(62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB03/004502

Transkrypt

1 PL B1 RZECZPOSPOLITA POLSKA (12) OPIS PATENTOWY (19) PL (11) (21) Numer zgłoszenia: (13) B1 Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie: (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego: , PCT/IB03/ (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego: , WO04/ (51) Int.Cl. A61K 39/395 ( ) A61K 9/19 ( ) (54) Preparat zawierający ludzkie przeciwciała do leczenia zaburzeń związanych z TNF- (30) Pierwszeństwo: , US, 10/222,140 (73) Uprawniony z patentu: ABBVIE BIOTECHNOLOGY LTD., Hamilton, BM (43) Zgłoszenie ogłoszono: BUP 24/05 (45) O udzieleniu patentu ogłoszono: WUP 01/15 (72) Twórca(y) wynalazku: HANS-JÜERGEN KRAUSE, Worms, DE LISA BAUST, Mannheim, DE MICHAEL DICKES, Rödersheim-Gronau, DE (74) Pełnomocnik: rzecz. pat. Wojciech Tykarski

2 2 PL B1 Opis wynalazku Stan techniki Czynnik martwicy nowotworu (TNF ) jest cytokiną wytwarzaną przez liczne typy komórek, w tym monocyty i makrofagi, którą pierwotnie wykryto na podstawie jej zdolności indukowania matrwicy pewnych nowotworów u myszy (patrz np. Old, L. (1985) Science 230: ). Następnie wykazano, że czynnik nazywany kachektyną, związany z kacheksją, ma cząsteczkę identyczną jak TNF. TNF pośredniczy we wstrząsie (patrz np. Beutler, B. i Cerami, A. (1988) Annu. Rev. Biochem. 57: ; Beutler, B. i Cerami, A. (1989) Annu. Rev. Immunol. 7: ). Ponadto, TNF bierze udział w patofizjologii różnorodnych innych chorób i zaburzeń u człowieka, w tym posocznicy, zakażenia, chorób autoimmunizacyjnych, odrzucania przeszczepu i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (patrz np. Moeller, A., i in. (1990) Cytokine 2: ; opis patentowy US nr , Moeller i in.; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Moeller, A., i in. Yasilli, P. (1992) Annu. Rev. Immunol. 10: ; Tracey, KJ. i Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: ). Ze względu na szkodliwe działanie ludzkiego TNF (htnf ) w różnorodnych zaburzeniach u człowieka, ułożono strategie terapeutyczne do hamowania lub przeciwdziałania aktywności htnf. W szczególności, poszukuje się przeciwciał wiążących się z i neutralizujących htnf jako środka do hamowania aktywności htnf. Niektórymi z najwcześniejszych takich przeciwciał były mysie przeciwciała monoklonalne (mab), wydzielane przez hybrydoma wytworzone z limfocytów myszy immunizowanych htnf (patrz np. Hahn T; i in., (1985) Proc Natl Acad Sci. USA 82: ; Liang, C-M., i in. (1986) Biochem. Biophys. Res. Commun. 137: ; Hirai, M., i in. (1987) J. Immunol. Methods 96:57-62; Fendly, B.M., i in. (1987) Hybridoma 6: ; Moeller, A., i in. (1990) Cytokine 2: ; opis patentowy US nr , Moeller i in.; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Wallach, D.; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr A1, Old i in.; publikacja europejskiego opisu patentowego nr B1, Moeller, A., i in.). Podczas gdy te mysie przeciwciała anty-htnf często przejawiały wysokie powinowactwo do htnf (np. K d < 10-9 M) i były zdolne neutralizować aktywność htnf, ich zastosowanie in vivo może być ograniczone przez problemy związane z podawaniem mysich przeciwciał ludziom, takie jak krótki okres półtrwania w osoczu, niezdolność do wywołania pewnych funkcji efektorowych u ludzi i wywoływanie niepożądanej odpowiedzi immunologicznej przeciwko mysim przeciwciałom u ludzi (odpowiedź ludzkich przeciwciał antymysich" (HAMA)). Próbując pokonać trudności związane z zastosowaniem całkowicie mysich przeciwciał u ludzi, metodą inżynierii genetycznej otrzymano bardziej podobne do ludzkich" mysie przeciwciała anty- -htnf. Przykładowo, wytworzono chimeryczne przeciwciała, w których części zmienne łańcuchów przeciwciał są pochodzenia mysiego, a części stałe łańcuchów przeciwciał są pochodzenia ludzkiego, (Knight, D.M, i in. (1993) Mol Immunol. 30: ; publikacja PCT nr WO 92/16553, Daddona, P.E., i in.). Ponadto, wytworzono także przeciwciała humanizowane, w których domeny hiperzmienne części zmiennych przeciwciał są pochodzenia mysiego, a reszta części zmiennych i stałych przeciwciał jest pochodzenia ludzkiego (publikacja PCT nr WO 92/11383, Adair, J.R., i in.). Jednakże, ponieważ te chimeryczne i humanizowane przeciwciała wciąż zawierają pewne sekwencje mysie, mogą nadal wywoływać niepożądaną odpowiedź immunologiczną, odpowiedź przeciw chimerycznym przeciwciałom (HACA) u człowieka, szczególnie podawanym przez dłuższy okres czasu, np. w wyniku wskazań ze względu na stany przewlekłe, takie jak reumatoidalne zapalenie stawów (patrz np. Elliott, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ; Elliot, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ). Korzystniejszym niż mysie mab lub ich pochodne (np. przeciwciała chimeryczne lub humanizowane) środkiem hamującym htnf byłoby całkowicie ludzkie przeciwciało przeciw htnf, ponieważ taki środek nie powinien wywoływać odpowiedzi HAMA, nawet w przypadku długotrwałego stosowania. Przy zastosowaniu technik ludzkiej hybrydomy wytworzono ludzkie przeciwciała monoklonalne przeciw htnf (Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152: ; Boyle, P., i in. (1993) Cell. Immunol. 