Dariusz KULUS Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy

Transkrypt

1

2 87 Dariusz KULUS Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. Jana i Jędrzeja Śniadeckich w Bydgoszczy BIOTECHNOLOGICZNE METODY REPRODUKCJI ROŚLIN OZDOBNYCH Biotechnological methods of ornamental plants reproduction Wstęp Produkcja roślin ozdobnych obejmuje dwie główne gałęzie rozmnażania: generatywną (przez nasiona) oraz wegetatywną (sadzonkowanie, szczepienie, kultury in vitro). Ta druga, polega na wykorzystywaniu ich unikatowej zdolności do odtwarzania całego organizmu z pojedynczego, odizolowanego fragmentu i przebiega bez udziału gamet. Osobniki których strukturę tworzą tkanki genetycznie jednorodne, będące potomstwem wegetatywnym danej rośliny, stanowią klon. W związku z coraz szerszym wykorzystaniem roślin ozdobnych nie tylko w produkcji ogrodniczej, ale także w farmacji, medycynie oraz przemyśle kosmetycznym, tradycyjne metody rozmnażania nie spełniają dłużej wymagań stawianych przez rynek. Problemy te może rozwiązać dzisiaj biotechnologia. Historia roślinnych kultur tkankowych Wraz z nastaniem XX wieku, rozpoczęły się badania nad możliwością restytucji roślin z wyizolowanych organów, tkanek, czy komórek w kulturach in vitro. Wzmożony ich rozwój nastąpił po II Wojnie Światowej 1. Pierwsze znaczące wykorzystanie kultur tkankowych w produkcji roślin ozdobnych miało miejsce w 1922 roku, kiedy Louis Knudson doprowadził w warunkach laboratoryjnych do asymbiotycznego kiełkowania nasion storczyka 2. Natomiast zastosowanie mikrorozmnażania na skalę produkcyjną, stało się możliwe dopiero w II połowie XX wieku. Mikropropagacja jest szczególnym typem rozmnażania wegetatywnego, prowadzonego w sterylnych, ściśle kontrolowanych warunkach laboratoryjnych, na specjalnie skomponowanych pożywkach. Technologia ta doprowadziła do udoskonalenia i unowocześnienia metod produkcji ogrodniczej. Obecnie, na drodze tej najwięcej rozmnaża się gatunków ozdobnych (stanowią 90% ogółu). Udział roślin rolniczych oraz sadowniczych, za względu na wysokie koszty, jest (jak do tej pory) marginalny. Polska zajmuje, po Holandii i Francji trzecie miejsce pod względem europejskiej produkcji roślin na tej drodze. Jak podają Jerzy i Krzymińska również w naszym kraju rośliny ozdobne zajmują pierwsze miejsce wśród gatunków rozmnażanych in vitro (są to głównie Gerbera jamesonii Bolus ex Hooker, Ficus benjamina L., Anthurium andreanum Linden, Aster dumosus L. i inne) 3. 1 A, Adamus, Podstawowe wiadomości o kulturach in vitro, [w:] Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin, red. B. Michalik, Kraków 1996, s G.R. Rout, A. Mohapatra, S.M. Jain, Tissue culture of ornamental pot plant: a critical review on present scenario and future prospects, Biotechnology Advances 2006, nr 24, s M, Jerzy, A, Krzymińska, Rozmnażanie roślin ozdobnych in vitro, [w:] Rozmnażanie wegetatywne roślin ozdobnych, red. M. Jerzy, A. Krzymińska, Poznań 2005, s

3 88 Warunki prowadzenie roślinnych kultur tkankowych Uprawa roślin w kulturach in vitro ma dwa podstawowe zadania: uwolnić je od patogenów oraz zapewnić rozwój tkanek i/lub organów w ściśle określonym kierunku 4. Zadaniem pożywek jest umożliwienie roślinom wzrost i rozwój, w odpowiednio przygotowanym mikrośrodowisku 5. Powinny one dostarczać (w postaci jonowej) niezbędnych związków mineralnych. Winny także zapewniać roślinie substraty organiczne, takie jak: aminokwasy (będące źródłem azotu) i witaminy (szczególnie pożądane w kulturach w szkle są tiamina i mezoinozytol), których synteza w warunkach in vitro jest zaburzona. Ponadto, jako że mikrosadzonki (przynajmniej okresowo) nie fotosyntezują, konieczne jest zapewnienie im stałego źródła węgla w postaci węglowodanów. Aby zminimalizować ryzyko wystąpienia zakażeń do pożywki czasem dodaje się antybiotyki zapobiegające rozwojowi mikroorganizmów. Musi ona dostarczać także podstawowego biologicznego rozpuszczalnika wody 6. Pożywki mogą być (w zależności od typu kultury) zestalone (zwykle agarem pozyskiwanym z krasnorostów, choć dostępne są też inne zestalacze), płynne lub dwufazowe. Roślinne kultury tkankowe prowadzone są w specjalnych pomieszczeniach: fitotronach lub pokojach wzrostowych. Czynniki fizyczne takie jak: temperatura, ciśnienie osmotyczne, naświetlenie (długość, natężenie i barwa), podlegają ścisłej kontroli. Opierając się na metodach kultur in vitro, napotykamy trzy podstawowe problemy. Pierwszy związany jest z brakiem dostatecznej liczby publikacji poświęconych wybranemu gatunkowi. Drugi dotyczy ograniczonej dostępności materiału biologicznego do badań 7. Trzecim problemem są wysokie koszty prowadzenia kultur tkankowych 8. Mikrorozmnażanie Nazwa mikrorozmnażanie wywodzi się stąd, że kolejne pokolenia uzyskuje się z niewielkiego fragmentu wyizolowanego z matecznika, zwanego eksplantatem 3. Zasadniczo może nim być dowolny element rośliny: fragmenty organów (korzeni, łodyg, liści, kwiatów) lub określony typ komórek (ziarna pyłku, bielmo), a nawet protoplasty 9. Eksplantaty pobiera się z matecznika wolnego od chorób i wykazującego typowe cechy gatunku. Technologia mikrorozmnażania obejmuje pięć głównych etapów: wstępny (wybór rośliny i przygotowanie do pobrania eksplantatu oraz jego dezynfekcja), 4 J.K. Kanwar, S. Kumar, In vitro propagation of Gerbera a review, Scientia Holticulturae 2008, nr 35, s A. Al-Gabbiesh, D.S. Hassawi, F.U. Afifi, In vitro propagation of endangered Iris species, Journal of Biological Science 2006, nr 6, s P.T. Lynch, Tissue culture techniques in in vitro plant conservation, [w:] Plant Conservation Technology, red. E. Benson, Londyn 1999, s P. Krogstrup, J.L. Find, D.J. Gurskov, M.M.H. Kristensen, Micropropagation of socotran fig, Dorsteniagigas Schweinf. Ex Balf. F. a threatened species, endemic to the Island of Socotra, Yemen, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2005, nr 41, s S.O. Amoo, J.F. Finnie, J. Van Staden, Influence of temperature, photoperiod and culture vessel size on adventitious shoot production of in vitro propagated Huernia hystrix, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2009, nr 99, s A, Slater, N, Scott, M, Fowler, Plant tissue culture, [w:] Plant biotechnology the genetic manipulation of plants, red. A. Slater, N. Scott, M. Fowler, Oksford 2008, s

