mieściło się w zakresie od 70,51% ZB do 75,28% mieszaniny BE+ZB; Burkholderia cepacia (s45) usunięcie barwników na drodze sorpcji po 120 h było w zakresie od 49,12% ZB do 77,78% BE. O udziale sorpcji w procesie decydowało również to, czy odbarwianiu poddawano pojedyncze barwniki (ZB i BE), czy ich mieszaninę (BE+ZB). Przeprowadzone analizy UV-Vis wykazały zmianę właściwości pojedynczych barwników (ZB i BE) w mieszaninie (różne długości fal odpowiadające maksymalnym absorbancjom pojedynczych barwników i ich mieszaniny). Odmienne właściwości mieszaniny korespondowały ze wzrostem (w porównaniu do barwników pojedynczych) poziomu jej sorpcji przez biomasę czystych kultur bakteryjnych, co stwierdzono w przypadku większości hodowli. Poziom wytrząsania hodowli (warunki statyczne, półstatyczne, dynamiczne) miał wpływ na wyniki usunięcia barwników przez czyste kultury bakteryjne (z wyjątkiem szczepu s45), co potwierdziły przeprowadzone analizy statystyczne (p<0,05). W przypadku disazowego barwnika (BE) procesy odbarwiania, niezależnie od zastosowanego szczepu bakterii i jego 7

8 wymagań tlenowych, najefektywniej zachodziły w hodowlach statycznych (usunięcie po 120 h od 85,76% do 100%). Wynikało to najprawdopodobniej z inhibicyjnego wpływu wyższej zawartości tlenu rozpuszczonego w próbach półstatycznych i dynamicznych na aktywność beztlenowej azoreduktazy odpowiadającej za pierwszy, redukcyjny etap rozkładu związków azowych. W przypadku barwnika trifenylometanowego (ZB) i mieszaniny barwników (ZB+BE), warunki inkubacji, odpowiadające najwyższej efektywności odbarwiania roztworów (usunięcie po 120 h od 96% do 100%), zależały od właściwości zastosowanego szczepu. Należy jednak podkreślić, iż typowy dla danego szczepu sposób oddychania (tlenowy, beztlenowy) nie zawsze był czynnikiem jednoznacznie determinującym rodzaj (warunki) hodowli, w której uzyskiwano najwyższe wyniki dekoloryzacji (wyjątek względnie beztlenowy szczep Bz4, odbarwiający roztwory najefektywniej w hodowlach statycznych). W badaniach wykazano również, że szczepy bakterii należące do tego samego gatunku, a wyizolowane z różnych środowisk, mogą różnić się właściwościami metabolicznymi, w tym potencjałem dekoloryzacyjnym, co wykazano w przypadku dwóch badanych szczepów Pseudomonas fluorescens (Sz6 i SDz3). Stwierdzone różnice dotyczyły również udziału poszczególnych mechanizmów (sorpcji i biotransformacji) w usuwaniu ZB, BE i ich mieszaniny oraz warunków, w których efektywność procesów odbarwiania była najwyższa. Równolegle z badaniami nad dekoloryzacją barwników przez pojedyncze szczepy bakterii prowadzono pomiary stężenia ich żywej biomasy w hodowlach. We wszystkich hodowlach stwierdzono wahania liczebności bakterii z utrzymującą się tendencją zamierania biomasy. Zwrócono uwagę, że poziom dekoloryzacji barwników nie zawsze był proporcjonalny do stężenia żywej biomasy w hodowli. Przeprowadzone testy fito- i zootoksyczności w zdecydowanej większości prób wykazały obniżenie toksyczności roztworów poprocesowych względem kontroli barwnikowych o jedną lub dwie klasy toksyczności. Nie uzyskano jednak całkowitej ich detoksykacji. Wykazany w tej części badań wysoki potencjał dekoloryzacyjny badanych szczepów bakteryjnych oraz obniżenie toksyczności roztworów po zakończeniu dekoloryzacji wskazuje na możliwość zastosowania badanych bakterii w systemach biologicznego oczyszczania roztworów/ścieków barwnych. Ponadto udowodniony w przypadku kilku szczepów (głównie Bz4 i s45) wysoki potencjał sorpcyjny wskazuje na możliwość wykorzystania ich biomasy w procesach usuwania barwników niepodatnych na biodegradację lub w procesach prowadzonych w warunkach niekorzystnych dla rozwoju i wzrostu bakterii (np. zbyt wysokie stężenia barwników w roztworach, obecność barwników i innych substancji o charakterze toksycznym). Wyniki dekoloryzacji barwników i ich mieszaniny przez czyste kultury bakteryjne opublikowano częściowo w pracach I.A.2; I.A.3 oraz I.A.4 (załącznik 3). W zakresie monografii (I.A.1 załącznik 3) dokonano obszerniejszego i bardziej szczegółowego opracowania tych wyników, poddając je analizie statystycznej i wzbogacając o dane dotyczące wahań stężenia żywej biomasy w hodowlach. Wyniki obszernych badań 8