152: ; publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr A2, Boyle, i in.). Jednakże, według doniesień, autoprzeciwciała monoklonalne pochodzące z hybrydomy mają zbyt małe powinowactwo do htnf, aby je obliczyć typowymi sposobami, nie były w stanie wiązać rozpuszczalnego htnf ani znieść cytotoksyczności wywołanej przez htnf (patrz Boyle, i in.; powyżej). Ponadto, powodzenie technik z zastosowaniem ludzkich hybrydom zależy od naturalnej obecności u człowieka limfocytów krwi obwodowej wytwarzających autoprzeciwciała swoiste dla htnf. W niektórych badaniach wykryto u człowieka autoprzeciwciała osocza przeciw htnf (Fomsgaard, A., i in. (1989)

3 PL B1 3 Scand. J. Immunol. 30: ; Bendtzen, K., i in. (1990) Prog. Leukocyte Biol 10B: ), podczas gdy w innych badaniach - nie (Leusch, H-G., i in. (1991) J. Immunol. Methods 13 9: ). Alternatywą naturalnie występujących ludzkich przeciwciał przeciw htnf byłoby rekombinowane przeciwciało htnf. Dotychczas opisano rekombinowane ludzkie przeciwciała wiążące htnf o względnie słabym powinowactwie (tj., K d ~ 10-7 M) i dużej stałej dysocjacji (tj., K off ~10-2 s -1 ) (Griffiths, A.D., i in. (1993) EMBO J. 12: ). Jednakże, ze względu na ich względnie szybką kinetykę dysocjacji, przeciwciała te mogą być nieodpowiednie do stosowania terapeutycznego. Ponadto, opisano rekombinowane ludzkie przeciwciało przeciw htnf, które nie neutralizuje aktywności htnf, a raczej zwiększa wiązanie htnf z powierzchnią komórek i zwiększa internalizację htnf (Lidbury, A., i in. (1994) Biotechnol Ther. 5:27-45; publikacja PCT nr WO 92/03145, Aston, R. i in.) Opisano również rekombinowane ludzkie przeciwciała wiążące rozpuszczalne htnf o dużym powinowactwie i powolnej kinetyce dysocjacji, mogące neutralizować aktywność htnf, w tym powodować zniesienie cytotoksyczności wywołanej przez htnf (in vitro i in vivo) oraz aktywacji komórek wywołanej przez htnf, (patrz opis patentowy US nr ). Istota wynalazku Istnieje zapotrzebowanie na trwały preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego o długim dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierający przeciwciało nadające się do zastosowania terapeutycznego w celu hamowania lub przeciwdziałania szkodliwej aktywności htnf. Istnieje także zapotrzebowanie na trwały preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego o długim dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierający przeciwciało nadające się do zastosowania terapeutycznego, łatwe do podawania i zawierające wysokie stężenie białka. Przedmiotem wynalazku jest płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawierający przeciwciało w ilości skutecznej terapeutycznie w buforowanym roztworze, co tworzy preparat o ph pomiędzy około 4 i około 8 i o dopuszczalnym okresie przechowywania wynoszącym co najmniej 18 miesięcy. Wynalazek także dotyczy preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego przeciwciało w ilości skutecznej terapeutycznie w buforowanym roztworze, co tworzy preparat w stanie ciekłym o ph pomiędzy około 4 i 8 i o dopuszczalnym okresie przechowywania wynoszącym co najmniej 18 miesięcy. W jednej postaci, preparat farmaceutyczny ma zwiększoną trwałość. W kolejnej postaci, trwałość preparatu według wynalazku pozwala na co najmniej 3 cykle zamrażanie/rozmrażanie preparatu. W innej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko TNF. W jeszcze innej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko ludzkiemu TNF. W jeszcze innej postaci, przeciwciałem jest D2E7. Wynalazek ten dotyczy także płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego przeciwciało w ilości skutecznej terapeutycznie w buforowanym roztworze, co tworzy preparat o ph pomiędzy 4 i 8 i o zwiększonej trwałości wynoszącej co najmniej 12 miesięcy w temperaturze 2-8 C. W jednej postaci, preparat ma zwiększoną trwałość wynoszącą co najmniej 18 miesięcy. W innej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko TNF. W jeszcze