4 89 inicjację kultury (izolacja i inokulacja eksplantatu), namnażanie zregenerowanych roślin, ukorzenianie mikrosadzonek oraz adaptację do warunków in vivo. Mikroropropagacja wykorzystywana jest zarówno w celu powielenia zachowawczego szczególnie cennych pojedynków jak i w procesach hodowlanych 3. Jest także ważnym elementem (na etapie regeneracji)w doskonaleniu roślin na drodze inżynierii genetycznej. Równie cenne jest zastosowanie mikrorozmnażania w udomowianiu roślin, kiedy tradycyjne metody z wykorzystaniem nasion, nie dostarczają satysfakcjonujących wyników. Przykładem może być Yucca valida Brandegee, gatunek cenny ze względu na produkcję steroidowych saponin 10.Mikrorozmnażanie jest metodą niezwykle wydajną. Z jednego wyłożonego na pożywkę eksplantatu można w przeciągu roku otrzymać miliony roślin potomnych (rezultaty takie uzyskano m. in. w przypadku Cyclamen persicum Mill. 11 i Nephrolepsis exaltata Schott 12. Dodatkowo uzyskany tą drogą materiał cechuje się dużą jednorodnością. Poprawie wydajności procesu towarzyszy postęp jakościowy uzyskanych tą drogą roślin. Objawia się on się m. in. lepszym wigorem mikrosadzonek uwolnionych od chorób (zarówno grzybowych, bakteryjnych jak i wirusowych) 3. Mikrosadzonki pochodzące z warunków in vitro rosną szybciej we wczesnych fazach rozwojowych, co ma kluczowe znaczenie w przypadku roślin, których rozwój w warunkach naturalnych jest zbyt powolny i nie spełnia wymogów rynku. Przykładowo wydłużenie korpusu niektórych kaktusów (np. Pelecyphora aselliformis Ehrenberg) o 1 cm trwa w warunkach szklarniowych 2 3 lata, a w naturalnych nawet Natomiast w warunkach in vitro wzrost jest 3 7 razy przyspieszony 14. Ponadto kultury tkankowe dostarczają szeroko pojętego materiału siewnego najwyższej klasy przez cały rok, jako że mikroropropagacja uniezależnia produkcję od pór roku oraz warunków klimatycznych. Technika ta jest doskonałą alternatywą dla rozmnażania roślin o wysokim stopniu ploidalności lub heterozygotyczności, niezdolnych do wytworzenia nasion lub takich, które tworzą nasiona o małej zdolności kiełkowania. Znajduje zastosowanie również w przypadku gatunków hapaksantamicznych, kiedy na pojawienie się organów generatywnych należy czekać bardzo długo. Przykładem jest wiele sukulentów z rodziny Agavaceae. Dużo uwagi poświęca się możliwości wykorzystania mikrorozmnażania w ochronie elitarnych (o dużej wartości jednostkowej) i zagrożonych gatunków (m. in. storczyków, goryczek, kaktusów), które poza funkcją zdobną ostatnimi czasy coraz częściej wykorzystywane są w przemyśle spożywczym i paszowym oraz farmaceutyczno-kosmetycznym. Jednakowoż niektóre gatunki (głównie drzew i traw) zaliczane są do tzw. opornych ze względu na niski współczynnik mikropropagacji 6. Kolejnym istotnym czynnikiem limitującym 10 J. Szopa, K. Kośtyń, Kultury komórkowe i rośliny transgeniczne w biotechnologii, Biotechnologia 2006, nr 75, s A.K. Hvoslef-Eide, O.A.S. Olsen, R. Lyngved, C. Munster, P.H. Heyerdahl, Bioreactor design for propagation of somatic embryos, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2005, nr 81, s A. Lazăr, C. Petolescu, S. Popescu, Studies concerning the in vitro multiplication of Nephrolepis exaltata Fluffy Ruffles, Journal of Horticulture, Forestry and Biotechnology 2010, nr 14, s M. Santos-Diaz, R. Mendez-Ontiveros, A. Arredondo-Gomez, In vitro organogenesis of Pelecyphora aselliformis Erhenberg (Cactaceae), In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2003, nr 39, s E. Pérez-Molphe-Balch, C. Dávila-Figueroa, In vitro propagation of Pelecyphora aselliformis Ehrenberg and P. strobiliformis Werdermann (Cactaceae), In Vitro Cellular and Development Biology Plant 2002, nr 38, s

5 90 są duże nakłady pracy, a co za tym idzie wysokie koszty prowadzenia kultur tkankowych. Tak więc technologia ta (podobnie jak każda inna) nie może być traktowana jako panaceum dla wszystkich problemów. Metody mikrorozmnażania Postęp w biotechnologii oraz inżynierii genetycznej roślin, jest nierozerwalnie związany z wykorzystaniem narzędzi dostarczanych nam przez kultury tkankowe. Techniki mikrorozmnażania cieszą się dużym zainteresowaniem wśród producentówi doprowadziły do zrewolucjonizowania rynku ogrodniczego. Do 2006 roku metodą kultur tkankowych, na skalę komercyjną rozmnażano 156 rodzajów roślin ozdobnych w laboratoriach na całym świecie. Liderami w tej dziedzinie są Holandia (33%), Japonia (24%), USA (12%) oraz Tajlandia (10%) 2. Jerzy i Krzymińska 3 dokonują następującego podziału metod mikrorozmnażania: metoda jednowęzłowych fragmentów metoda pędów bocznych (kątowych) meryklonowanie storczyków metoda pędów przybyszowych somatyczna embriogeneza kultury pojedynczych komórek Metody z udziałem merystemu w eksplantacie inicjującym Metody, w których eksplantat inicjujący pozbawiony jest merystemu Schemat zależności pomiędzy różnymi metodami kultur tkankowych przedstawiono na Rycinie 1. Rycina 1. Integracja różnych typów kultur tkankowych 15. Stosowane komercyjnie metody mikrorozmnażania muszą spełniać dwa warunki: zapewniać wysoki stopień identyczności (brak mutacji i trwałych zmian epigenetycznych) oraz być opłacalne w porównaniu z tradycyjnymi R. Walden, R. Wingender, Gene-transfer and plant-regeneration techniques, Trends in Biotechnology 1995, nr 13, s , zmienione. 16 T. Orlikowska, Regulatory roślinne w kulturach in vitro, t. 2 Regulatory wzrostu i rozwoju roślin, Warszawa 1997, s