9 realizowanych w ramach kolejnych etapów opublikowano tylko w monografii (I.A.1 załącznik 3). Odpowiedni poziom bioróżnorodności mikrobiocenoz ekosystemów naturalnych i sztucznych, takich jak np. bioreaktory umożliwia zawiązanie wielu zależności pomiędzy mikroorganizmami tworzącymi te układy ekologiczne, opartych m.in. na metabiozie, synergizmie, syntrofii czy kometabolizmie, umożliwiających sprawne przeobrażanie substancji organicznych przy współudziale organizmów, o różnorodnych możliwościach metabolicznych. W kolejnym etapie badań zastosowano więc mieszane kultury bakterii, zakładając, że poszerzy to spektrum przemian i zwiększy sprawność procesów usuwania barwników syntetycznych, przez zwiększenie efektywności biotransformacji, a nawet mineralizacji substancji barwnych. W mieszanych mikrobiocenozach (konsorcja lub sztucznie skomponowane mieszane kultury) poszczególne szczepy, wyposażone w różnorodne aparaty enzymatyczne, mogą atakować cząsteczkę barwnika w różnych pozycjach lub uczestniczyć w dekompozycji metabolitów, wytworzonych przez współwystępujące mikroorganizmy (syntrofia). W prezentowanych badaniach zastosowano mieszane kultury bakteryjne skomponowane z dwóch szczepów: bazowego (Bz4) i dopełniającego (Rz7, Sz6, SDz3 lub s45), pomiędzy którymi nie stwierdzono antagonizmów. O wyborze Bz4 na szczep bazowy zdecydowała wysoka efektywność usuwania ZB, BE i ich mieszaniny już w pierwszej godzinie procesu dekoloryzacji, będąca prawdopodobnie wynikiem połączenia dwóch mechanizmów wysokiego poziomu sorpcji i enzymatycznej biotransformacji. Założono, że tak wysoka redukcja zawartości barwników na początku procesu stworzy korzystniejsze warunki rozwoju szczepu dopełniającego i może wpłynąć na wzrost efektywności dekoloryzacji. Inokula zaszczepowe pojedynczych szczepów przygotowano identycznie jak w poprzednim etapie badań. Posłużyły one do skomponowania kultur mieszanych z biomasy szczepów składowych w stosunku 1:1. W celu uniknięcia wpływu stężenia biomasy na wyniki dekoloryzacji, odpowiednio przygotowane zawiesiny bakteryjne (stężenie biomasy wg skali Mc Farlanda ~15*10 8 CFU/cm 3 ) wprowadzano do prób badawczych w objętościach, które gwarantowały we wszystkich hodowlach kultur mieszanych uzyskanie jednakowych początkowych stężeń biomasy, również w odniesieniu do ich stężeń w hodowlach czystych kultur (poprzedni etap badań). Mieszane kultury bakteryjne, skomponowane na bazie szczepów o odpowiednio dobranych cechach, efektywnie usuwały zarówno pojedyncze barwniki, jak również ich mieszaninę. Ich zastosowanie w większości przypadków wydłużyło jednak czas odbarwiania roztworów, co częściowo rekompensowały wyższe, końcowe wyniki usunięcia. Najwyższy poziom dekoloryzacji ZB, BE i ich mieszaniny przez mieszane kultury uzyskano w hodowlach statycznych, w których efektywność procesu była na poziomie porównywalnym lub wyższym od efektywności szczepów pojedynczych (usunięcie po 120 h od 95,38% do 100%). Spadek wydajności procesów dekoloryzacji względem czystych kultur bakteryjnych obserwowano najczęściej w hodowlach półstatycznych i dynamicznych (usunięcie po 9

10 120 h od 52,99% do 84,22%). Przeprowadzone analizy statystyczne dotyczące wpływu warunków hodowli na wyniki dekoloryzacji wykazały istotne statystycznie różnice (p<0,05) głównie między wynikami uzyskanymi w hodowlach statycznych a pozostałych warunkach prowadzenia procesu (dynamicznych i półstatycznych). Podobnie jak w przypadku pojedynczych szczepów bakterii mechanizm dekoloryzacji barwników i ich mieszaniny przez mieszane kultury bakteryjne był dwojaki (sorpcja i biotransformacja). Udział sorpcji w odbarwianiu roztworów był zróżnicowany (po 120 h od 22,67% do 86,17%) i zależał od gatunków bakterii wchodzących w skład mieszanej kultury. Połowiczny udział każdego ze szczepów w mieszaninie nie przekładał się jednak na uzyskanie uśrednionej wartości sorpcji, wykazanej dla szczepów pojedynczych. Współobecność dwóch szczepów w mieszanej kulturze mogła przyczynić się do zmiany ich proporcji w trakcie hodowli, wpływając na sumaryczne właściwości mieszanej biomasy. Mogło to być powodem obserwowanych zmian jej właściwości sorpcyjnych (znaczący spadek albo wzrost względem pojedynczych szczepów) i różnic w sorbowaniu pojedynczych barwników i ich mieszaniny. Podobnie jak w przypadku czystych kultur bakterii, wykazane na podstawie analizy UV-Vis odmienne właściwości mieszaniny barwników (ZB+BE) względem barwników pojedynczych, korespondowały ze wzrostem poziomu jej sorpcji przez biomasę mieszanych kultur. Wyniki pomiarów stężenia żywej biomasy w roztworach dekoloryzowanych przez mieszane kultury bakteryjne wykazały, w przeciwieństwie do czystych kultur, utrzymującą się do końca badań żywotność hodowli. W trakcie badań, pomimo obserwowanych fluktuacji liczebności bakterii, nie stwierdzono wyraźnie zarysowanej tendencji zamierania biomasy, co odnotowano w przypadku hodowli pojedynczych szczepów bakterii. Otrzymane wyniki, pomimo często stwierdzanego spowolnienia procesu, wskazywały więc na większy potencjał i możliwość wykorzystania mieszanych kultur bakteryjnych w kolejnych cyklach dekoloryzacji barwników. Dekoloryzacja pojedynczych barwników (ZB i BE) oraz ich mieszaniny przez pojedyncze szczepy bakterii (Bz4, Rz7, Sz6, SDz3, s45), w zdecydowanej większości przypadków, przyczyniła się do obniżenia toksyczności prób poprocesowych względem kontroli barwnikowej (o jedną, a nawet dwie klasy toksyczności). Zastosowanie mieszanych kultur bakterii w procesie dekoloryzacji barwników skutkowało większym lub porównywalnym z czystymi kulturami obniżeniem toksyczności roztworów poprocesowych. Wynikało to prawdopodobnie z większych możliwości metabolicznych kultur mieszanych, a co za tym idzie możliwości sprawniejszego usuwania powstających pośrednich produktów przemian. Roztwory poprocesowe wykazywały wyższy poziom zoo- aniżeli fitotoksyczności. Jednak podobnie jak w próbach po dekoloryzacji przez czyste szczepy bakteryjne, w żadnym przypadku nie stwierdzono całkowitej detoksykacji roztworów. Wyniki przeprowadzonych badań wykazały, że mieszaniny barwników mogą być dekoloryzowane przez wyizolowane szczepy z efektywnością równie wysoką jak barwniki stosowane indywidualnie. W zdecydowanej większości analizowanych przypadków najlepsze 10

11 wyniki odbarwiania uzyskano w warunkach statycznych. W tych warunkach zastosowane mieszane kultury bakterii całkowicie odbarwiały roztwory, a liczebność bakterii w hodowlach, w przeciwieństwie do czystych kultur, do końca badań utrzymywała się na wysokim poziomie. Wyniki przeprowadzonych testów fito- i zootoksyczności niejednokrotnie wskazywały na niższą, w porównaniu do prób dekoloryzowanych przez pojedyncze szczepy, toksyczność roztworów odbarwianych przez mieszane kultury bakterii. Kierując się opisanymi powyżej wynikami, zaplanowano ostatni etap badań, obejmujący hodowle w bioreaktorach. W etapie tym dekoloryzacji poddano mieszaninę azowego błękitu Evansa i trifenylometanowej zieleni brylantowej o stężeniu początkowym 0,08 g/dm 3 (0,04 g/dm 3 ZB + 0,04 g/dm 3 BE). Badania prowadzono w warunkach statycznych, w układzie hodowli półokresowej w bioreaktorach porcjowych, w celu określenia możliwości dekoloryzacji kolejnych, wprowadzanych dawek mieszaniny barwników. Substancje barwne wprowadzano w 3 kolejnych porcjach w objętościach pozwalających każdorazowo na wzrost ich stężenia w reaktorze o 0,03 g/dm 3 (0,015 g/dm 3 ZB + 0,015 g/dm 3 BE). W tej części badań podjęto również próbę optymalizacji warunków procesu. Dokonano oceny wpływu na efektywność odbarwiania roztworów barwnych takich czynników, jak korekta ph (do ph>6,0) oraz dostarczenie uzupełniającego źródła węgla i azotu w postaci wprowadzanych co 48 h porcji zatężonego podłoża hodowlanego. Po wprowadzeniu każdej kolejnej dawki pożywki uzyskiwano w roztworze hodowlanym wzrost stężenia substratów odżywczych o: 0,4 g/dm 3 glukozy, 0,1 g/dm 3 peptonu, 0,04 g/dm 3 ekstraktu drożdżowego. Po zakończeniu badań dokonano oceny ekotoksykologicznej na podstawie testów fito- i zootoksyczności. Dekoloryzację mieszaniny barwników ZB+BE w bioreaktorach prowadzono z użyciem wcześniej opisanych mieszanych kultur bakteryjnych oraz szczepu bazowego Bz4 w postaci czystej kultury. Przygotowanie inokulum i zaszczepienie reaktorów przeprowadzono zgodnie z procedurą opisaną w poprzednich etapach badań. Każdą mieszaną kulturę bakteryjną testowano w następujących seriach, które różniły się zastosowanymi modyfikacjami: bez modyfikacji (b.m.), z korektą ph (ph), z dodatkiem pożywki (poż.), z korektą ph i dodatkiem pożywki (ph+poż.). Odczyn jest czynnikiem determinującym aktywność enzymatyczną bakterii, przyrost biomasy bakteryjnej, możliwość sorpcji barwnika przez biomasę, jak też możliwość jego przenikania przez błonę komórkową, decyduje również o biodostępności barwnika jako substratu, wpływając na jego rozpuszczalność. Jest on więc jednym z parametrów istotnie wpływających na efektywność biologicznej dekoloryzacji barwników syntetycznych. Poszczególne szczepy bakterii różnią się preferencjami, co do wartości czy też optymalnego zakresu ph. Przyjmuje się, że dla procesów bakteryjnej dekoloryzacji optymalny jego zakres mieści się między 6,0-9,5. Obecność w środowisku reakcji dodatkowego źródła węgla i azotu 11