innej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko ludzkiemu TNF. W kolejnej postaci, przeciwciałem jest D2E7. Wynalazek dotyczy także płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego przeciwciało w ilości skutecznej terapeutycznie w buforowanym roztworze, co daje preparat o ph pomiędzy około 4 i około 8, który łatwo się podaje. W jednej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko TNF. W jeszcze innej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko ludzkiemu TNF. W kolejnej postaci, przeciwciałem jest D2E7. W jednej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego jest odpowiedni do wstrzykiwania. W kolejnej postaci, preparat jest odpowiedni do jednorazowego zastrzyku podskórnego. W innej postaci, stężenie przeciwciał w płynnym preparacie farmaceutycznym w postaci roztworu wodnego wynosi około mg/ml. W jeszcze innej postaci, stężenie przeciwciał w preparacie wynosi około 50 mg/ml. W jeszcze innej postaci, preparat zawiera białko w wysokim stężeniu. W jeszcze innej postaci wynalazku, preparat nie jest wrażliwy na światło. W jednej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, przy czym obie z nich określono za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. W innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej. W kolejnej

4 4 PL B1 postaci, preparat zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniej. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro przy IC 50 wynoszącym 1 x 10-8 M lub mniej. W jeszcze innej postaci wynalazku, opisywany preparat zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro przy IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej. Inna postać wynalazku, obejmuje preparat, w którym przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro przy IC 50 wynoszącym 1 x M lub mniej. W innej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które jest rekombinowanym przeciwciałem, lub jego częścią wiążącą antygen. W innej postaci, preparat zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które hamuje ekspresję ELAM-1 na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej wywołaną ludzkim TNF. W jeszcze innej postaci, opisywany preparat zawiera przeciwciało D2E7. W innej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, co określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego; b) ma domenę CDR3 łańcucha lekkiego zawierającą sekwencję aminokwasową SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9; c) ma domenę CDR3 ciężkiego łańcucha zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedno do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. W innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej. W jeszcze innej postaci wynalazku, preparat zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniej. W jeszcze innej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego, zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które ma region zmienny lekkiego łańcucha (LCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8, oraz region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11. W kolejnej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, w którym LCVR przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, dodatkowo ma domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 5, a HCVR przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, dodatkowo ma domenę CDR2 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 6. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, w którym LCVR przeciwciała, lub jego części wiążącej antygen, dodatkowo ma domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 7, a HCVR ma domenę CDR1 zawierającą sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 8. W jeszcze innej postaci wynalazku, przeciwciało lub jego część wiążąca antygen, zawarte w płynnym preparacie farmaceutycznym w postaci roztworu wodnego ma region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 1, a region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) zawierający sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 2. W innej postaci, przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, ma region stały łańcucha ciężkiego IgG1. W jeszcze innej postaci, przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, ma region stały łańcucha ciężkiego IgG4. W innej postaci, przeciwciałem, lub jego częścią wiążącą antygen, jest fragment Fab. W jeszcze innej postaci, przeciwciałem, lub jego częścią wiążącą antygen, jest fragment Fv o pojedynczym łańcuchu. W jednej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego, zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które ma region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasów wybraną z grupy obej-

