Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w mechanizmach powstawania i aktywności granulowanego osadu czynnego w warunkach tlenowych

Transkrypt

1 Politechnika Śląska Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki Katedra Biotechnologii Środowiska PRACA DOKTORSKA Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w mechanizmach powstawania i aktywności granulowanego osadu czynnego w warunkach tlenowych Beata Kończak Promotor Prof. dr hab. inż. Korneliusz Miksch Praca finansowana przez Ministra Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Grant promotorski nr N N Gliwice 2011

2 Projekt okładki: Marcin Kończak Zdjęcie na okładce i na stronie 12 : Taniec z bąbelkami (fot. Marcin i Beata Kończak) Zdjęcie zamieszczono dzięki uprzejmości organizatorów 3 Konkursu Fotograficznego Uniwersytetu Śląskiego: NAUKA ŚWIAT BEZ GRANIC Druk i oprawa: Błękitne Studio Graficzne

3 Podziękowania Chciałbym bardzo serdecznie podziękować wszystkim osobom, które przyczyniły się do powstania niniejszej pracy. Bez ich pomocy i wsparcia ukończenie jej nie byłoby możliwe. Przede wszystkim pragnę wyrazić specjalne podziękowania mojemu promotorowi, Panu Profesorowi Korneliuszowi Miksch za wsparcie naukowe podczas każdego etapu realizacji moich studiów doktoranckich, prowadzenia badań i pisania rozprawy doktorskiej. Dzięki Panu Profesorowi ukształtowały się moje zainteresowania naukowe i miałam motywację do podejmowania naukowych wyzwań. Chciałabym podziękować także Panu Profesorowi Juan owi Lema, Panu Profesorowi Francisco wi Omil i Pani Profesor Anusce Mosquera z Uniwersytetu w Santiago de Compostela, za możliwość odbycia niezwykle inspirującego stażu naukowego. Pragnę też gorąco podziękować moim serdecznym przyjaciołom z Uniwersytetu w Santiago de Compostela: Angeli i Angelice, Carlosowi, Dafne, Dagmarze, Denisse, Jose, Laurze, Monice i Miriam, Pauli, Rosie, Rocio, Sarze, Soni, Ruben owi za to, że zawsze z uśmiechem na ustach wracam w to magiczne miejsce. Quiero agradecer al Profesor Juan Lema, al Profesor Francisco Omil y a la Profesora Anusca Mosquera de la Universidad de Santiago de Compostela por la oportunidad de brindarme una beca y ser parte de su grupo de investigación. Quiero agradecer también a mis amigas y amigos de la Universidad de Santiago de Compostela: Ángela, Angélica, Carlos, Dafne, Dagmara, Denisse, José, Laura, Mónica y Miriam, Paula, Rosa, Rocío, Sara, Sonia, Rubén porque siempre regreso con una sonrisa de este mágico sitio. Specjalne wyrazy wdzięczności kieruję do Pani Dr Ewy Małuseckiej z Instytutu Onkologii w Gliwicach za nieocenioną pomoc w przygotowaniu ultraskrawków niezbędnych do badań z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego. Podziękowania kieruję także do Pani Dr Jagny Karcz z Uniwersytetu Śląskiego za ogromną pomoc podczas przygotowywania i analizy zdjęć z mikroskopu elektronowego. Jestem niezwykle wdzięczna Annie Lalik za pomoc w analizie proteomicznej białek. Przede wszystkim chciałam jednak podziękować jej za ciepło, życzliwość i cierpliwość. 1

4 Ministerstwu Nauki i Szkolnictwa Wyższego składam podziękowanie za finansowanie badań w ramach grantu promotorskiego N N Chciałabym także podziękować moim koleżankom i kolegom z Katedry Biotechnologii Środowiskowej. Grzesiowi Cemie za życzliwość i cenne wskazówki w czasie prowadzenia badań i pisania niniejszej rozprawy. Oli Ziembińskiej za ciekawe pomysły i energię, którą mnie zarażała każdego dnia. Oli Zgórskiej za wprowadzenie mnie w tajniki metod statystycznych. Ani R., Ani W., Adamowi, Dorocie, Ewie, Grażynce, Jarkowi, Joli, Leszkowi i Sebastianowi za to, że w każdej chwili mogłam liczyć nie tylko na interesujące konsultacje naukowe, ale i chwilę relaksu w przerwach między kolejnymi badaniami. Asi K., Kasi K., i Weronice, za to, że zawsze mogę liczyć na ich wsparcie i pogodę ducha. Kasi R. chciałam podziękować za nieocenioną pomoc podczas każdego dnia mojej pracy w laboratorium. Podziękowania kieruję także do Pana Marka Tarłowskiego za zaskakujące pomysły i pomoc podczas prowadzenia układów badawczych, a także do Pani Elżbiety Tarłowskiej za pomoc w sprawach formalnych. Podziękowania składam także moim przyjaciołom. Kai, Kasi i Oli dziękuję za wsparcie w trudnych chwilach i pozytywne myślenie. Isaac owi dziękuję za cenne wskazówki do prowadzenia badań i pisania publikacji naukowych w języku hiszpańskim. Przede wszystkim jednak chciałam mu podziękować za to, że mimo dzielących nas wielu, wielu kilometrów, zawsze mogę na niego liczyć. Quiero agradecer al Isaac por sus consejos para hacer este trabajo y escribir los artículos en español. Ante todo quisiera agradecerle que a pesar de que estamos tan lejos, siempre puedo contar con él. Wreszcie dziękuję najbliższym, mojej wspaniałej Rodzinie, bez której wsparcia i miłości nic nie byłoby możliwe. Serdeczne podziękowania składam Babciom i Dziadkom, którzy wspaniale zajmowali się Martusią, w czasie gdy powstawała niniejsza rozprawa, a mnie samej dodawali otuchy. Największe podziękowania należą się mojemu mężowi i córeczce, którym dedykuję tę pracę. Marcinowi dziękuję za nieocenioną pomoc podczas weekendowych prac w laboratorium i podczas wykonywania oprawy graficznej pracy, przede wszystkim jednak dziękuję mu za optymizm i wiarę we mnie. Martusi dziękuję za wszystkie beztroskie chwile wspólnej zabawy, które dodawały mi energii potrzebnej do realizacji wyznaczonych celów. 2

5 SPIS TREŚCI Str. Wykaz najważniejszych skrótów i oznaczeń 7 Wprowadzenie Przegląd teoretyczny Charakterystyka technologii granulowanego osadu Charakterystyka granul Morfologia Struktura granul Polimery zewnątrzkomórkowe Egzopolisacharydy Białka Ektoenzymy edna Dystrybucja polimerów zewnątrzkomórkowych w granulach Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w granulach osadu Czynniki wpływające na formowanie granul Warunki uczta-głód Kompozycja pożywki Obciążenie ładunkiem zanieczyszczeń Siły hydrodynamiczne Czas opadania Stopień wymiany reaktora Mechanizm formowania granul Znaczenie hydrofobowości komórek w mechanizmach 33 formowania granul Znaczenie biokoagulacji w mechanizmach formowania granul 34 3