12 może zwiększyć wyniki usunięcia barwników, ponieważ w procesach dekoloryzacji związki te pełnią dwie zasadnicze funkcje: po pierwsze, stanowią źródło węgla, azotu i energii niezbędnej dla wzrostu i przetrwania mikroorganizmów, po drugie, są donorami elektronów niezbędnych w redukcyjnych procesach degradacyjnych, np. redukcyjnym rozszczepianiu wiązań azowych. Uzyskane wyniki wykazały, że zarówno szczep bazowy Bz4, jak również skomponowane z jego udziałem mieszane kultury bakteryjne mogą efektywnie usuwać kolejne, dostarczane porcje mieszaniny barwników (BE+ZB), pracując w układach hodowli półokresowej. W przypadku mieszaniny dwóch względnie beztlenowych szczepów Bz4+Rz7 odbarwienie wszystkich 4 porcji barwników we wszystkich reaktorach zaszło w najkrótszym czasie. Wykazano, że zastosowane modyfikacje prób w postaci: korekty odczynu, dostarczenia dodatkowych porcji kosubstratów oraz obu tych modyfikacji łącznie (ph+pożywka) nie wpłynęły na wzrost efektywności dekoloryzacji pierwszej startowej (0,08 g/dm 3 ) i drugiej (0,03 g/dm 3 ) dawki mieszaniny barwników. Regulacja odczynu oraz regulacja odczynu połączona z dostarczeniem kosubstratów pozwoliły natomiast na utrzymanie wysokiej efektywności i skrócenie czasu odbarwiania w 3 i 4 etapie we wszystkich bioreaktorach. Istotny wpływ tych modyfikacji na efektywność dekoloryzacji przez szczep Bz4 w 3 etapie i mieszane kultury (z wyjątkiem Bz4+Rz7) w 4 etapie potwierdziły przeprowadzone analizy statystyczne (test NIR/Kruskala-Wallisa p<0,05). Natomiast w reaktorach bez modyfikacji, jak również w reaktorach z dodatkiem samej pożywki w 3, a zwłaszcza 4 etapie badań stwierdzono obniżenie efektywności dekoloryzacji względem etapów wcześniejszych. Otrzymane wyniki dekoloryzacji były niższe aniżeli uzyskane w reaktorach z korektą odczynu. Ponadto stwierdzono, że w przypadku szczepu Bz4 i mieszanin Bz4+Rz7 i Bz4+Sz6 modyfikacja polegająca na dostarczaniu kolejnych porcji samej pożywki wpłynęła na istotne spowolnienie procesu dekoloryzacji względem wyników uzyskiwanych w pozostałych reaktorach, w tym w reaktorach bez modyfikacji. Dostępność łatwo przyswajalnych substratów, stanowiących źródło węgla i azotu, mogła spowodować wśród bakterii spadek zainteresowania barwnikami, a co za tym idzie, obniżenie efektywności procesu dekoloryzacji. Analizy UV-Vis, wykonane po zakończeniu procesów dekoloryzacji w bioreaktorach, wykazały obecność w roztworach poprocesowych produktów biotransformacji (pojawienie się nowych pików nieobecnych w skanach kontrolnych roztworów barwnikowych). W zależności od zastosowanej mieszaniny szczepów nowe piki pojawiały się przy różnych długościach fal. Wskazywało to na różnice w przebiegu procesów dekoloryzacji oraz różnorodność powstających metabolitów w zależności od zaangażowanych w przemiany szczepów bakterii. Uzyskane widma UV-Vis potwierdziły jednocześnie pozytywny wpływ obu modyfikacji z korektą odczynu (ph i ph+pożywka) na wyniki dekoloryzacji i mniejsze nagromadzenie metabolitów w próbach. 12

13 Pomiary stężenia żywej biomasy w reaktorach nie dały jednoznacznej odpowiedzi, dotyczącej wpływu tego parametru na wyniki dekoloryzacji. Stwierdzono wahania liczebności bakterii we wszystkich próbach, niezależnie od modyfikacji, jednak wyraźne tendencje spadku ich liczebności obserwowano głównie w próbach niemodyfikowanych. Ocena ekotoksykologiczna prób poprocesowych, po zakończeniu 4 cykli dekoloryzacji mieszaniny barwników (BE+ZB) przez mieszane kultury bakteryjne, wykazała spadek ich toksyczności. Roztwory poprocesowe były bardziej toksyczne względem organizmu testowego Daphnia magna aniżeli Lemna minor. Nie udało się jednak powiązać warunków prowadzenia procesu ani stopnia usunięcia barwników ze stopniem obniżenia toksyczności prób. Najczęściej