6 91 Metoda jednowęzłowych fragmentów pędu Metoda jednowęzłowych fragmentów pędu, nazywana także sadzonkowaniem in vitro, w swej prostocie ogranicza się do poprzecznego dzielenia pędów, na fragmenty zawierające tkankę twórczą (merystem wierzchołkowy lub kątowy). Technika ta jest wielce przydatna w przypadku roślin wyróżniających się silną dominacją wierzchołkową (czyli takich, które tworzą boczne rozgałęzienia pędu dopiero po usunięciu wierzchołka wzrostu). Zaliczmy tu gatunki z rodzaju Chrysanthemum, Dianthus, Hedera, Hydrangea oraz Pelargonium. Po jej ustąpieniu można otrzymać większą liczbę roślin. W metodzie tej nie ma potrzeby wzbogacania pożywki regulatorami wzrostu. Poważną jej wadą jest natomiast stosunkowo niski współczynnik namnażania, który wynosi średnio 4 5 mikrosadzonek z jednego pędu 3. Metoda pędów bocznych Najlepiej poznanym sposobem multiplikacji jest pobudzanie do rozwoju pędów bocznych. Pąki pachwinowe zlokalizowane w kątach liści w warunkach in vitro, są aktywowane i mogą tworzyć pędy boczne. Do owej aktywacji dochodzi w obecności cytokinin w pożywce. Cytokininy stymulują podziały i wydłużanie komórek oraz niwelują dominację wierzchołkową. W przypadku pobudzania do rozwoju pąków bocznych roślin ozdobnych, najlepiej sprawdza się kombinacja: niska (lub brak) zawartość auksyn oraz wysoka (lub umiarkowana) koncentracja cytokinin. Zaletą tej metody jest wysoki współczynnik namnażania z jednej rośliny można otrzymać do 20 pąków. Uzyskane mikrosadzonki przenosi się następnie na pożywki ukorzeniające (zawierające auksyny zazwyczaj kwas indolilooctowy IAA, rzadziej indolilomasłowy IBA).Technika ta znalazła zastosowanie w laboratoryjnej produkcji gatunków z rodzaju: Spathiphyllum, Ficus, Syringa, Gerbera, Nephrolepis oraz Syngonium 3, a także wielu kaktusów 17, 18, aloesów, gruboszy i innych sukulentów 7. Meryklonowanie storczyków Mikrorozmnażanie okazało się szczególnie cenne w przypadku przedstawicieli rodziny Orchidaceae. Wiele popularnych storczyków (z rodzaju Phalaenopsis, Dendrobium, Oncidium) jest epifitami lasów tropikalnych, wymagającymi specjalnych warunków kiełkowania (np. obecności symbiotycznego grzyba z rodzaju Rhizoctonia), które mocno ograniczają możliwość tradycyjnego rozmnażania. Zastosowanie kultur in vitro pozwoliło na znaczącą redukcję kosztów produkcyjnych tych pożądanych roślin, które dzięki wysiłkom biotechnologów z elitarnych i rzadkich stały się szeroko dostępne. Meryklnowanie storczyków rozpoczyna się od pobrania merystemu z fragmentu pędu przekształconego w pseudobulwę. Na zestalonej agarem pożywce z merystemu rozwija się tkanka charakterystyczna dla storczyków protokorm, który następnie dzieli się i namnaża na pożywce płynnej. Kolejno protokormy 17 R. Infante, In vitro axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis of yellow pitaya Mediocactus coccineus (Salm-Dyck), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1992, nr 31, s E. Pérez-Molphe-Balch, M. Reyes, E. Amador, E. Rangel, L. Ruiz, H. Viramontes, Micropropagation of 21 species of Mexican cacti by axillary proliferation, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 1998, nr 34, s

7 92 przenosi się ponownie na pożywkę stałą, ale z dodatkiem giberelin, które stymulują rozwój pędów i korzeni storczyków. Metoda ta cechuje się bardzo dużą efektywnością. Z jednego merystemu Cymbidium można w ciągu roku otrzymać ponad milion roślin potomnych 3. Metoda pędów przybyszowych Jedną z najczęściej stosowanych do tej pory technik mikrorozmnażania, jest metoda pędów przybyszowych. W metodzie tej eksplantatem może być praktycznie każdy (niemerystematyczny) organ lub jego fragment, np. liście, międzywęźla (u Crassula helmsii (Kirk) Cockayne 19 ) lub płatki kwiatów (w przypadku Mammillaria albicoma Boed. 20 oraz gatunków z rodzaju Sedum 21 ). Organogeneza in vitro może przebiegać bezpośrednio lub pośrednio, jeśli poprzedza ją regeneracja kalusa. Pędy przybyszowe tworzą się z centrów merystematycznych endogennie (z głębszych warstw parenchymy) lub egzogennie, wyrastając z komórek epidermy. Do ich rozwoju niezbędna jest obecność w pożywce cytokininy, na ogół benzyloadeniny BA 3. W przypadku wielu roślin ozdobnych, najskuteczniejsze okazały się być pożywki zawierające cytokininy z niewielkim dodatkiem auksyn (w przypadku Sansevieria trifasciata L. najlepiej kwasu 2,4-dichlorofenoksyoctowego 2,4-D 22 ). Jednak dokładne stężenie regulatorów wzrostu musi być ustalane indywidualnie dla każdego gatunku. O koniczności stosowania cytokinin świadczy przykład doświadczenia przeprowadzonego przez Rubluo 23 oraz Ramirez-Malagona i in. 24 na kaktusach z rodzaju Mammillaria, w przypadku których organogeneza nie zachodziła na pożywce pozbawionej kinetyny. Regeneracja pędu przybyszowego może przebiegać jednocześnie z tworzeniem korzeni (np. u chryzantem rozmnażanych z liści, goździków regenerowanych z międzywęźli oraz hiacyntów otrzymywanych z łusek cebul), może wyprzedzać ryzogenezę (np. gerbera, sępolia, begonia regenerowane z liści) lub następować po niej (różanecznik rozmnażany z międzywęźli) 3. Kierunek rozwoju eksplantatów zależy nie tylko od rodzaju i wzajemnego stosunku wykorzystanych regulatorów wzrostu, ale również od czynników genetycznych i warunków kultury (zwłaszcza światła i temperatury). U roślin nasiennych regeneracja następuje łatwiej u gatunków dwuliściennych niż jednoliściennych, a najtrudniej u nagozalążkowych. U większości gatunków można jednak znaleźć taki eksplantat, który da dobre wyniki. 19 M.E. Kane, N.L. Philman, C.A. Bartuska, D.B. McConnell, Growth regulator effects on in vitro shoot regeneration of Crassula helmsii, Journal of Aquatic Plant Management 1993, nr 31, s T.P. Wyka, M. Hamerska, M. Wróblewska, Organogenesis of vegetative shoots from in vitro cultured flower buds of Mammillaria albicoma (Cactaceae), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2006, nr 87, s M.K. Wojciechowicz, Organogenesis and somatic embryogenesis induced in petal cultures of Sedum species, Acta Biologica Cracoviensia Botanica 2009, nr 51, s M.K. Sarmast, M. Salehi, The potential of different parts of Sansevieria trifasciata L. leaf for meristemoids production, Australian Journal of Basic and Applied Sciences 2009, nr 3, s A. Rubluo, Micropropagation of Mammillaria species (Cactaceae), Biotechnology in Agriculture and Forestry 1997, nr 40, s R. Ramirez-Malagon, I. Aguilar-Ramirez, A. Borodanenko, L. Perez-Moreno, J.L. Barrera-Guerra, H. Nunez-Palenius, G. Ochoa-Alejo, In vitro propagation of ten threatened species of Mammillaria (Cactaceae), In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2007, nr 43, s