6 Teoria alginianowa Teoria DLVO Teoria Mostków Łączących Cel i zakres pracy Materiały i metodyka badań Układ badawczy Materiały Metodyka badań Określenie dystrybucji średnic granul Oznaczanie zawiesiny ogólnej i suchej masy organicznej Oznaczanie ChZT, N-NH 4, N-NO 2, N-NO Oznaczanie indeksu objętościowego (Mohlmana) Hydrofobowość Ekstrakcja EPS.. 50 Ekstrakcja żywicą Dowex.. 51 Ekstrakcja z EDTA 53 Ekstrakcja ultradźwiękami 53 Ekstrakcja termiczna. 53 Ekstrakcja metodami łączonymi Określenie zawartości polisacharydów Określenie zawartości polipeptydów Określenie zawartości edna Określenie aktywności dehydrogenazy glukozo-6-fosforanowej Analiza proteomiczna białek zewnątrzkomórkowych Pomiar aktywności oddechowej Aktywność enzymatyczna.. 58 Aktywność proteolityczna. 58 Aktywność amylolityczna. 59 4

7 Określenie dystrybucji polimerów zewnątrzkomórkowych w 60 ultraskrawku Obserwacje za pomocą mikroskopu konfokalnego Określenie struktury granul za pomocą 61 skaningowego mikroskopu elektronowego Opracowanie wyników Wyniki Charakterystyka procesu biogranulacji Rola EPS w formowaniu granul Wpływ poszczególnych komponentów na formowanie 68 i właściwości fizykochemiczne granul Wpływ poszczególnych komponentów na formowanie granul Wpływ poszczególnych frakcji EPS na formowanie granul Dystrybucja przestrzenna EPS w granulach Rola EPS w mechanizmach formowania granul Wpływ EPS na hydrofobowość komórek Udział kationów dwu- i trójwartościowych w procesach 84 sieciowania polimerów i mechanizmach tworzenia granul Wpływ kationów dwuwartościowych na strukturę granul Wpływ kationów trójwartościowych (kation Fe 3+ ) 90 na strukturę granul Wpływ dawki wapnia na proces biogranulacji Wpływ dawki wapnia na strukturę macierzy EPS Wpływ kationów na zmiany profilu proteomicznego 94 macierzy białkowej 4.5. Wpływ polimerów zewnątrzkomórkowych na ogólną 97 aktywność granulowanego osadu i efektywność usuwania zanieczyszczeń 4.6. Rola enzymów zewnątrzkomórkowych w biogranulacji Wpływ enzymów proteolitycznych na formowanie granul Wpływ enzymów amylolitycznych na formowanie granul Dynamika zmian aktywności proteolitycznej 101 i amylolitycznej podczas jednego cyklu 5

8 5. Dyskusja wyników Wpływ EPS na formowanie granul Udział kationów w formowaniu granul Podsumowanie Wnioski i kierunki dalszych badań Wnioski Kierunki dalszych badań Literatura. 127 ANEKS. 140 SPIS RYSUNKÓW 145 SPIS TABEL 148 Prezentowany wydruk zawiera zasadniczy tekst pracy doktorskiej. Uzupełniające informacje metodyczne (spis odczynników, sprzętu, krzywe wzorcowe) zamieszczono na dołączonej płycie CD. 6

9 Wykaz najważniejszych skrótów i oznaczeń APS nadsiarczan amonu ChZT chemiczne zapotrzebowanie na tlen CLSM mikroskopia konfokalna CN ciecz nadosadowa, frakcja EPS po pierwszym odwirowaniu cona konkanawalina A CSH właściwości hydrofobowe powierzchni bakterii CW biały kalkofluor DCB teoria mostków łączących DNA kwasy nukleinowe DNS 3,5 - kwas dintrosalicylowy DMSO dimetylosulfotlenek DLVO teoria Derjaguin, Landau, Verwey i Overbeek a edna zewnątrzkomórkowe kwasy nukleinowe EDTA kwas etylenodiaminotetraoctowy EPS zewnątrzkomórkowe polimery ESEM środowiskowy mikroskop elektronowy FISH fluorescencyjna hybrydyzacja in situ FITC fluoresceina GC-MS spektormetria mas sprzężona z chromatografią gazową GSM gramy suchej masy GSMO gramy suchej masy organicznej G6PDH dehydrogenaza glukozo-6-fosforanowa IO indeks objętościowy kda kilo daltonów LB frakcja luźno związanych polimerów zewnątrzkomórkowych LecA lektyna A LecB lektyna B MATH adhezja mikroorganizmów do węglowodorów PBS bufor fosforanowy PP polipeptydy PS polisacharydy rpm liczba obrotów na minutę SBR biologiczny reaktor sekwencyjny SDS dodecylosiarczan sodu SEM skaningowy mikroskop elektronowy ŚLUZ otoczka śluzowa TB frakcja mocno związanych z granulą polimerów zewnątrzkomórkowych UASB beztlenowy reaktor z zawieszoną, granulowaną biomasą TCA kwas trójchloroctowy TEM elektronowy mikroskop transmisyjny TEMED N,N,N,N -Tetrametyloetylenodiamina 7

10 Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w mechanizmach powstawania i aktywności granulowanego osadu czynnego w warunkach tlenowych WPROWADZENIE

11 WPROWDZENIE WPROWADZENIE Woda, której dotykasz w rzece, jest ostatkiem tej, która przeszła, i początkiem tej, która przyjdzie; tak samo teraźniejszość. Leonardo da Vinci (Leonardo di ser Piero da Vinci) Ważnym zadaniem stojącym przed eksploratorami oczyszczalni ścieków jest dostosowanie się do wymogów Rozporządzenia Ministra Środowiska, Zasobów Naturalnych i Leśnictwa z dnia 29 listopada 2002, w którym określono, iż w przypadku dużych oczyszczalni ścieków dopuszczalna ilość związków organicznych odprowadzanych wraz ze ściekami oczyszczonymi do wód powierzchniowych może wynosić zaledwie 150 mgchzt/dm 3, ilość odprowadzanego azotu ogólnego nie powinna przekraczać 30 mgn og /dm 3, natomiast zawiesiny ogólnej 50 mg/dm 3 (Dz.U. 212, 2002). Niezwykle ważne stały się więc próby opracowywania systemów oczyszczania o zwiększonej retencji biomasy, efektywnie oczyszczających ścieki, tak by spełnić wymogi określone w/w Rozporządzeniu. W latach 90-tych opracowano pierwsze systemy, gdzie biomasa immobilizowana była w postaci błony biologicznej na specjalnych nośnikach (Heijnen i in., 1992). W tym czasie rozwinęły się również technologie beztlenowego oczyszczania ścieków w reaktorach UASB, gdzie mikroorganizmy utrzymywane są w dolnej części reaktora w postaci zawieszonej warstwy utworzonej z beztlenowych granul (Schmidt i Ahring, 1994). Morgenroth i in. (1997) podjęli próbę opracowania technologii otrzymywania granulowanych form drobnoustrojów w warunkach aerobowych, co stworzyło nowe perspektywy ulepszenia procesów tlenowych, zachodzących w konwencjonalnych oczyszczalniach ścieków metodą osadu czynnego. Granulowany osad czynny, zgodnie z definicją ustanowioną podczas konferencji 1 st IWA-Workshop Aerobic Granular Sludge w Monachium (2004), stanowią agregaty mikroorganizmów charakteryzujące się wysoką wytrzymałością mechaniczną i bardzo dobrymi właściwościami sedymentacyjnymi (de Kreuk i in., 2005). Właściwości te sprawiają, iż w porównaniu z tradycyjną technologią, urządzenia pracujące z granulowanym osadem czynnym wymagają znacznie mniejszej powierzchni, zużywają o wiele mniej energii na przepompowywanie, a ponadto następuje w nich lepsze wykorzystanie rozpuszczonego tlenu. 9