uzyskiwano redukcję z V do IV klasy toksyczności, w pojedynczych przypadkach z V do III klasy. Należy zwrócić uwagę, że toksyczność prób poprocesowych po dekoloryzacji przez mieszane kultury bakteryjne 4 kolejnych dawek mieszaniny barwników (bioreaktory) była wyższa aniżeli po dekoloryzacji jednej jej dawki. Wynikało to prawdopodobnie z faktu, iż odbarwianiu kilku porcji barwników, w warunkach hodowli półokresowej, towarzyszyła kumulacja większej ilości produktów biotransformacji barwników, jak też innych metabolitów bakteryjnych. Uzyskane wyniki oceny ekotoksykologicznej wskazują więc na częściową tylko detoksykację roztworów po dekoloryzacji, co nie gwarantuje bezpieczeństwa środowiskowego procesu. Pomimo zadowalających wyników usunięcia barwników, stwierdzana nadal wysoka toksyczność prób poprocesowych wskazuje na potrzebę dalszych badań nad procesami bakteryjnej dekoloryzacji połączonej z większą, a nawet całkowitą detoksykacją roztworów barwnych. Podsumowanie Odpowiednio dobrana lokalizacja źródeł poboru materiału do izolacji mikroorganizmów i prawidłowo przeprowadzony screening bakterii zdolnych do degradacji barwników syntetycznych, umożliwił pozyskanie szczepów aktywnych w procesach oczyszczania ścieków barwnych. Wykazano wysoki potencjał dekoloryzacyjny wyselekcjonowanych szczepów bakteryjnych zastosowanych zarówno w postaci czystych jak mieszanych kultur względem trifenylometanowej zieleni brylantowej (ZB) i disazowego błękitu Evansa (BE). Stwierdzono, że mechanizm dekoloryzacji (z jednym wyjątkiem) był dwojaki (sorpcja i biotransformacja). Sorpcja stanowiła pierwszy etap procesu, po którym następowały procesy enzymatycznej biotransformacji, prowadzące do odbarwienia zarówno roztworów jak biomasy bakteryjnej. Udział sorpcji w procesach odbarwiania zależał od zastosowanego szczepu, składu mieszaniny szczepów, jak również od rodzaju barwnika. W przypadku mieszaniny ZB i BE stwierdzono, iż pomimo wykazanych odmiennych jej właściwości w porównaniu do pojedynczych barwników, efektywność jej usuwania przez czyste i mieszane szczepy była 13

14 równie wysoka. Odmienne właściwości mieszaniny wpłynęły jednak na mechanizm odbarwiania przez wzrost udziału sorpcji w procesie. Udowodniony w przypadku kilku szczepów (głównie Bz4 i s45) wysoki potencjał sorpcyjny wskazał na możliwość wykorzystania ich biomasy jako biosorbentów w procesach usuwania barwników niepodatnych na biodegradację jak również w procesach prowadzonych w warunkach niekorzystnych dla rozwoju i wzrostu bakterii (np. zbyt wysokie stężenia barwników w roztworach, obecność barwników i innych substancji o charakterze toksycznym). Zróżnicowany poziom wytrząsania hodowli miał wpływ na efektywność dekoloryzacji roztworów zarówno przez czyste jak mieszane kultury bakterii, zwrócono jednak uwagę, iż warunki hodowli, w których uzyskiwano najwyższe wyniki usunięcia barwników nie zawsze korespondowały z typem tlenowym (oddychanie tlenowe lub beztlenowe) zastosowanych mikroorganizmów. Uzyskane wyniki wykazały istotne różnice w efektywności i mechanizmie usuwania barwników i ich mieszaniny przez dwa szczepy należące do jednego gatunku Pseudomonas fluorescens, wyizolowane z różnych środowisk. Zastosowanie mieszanych kultur bakteryjnych, skomponowanych na bazie szczepów o odpowiednio dobranych cechach, spowodowało jedynie nieznaczny wzrost efektywności odbarwiania roztworów barwnikowych (hodowle statyczne) względem czystych kultur. Argumentem przemawiającym jednak za stosowaniem mieszanin szczepów w procesach dekoloryzacji było, w porównaniu do czystych kultur, utrzymujące się we wszystkich hodowlach, wysokie stężenie żywej biomasy oraz zazwyczaj niższa toksyczność roztworów poprocesowych, co jest istotne z racji możliwości wykorzystania mieszanych kultur bakterii w cyklicznie pracujących systemach usuwania barwników. Badania prowadzone w układzie hodowli półokresowej w bioreaktorach porcjowych wykazały możliwość dekoloryzacji kolejnych porcji mieszaniny barwników przez zastosowane mieszane kultury bakterii (oraz szczep bazowy). W przypadku większości z nich istotny wpływ korekty ph oraz korekty ph połączonej z dopływem pożywki na wzrost efektywności procesu odbarwiania stwierdzono w 4 cyklu odbarwiania. Suplementacja hodowli dodatkowymi porcjami składników pokarmowych wpłynęła na