8 93 Reprodukcja roślin tą metodą ma kluczowe znaczenie w hodowli mutacyjnej. Udowodniono bowiem, że pędy przybyszowe mogą tworzyć się z pojedynczej komórki dzięki czemu zbudowane są z tkanek genetycznie jednorodnych. Po wywołaniu mutacji nie tworzą się więc niepożądane w hodowli chimery, lecz rośliny o jednolicie zmienionej barwie lub kształcie kwiatów, dające początek nowym odmianom 25. Ponadto, możliwość regeneracji z jednej komórki jest przydatna w separacji komponentów chimer i produkcji nowych odmian. Technika ta, poza wspomnianymi wcześniej gatunkami ozdobnymi, znalazła także zastosowanie w przypadku przedstawicieli rodziny Agavaceae 26, niektórych aloesów (np. Aloe vera L. 27 ),przedstawicieli rodziny Crassulaceae (np. Crassula arborescens Willd. 28 ) oraz kaktusów (np. z rodzaju Cereus 29 ). Pomimo, że wiele gatunków roślin ozdobnych można rozmnażać metodą pędów bocznych oraz przybyszowych, to jednak często wydajność tych technik wciąż pozostaje niezadawalająca. Stąd poszukuje się nowych, bardziej efektywnych sposobów mikropropagacji. Kultury pojedynczych komórek Kultury pojedynczych komórek prowadzą do restytucji roślin w kulturach zawiesinowych (z komórek kalusa),protoplastów lub pylników i mikrospor (dostarczając cennych w hodowli haploidów). Regeneracja następuje przez tworzące się in vitro pędy przybyszowe lub zarodki somatyczne 3,30. Zdolność roślin do odtwarzania całego ciała z pojedynczej komórki jest wyrazem ich totipotencji. W 1839 roku po raz pierwszy możliwość taką przewidzieli dwaj niemieccy profesorowie: botanik Matthias Schleiden i zoolog Teodor Schwann. Jednakże uzyskanie pełnego organizmu z jednej komórki nie było łatwe 1. Na potwierdzenie tej teorii trzeba było jednak czekać ponad 100 lat. Dokonał tego w roku 1954 Amerykanin William Muir, regenerując marchew z pojedynczej komórki pochodzącej z kultury zawiesinowej kalusa 3. Totipotencja komórek roślinnych wskazuje na obecność w każdej z nich kompletnego materiału genetycznego 10. Zjawisko to oraz plastyczność rozwojowa są kluczowe dla zrozumienia istoty kultur tkankowych. Rośliny ze względu na stacjonarny tryb życia oraz długi cykl ontogenetyczny rozwinęły lepsze zdolności adaptacyjne niż zwierzęta. Ta plastyczność pozwala im dostosować swój metabolizm, wzrost i rozwój do aktualnie panujących warunków zewnętrznych. Szczególnie ważnym aspektem tej adaptacji, z punktu widzenia kultur tkankowych jest zdolność do zainicjowania podziałów komórek z niemal każdej tkanki i regeneracji utraconego organu lub wejście na zupełnie nową 25 M, Zalewska, In vitro adventitious bud techniques as a tool in creation of new chrysanthemum cultivars, [w:] Floriculture: role of tissue culture and molecular techniques, red. S.K. Datta, D. Chakrabarty, Jaipur 2010, S M.L. Robert, J.L. Herrera, F. Contreras, K.N. Scorer, In vitro propagation of Agave fourcroydes Lem. (Henequen), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1987, nr 8, s A.K. Choudhary, A.K. Ray, S. Jha, I.N. Mishra, Callus formation, shoot initiation and in vitro culture of Aloe vera, Biotechnology, Bioinformatics and Bioengineering 1987,nr 4, s Y. Liu, Z. Long, Y. Gao, T. Harada, Organ formation and plant regeneration in vitro tissue culture of Crassula arborescens, Journal of Zhejiang University 2007, nr 33, s N. Karimi, M.R. Mofid, M. Ebrahimi, R. Naderi, Effect of areole and culture medium on callus induction and regeneration Cereus peruvianus Mill. (Cactaceae), Trakia Journal of Science 2010, nr 8, s A. Fiuk, J.J. Rybczyński, Wykorzystanie metod współczesnej analizy materiału roślinnego w badaniach somatycznej embriogenezy Gentiana kurroo (Royle), Biotechnologia 2006, nr 75, s

9 94 ścieżkę rozwojową, w zależności od zastosowanego bodźca. Komórki i tkanki roślinne znajdujące się w warunkach in vitro wykazują bardzo wysoki poziom plastyczności, co pozwala na indukcję rozwoju jednego typu tkanek lub organów z innych. W ten sposób możliwa staje się regeneracja całych roślin 9,30. Embriogeneza somatyczna Embriogeneza somatyczna jest wieloetapowym procesem prowadzącym do wytworzenia zarodków z komórek somatycznych bez udziału gamet i zapłodnienia 31. Podobnie jak organogeneza przybyszowa, regeneracja zarodków przebiegać może bezpośrednio z tkanek eksplantu lub pośrednio przez kalus, zarówno z pojedynczej komórki, jak i z całej grupy 32. W celu zainicjowania embriogenezy somatycznej, eksplantaty wykładane są na pożywkę z dodatkiem auksyn (najczęściej 2,4-D), czasem też cytokin, a następnie, pasażowane są na pożywkę bezauksunową stymulującą dojrzewanie zarodków. Embriogeneza somatyczna jest coraz częściej stosowaną metodą reprodukcji roślin in vitro. Technika ta jest dużo bardziej wydajna niż organogeneza (zarodki przechodzą konwersję jednoetapowo, podczas gdy w czasie organogenezy konieczna jest osobna inicjacja pędu i korzenia) i umożliwia produkcję metabolitów wtórnych, których nie można pozyskać z niezróżnicowanego kalusa. Znalazło to szersze zastosowanie w przypadku betalain pozyskiwanych z kalusa Mammillaria huitzilopochtli Hunt 23. Do niewątpliwych korzyści embriogenezy somatycznej należą: możliwość otoczkowania i krioprezerwacji w ciekłym azocie (dzięki czemu możliwe jest tworzenie banków genów), a także wykorzystanie w rozmnażaniu klonalnym, hodowli oraz badaniach nad embriogenezą. Somatyczną embriogenezę można również wykorzystać w procesie transformacji genetycznej 2. Albowiem jeżeli przebiega ona na drodze pośredniej rozwija się kalus, zawierający ogromną populację embriogenicznych komórek, podatnych na transformację. Każda transformowana komórka daje początek niezależnej transgenicznej linii, znacznie poprawiając wydajność procesu 33. Metoda ta sprawdziła się u Rosa chinensis Jacq. 34 oraz Mammillaria gracillis Pfeiff. 35.Dodatkową korzyścią jest regeneracja niechimeralnych roślin (jeśli powstają z jednej komórki). Największą jednak zaletą embriogenezy somatycznej jest potencjał do wielkoskalowej produkcji w bioreaktorach. Stanowi to kluczowy czynnik umożliwiający redukcję kosztów i tym samym wykorzystanie kultur in vitro na skalę komercyjną. Możliwość tę 31 D. Kulus, Embriogeneza somatyczna in vitro, [w:] Nowe trendy w naukach przyrodniczych 4, red. M. Kuczera, Kraków 2013, s J. Lema-Rumińska, D. Kulus, Induction of somatic embryogenesis in Astrophytum asterias (Zucc.) Lem. in the aspect of light conditions and auxin 2,4-D concentrations, Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus 2012, nr 11, s S. Leelavathi, V.G. Sunnichan, R. Kumria, G.P. Vijaykanth, R.K. Bhatnagar, V.S. Reddy, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (Gossypium hirsutum L.): embryogeniccalli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Reports 2004, nr 22, s P. Vergne, M. Maene, G. Gabant, A. Chauvet, T. Debener, M. Bendahmane, Somatic embryogenesis and transformation of the diploid Rosa chinensis cv Old Blush, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2010, nr 100, s B. Balen, P. Peharec, M. Krsnik-Rasol, Developmentaly specific soluble and membrane proteins and glycoproteins in Mammillaria gracillis Pfeiff. (Cactaceae) tissue culture, Acta Botanica Croatica 2008, nr 67, s