5 PL B1 5 mującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34. W jeszcze innej postaci, przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, neutralizuje aktywność ludzkiego TNF, TNF szympansa i TNF co najmniej jednej dodatkowej małpy naczelnej wybranej z grupy obejmującej TNF pawiana, TNF marmozety, TNF małpy cynomolgus i TNF rezusa. W kolejnej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które także neutralizuje aktywność mysiego TNF. Preparat według wynalazku zawiera także przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które neutralizuje aktywność TNF świni. W kolejnej postaci, przedmiotem wynalazku jest płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawierający przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, wiążące ludzki TNF i składające się z: domeny CDR3 łańcucha lekkiego zawierającej sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 3, lub SEQ ID NO: 3 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 1, 4, 5, 7 lub 8 lub przez jedną do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 1, 3, 4, 6, 7, 8 i/lub 9, oraz domeny CDR3 łańcucha ciężkiego zawierającej sekwencję aminokwasów SEQ ID NO: 4, lub SEQ ID NO: 4 zmodyfikowaną przez pojedynczą substytucję alaniny w pozycji 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10 lub 11 lub przez jedną do pięciu konserwatywnych substytucji aminokwasowych w pozycjach 2, 3, 4, 5, 6, 8, 9, 10, 11 i/lub 12. W jednej postaci, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawiera przeciwciało wiążące ludzki TNF i zawierające region zmienny łańcucha lekkiego (LCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 11, SEQ ID NO: 12, SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26 lub region zmienny łańcucha ciężkiego (HCVR) z domeną CDR3 zawierającą sekwencję aminokwasową wybraną z grupy obejmującej SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28, SEQ ID NO: 29, SEQ ID NO: 30, SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, SEQ ID NO: 33 i SEQ ID NO: 34. W kolejnej postaci wynalazku, przeciwciałem, lub jego częścią wiążącą antygen, wiążącym ludzki TNF jest przeciwciało D2E7 lub jego część wiążąca antygen. Wynalazek dotyczy także kompozycji farmaceutycznej w postaci roztworu wodnego zawierającej poliol, środek powierzchniowo czynny i układ buforujący zawierający cytrynian i/lub fosforan o ph około 4 do 8, w ilościach wystarczających do wytworzenia przeciwciał do zastosowania terapeutycznego w stężeniu powyżej około 45 mg/ml. W jednej postaci, poliolem jest mannitol, a środkiem powierzchniowo czynnym jest polysorbate 80. W innej postaci, kompozycja zawiera 5-20 mg/ml mannitolu i 0,1-10 mg/ml polysorbate 80. W kolejnej postaci, kompozycja zawiera przeciwciało D2E7. Wynalazek dotyczy także płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego składającego się z mg/ml przeciwciała, 5-20 mg/ml mannitolu, 0,1-10 mg/ml Tween-80 i układu buforującego zawierającego cytrynian i/lub fosforan, o ph 4 do 8. W jednej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko htnf. W innej postaci, preparat zawiera około 40 mg przeciwciał. Ponadto, wynalazek dotyczy płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego około 50 mg/ml przeciwciała, około 12 mg/ml mannitolu, około 1 mg/ml Tween-80 i układ buforujący zawierający cytrynian i/lub fosforan, o ph około 4 do około 8. W jednej postaci, ph preparatu wynosi pomiędzy około 4,5 a około 6,0. W innej postaci, ph wynosi pomiędzy około 4,8 a około 5,5. W jeszcze innej postaci, ph preparatu według wynalazku wynosi pomiędzy około 5, 0 a około 5,2. W jednej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego zawiera także około 1,305 mg/ml kwasu cytrynowego, około 0,305 mg/ml cytrynianu sodu, około 1,53 mg/ml dihydratu fosforanu disodu, około 0,86 mg/ml dihydratu diwodorofosforanu sodu i około 6,165 mg/ml chlorku sodu. W innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało skierowane przeciwko htnf. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało D2E7. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku podaje się osobnikowi cierpiącemu na zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa, w celu hamowania aktywności TNF. Szczegółowy opis wynalazku Wynalazek ten dotyczy płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego o ph około 4 do około 8 zawierającego białko w dużym stężeniu, zawierającego przeciwciała w stężeniu w zakresie od około 1 do około 150 mg/ml i o zwiększonej trwałości. Wynalazek dotyczy także płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego do zastosowania terapeu-