12 WPROWDZENIE Dodatkową zaletą technologii granulowanego osadu czynnego jest możliwość przeprowadzenia symultanicznego procesu usuwania związków węgla i azotu, a także oczyszczanie ścieków o dużej nierównomierności składu. Niewątpliwą zaletą jest też minimalizacja powstałych osadów nadmiernych. Konwencjonalne systemy oczyszczania ścieków metodą osadu czynnego, ze względu na ograniczone ilości zatrzymywanej biomasy, wymagają zespolenia z osadnikami wtórnymi. Wadą tej metody jest także ograniczone obciążenie komór napowietrzania ładunkiem zanieczyszczeń. Bardzo wysokie obciążenie układu powoduje nadmierną podaż substratu, co intensyfikuje syntezę biomasy przy jednoczesnym ograniczeniu ilości utlenionych substancji. W konsekwencji efektywność oczyszczenia ścieków jest niewystarczająca, a ponadto następuje niekorzystne zwiększenie ilości odprowadzanego osadu nadmiernego Mając na uwadze to, że szczególną rolę w powstawaniu granulowanego osadu czynnego mogą odgrywać polimery zewnątrzkomórkowe, a w obecnym stanie wiedzy brakuje dokładnych informacji na temat znaczenia tychże polimerów w tlenowych granulach, w niniejszej pracy scharakteryzowano proces biogranulacji z uwzględnieniem zmian zachodzących w macierzy zewnątrzkomórkowej. Wykonane badania służyły także znalezieniu odpowiedzi na pytania, który z komponentów polimerowej macierzy zewnątrzkomórkowej ma największe znaczenie w procesach biogranulacji oraz w jaki sposób zmienia się aktywność ogólna i enzymów zewnątrzkomórkowych w czasie ich formowania. Celem podjętych analiz była też weryfikacja różnych teorii tłumaczących mechanizm granulacji i ustalenie roli polimerów zewnątrzkomórkowych w tych mechanizmach. Poznanie mechanizmu granulacji może stworzyć możliwość kontroli nad przebiegiem procesu granulacji i dać gwarancję pozyskania stabilnych i efektywnie oczyszczających granul. Ważną sprawą jest też upowszechnienie wiedzy o możliwościach, jaką daje kontrolowana granulacja osadu, dzięki temu zwiększy się zaufanie eksploatatorów i inwestorów do tej nowej technologii. Modernizacja oczyszczalni ścieków, poprzez zastępowanie klasycznych komór napowietrzania, reaktorami z granulowaną biomasą, może przyczynić się nie tylko do poprawy efektywności procesów oczyszczania, ale przede wszystkim pozwoli na zmniejszenie ilości powstałych osadów nadmiernych i co za tym idzie zminimalizuje problemy związane z ich zagospodarowaniem. Praca składa się z pięciu części, z których pierwsza teoretyczna - służy wprowadzeniu podstawowych pojęć i zdefiniowaniu zmiennych, stanowiących przedmiot pomiaru w badaniach. Przedstawiono przegląd najważniejszych istniejących w literaturze koncepcji dotyczących formowania granul oraz charakterystykę technologii granulowanego 10

13 WPROWDZENIE osadu pracującego w warunkach tlenowych. Dzięki temu ukazano genezę przyjętego stanowiska teoretycznego, jak również relację, w jakiej pozostaje ono w stosunku do innych ujęć. W prezentacji teoretycznych zagadnień dotyczących technologii granulowanego osadu, skoncentrowano się na roli polimerów zewnątrzkomórkowych w mechanizmach powstawania granul. W konkluzji analizy literaturowej sformułowano zasadnicze problemy i hipotezy badawcze. Druga część poświęcona jest metodyce badań. Część trzecia obejmuje prezentację uzyskanych wyników badań własnych oraz ich wstępne omówienie. Przedstawiono wyniki analiz fizykochemicznych, dzięki którym określono ilościowo zmiany, jakie zachodzą w kompozycji macierzy zewnątrzkomórkowej w czasie biogranulacji, zaprezentowano także jakościową analizę białek zewnątrzkomórkowych na poziomie molekularnym. W tej części umieszczono także wyniki badań wykonanych z wykorzystaniem nowoczesnych techniki mikroskopowych, dzięki którym określono dystrybucję poszczególnych komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej w granuli, a także zbadano strukturę warstwy powierzchniowej granuli. Część trzecią zamyka prezentacja badań dotyczących zmian aktywności enzymów zewnątrzkomórkowych (proteaz i -amylaz) w czasie biogranulacji oraz roli kationów metali wielowartościowych (kationu wapnia, magnezu i żelaza) w procesach wiązania i sieciowania polimerów zewnątrzkomórkowych. Część czwarta poświęcona jest dyskusji otrzymanych wyników. Podjęto analizę porównawczą dotyczącą uzyskanych wyników badań z wynikami prezentowanymi w dostępnym piśmiennictwie na ten temat. Zaproponowano schemat mechanizmu biogranulacji z uwzględnieniem roli poszczególnych komponentów macierzy zewnątrzkomórkowej, w tym także enzymów zewnątrzkomórkowych oraz kationów metali wielowartościowych. W części piątej przedstawiono wnioski wynikające z badań, ukazano praktyczne wskazówki do prowadzenia procesu biogranulacji wynikające z uzyskanych rezultatów badań, a także sformułowano sugestie odnośnie dalszych badań. Pracę zamyka bibliografia i aneks, w którym zamieszczono dodatkowe informacje dotyczące optymalizacji metodyki ekstrakcji polimerów zewnątrzkomórkowych. 11

14 Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w mechanizmach powstawania i aktywności granulowanego osadu czynnego w warunkach tlenowych PRZEGLĄD TEORETYCZNY

15 PRZEGLĄD TEROETYCZNY 1. Przegląd teoretyczny 1.1. Charakterystyka technologii granulowanego osadu Granule to gęste skupiska ogromnej ilości mikroorganizmów formowane przez samorzutną immobilizację bez udziału nośnika (rys. 1.1) (Liu i Tay, 2004). Rysunek 1.1. Granulowany osad czynny (fot. Kończak B., Kończak M.) Granule o kompaktowej, gęstej strukturze, dużej bioróżnorodności oraz o doskonałych właściwościach sedymentacyjnych udało się pozyskać w reaktorze SBR (Sequencing Batch Reactor) (Morgenroth i in., 1997; Beun i in., 1999; Jang i in., 2003; Arrojo i in., 2004; Arrojo i in., 2007a; Liu i in., 2010a; Wojnowska-Baryła i in., 2010; Kończak i in., 2010a). Tlenowe granule cechuje: 1. Sferyczny lub elipsoidalny kształt; granule mogą być czasami wydłużone i kształtem przypominać pręt; 2. Średnica 0,2 20 mm; 3. Gładka (skóropodobna) bądź postrzępiona powierzchnia (w przypadku, gdy dominują bakterie nitkowate i grzyby), przeważnie cechująca się właściwościami hydrofobowymi; 4. Warstwowa budowa; każda warstwa utworzona jest przez mikro-agregaty specyficznych grup mikroorganizmów. Natomiast wnętrze przypomina żel, czasami 13