10 95 wykorzystano już w przypadku begonii oraz cyklamena, w przypadku którego z 1L embriogennej zawiesiny otrzymano roślin w ciągu 10 tygodni 11. Największe ograniczenia stanowią natomiast: zależność od genotypu (w obrębie którego, tylko niektóre odmiany można regenerować na drodze embriogenezy somatycznej), dotyczy to zwłaszcza chryzantem. Dylematem stosowania bioreaktorów jest większe ryzyko zakażeń. Niekiedy pojawia się także konieczność eliminacji zaburzeń wzrostu i rozwoju zarodków (uszkodzenia merystemu korzeniowego lub apikalnego oraz deformacje w obrębie liścieni i epikotylu, które ograniczają wydajność fotosyntetyczną). Problemem w produkcji jest brak synchronizacji wzrostu korzeni i pędów podczas konwersji 36. Ambaras ten można rozwiązać, poprzez fizyczną separację poszczególnych stadiów rozwojowych zarodków lub przez zastosowanie antyauksyn 37. Do pozostałych problemów należą niski współczynnik konwersji oraz trudności w aklimatyzacji uzyskanych roślin do warunków ex vitro 38. Przykładowo w 1998 roku Martin- Hernandez 39 i inni zaindukowali embriogenezę somatyczną u kilku przedstawicieli zagrożonego gatunku Mammillaria san-angelensis. Zarodki (zarówno pochodzenia jedno- jak i wielokomórkowego) otrzymano z integumentów zalążków na pożywce B 5 40 wzbogaconej 4 mg dm -3 2,4-D + 2 mg dm -3 kinetyny. Regeneracja roślin jednak nie nastąpiła. Problemy takie napotkano także w przypadku wartościowego gospodarczo kaktusa opuncji 41. Uważa się, że główną przyczyną słabego wigoru somatycznych zarodków jest brak odpowiedniej ilości materiałów zapasowych oraz szybsza ich hydroliza, a także pęcznienie wywołane brakiem okrywy nasiennej, oraz anormalny rozwój stożka wzrostu pędu i liścieni. Aby zwiększyć zawartość materiałów zapasowych dodaje się do pożywek sacharozę oraz aminokwasy. Dodatek giberelin (które wpływają na aktywność α-amylazy), powoduje hydrolizę magazynowanej skrobi do rozpuszczalnych cukrów, szybko wykorzystywanych w procesach rozwojowych zarodków, co automatycznie poprawia ich wigor 42. Także dodatek do pożywki węgla aktywnego zwiększa efektywność konwersji 38. Ponadto w celu podniesienia żywotności zarodków poddaje się je hartowaniu, które obejmuje suszenie, traktowanie obniżoną temperaturą lub inhibitorami wzrostu 3. O przydatności somatycznej embriogenezy do masowej produkcji roślin, decyduje zatem zarówno ilość jak i jakość otrzymanych zarodków 42. Wykorzystanie 36 M.J. Latkowska, Somatyczna embriogeneza roślin iglastych na przykładzie świerka pospolitego (Picea bies [L.] Karst.), Biotechnologia 2002, nr 59, s K. Sankara-Rao, Embryogenesis in flowering plants: recent approaches and prospects, Recent Developments in Plant Embryogenesis 1996, nr 21, s M.J. Latkowska, K. Wojciechowska, Wpływ egzogennych regulatorów wzrostu na kiełkowanie i konwersję zarodków somatycznych świerka pospolitego (Picea bies (L.) Karst.), Biotechnologia 2004, nr 65, s T. Martin-Hernandez, J. Marquez-Guzman, B. Rodriguez-Gray, A. Rubluo, Early stages in the development of somatic embryogenesis in Mammillaria san-angelensis Sanchez-Mejorada (Cactaceae), Phyton 1998, nr 62, s O.L. Gamborg, R.A. Miller, K. Ojima, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells, Experimental Cell Research" 1968, nr 50, s F. Linhares, F. Gomes, F.F. Heredia, P.B. Silva, O. Faco, F. Campos, Somatic embryogenesis and plant regeneration in Opuntiaficus-indica (L.) Mill. (Cactaceae), Scientia Hotriculturae 2005, nr 108, s E. Kępczyńska, Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro, Biotechnologia 2006, nr 75, s

11 96 opisywanej metody na skalę komercyjną, opłacalne jest tylko wówczas, gdy współczynnik konwersji przekracza 80% 2. Od czasu, gdy w 1958 roku Steward po raz pierwszy opisał zjawisko somatycznej embriogenezy na przykładzie marchwi, liczba gatunków, u których udało się zaindukować ten proces ciągle rośnie. Badania nad embriogenezą somatyczną prowadzono m.in. u następujących roślin ozdobnych: Chrysanthemum grandiflorum /Ramat./ Kitam. 43, Rosa hybryda L. 44, Begonia gracilis Kunth 45, Saintpaulia ionantha Wendl. 46.Na skalę komercyjną metoda ta została wykorzystana m. in. u: Cyclamen persicum 47, Euphorbia pulcherrima Willd. ex Klotzsch 48 i Picea abies Karst. 38. Witryfikacja Pojawiającym się czasem problemem w kulturach in vitro jest witryfikacja roślin. Wiąże się ona z nadmiernym uwodnieniem tkanek (które przyjmują szklisty wygląd), spowodowanym wysokim poziomem wilgotności w naczyniu, stężenia sacharozy oraz regulatorów wzrostu w pożywce, a także ograniczonym naświetleniem. Rośliny takie posiadają zdeformowane chloroplasty, stwierdza się u nich zaburzenia w syntezie chlorofilu i innych barwników oraz aktywności enzymatycznej 49,50. W rezultacie nie są zdolne do życia w warunkach szklarniowych. Problem ten można rozwiązać stosując dodatek antygiberelin (np. PBZ paklobutrazol) lub zwiększając stężenie zestalacza pożywki (agaru, gerlitu, etc.), ograniczając w ten sposób dostępność wody 14 Aklimatyzaja do warunków in vivo Ukorzenione (na pożywce z auksynami, opcjonalnie z dodatkiem węgla aktywnego 18 ) mikrosadzonki długości ok. 5 cm mogą być przeniesione do warunków in vivo. Nie zawsze jest to jednak proste, albowiem otrzymane rośliny podlegają silnemu wpływowi warunków kultur in vitro (ograniczonego oświetlenia i wysokiej wilgotności). W rezultacie mikrosadzonki posiadają cienką kutykulę i dysfunkcyjne aparaty szparkowe, a także obserwuje się u nich zaburzenia w aktywności układów fotosyntetycznych 50. W związku z tym przeniesione do 43 R.A. May, R.N. Trigiano, Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaves of Dendranthema grandiflora, Journal of American Society for Horticultural Science, 1991, nr 116, s S.Y. Lee, B.H. Han, Y.S. Kim, Somatic embryogenesis and shoot development in Rosa hybrida L., Acta Horticulturae, 2010, B. Castillo, M.A.L. Smith, Direct somatic embryogenesis from Begonia gracilis explants, Plant Cell Reports 1997, nr 16, s M. Shukla, J.A. Sullivan, S.M. Jain, S.J. Murch, P.K. Saxena, Micropropagation of African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.), Methods in Molecular Biology 2013, nr 994, s A. Hohe, T. Winkelmann, H-G. Schwenkel, Cell growth in and differentiation of somatic embryos from suspension cultures of Cyclamen persicum Mill. in bioreactors, [w:] Reproduction of Cyclamen persicum Mill. through somatic embryogenesis using suspension culture systems (EUR 19697), red. H.G. Schwenkel, Brussels 1999, s T.Y. Jasrai, K.N. Thaker, C.M. D Souza, In vitro propagation of Euphorbia pulcherrima through somatic embryogenesis, Plant Tissue Culture 2003, nr 13, s B. Balen, J. Milosevic, M. Krsnik-Rasol, Protein and glycoprotein patterns related to morphogenesis in Mammillaria gracilis Pfeiff. tissue culture, Food Technology and Biotechnology 2002, nr 40, s B. Balen, M. Tkalec, P.P. Ńtefanić, Z. Vidaković-Cifrek, M. Krsnik-Rasol, In vitro conditions affect photosynthetic performance and crassulacean acid metabolism in Mammillari agracilis Pfeiff. tissues, Acta Physiologiae Plantarum 2012, nr 34, s