spowolnienie i obniżenie efektywności procesu. Analizy UV-Vis wykazały różnice dotyczące liczby pojawiających się nowych pików i odpowiadających im długości fal, wskazując na różnorodność powstałych w procesie biotransformacji metabolitów w zależności od składu gatunkowego zastosowanej mieszanej kultury oraz wprowadzonych modyfikacji. Bakteryjna dekoloryzacja roztworów barwnikowych spowodowała obniżenie ich ekotoksyczności o jedną lub dwie klasy. Nie stwierdzono jednoznacznej zależności poziomu ich toksyczności od wykorzystanych szczepów, wiodącego mechanizmu odbarwiania czy warunków prowadzenia hodowli. Zastosowanie mieszanych kultur bakteryjnych 14

15 spowodowało jednak większe, aniżeli w przypadku szczepów pojedynczych, obniżenie ekotoksyczności prób, w żadnym jednak przypadku nie uzyskano całkowitej ich detoksykacji. Przedstawione wyniki badań mogą być pomocne w opracowywaniu systemów biologicznego usuwania zanieczyszczeń barwnych. Opisane szczepy mogą być wykorzystane w dalszych badaniach nad dekoloryzacją z zastosowaniem m.in. różnych kompozycji mieszanych kultur w usuwaniu innych grup barwników jak również bardziej złożonych ich mieszanin. Wykazany wysoki potencjał dekoloryzacyjny testowanych bakterii wskazuje na możliwość ich użycia w systemach oczyszczania. Szczepionki przygotowane na bazie testowanych gatunków bakterii mogłyby posłużyć do bioaugmentacji mikrobiocenoz w pracujących/testowanych systemach oczyszczania. Wysoki potencjał sorpcyjny, udowodniony w przypadku niektórych z badanych szczepów, wskazuje na możliwość wykorzystania ich biomasy również w procesach usuwania barwników niebiodegradowalnych, toksycznych lub występujących w roztworach w dużych stężeniach. Zważywszy na niskie koszty produkcji biomasy bakteryjnej rozwiązania takie można uznać za godne rozważenia. 5. Omówienie pozostałych osiągnięć naukowo-badawczych Od początku mojej pracy naukowej koncentrowałam się na badaniach związanych z biologicznymi metodami usuwania zanieczyszczeń organicznych ze środowiska (gleby i wody). Skupiałam się na wykorzystaniu w tych procesach mikroorganizmów (głównie bakterii), określeniu wpływu wybranych czynników na efektywność prowadzonych przez nie procesów eliminacji zanieczyszczeń oraz oddziaływaniu tych zanieczyszczeń i produktów ich biotransformacji na wybrane organizmy żywe. Przed uzyskaniem stopnia doktora nauk technicznych ( ) jak również w późniejszym okresie zajmowałam się problemami bioremediacji gruntów zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi oraz wpływem tych zanieczyszczeń na dynamikę zmian jakościowo-ilościowych w mikrobiocenozach glebowych. Badania w tym obszarze prowadziłam na glebach skażanych substancjami ropopochodnymi w warunkach laboratoryjnych (surowa ropa naftowa, olej napędowy, olej przekładniowy, mieszanina wybranych WWA) jak również na glebie o zastarzałym skażeniu (około 100-letnim) pobranej z terenu rafinerii w Czechowicach-Dziedzicach (wysypisko odpadów ropopochodnych). Badania o charakterze hodowli wazonowych prowadziłam w modyfikowanych układach modelowych. Zachodzące w glebach skażonych procesy samooczyszczania mają głównie biologiczny charakter i są wynikiem aktywności przede wszystkim bakterii (w tym promieniowców) i grzybów. Efektywność tych procesów zależy od składu jakościowo-ilościowego mikrobiocenoz glebowych i udziału w nich mikroorganizmów zaadaptowanych do rozkładu tych związków. W przeprowadzonych badaniach wykazałam, że wprowadzone do gleby 15

16 zanieczyszczenia w postaci surowej ropy naftowej (stężenie ropy naftowej w glebie - 2%, 4%, 8% v/w), oleju przekładniowego ciężkiego (Hipol) i oleju napędowego lekkiego (stężenie olejów w glebie - 5%, 15%, 25% v/w) oraz mieszaniny WWA (antracen, naftalen i piren w stosunku 1:1:1 o łącznym stężeniu w glebie 0,6% w/w) spowodowały przebudowę składu jakościowo-ilościowego badanych gleb. Wzrosła ogólna liczebności bakterii w tym bakterii aktywnych w usuwaniu ropy naftowej oraz bakterii z rodzaju Pseudomonas, przy jednoczesnym ograniczeniu rozwoju promieniowców. Obecność w glebach substancji ropopochodnych stymulowała na ogół rozwój grzybów pleśniowych, przy czym wzrost liczebności grzybów aktywnych w usuwaniu ropy naftowej był znacznie mniejszy niż bakterii. Potwierdzeniem wykazanych zmian w mikrobiocenozach gleb skażonych był stwierdzony