16 PRZEGLĄD TEROETYCZNY w centrum dużych granul obserwuje się czarną, obumarłą materię organiczną bądź pęcherzyk gazu; 5. Obecność kanałów i porów; dzięki czemu możliwy jest transport masy i powietrza do wnętrza granuli; 6. Inkluzja kationów; 7. Wysoka tolerancja na substancje toksyczne. Jedną z najważniejszych zalet technologii granulowanego osadu czynnego jest duża szybkość opadania granul, wynosząca od 25 do 70 m/h, dzięki czemu wartość indeksu objętościowego granulowanego osadu jest bardzo mała, wynosząca nawet mniej od 50 cm 3 /g. Mała wartość indeksu objętościowego pozwala na prowadzenie procesu z wysokim stężeniem biomasy i obciążeniem hydraulicznym reaktora, co z kolei zapewnia szybką degradację zanieczyszczeń i wpływa na zmniejszenie reaktorów (Liu i Tay, 2004; Qin i in., 2004). Technologia granulowanego osadu w warunkach tlenowych może znaleźć zastosowanie do: oczyszczania ścieków zarówno o niskim, jak i wysokim obciążeniu ładunkiem zanieczyszczeń, usuwania związków azotu i fosforu, usuwania substancji toksycznych (biodegradacja fenolu, pirydyny, p-nitrofenolu, 2,4 dichlorofenolu, eteru metylowo t-butylowego), usuwania metali ciężkich, usuwania barwników (Adav i in, 2007a; Adav i in., 2007b; Adav i in., 2007c; Adav i in., 2008a, Sheng i in., 2008) Charakterystyka granul Morfologia Granulami nazywamy zwarte agregaty, których średnica jest większa niż 0,2 mm (Tay i in., 2001a, 2001b). Przeciętna średnica dojrzałych granul wynosi 5 mm, choć niektórzy autorzy podają, iż granule mogą wzrastać nawet do 20 mm (Kończak i Miksch, 2009a). Średnica granul jest wynikiem równowagi między wzrostem biomasy a ścieraniem spowodowanym stosunkowo silnymi siłami hydrodynamicznego ścinania w reaktorach, w których kultywuje się granule (Liu i Tay, 2002a). Tlenowe granule, o małych rozmiarach, zbudowane przede wszystkim z żywych mikroorganizmów, są bardziej zwarte 14

17 PRZEGLĄD TEROETYCZNY i skuteczniejsze w oczyszczaniu ścieków. W dużych granulach ze względu na utrudniony transport tlenu i masy do wnętrza, powstają strefy beztlenowe, w których przede wszystkim odnajdywane są martwe komórki oraz polimery zewnątrzkomórkowe (Yang i in., 2004) Struktura granul Zarówno tlenowe, jak i beztlenowe granule charakteryzuje heterogenna budowa, a każda granula składa się z kilku małych agregatów ułożonych radialnie bądź w postaci koncentrycznych warstw. W większych granulach obserwuje się obecność mikrogranul w obrębie jednej, dużej granuli (Tay i in., 2002a; Felipe i in., 2004; McSwain i in., 2005). Warstwowa i heterogenna budowa granuli jest wynikiem ograniczonej dyfuzji substratów i tlenu do wnętrza granuli. Środowisko chemiczne w granuli często zmienia się diametralnie wraz z głębokością. Substancje biogenne występujące w cieczy otaczającej są konsumowane przez mikroorganizmy z warstw zewnętrznych i ich stężenie maleje wraz z głębokością. Z drugiej strony wzrasta stężenie produktów metabolicznych, które akumulowane są we wnętrzu granuli. Zatem, ograniczona dyfuzja wywołuje poziomy bądź odwrotny gradient substancji i generuje zmienność mikroorganizmów w granuli, które dostosowują się do lokalnych warunków. Najlepszym tego przykładem jest ograniczona dyfuzja tlenu (Li i in., 2008a). Tlen konsumowany jest szybko w powierzchniowych warstwach granuli (do 100 µm głębokości) przez mikroorganizmy wykazujące tlenowy metabolizm i utleniające azot amonowy do azotynów. Natomiast w głębszych warstwach powstają warunki odpowiednie do rozwoju, mikroorganizmów utleniających azotyny do azotanów (De Beer i in., 1994; Ahn i in., 2002). I ostatecznie w centrum granuli, gdzie dyfuzja tlenu jest ograniczona, azotany redukowane są do wolnego azotu (tab. 1.1). Agregaty bakterii utleniających azot amonowy są wydłużone radialnie, co związane jest z krokową dyfuzją tlenu do wnętrza granuli, a także z odwrotnym gradientem azotu amonowego uwalnianego z głębokich warstw utworzonych z martwych komórek. Radialne wydłużanie agregatów jest też strategią przeżyciową, ponieważ posiadają one wtedy wysoki stosunek powierzchni do wysokości, co znacznie poprawia transfer substratu. 15

18 PRZEGLĄD TEROETYCZNY Tabela 1.1. Charakterystyka poszczególnych warstw granuli (De Beer i in., 1994; Ahn i in., 2002; McSwain i in., 2005; Sheng i in., 2006; Weber i in., 2007; Adav i in. 2010a) Warstwa Warstwa utworzona z agregatów bakterii utleniających azot amonowy Fakultatywne bakterie beztlenowe Obligatoryjne bakterie beztlenowe (Bacterioides sp.) Białka Polisacharydy Centrum utworzone z martwych komórek Średnia odległość warstwy od powierzchni granuli i jej grubość 70 µm (odległość od powierzchni granuli), 20 µm (grubość). Koncentracja wzrasta, aż osiąga maksymalna wartość na głębokości 450 µm i aż do 850 µm utrzymuje stałą wartość. 850 µm (odległość od powierzchni granuli), 150 µm (grubość). Rozproszone w całej objętości granuli. Występują w całej objętości, przy czym największe stężenie polisacharydów występuje tuż przy powierzchni. Głębokość 1000 µm. Grubość zależy od średnicy granuli. Rola w granuli, informacje dodatkowe Najaktywniejsza warstwa, której grubość zależy od ilości tlenu i stopnia jego dyfuzji. Przeprowadzają procesy tlenowego i beztlenowego utleniania zanieczyszczeń. Odpowiedzialne za beztlenowe procesy rozkładu zanieczyszczeń. Są źródłem substancji zapasowych dla mikroorganizmów z głębszych warstw. Stanowią szkielet granuli. Mogą utrudniać dyfuzję substratu w głąb granuli. Dostarczają monomerów do warstw zewnętrznych. 16

19 PRZEGLĄD TEROETYCZNY Grubość warstwy aktywnej w dużej mierze zależy od koncentracji substancji biogennych w cieczy oraz aktywności metabolicznej mikroorganizmów. Kiedy występuje nadmiar substancji odżywczych, penetrują w głąb i warstwa aktywna jest wtedy cieńsza. Natomiast, gdy substancji odżywczych jest mniej, są one szybko zużywane i wtedy warstwa aktywnych mikroorganizmów jest relatywnie grubsza (Li i in., 2008b; Liu i in, 2010a). W każdej granuli wyróżnić możemy dwie strefy: centrum oraz obrzeże. Luźna warstwa zewnętrzna utworzona jest w głównej mierze przez bakterie, orzęski osiadłe i grzyby. Ta część granuli jest najbardziej dynamicznym i aktywnym układem poddanym silnemu oddziaływaniu sił hydrodynamicznych. W granulach o kompaktowej i zwartej strukturze, w powierzchniowych warstwach obserwuje się tylko grzyby i orzęski. Centrum utworzone jest przez gęsto upakowane komórki bakteryjne i polimery zewnątrzkomórkowe (Weber i in., 2007, Sheng i in.,2006). Zarówno w centrum, jak i na powierzchni obserwuje się komórki zamknięte w macierzy utworzonej z EPS. Żywe komórki występujące w powierzchniowych warstwach mają gładką powierzchnię i kolisty kształt, natomiast martwe komórki występujące w centrum charakteryzuje nieregularny kształt (Lemaire i in., 2008) (rys.1.2.). A B Rysunek 1.2. Komórki zamknięte w macierzy EPS. A) Żywe komórki; B) Martwe komórki (Lemaire i in., 2008) W granulach występują też liczne kanały i pory (Zheng i in., 2007). Tworzą one w nich sieć, która uczestniczy w transporcie substratów i metabolitów. Lemaire i in. (2008) podają, iż w dużych granulach występuje duży por, połączony systemem kanalików z warstwami zewnętrznymi (rys. 1.3). Ponadto informują, iż duże granule o zbitej strukturze z czasem rozpadają się i tworzą się z nich nowe granule. Kanały często wypełnione są polimerami zewnątrzkomórkowymi, a transport w nich przypomina transport wód podziemnych, które cyrkulują wolnymi przestrzeniami i porami 17