12 97 warunków szklarniowych rośliny wymagają odpowiedniej aklimatyzacji. Wiąże się ona z takimi zabiegami jak okrywanie roślin folią perforowaną, agrowłókniną lub innymi osłonami oraz częstym ich zraszaniem (przez 7 28 dni) w celu uchronienia ich przed nadmiernym odwodnieniem i poparzeniem słonecznym. Jak wykazały badania Sarmast i in. 51 wytrząsanie roślin przed aklimatyzacją (na etapie in vitro) przez około 14 dni może poprawić wydajność aklimatyzacji. Stabilność genetyczna i zmienność somaklonalna Niewątpliwą zaletą meryklonowania oraz metod jednowęzłowych fragmentów pędu i pąków bocznych jest gwarancja stabilności genetycznej. Jednakże, pomimo wegetatywnego charakteru mikrorozmnażania, regeneracja roślin w kulturach in vitro, nie zawsze prowadzi do wiernego odtworzenia cech organizmu matecznego. Metoda pędów przybyszowych, kultury pojedynczych komórek oraz somatyczna embriogeneza, ze względu na brak merystemu w eksplantacie inicjalnym nie gwarantują stabilności genetycznej. Techniki te jednakże zyskują kardynalne znaczenie w tworzeniu sztucznych nasion, hodowli roślin (zarówno mutacyjnej jak i na drodze transformacji genetycznej) oraz w laboratoryjnej reprodukcji cebul kwiatowych 3. Dodatkową ich zaletą jest fakt, że w przypadku technologii wykorzystujących eksplantaty merystematyczne (wierzchołki pędu/korzeni, nasiona lub wyizolowane z nich zarodki) otrzymujemy potomstwo genetycznie identyczne, co nie jest pożądane w przypadku gatunków o i tak już mocno uszczuplonej puli genowej jak np. Astrophytum asterias (Zucc.) Lem. Ponadto w związku z obecnością w pożywce regulatorów wzrostu, wykorzystanie merystemu nie jest jednoznaczne z zatrzymaniem rozwoju niestabilnego genetycznie kalusa 23. W trakcie pośredniej regeneracji roślin przez kalus, może dochodzić do rozszczepienia komponentów chimery, jeżeli roślina jest złożona z kilku genotypów osobniczych, a także do powstania różnorodnych zmian 52. Mogą się one przejawiać w formie zmiany barwy, rozmiaru lub kształtu kwiatów, ich liczby, ilości płatków, kształtu liści lub pokroju całej rośliny. Zmiany te mogą być korzystne, jeśli prowadzą do otrzymania nowych, stabilnych linii. Jednak w przypadku materiału elitarnego, są niepożądane. Częstość występowania zmienności somaklonalnej (zmienności w kulturze in vitro) jest dużo mniejsza w przypadku konwersji z zarodków somatycznych, niż w przypadku regeneracji roślin z pędów przybyszowych, co zaobserwowano na przykładzie chryzantemy, sępolii i begonii 53. Zmienność somaklonalną obserwuje się także rzadziej w przypadku pędów przybyszowych i zarodków, które powstają z pojedynczych komórek 2.Genetyczną stabilność uzyskano w przypadku embriogenezy somatycznej następujących gatunków: Cyclamen persicum Mill. 54, Schlumbergera truncata Moran 55 oraz Chrysanthemum grandiflorum M.K. Sarmast, H. Salehi, M. Khosh-Khui, Seismomorphogenesis: a novel approach to acclimatization of tissue culture regenerated plants, Biotech 2013, nr 3, s M. Zalewska, J. Lema-Rumińska, N. Miler, In vitro propagation using adventitious buds technique as a source of new variability in chrysanthemum, Scientia Horticulturae 2007, nr 113, s M.S. Jain, Somaclonal variation in Begonia elatior and Saintpaulia ionantha L., ScientiaHorticulturae 1993, nr 54, s T. Winkelmann, Clonal propagation of Cyclamen persicum via somatic embryogenesis, Methods in Molecular Biology 2010, nr 589, s E. Al-Ramamneh, S. Sriskandarajah, M. Serek, Plant regeneration via somatic embryogenesis in Schlumbergera truncata, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2006, nr 84, s

13 98 Sztuczne nasiona Mikrorozmnażanie znalazło szerokie spektrum zastosowań w produkcji ogrodniczej i biotechnologii. Wykorzystuje się je w szkółkarstwie i nasiennictwie do tworzenia tzw. sztucznych nasion. Zbudowane są one z uwodnionego lub wysuszonego somatycznego zarodka, pędu przybyszowego lub innego wyizolowanego in vitro eksplantatu (pąka wierzchołkowego, bocznego lub samego merystemu), mającego zdolność odtworzenia całej rośliny i otaczającej go osłonki. Stanowi ją specjalnie dobrany żel spełniający rolę ochronno-odżywczą. Funkcję sztucznego bielma spełnia alginian sodu suplementowany substancjami odżywczymi. Rola okrywy nasiennej przypada najczęściej alginianowi wapnia lub rzadziej poliuretanowi. Eksplantaty merystematyczne zapewniają wyższą gwarancję stabilności genetycznej, ale kosztem dużo niższej przeżywalności 3. Technologia ta jest szczególnie przydatna, w sytuacji kiedy nie można wykorzystać tradycyjnych nasion, gdy nie są one wytwarzane, wymagają specjalnego przedtraktowania/przechowywania lub jeżeli roślina została porażona przez choroby wirusowe 57. Pozwala to na uniezależnienie produkcji cennego materiału siewnego od czynników klimatycznych oraz przyspiesza tworzenie nasion u roślin charakteryzujących się długim cyklem ich produkcji lub niską plennością oraz ułatwia przechowywanie i transport na duże odległości 42.Syntetyczne nasiona znalazły zastosowanie w przypadku wielu roślin ozdobnych, np. Cyclamenpersicum 58, Chrysanthemum grandiflorum 59, Rhodiola kirilowii (Regel.) Maxim 56, Nerium oleander L. 60 oraz Coelogyne breviscapa Lindl. 61. Ważną zaletą sztucznych nasion jest możliwość ich kriokonserwacji (po odwodnieniu) w ciekłym azocie 62,63. Podsumowanie Mikrorozmnażanie jest ważną gałęzią biologii regeneracyjnej. Zrozumienie tego procesu pozostaje niezwykle istotnym zagadnieniem wpływającym na rozwój nowoczesnych technik ogrodniczych. Z każdym rokiem wzrasta bowiem liczba gatunków rozmnażanych na drodze in vitro. Elektroniczne bazy danych przytłaczają mnogością opisów tego procesu. Zagadnienie to jednak wciąż jest 56 J. Lema-Rumińska, E. Śliwińska, Ocena stabilności roślin uzyskanych z zarodków somatycznych u chryzantemy wielkokwiatowej (Chrysanthemum x grandiflorum /Ramat./ Kitam.), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 2009, nr 539, s M. Zych, F. Furmanowa, A. Krajewska-Patan, A. Łowicka, M. Dreger, S. Mendlewska, Micropropagation of Rhodiola kirilowii plants using encapsulated axillary buds and callus, Acta Biologica Cracoviensia Botanica 2005, nr 47, s T. Winkelmann, L. Meyer, M. Serek, Germination of encapsulated somatic embryos of Cyclamen persicum, Horticultural Science 2004, nr 39, s I. Pinker, S.S.A. Abdel-Rahman, Artificial seeds for propagation of Dendranthema x grandiflora (Ramat.), Propagation of Ornamental Plants 2005, nr 5, s Y. Ozden-Tokatli, A. De Carlo, F. Gumusel, S. Pignattelli, M. Lambardi, Development of encapsulation techniques for the production and conservation of synthetic seeds in ornamental species, Propagation of Ornamental Plants 2008, nr 8, s R. Mohanraj, R. Ananthan, V.N. Bai, Production and storage of synthetic seeds in Coelogyne breviscapa Lindl. Asian Journal of Biotechnology 2009, nr 3, s D, Kulus, Wykorzystanie krioprezerwacji w ochronie cennych zasobów genetycznych chryzantem, [w:] Młodzi naukowcy dla polskiej nauki 11 Nauki przyrodnicze t. 2, red. M. Kuczera, Kraków 2013, s M. Zalewska, D. Kulus, Czas boi się kriobiologów, Format UTP 2012, nr 3, s