w nich spadek aktywności amylolitycznej i celulolitycznej. Wykazałam również wpływ składu zanieczyszczenia na skład mikrobiocenoz. Bakterie lepiej rozwijały się w glebach skażonych olejem napędowym lekkim, grzyby w glebach skażonych olejem przekładniowym ciężkim (Hipol). Przeprowadzone przeze mnie badania wykazały, że pomimo przebudowy biocenoz w glebach skażonych substancjami ropopochodnymi (w badanym zakresie stężeń) liczebność mikroorganizmów utrzymywała się na wysokim poziomie, co wskazywało na możliwość samooczyszczania się tych gleb. Bakteryjne procesy usuwania WWA uznawane są za bardziej efektywne i bezpieczne dla środowiska (m.in. brak powstających w wyniku rozszczepienia pierścienia aromatycznego szkodliwych form epoksydowych) aniżeli procesy grzybowe. Szczególną uwagę przywiązuje się zatem do wskaźnika wyrażającego stosunek liczebności bakterii (w tym promieniowców) do grzybów (B/G). W procesach bioremediacji gleb zanieczyszczonych WWA za korzystny uznaje się stosunek B/G>1. Kolejnym zagadnieniem, którym zajęłam się w swoich badaniach były więc próby ograniczenia rozwoju grzybów pleśniowych w badanych glebach skażonych przez podniesienie ich odczynu do wartości optymalnej dla rozwoju bakterii (ph 6,8-7,0). W tym celu zastosowałam zabieg wapnowania (CaCO 3 ). Zastosowanie tej modyfikacji spowodowało wzrost liczebności bakterii w glebach, jednak nie we wszystkich przypadkach przyniosło spodziewane efekty w postaci ograniczenia w nich rozwoju grzybów pleśniowych (efekt taki uzyskano tylko w glebach skażonych mieszaniną antracenu, naftalenu i pirenu). Zaskakującym wynikiem był również negatywny wpływ wapnowania na rozwój promieniowców w badanych glebach. Zabieg ten wpłynął na kolejne zmiany w składzie mikrobiocenoz o czym świadczył wzrost aktywności celulaz i dehydrogenaz. Wyniki opublikowano w pracach II.B.5; II.C.2; II.C.3; II.C.4 oraz prezentowano na konferencjach (III.B.2.1; III.B.2.2; III.B.2.3) wykazanych w załączniku 3. Wśród wielu parametrów glebowych (np. wilgotność, temperatura, natlenienie, odczyn) bardzo istotna dla procesów bioremediacji gleb zanieczyszczonych związkami organicznymi jest odpowiednia proporcja C:N:P (najczęściej zalecana proporcja to 100:10:1). W glebach zanieczyszczonych substancjami ropopochodnymi jest ona silnie zachwiana obecnością nadmiaru węgla, co wpływa na ograniczenie rozwoju mikroorganizmów i obniżenie 16

17 efektywności procesów usuwania zanieczyszczeń. Wobec pozytywnych wyników wapnowania (wzrost liczebności bakterii) zdecydowałam więc o połączeniu zabiegu wapnowania z nawożeniem mineralnym (NH 4 Cl oraz Na 2 HPO 4 ). Zastosowanie tej modyfikacji w glebach skażonych wybranymi WWA spowodowało silniejszy niż w próbach poddanych tylko wapnowaniu, wzrost ogólnej liczby bakterii, bakterii z rodzaju Pseudomonas oraz promieniowców przy znaczącym ograniczeniu rozwoju grzybów pleśniowych. Wyniki opublikowano w pracy II.C.4; wykazanej w załączniku 3. Kolejnym zagadnieniem, którym zajmowałam się w moich badaniach była bioaugmentacja gleb skażonych w celu zwiększenie efektywności usuwania z nich zanieczyszczeń. Zastosowałam biopreparaty stanowiące odpowiednio wyselekcjonowane mikroorganizmy, wykazujące wysoki potencjał w kierunku rozkładu określonych zanieczyszczeń. Jednym z warunków skuteczności takiego zabiegu jest wprowadzenie odpowiedniego stężenia biomasy aktywnej mikroflory oraz zaadaptowanie się jej w warunkach glebowych i podołanie konkurencji ze strony autochtonicznych organizmów. Określenie możliwości zasiedlenia, rozwoju i utrzymania się w skażonych glebach wyselekcjonowanej mikroflory wprowadzonej z biopreparatem oraz określenie zmian w bioaugmentowanych mikrobiocenozach glebowych było jednym z celów prowadzonych przeze mnie badań. Do bioaugmentacji gleb skażonych olejem napędowym lekkim oraz olejem przekładniowym ciężkim wykorzystałam biopreparaty sporządzone na bazie czystych kultur wyselekcjonowanych przeze mnie szczepów bakterii, które zaklasyfikowałam do rodzaju Pseudomonas. Bioaugmentacja połączona z wapnowaniem prób powodowała na ogół wzrost liczebności bakterii przy jednocześnie obserwowanej redukcji liczebności grzybów i promieniowców. Utrzymująca się do końca badań (104 dni) wysoka liczebność bakterii wskazywała na zaadaptowanie się wprowadzonej mikroflory. W przypadku gleb