20 PRZEGLĄD TEROETYCZNY występującymi w glebie. W tym typie kanałów nie występują mikro-agergaty, ze względu na stały przepływ cieczy w kanałach, który uniemożliwia adhezję i powoduje wymywanie cząstek. W sytuacji, gdy kanały nie są wypełnione polimerami zewnątrzkomórkowymi, transport przypomina ruch wód śródlądowych, który nie jest prawie niczym ograniczony. Ten typ kanałów najczęściej ulokowany jest pomiędzy dwoma koli-formistymi agregatami. Zheng i in. (2007) wykazali pozytywną relację pomiędzy aktywnością granul a obecnością porów. Stwierdzili, iż ilość porów maleje wraz ze wzrostem średnicy granul. Najprawdopodobniej jest to wynikiem zablokowania porów przez polimery zewnątrzkomórkowe. Mniejsza ilość wolnych porów wpływa na ograniczony transport substancji biogennych do wnętrza, a to z kolei wpływa na mniejszą aktywność mikroorganizmów tej strefy. Rysunek 1.3. Dystrybucja kanałów i porów w tlenowej granuli. CLSM (ultraskrawek o grubości 300 m) (Fot. Kończak B.) Jak podają Ivanow i in. (2004), grubość warstwy porów koreluje ze średnicą granuli. I tak np. w granuli o średnicy 1200 µm pory i kanały występują aż do głębokości 900 µm. Największa ich koncentracja ma miejsce w obszarze µm od powierzchni granuli. Zaznaczają także, iż w przypadku dużych granul nie obserwuje się penetracji cząstek o średnicy większej niż 0,1 µm do centralnych warstw granuli. Z tego powodu bardzo ważne jest kontrolowanie wzrostu granul osadu, co może odbywać się poprzez stymulację lub hamowanie wydzielania polimerów zewnątrzkomórkowych. 18

21 PRZEGLĄD TEROETYCZNY 1.2. Polimery zewnątrzkomórkowe Polimery zewnątrzkomórkowe - EPS (z ang. Extracellular Polymeric Substances) są to produkty metaboliczne akumulowane na powierzchni komórki, które zawierają różnego rodzaju substancje organiczne, takie jak egzopolisacharydy (PS), egzoproteiny (PN), DNA, kwasy humusowe, kwasy uronowe itd. (Characklis i in., 1989; Wingerder i in., 1999; Sutherland i in., 2001; Tian, 2008; Subramanian i in., 2010, Kończak, 2010b). EPS sprzyjają procesowi żelowania, łączenia się komórek w agregaty i formowania granul. Stanowią one specyficzny rodzaj ochrony dla komórki, mogą też być źródłem łatwo przyswajalnego węgla organicznego w warunkach niedoboru substancji odżywczych (Laspidou i in., 2002). Wydzielanie polimerów zewnątrzkomórkowych jest powszechnie spotykane w przyrodzie i stanowi dla większości mikroorganizmów strategię życiową. I tak na przykład bakterie nazębne intensywnie produkcją polimery zewnątrzkomórkowe i tworzą warstwę biofilmu, która pomaga im przyczepić się do powierzchni zęba, długo na niej utrzymać, a dodatkowo zapewnia im ochronę przed siłami mechanicznymi. Granule są bardzo dynamicznym i aktywnym układem, poddanym silnemu oddziaływaniu sił hydrodynamicznych. Szansę przetrwać mają tylko mikroorganizmy o silnych właściwościach adhezyjnych i mających zdolność wydzielania polimerów zewnątrzkomórkowych, dzięki którym proces adhezji staje się nieodwracalny (McSwain i in., 2005; Wang i in., 2007). W dotychczasowych badaniach udało się ustalić, iż macierz EPS pokrywająca powierzchnię granuli stanowi materiał kohezyjny, do którego przyczepiają się cząstki, komórki bądź małe agregaty komórek, a zarazem pomaga w utrzymywaniu integralności struktur granul. Stwierdzono też, iż polimery zewnątrzkomórkowe tworzą kapsułki, które otaczają i zamykają skupiska komórek w granuli osadu. Mogą one też pokrywać ciała orzęsek, bądź też formować macierz wokół kolonii bakterii. Nadal jednak pozostaje bez odpowiedzi pytanie, jaką rolę odgrywają EPS w mechanizmach formowania granul. Sheng i in. (2006) podają, iż w granuli wyróżnić możemy 2 główne części: złożone i zagęszczone centrum granuli oraz warstwy zewnętrzne. Centrum tworzą liczne, często obumarłe komórki połączone ze sobą warstwą kleju złożonego z EPS (rys. 1.4). 19

22 PRZEGLĄD TEROETYCZNY Rysuenk 1.4. Budowa granuli Natomiast zewnętrzne warstwy utworzone są przez rozproszone i luźno związane za pomocą EPS komórki. Ta część granuli jest najbardziej dynamicznym i aktywnym układem poddanym silnemu oddziaływaniu sił hydrodynamicznych. Warstwową budowę oraz obecność EPS potwierdziły obserwacje mikroskopowe z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego i techniki CLSM (confocal laser scaning microscopy). Tabela 1.2. Podstawowe komponenty polimerów zewnątrzkomórkowych (Bressler, 2008) Komponent Polisacharydy Makromolekuły polimeryczne Monosacharydy Kwasy uronowe Aminocukry Rodzaje wiązań Wiązania glikozydowe Polipeptydy Aminokwasy Wiązania peptydowe DNA Nukleotydy Fosfodiestrowe wiązania Lipidy Kwasy humusowe Gliceryna Seryna Cholina Cukier Kwasy tłuszczowe Fosforany Etanoloamina Fenole Cukry proste Aminokwasy Wiązania estrowe Wiązania C-O-C- Wiązania typu C-C Wiązania peptydowe Struktura Liniowa, rozgałęziona Liniowa Niepolimeryczne substancje wbudowane w polimer Organiczne: O-acetyl, N- acetyl, sukcynyl, pyruvyl Nieorganiczne: siarczany, fosforany Oligosacharydy (glikoproteiny), kwasy tłuszczowe, lipoproteiny Liniowa - Pierścienie boczne Usieciowana