14 99 poznane w niewyczerpującym stopniu. Niektóre gatunki wykazują bowiem większą oporność niż inne pod względem możliwości sterylizacji oraz dalszej regeneracji in vitro 64. W przypadku innych problemem pozostaje zachowanie stabilności genetycznej. Przyszłość mikrorozmnażania upatruje się w embriogenezie somatycznej, po zastosowaniu technologii bioreaktorów (umożliwiających masową reprodukcję) oraz opracowaniu wydajnych metod konwersji zarodków i aklimatyzacji uzyskanych z nich roślin do warunków szklarniowych. Dla wielu roślin ozdobnych bowiem, opracowane procedury indukcji embriogenezy nie zostały wdrożone w praktyce. Wiąże się to z wciąż słabo poznanymi mechanizmami kontrolującymi ten proces 62. Największym dotychczasowym ograniczeniem kultur tkankowych jest czynnik ekonomiczny. Rozwiązaniem tych problemów może być redukcja kosztów pracowniczych (do 25%), związana z automatyzacją wielkoskalowej produkcji, która powinna doprowadzić do większego spopularyzowania tej technologii oraz minimalizacji strat spowodowanych ludzkimi błędami. Literatura: Bibliography: Adamus A, Podstawowe wiadomości o kulturach in vitro, [w:] Zastosowanie metod biotechnologicznych w hodowli roślin, red. B. Michalik, Kraków 1996, s. 5. Infante R., In vitro axillary shoot proliferation and somatic embryogenesis of yellow pitaya Mediocactus coccineus (Salm-Dyck), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1992, nr 31, s Jain M.S., Somaclonal variation in Begonia elatior and Saintpaulia ionantha L., ScientiaHorticulturae 1993, nr 54, s Kępczyńska E., Kiełkowanie i konwersja somatycznych zarodków in vitro, Biotechnologia 2006, nr 75, s Kulus D., Embriogeneza somatyczna in vitro, [w:] Nowe trendy w naukach przyrodniczych 4, red. M. Kuczera, Kraków 2013, s Kulus D, Wykorzystanie krioprezerwacji w ochronie cennych zasobów genetycznych chryzantem, [w:] Młodzi naukowcy dla polskiej nauki 11 Nauki przyrodnicze t. 2, red. M. Kuczera, Kraków 2013, s Orlikowska T., Regulatory roślinne w kulturach in vitro, t. 2 Regulatory wzrostu i rozwoju roślin, Warszawa 1997, s Latkowska M.J., Somatyczna embriogeneza roślin iglastych na przykładzie świerka pospolitego (Picea bies [L.] Karst.), Biotechnologia 2002, nr 59, s Lynch P.T., Tissue culture techniques in in vitro plant conservation, [w:] Plant Conservation Technology, red. E. Benson, Londyn 1999, s Winkelmann T., Clonal propagation of Cyclamen persicum via somatic embryogenesis, Methods in Molecular Biology 2010, nr 589, s Wojciechowicz M.K., Organogenesis and somatic embryogenesis induced in petal cultures of Sedum species, Acta Biologica Cracoviensia Botanica 2009, nr 51, s A, Ilczuk, E, Jacygrad, K, Jagiełło-Kubiec, A, Pacholczak, Rozmnażanie in vitro roślin drzewiastych perspektywy i problemy, [w:] Ogrodnictwo ozdobne sektorem gospodarki narodowej, red. J. Rabiza- Świder, E. Skutnik, Warszawa 2013, s

15 100 Zalewska M, In vitro adventitious bud techniques as a tool in creation of new chrysanthemum cultivars, [w:] Floriculture: role of tissue culture and molecular techniques, red. S.K. Datta, D. Chakrabarty, Jaipur 2010, s Leelavathi S., V.G. Sunnichan, R. Kumria, G.P. Vijaykanth, R.K. Bhatnagar, V.S. Reddy, A simple and rapid Agrobacterium-mediated transformation protocol for cotton (Gossypium hirsutum L.): embryogeniccalli as a source to generate large numbers of transgenic plants, Plant Cell Reports 2004, nr 22, s Pinker I., S.S.A. Abdel-Rahman, Artificial seeds for propagation of Dendranthema x grandiflora (Ramat.), Propagation of Ornamental Plants 2005, nr 5, s Hvoslef-Eide A.K., O.A.S. Olsen, R. Lyngved, C. Munster, P.H. Heyerdahl, Bioreactor design for propagation of somatic embryos, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2005, nr 81, s Choudhary A.K., A.K. Ray, S. Jha, I.N. Mishra, Callus formation, shoot initiation and in vitro culture of Aloe vera, Biotechnology, Bioinformatics and Bioengineering 1987,nr 4, s Hohe A., T. Winkelmann, H-G. Schwenkel, Cell growth in and differentiation of somatic embryos from suspension cultures of Cyclamen persicum Mill. in bioreactors, [w:] Reproduction of Cyclamen persicum Mill. through somatic embryogenesis using suspension culture systems (EUR 19697), red. H.G. Schwenkel, Brussels 1999, s Zalewska M., D. Kulus, Czas boi się kriobiologów, Format UTP 2012, nr 3, s Ozden-Tokatli Y., A. De Carlo, F. Gumusel, S. Pignattelli, M. Lambardi, Development of encapsulation techniques for the production and conservation of synthetic seeds in ornamental species, Propagation of Ornamental Plants 2008, nr 8, s Balen B., P. Peharec, M. Krsnik-Rasol, Developmentaly specific soluble and membrane proteins and glycoproteins in Mammillaria gracillis Pfeiff. (Cactaceae) tissue culture, Acta Botanica Croatica 2008, nr 67, s Castillo B., M.A.L. Smith, Direct somatic embryogenesis from Begonia gracilis explants, Plant Cell Reports 1997, nr 16, s Martin-Hernandez T., J. Marquez-Guzman, B. Rodriguez-Gray, A. Rubluo, Early stages in the development of somatic embryogenesis in Mammillaria sanangelensis Sanchez-Mejorada (Cactaceae), Phyton 1998, nr 62, s Karimi N., M.R. Mofid, M. Ebrahimi, R. Naderi, Effect of areole and culture medium on callus induction and regeneration Cereus peruvianus Mill. (Cactaceae), Trakia Journal of Science 2010, nr 8, s Sankara-Rao K., Embryogenesis in flowering plants: recent approaches and prospects, Recent Developments in Plant Embryogenesis 1996, nr 21, s Walden R., R. Wingender, Gene-transfer and plant-regeneration techniques, Trends in Biotechnology 1995, nr 13, s , zmienione. Winkelmann T., L. Meyer, M. Serek, Germination of encapsulated somatic embryos of Cyclamen persicum, Horticultural Science 2004, nr 39, s Kane M.E., N.L. Philman, C.A. Bartuska, D.B. McConnell, Growth regulator effects on in vitro shoot regeneration of Crassula helmsii, Journal of Aquatic Plant Management 1993, nr 31, s