skażonych wybranymi WWA bioaugmentacja czystą kulturą bakteryjną (Pseudomonas aeruginosa) połączona z wapnowaniem i nawożeniem mineralnym skutkowała silniejszym wzrostem ogólnej liczby bakterii aniżeli w próbach wapnowanych z nawożeniem mineralnym. Nie obserwowano wzrostu liczebności grzybów pleśniowych, co pozwoliło na uzyskanie korzystnej proporcji B/G>1. Wyniki opublikowano w pracach II.C.2; II.C.3; II.C.4 oraz prezentowano na konferencjach krajowych (III.B.2.1; III.B.2.2; III.B.2.3) wykazanych w załączniku 3. Bakterie i grzyby różnią się posiadanym aparatem enzymatycznym, a co się z tym wiąże możliwościami dekompozycji zwłaszcza złożonych substratów. Pomimo zalecanego w procesach bioremediacji stosunku B/G>1 zdecydowałam więc o zastosowaniu biopreparatów zawierających czyste i mieszane kultury odpowiednio wyselekcjonowanych szczepów bakterii jak również grzybów, wyizolowanych ze środowisk skażonych substancjami ropopochodnymi. Biopreparatami skomponowanymi z wyselekcjonowanych gatunków bakterii i grzybów bioaugmentowano gleby skażone surową ropą naftową. Silny 17

18 wzrost ogólnej liczby bakterii i grzybów oraz bakterii i grzybów rozkładających ropę naftową obserwowano przez kilka dni od wprowadzenia biopreparatów, po czym ich liczebność malała. Charakterystyczne, że w glebach bioaugmentowanych biopreparatem grzybowym obserwowano spadek liczebności bakterii i odwrotnie. Nie uzyskano trwałego efektu zwiększenia liczebności mikroorganizmów w badanych glebach. Bioaugmentacja skutkowała tylko chwilowym wzrostem tego parametru, co mogło być wynikiem m.in. wyczerpania się łatwo przyswajalnych źródeł węgla, a zwłaszcza deficytowego w przypadku tego typu skażeniu azotu. Wyniki opublikowano w pracy II.B.5 wykazanej w załączniku 3. Oprócz dynamiki zmian w mikrobiocenozach gleb skażonych ropą naftową bioaugmentowanych biopreparatami bakteryjnymi i grzybowymi badałam również fitotoksyczność odcieków pochodzących z tych gleb. Celem tych badań była ocena wpływu wprowadzonych zanieczyszczeń i powstających produktów biologicznych przemian na wegetację wybranych gatunków roślin oraz ewentualna selekcja roślin mogących znaleźć zastosowanie w technikach fitoremediacyjnych. Fitotoksyczność odcieków oceniałam na podstawie takich wskaźników jak: zahamowanie kiełkowania, zahamowanie przyrostu łodygi i korzenia, stosunek długości łodygi do korzenia (Ł/K). Do testów wytypowałam 3 gatunki roślin dwuliściennych gorczyca jasna (Sinapis alba L.), ogórek siewny (Cucumis sativus L.), len zwyczajny (Linum usitatissimum L.) oraz 2 gatunki roślin jednoliściennych pszenica (Triticum spp.) i proso (Panicum sp.). Wykazałam, że zarówno w glebach bioaugmentowanych biopreparatem bakteryjnym jak i grzybowym reakcje roślin były zróżnicowane, jednak rośliną najbardziej wrażliwą okazała się pszenica i len, najbardziej odporna na wpływ zanieczyszczeń była gorczyca. We wszystkich testach toksyczność odcieków wzrastała w miarę upływu czasu i na ogół była wyższa w próbach bioaugmentowanych, co wynikało prawdopodobnie z większej intensywności przemian i gromadzenia pośrednich produktów biotransformacji ropy naftowej. Fitotoksyczność odcieków z gleb bioaugmentowanych biopreparatem bakteryjnym była na ogół nieco wyższa aniżeli w przypadku zastosowania biopreparatu grzybowego. Wyniki badań opublikowano w pracach II.C.8; II.C.9 oraz prezentowano na konferencji krajowej (III.B.2.6) załącznik 3. Badania związane z dynamiką zmian w mikrobiocenozach gleb skażonych substancjami ropopochodnymi kontynuowałam na glebie o zastarzałym charakterze skażenia, pobranej ze składowiska odpadów ropopochodnych z terenu rafinerii w Czechowicach-Dziedzicach (II.B.2; II.B.3; II.B.6; II.C.5; II.C.6; II.C.7 załącznik 3). Wykonane oznaczenia analityczne (zawartość [g/kg s.m. gleby]: TPH 19,11; WWA 0,032;, frakcji ciężkich 159,11; C:N=100:0,7; ph=5,8) wykazały silną degradację badanej gleby. Na podstawie przeprowadzonych badań stwierdziłam, że pomimo tak silnej degradacji gleby zachowała ona aktywność biologiczną i zdolność usuwania zanieczyszczeń, a utrzymywana na odpowiednim poziomie wilgotności gleby (25% wagowych stanowiących 71% cpw) skutkowała desorpcją do roztworu glebowego zaadsorbowanych przez glebę zanieczyszczeń (TPH i WWA) zwiększając ich biodostępność dla degradatorów. W celu zwiększenia potencjału 18