23 PRZEGLĄD TEROETYCZNY EPS są związkami organicznymi, które powstają w wyniku polimeryzacji makromolekuł ułożonych w postaci powtarzających się po sobie jednostek. EPS mogą zawierać ponadto niepolimeryczne substancje jak drobne cząsteczki organiczne lub nieorganiczne, które mogą zmieniać ich konfirmację przestrzenną, a także właściwości fizykochemiczne. Zewnątrzkomórkowe polisacharydy często zawierają wbudowane cząsteczki acetylu, sukcynylu, a także pirogronianu lub inne nieorganiczne substancje, takie jak np. siarczany. Białka związane kowalencyjnie z oligosacharydami tworzą glikoproteiny, natomiast te, które wbudowane mają kwasy tłuszczowe, stanowią lipoproteidy (tab. 1.2) (Bressler, 2008) Egzopolisacharydy Egzopolisachrydy pełnią istotną rolę w procesie adhezji, stąd często określane są też polisacharydami adhezyjnymi. W literaturze odnaleźć można informację, iż największa produkcja egzopolisacharydów ma miejsce podczas pierwszego etapu formowania agregatów i stymulowana jest istniejącymi warunkami stresowymi, np. intensywnym napowietrzaniem, ruchem pożywki, siłami hydrodynamicznymi. W przypadku badań dotyczących formowania biofilmu obserwowano liniową zależność pomiędzy gęstością biofilmu a zawartością egzopolisachrydów w biofilmie. Wykazano jednak, że egzpolisacharydy nie są komponentem niezbędnym, aby powstał biofilm, ale pomagają tworzyć trójwymiarową strukturę (Liu i in., 2001). Podobne informacje podają Fang i in. (2002). Według tych badaczy polisacharydy stanowią główny komponent macierzy EPS, uczestniczą w sieciowaniu i powodują uformowanie trójwymiarowej sieci. Podjęto się też określenia roli zewnątrzkomórkowych polisacharydów w reaktorach z granulowaną biomasą. Chen i in. (2007) i Adav i in. (2008d) w swoich badaniach wykazali, że polisacharydy spełniają rolę lepiszcza i podpory dla kolonii mikroorganizmów zlokalizowanych na powierzchni granuli. Natomiast w głębszych warstwach, gdzie utrudniona jest penetracja substratu i tlenu, znajdują się przede wszystkim białka, które stanowią źródło substancji odżywczych dla mikroorganizmów z tej strefy. Największą rolę w procesie agregacji przypisuje się polisacharydowi o nazwie alginian, który zbudowany jest z naprzemiennie ułożonych grup mannuronowych i glukuronowych. Alginian uczestniczy w procesach żelowania. Wspomaga on sklejanie komórek bakteryjnych ze sobą (Lin i in., 2010). 21

24 PRZEGLĄD TEROETYCZNY Białka Istotną rolę w procesach adhezji odgrywają białka powierzchniowe, czyli cząsteczki hydrofilne, powiązanie oddziaływaniami niekowalencyjnymi z białkami integralnymi zakotwiczonymi w błonie komórkowej. Część białek może znajdować się też całkowicie poza rejonem błony. I dopiero połączone z łańcuchami sacharydowymi (glikoproteiny) oraz kwasami tłuszczowymi czy długo łańcuchowymi alkoholami, mogą zakotwiczać się w obrębie błony. Ich obecność inicjuje pierwszy etap adhezji. Początkowo akumulowane są na powierzchni komórek, a następnie, gdy uwolnione zostaną do roztworu, mogą być adsorbowane na powierzchniach komórek sąsiadujących. W kolejnych etapach, gdy czas kontaktu pomiędzy powierzchniami komórek wydłuża się, zintensyfikowana produkcja białek prowadzi do ustabilizowania nowo powstałych bioagregatów. Białka powierzchniowe modyfikują oddziaływania elektrostatyczne, a zwłaszcza siły van der Waalsa oraz oddziaływania hydrofobowe. Ponadto posiadają zdolność wiązania cząsteczek wody, dzięki czemu może nastąpić dehydratacja powierzchni i w rezultacie adhezja staje się znacznie ułatwiona (Czaczyk A., 2004). Szczególną rolę w formowaniu bioagregatów odgrywają adhezyny. Większość z nich stanowią białkowe adhezyny występujące w postaci białek fibrylarnych, takich jak fimbrie czy fibryle. Zdolność do tworzenia nici i fibryli, czyli właściwości filamentacyjne oraz lepkość tych polimerów znacznie ułatwiają bakteriom adhezje do powierzchni lub sklejanie komórek ze sobą. Bakterie używają też czasem specjalnych ligand, czyli jonów nieorganicznych (np. H 2 O, NH 3, Cl - ) lub grup wywodzących się ze związków organicznych (np. aminy, fenole, etery, alkohole), lub ze związków nieorganicznych, które oddziałują z receptorami zlokalizowanymi na komórce gospodarza, powodując zmiany strukturalne i elektronowe w receptorze oraz ligandzie, umożliwiając w ten sposób adhezję (Crusz, 2009). Lektyny oraz glikoproteiny są bardzo dobrym przykładem tego typu adhezyn produkowanych przez bakterie (Fleischer i Przondno-Mordarska, 1998). Co ciekawe lektyny najczęściej zlokalizowane są na końcach fimbrii lub pili, co świadczy o ich specjalnej roli w procesach adhezji (Bressler, 2008). Dotychczas nie poznano jeszcze natury fizykochemicznej adhezyn tj. ich hydrofobowości, stabilności w rożnych warunkach ph i temperatury, czy mechanizmu wiązania z kationami. Celowe wydaje się podejmowanie tego typu badań, zwłaszcza gdy rozważamy rolę adhezyn w procesach formowania biofilmu czy granulowanego osadu. 22

25 PRZEGLĄD TEROETYCZNY Ektoenzymy Zewnątrzkomórkowe enzymy odgrywają istotną rolę w procesach biologicznych, dlatego pomiar ich aktywności może być alternatywną metodą do oceny mikrobiologicznej aktywności (Lee i in., 2009). Najważniejsze są enzymy hydrolityczne (tj. proteazy, glikozydazy, lipazy i fosfatazy). Hydroliza jest to pierwszy krok w biodegradacji wielkocząsteczkowych związków, dzięki której powstają oligomery i monomery, które mogą być przetransportowane do wnętrza komórki, gdzie zachodzą dalsze przemiany. Zewnątrzkomórkowe enzymy, wskutek degradacji komponentów macierzy międzykomórkowej, zwiększają objętość porów i kanałów, które łączą wewnętrzną strukturę granul z jej powierzchnią, ułatwiając tym samym transport masy i tlenu (ograniczenie beztlenowej warstwy) (Martinez i in., 2004). Zewnątrzkomórkowe białka, w tym enzymy, mogą również wpływać na Quorum Sensing (przekazywanie sygnałów) w biostrukturach (Crusz, 2009). Wpływ macierzy EPS na aktywność zewnątrzkomórkowych enzymów nie jest jasny. Niektórzy z naukowców uważają, że EPS mogą utrudniać dostęp substratów do enzymów, zaś inni, że zapobiegają wypłukaniu enzymów, zwiększając w ten sposób aktywność warstw powierzchniowych (Burgess i Pletschke, 2008). Podczas badań granulowanego osadu skupiono się tylko na pomiarze zmian aktywności enzymów proteolitycznych i amylolitycznych w czasie przechowywania granul. Badania te przyniosły ciekawą odpowiedź, na temat tego, który z komponentów granul jest konsumowany, w czasie przechowywania. Niektórzy badacze na tej podstawie stwierdzili, iż polisacharydy są materiałem strukturalnym, natomiast białka stanowią rezerwuar węgla i energii (Bae i in. 1995; Ng, 2002; Zeng i in., 2007; Wang i in., 2007; Wang i in., 2008). Tymczasem wykorzystanie wiedzy zaczerpniętej z badań medycznych i wykorzystanie jej podczas analizy procesu granulacji, może także dać odpowiedź, czy produkowane zewnątrzkomórkowe enzymy hydrolityczne są wykorzystywane w celu inicjacji kohezji mikroorganizmów i tworzenia granul. Podczas inwazji komórek bakteryjnych w organizmie ludzkim, produkują one nie tylko znaczne ilości macierzy zewnątrzkomórkowej, która pozwala im się przylepić i utrzymać na tkankach gospodarza, ale też enzymy hydrolityczne, dzięki którym trawią tkanki, odsłaniają miejsca receptorowe, tym samym umożliwiając adhezję komórek. Szczególną rolę w tych procesach odgrywają enzymy z grupy proteaz, zwłaszcza metaloproteinazy (Lipka i in., 2010). 23