16 101 Balen B., M. Tkalec, P.P. Ńtefanić, Z. Vidaković-Cifrek, M. Krsnik-Rasol, In vitro conditions affect photosynthetic performance and crassulacean acid metabolism in Mammillari agracilis Pfeiff. tissues, Acta Physiologiae Plantarum 2012, nr 34, s Santos-Diaz M., R. Mendez-Ontiveros, A. Arredondo-Gomez, In vitro organogenesis of Pelecyphora aselliformis Erhenberg (Cactaceae), In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2003, nr 39, s Robert M.L., J.L. Herrera, F. Contreras, K.N. Scorer, In vitro propagation of Agave fourcroydes Lem. (Henequen), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 1987, nr 8, s Al-Gabbiesh A., D.S. Hassawi, F.U. Afifi, In vitro propagation of endangered Iris species, Journal of Biological Science 2006, nr 6, s Jasrai T.Y., K.N. Thaker, C.M. D Souza, In vitro propagation of Euphorbia pulcherrima through somatic embryogenesis, Plant Tissue Culture 2003, nr 13, s Kanwar J.K., S. Kumar, In vitro propagation of Gerbera a review, Scientia Holticulturae 2008, nr 35, s Pérez-Molphe-Balch E., C. Dávila-Figueroa, In vitro propagation of Pelecyphora aselliformis Ehrenberg and P. strobiliformis Werdermann (Cactaceae), In Vitro Cellular and Development Biology Plant 2002, nr 38, s Ramirez-Malagon R., I. Aguilar-Ramirez, A. Borodanenko, L. Perez-Moreno, J.L. Barrera-Guerra, H. Nunez-Palenius, G. Ochoa-Alejo, In vitro propagation of ten threatened species of Mammillaria (Cactaceae), In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2007, nr 43, s Zalewska M., J. Lema-Rumińska, N. Miler, In vitro propagation using adventitious buds technique as a source of new variability in chrysanthemum, Scientia Horticulturae 2007, nr 113, s Lema-Rumińska J., D. Kulus, Induction of somatic embryogenesis in Astrophytum asterias (Zucc.) Lem. in the aspect of light conditions and auxin 2,4-D concentrations, Acta Scientiarum Polonorum, Hortorum Cultus 2012, nr 11, s Amoo S.O., J.F. Finnie, J. Van Staden, Influence of temperature, photoperiod and culture vessel size on adventitious shoot production of in vitro propagated Huernia hystrix, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2009, nr 99, s Szopa J., K. Kośtyń, Kultury komórkowe i rośliny transgeniczne w biotechnologii, Biotechnologia 2006, nr 75, s Rubluo A., Micropropagation of Mammillaria species (Cactaceae), Biotechnology in Agriculture and Forestry 1997, nr 40, s Shukla M., J.A. Sullivan, S.M. Jain, S.J. Murch, P.K. Saxena, Micropropagation of African violet (Saintpaulia ionantha Wendl.), Methods in Molecular Biology 2013, nr 994, s Pérez-Molphe-Balch E., M. Reyes, E. Amador, E. Rangel, L. Ruiz, H. Viramontes, Micropropagation of 21 species of Mexican cacti by axillary proliferation, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 1998, nr 34, s Zych M., F. Furmanowa, A. Krajewska-Patan, A. Łowicka, M. Dreger, S. Mendlewska, Micropropagation of Rhodiola kirilowii plants using encapsulated

17 102 axillary buds and callus, Acta Biologica Cracoviensia Botanica 2005, nr 47, s Krogstrup P., J.L. Find, D.J. Gurskov, M.M.H. Kristensen, Micropropagation of socotran fig, Dorsteniagigas Schweinf. Ex Balf. F. a threatened species, endemic to the Island of Socotra, Yemen, In Vitro Cellular and Developmental Biology Plant 2005, nr 41, s Gamborg O.L., R.A. Miller, K. Ojima, Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells, Experimental Cell Research" 1968, nr 50, s Lema-Rumińska J., E. Śliwińska, Ocena stabilności roślin uzyskanych z zarodków somatycznych u chryzantemy wielkokwiatowej (Chrysanthemum x grandiflorum /Ramat./ Kitam.), Zeszyty Problemowe Postępów Nauk Rolniczych 2009, nr 539, s Liu Y., Z. Long, Y. Gao, T. Harada, Organ formation and plant regeneration in vitro tissue culture of Crassula arborescens, Journal of Zhejiang University 2007, nr 33, s Wyka T.P., M. Hamerska, M. Wróblewska, Organogenesis of vegetative shoots from in vitro cultured flower buds of Mammillaria albicoma (Cactaceae), Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2006, nr 87, s Al-Ramamneh E., S. Sriskandarajah, M. Serek, Plant regeneration via somatic embryogenesis in Schlumbergera truncata, Plant Cell, Tissue and Organ Culture 2006, nr 84, s Slater A, N, Scott, M, Fowler, Plant tissue culture, [w:] Plant biotechnology the genetic manipulation of plants, red. A. Slater, N. Scott, M. Fowler, Oksford 2008, s Mohanraj R., R. Ananthan, V.N. Bai, Production and storage of synthetic seeds in Coelogyne breviscapa Lindl. Asian Journal of Biotechnology 2009, nr 3, s Balen B., J. Milosevic, M. Krsnik-Rasol, Protein and glycoprotein patterns related to morphogenesis in Mammillaria gracilis Pfeiff. tissue culture, Food Technology and Biotechnology 2002, nr 40, s Ilczuk A, E, Jacygrad, K, Jagiełło-Kubiec, A, Pacholczak, Rozmnażanie in vitro roślin drzewiastych perspektywy i problemy, [w:] Ogrodnictwo ozdobne sektorem gospodarki narodowej, red. J. Rabiza-Świder, E. Skutnik, Warszawa 2013, s Jerzy M, A, Krzymińska, Rozmnażanie roślin ozdobnych in vitro, [w:] Rozmnażanie wegetatywne roślin ozdobnych, red. M. Jerzy, A. Krzymińska, Poznań 2005, s Sarmast M.K., H. Salehi, M. Khosh-Khui, Seismomorphogenesis: a novel approach to acclimatization of tissue culture regenerated plants, Biotech 2013, nr 3, s May R.A., R.N. Trigiano, Somatic embryogenesis and plant regeneration from leaves of Dendranthema grandiflora, Journal of American Society for Horticultural Science, 1991, nr 116, s Linhares F., F. Gomes, F.F. Heredia, P.B. Silva, O. Faco, F. Campos, Somatic embryogenesis and plant regeneration in Opuntiaficus-indica (L.) Mill. (Cactaceae), Scientia Hotriculturae 2005, nr 108, s Lee S.Y., B.H. Han, Y.S. Kim, Somatic embryogenesis and shoot development in Rosa hybrida L., Acta Horticulturae, 2010, 870.