26 PRZEGLĄD TEROETYCZNY edna Po raz pierwszy DNA wykryto i zaliczono do sub-komponentów EPS w kulturach bakterii Pseudomonas aeruginosa. Kwasy nukleinowe występujące jako polimery zewnątrzkomórkowe nazwano zewnątrzkomórkowym DNA, w skrócie edna (extracellular DNA). Z najnowszych doniesień literaturowych wynika, iż edna produkowane jest w czasie wzrostu bakterii, nie udało się jednak do tej pory ustalić drogi sekrecji edna. Podaje się następujące trzy możliwe drogi sekrecji: aktywnie wydzielane, pasywnie uwalniane na skutek wzrostu przepuszczalności błon, liza komórek. Jak do tej pory nie udało się ustalić skutecznej i mało inwazyjnej metody ekstrakcji polimerów zewnątrzkomórkowych. Zwykle stosuje się fizyczne metody ekstrakcji (ultradźwięki, wirowanie) lub chemiczne (żywica kationo-wymienna DOWEX, czy związek kompleksujący EDTA) (Pan i in., 2010). Krótkie wirowanie, przy wysokich obrotach, nie powoduje lizy komórek, jednak metoda ta pozwala na wyekstrahowanie jedynie rozpuszczalnych lub słabo związanych z komórką polimerów zewnątrzkomórkowych. Natomiast metody takie jak ekstrakcja za pomocą EDTA, żywicy Dowex czy ultradźwięków, pozwala na oderwanie EPS silnie związanych z komórką, dzięki czemu analiza tych związków staje się pełniejsza. Metody te jednak, w przypadku gdy źle dobierze się dawkę ekstrahenta lub zbytnio wydłuży czas ekstrakcji, mogą powodować lizę komórek i uwolnienie DNA komórkowego. W literaturze rzadko więc odnajdujemy informację na temat roli DNA zewnątrzkomórkowego, podając, iż jego obecność wynika tylko i wyłącznie z lizy komórek podczas procesu ekstrakcji (McSwain i in., 2005). Połączenie badań fizykochemicznych z mikrobiologicznymi przyniosło jednak potwierdzenie teorii o produkowaniu przez mikroorganizmy edna. Stwierdzono bowiem, iż w kulturach bakterii Bacillus subtilis wzrastających w postaci biofilmu, edna wydzielane jest głównie podczas końcowej fazy adaptacyjnej i podczas fazy logarytmicznego wzrostu, natomiast nigdy podczas fazy równowagi, co sugeruje, iż edna nie pochodzi z lizy komórek. Obserwacje mikroskopowe z użyciem barwników fluorescencyjnych typu LIVE/DEAD wykazały, że w biofilmie występują przede wszystkim żywe komórki, co również sugeruje, iż edna jest materiałem zewnątrzkomórkowym (Whitchurch i in., 2002; Steinberger i Holden, 2005; Vilain i in., 2009). Zewnątrzkomórkowe DNA niezbędnym składnikiem warunkującym integralność biofilmów. Vilain i in. (2009) podają, iż kultury Bacillus cereus wzrastają na szkle w postaci biofilmów, a większość komórek bakteryjnych wydaje się być zamknięta w kapsułce 24

27 PRZEGLĄD TEROETYCZNY zawierającej edna. Stwierdzili także, iż produkcją edna zależy od obecności genów syntetyzujących puryny. Należy podejmować się badań mających na celu określenia roli edna w granulach Dystrybucja polimerów zewnątrzkomórkowych w granulach EPS usytuowane są na zewnątrz ściany komórkowej arecheonów (pseudomureina), prokariontów oraz eukariontów. Struktury, które zawierają EPS, to przede wszystkim kapsułki otaczające pojedyncze komórki (tzw. polimery kapsularne) oraz śluzowe otoczki (Xu i in., 2010). Kapsułki są silnie związane z powierzchnią komórek poprzez kowalencyjne interakcje i prezentują oddzielone struktury z wyraźnie zarysowanym brzegiem (rys. 1.2). Natomiast amorficzne, śluzowe otoczki są luźno połączone z powierzchnią komórki poprzez wiązania niekowalencyjne. Czasami warstwa śluzu wypełnia też przestrzeń między komórkami. Co ciekawe stwierdzono, iż śluzowa otoczka powstaje tyko w obecności kapsularnych EPS. Zatem obie struktury EPS są ważne i niezbędne w formowaniu każdej z osobna. Wiarygodne wizualizowanie dystrybucji i struktury EPS za pomocą konwencjonalnego mikroskopu świetlnego jest praktycznie niemożliwe. Rozwiązanie tego problemu przyniosło zastosowanie technik mikroskopii elektronowej. Skaningowa mikroskopia elektronowa pozwala na wizualizację materiału fibrylnego leżącego pomiędzy komórkami i daje obraz na temat wymiarów macierzy EPS wokół komórki. Wydaje się, iż fibryle, które stanowią agregaty koloidalne z wysoko molekularnych EPS (w których dominują przede wszystkim polisacharydy i białka) reprezentują dominujący fizyczny mechanizm wiążący komórki z komponentami nieorganicznymi wstępującymi w biofilmie. Włókna utworzone z EPS prezentują różnorodność kształtów, deseni, które uwidaczniają się podczas obserwacji za pomocą mikroskopu elektronowego, a wynikają z różnorodnej chemicznej kompozycji EPS (Karcz, 2007; Woźnica i in., 2010; Adav i in., 2010b). Najnowsze badania z wykorzystaniem mikroskopu konfokalnego w połączeniu z barwieniem fluorescencyjnym pozwoliły na określenie trojwymiarowej struktury EPS w pełni uwodnionych próbkach i w nienaruszonym biofilmie. Zastosowanie mikroskopii konfokalnej w badaniach EPS zmieniła dotychczasowy pogląd na temat homogennej struktury EPS. Badania te pokazały, iż bakterie w biofilmie wzrastają jak odległe od siebie mikrokolonie zanurzone w macierzy EPS, które oddzielone są od siebie za pomocą mniej 25

28 PRZEGLĄD TEROETYCZNY gęstych regionów biofilmu, które zawierają kanały wodne i pory. Użycie fluorescencyjnych znaczników takich jak: Fluoresceina (FITC) służy do wybarwiania wszystkich białek i aminocukrów; Konkanawalina A (cona) służy do wybarwiania α-mannopiranozy i α-glukopiranozy ( -polisacharydy); Biały kalkofluor (z ang. Calcofluor White (CW) lub Fluorescente Brightener) wybarwia β-polisachrydy; Grupa barwników SYTO wybarwianie kwasów nukleinowych oraz znakowanie żywych i martwych komórek, dzięki wykorzystaniu różnicy w przepuszczalności błon komórkowych; najczęściej stosuje się SYTO 63 (komórki żywe i martwe) i SYTO Blue (komórki martwe); Czerwień Nilu (z ang. Nile Red) wybarwianie lipidów; Calcium Green, Magensium Green wizualizacja dystrybucji kationów wapnia i magnezu, pozwoliło na określenie przestrzennej dystrybucji różnych komponentów EPS w naturalnych środowiskach i potwierdziło heterogenną strukturę biofilmu (Hoch i in., 2005; Rao i in., 2007; Adav i in., 2010a) Rola polimerów zewnątrzkomórkowych w granulach osadu Od kiedy główną rolę w procesie bioflokulacji i tworzenia się biofilmów przypisuje się polimerom zewnątrzkomórkowym, pojawiły się sugestie, iż mogą one mieć także duże znaczenie w powstawaniu granulowanego osadu czynnego (McSwain i in., 2005). Macierz EPS pełni ochronną rolę dla komórek, które są w niej zanurzone. Utrata EPS w środowisku naturalnym prowadzi do uszkodzenia komórek i utraty żywotności. Ponadto pełnią one ważną rolę w budowaniu szkieletu i zapewnieniu integralności struktury bakteryjnych agregatów. Jak do tej pory fakt produkcji EPS przez mikroorganizmy tworzące biofilm był przez naukowców pomijany. Wynikało to przede wszystkim ze zmian behawioralnych mikroorganizmów hodowanych in vitro. W warunkach in vitro czyste kultury, wzrastające na sztucznych podłożach, nie wykazywały zdolności do produkcji strukturalnych EPS, a często nawet traciły tą zdolność. Produkcja EPS wymaga nakładu energii, dlatego też w warunkach laboratoryjnych, gdy mikroorganizmy nie muszą 26

29 PRZEGLĄD TEROETYCZNY konkurować o miejsce do życia, ani walczyć o przetrwanie populacji, produkcja EPS jest nieopłacalna (Adav i in., 2010b). Zupełnie innej wygląda to w przypadku egzopolimerów bakteryjnych produkowanych przez różnorodne populacje i wydzielane do tego samego środowiska zewnętrznego. Dzięki otoczce utworzonej z EPS mogą koegzystować koło siebie różne typy mikroorganizmów, nawet, gdy jedne z nich produkują substancje toksyczne dla pozostałych (Adav i Lee, 2008b; Adav i in., 2008c). I tak na przykład w środowisku naturalnym kolonie bakterii Acinetobacter I8 uniemożliwiają rozwój bakterii Bacillus sphaericus I5. Jednakże w biofilmach obserwuje się wzrost tychże populacji w niewielkiej odległości od siebie. Jest to możliwe dzięki produkcji EPS, które tworzą ochronną przestrzeń dla każdej kolonii mikroorganizmów i efektywnie adsorbują substancje toksyczne (Adav i in., 2010b). W granulach osadu, które są specyficzną odmianą biofilmu formującego się bez nośnika lub, jak podają niektórzy, owym nośnikiem są ciała orzęsków występujące w osadzie czynnym, EPS pełnią szczególną rolę. Dzięki obecności macierzy pozakomórkowej, granule osadu czynnego, które poddawane są bezustannie działaniu sił hydrodynamicznych, mogą utrzymać swoją integralność, a jednocześnie macierz EPS, wypełniająca przestrzenie między komórkami, ułatwia transport masy do wnętrza granuli i umożliwia symultaniczne oczyszczanie ścieków z różnego rodzaju zanieczyszczeń (Li i in., 2008b; Kończak i in., 2011a). W chwili obecnej brak jest jednak dokładnych informacji o znaczeniu EPS w mechanizmach formowania granul. W literaturze trwa też dyskusja, czy mikroorganizmy mogą używać EPS jak źródło węgla (Sutherland, 1999; Li i in., 2008a; Li i in., 2008c). Sutherland (1999) podaje, że mikroorganizmy nie degradują substancji, które same wyprodukowały. Matrix uformowane przez polisacharydy jest relatywnie stałe, zmienna może być tylko frakcja białek. Wang i in. (2006a) sugerują, że mikroorganizmy powinny regulować ilość EPS, a zwłaszcza ilość białek, aby zachowana była równowaga pomiędzy siłami przyciągania i odpychania pomiędzy molekułami. Jak podaje Alleoni (2006) wytrzymałość fizyczna biofilmu zależy od równowagi pomiędzy siłami odpychania i przyciągania. Kiedy siła przyciągania dominuje, formuje się sieć trójwymiarowa. I odwrotnie, wzrost siły odpychania powodować będzie rozluźnianie struktury. Poznanie dokładnej roli EPS w mechanizmach formowania granul i ich znaczenia dla mikroorganizmów granulowanego osadu wydaje się być istotne ze względu na możliwość opracowania strategii sterowania procesem biogranulacji (Hang i in., 2007; Li i in., 2007). 27

30 PRZEGLĄD TEROETYCZNY 1.6. Czynniki wpływające na formowanie granul Badania, dotyczące procesu formowania granulowanego osadu i efektywności oczyszczania ścieków przez tlenowe granule, prowadzone są przez ośrodki badawcze w Chinach, Korei, Japonii, Singapurze (Qin i in., 2004; Wang i in., 2004; Linlin i in., 2005; Li i in., 2006), Holandii i Hiszpanii (Morgenroth i in.,1997; Beun i in., 2002; Arrojo i in., 2004), a także w Polsce (Cydzik-Kwiatkowska i in., 2008, Kończak i Miksch, 2011c). Z badań tych wynika, iż na formowanie granul i ich morfologię wpływ ma kompozycja pożywki oraz warunki stresowe w reaktorze, wywołane intensywnym napowietrzaniem oraz odpowiednio długim okresem, w którym mikroorganizmy pozbawione są substratu. Poniżej scharakteryzowano najważniejsze czynniki wpływające na formowanie granul Warunki uczta-głód Mikroorganizmy granulowanego osadu do wzrostu w postaci agregatów potrzebują cyklicznie następujących po sobie faz: fazy uczty, w czasie której substrat jest dostępny dla mikroorganizmów i fazy głodu, w czasie której substrat jest nieobecny w cieczy otaczającej. W sytuacji, gdy substrat konsumowany jest bardzo szybko i przez pozostały okres napowietrzania jest nieobecny w cieczy, przetrwać mają szansę tylko te mikroorganizmy, które mają zdolność wiązania substratu w formie PHB (kwas polihydroksybutanowy) i akumulowania go wewnątrz komórek. Mikroorganizmy te zużywają PHB w czasie fazy głodu i następuje przyrost biomasy. Dodatkowo posiadają zdolność łączenia się w agregaty. Natomiast mikroorganizmy, które nie akumulują polimerów mogą wzrastać tylko w fazie uczty, co w konsekwencji sprawia, iż szybko zostają wypłukane z układu, a w systemie zaczynają dominować mikroorganizmy formujące agregaty. Różnice w szybkości wzrostu mikroorganizmów tłumaczy teoria kinetycznej selekcji opracowana przez Chudoba i Pujol, (1994) i opierająca się na równaniu Monod a. Równanie to definiuje wzrost mikroorganizmów i uwzględnia to, iż różne mikroorganizmy mają odmienne stałe saturacji, w związku z tym zależność pomiędzy właściwą szybkością wzrostu a stężeniem substratu także jest odmienna dla różnych mikroorganizmów. Rysunek 1.5. przedstawia teorię kinetycznej selekcji w odniesieniu dla mikroorganizmów nitkowatych oraz flokujących i tworzących granule. 28