6 6 PL B1 tycznego u osobnika dotkniętego stanem charakteryzującym się szkodliwym działaniem TNF. Preparat według wynalazku zawiera następujące składniki: przeciwciało wiążące ludzki TNF o dużym powinowactwie, małej stałej dysocjacji i dużych możliwościach neutralizacji; bufor, w tym kwas cytrynowy, cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu i dihydrat diwodorofosforanu sodu; środki osmotyczne, w tym mannitol i chlorek sodu; detergent, w tym polysorbate 80; i wodorotlenek sodu, w celu regulacji ph. Definicje W celu ułatwienia zrozumienia wynalazku niektóre określenia zdefiniowano na wstępie. Określenie osobnik" dotyczy organizmów żywych, np. prokaryota i eukaryota. Przykłady osobników obejmują ssaki, np. ludzi, psy, krowy, konie, świnie, owce, kozy, koty, myszy, króliki, szczury i zwierzęta transgeniczne. W konkretnych postaciach wynalazku, osobnikiem jest człowiek. Określenie preparat farmaceutyczny" dotyczy preparatów, które są w postaci umożliwiającej zdecydowaną skuteczność biologiczną składników czynnych i które nie zawierają żadnych dodatkowych składników w sposób istotny toksycznych względem osobników, którym podawano by preparat. Zaróbki (podłoża, substancje dodatkowe) dopuszczalne farmaceutycznie" to takie, które można w sposób rozsądny podawać ssakowi otrzymując skuteczną dawkę stosowanego składnika czynnego. Określenie trwały" preparat dotyczy takiego preparatu, w którym przeciwciało w zasadzie zachowuje trwałość fizyczną i/lub trwałość chemiczną i/lub aktywność biologiczną podczas przechowywania. Znane w dziedzinie różne techniki analityczne do pomiaru trwałości białek opisano na przykład w Peptide and Protein Drug Delivery, , Vincent Lee Ed., Marcel Dekker, Inc., Nowy Jork, N.Y., Pubs. (1991) i Jones, A. Adv. Drug Delivery Rev. 10: (1993). Trwałość można zmierzyć w wybranej temperaturze w wybranym okresie czasu. Korzystnie, preparat jest trwały w temperaturze pokojowej (około 30 C) lub w temperaturze 40 C przez co najmniej 1 miesiąc i/lub trwały w temperaturze około 2-8 C przez co najmniej 1 rok lub przez co najmniej 2 lata. Ponadto, korzystne jest, aby preparat zachowywał trwałość po zamrożeniu (do np. -70 C) i rozmrożeniu, co dalej określa się jako cykl zamrażanie/rozmrażanie". Przeciwciało zachowuje fizyczną trwałość" w preparacie farmaceutycznym jeśli przy oględzinach gołym okiem lub przy pomiarze za pomocą rozpraszania światła UV lub chromatografii wykluczania nie wykazuje żadnych objawów agregacji, wytrącania i/lub denaturacji przejawiających się zmianą zabarwienia i/lub klarowności. Przeciwciało w preparacie farmaceutycznym zachowuje chemiczną trwałość", jeśli trwałość chemiczna w danym momencie jest taka, że przeciwciało zachowuje aktywność biologiczną, jak zdefiniowano poniżej. Trwałość chemiczną można określić przez wykrywanie i określanie ilościowe postaci przeciwciała zmienionych chemicznie. Zmiana chemiczna może obejmować zmianę wielkości (np. przycinanie), którą można oszacować stosując na przykład chromatografię wykluczania, SDS-PAGE i/lub spektrometrię masową z laserową desorpcją i jonizacją próbki wspomaganą matrycą z analizatorem czasu przelotu (MALDI/TOF MS). Inne rodzaje zmian chemicznych obejmują zmianę ładunku (np. zachodzącą w wyniku dezaminacji), którą można oszacować na przykład za pomocą chromatografii jonowymiennej. Przeciwciało w preparacie farmaceutycznym zachowuje aktywność biologiczną", jeśli przeciwciało w preparacie farmaceutycznym jest biologicznie czynne w stopniu odpowiednim do zamierzonego celu. Przykładowo, aktywność biologiczna jest zachowana jeśli aktywność biologiczna przeciwciała w preparacie farmaceutycznym mieści się w zakresie około 30%, około 20%, lub około 10% (w granicach błędu pomiaru) aktywności biologicznej wykazywanej podczas wytwarzania preparatu farmaceutycznego (np. określonej w teście wiązania antygenu). Określenie izotoniczny" jest znane w dziedzinie. Izotoniczny może oznaczać, np. że dany preparat ma w zasadzie takie samo ciśnienie osmotyczne jak krew człowieka. Preparaty izotoniczne na ogół mają ciśnienie osmotyczne od około 250 do 350 mosm. Izotoniczność można zmierzyć stosując na przykład osmometr typu parowego lub z zamrażaniem lodem. Określenie środek osmotyczny" oznacza związek, który nadaje preparatowi izotoniczność. Określenie poliol" oznacza substancję zawierającą wiele grup hydroksylowych i obejmuje cukry (cukry redukujące i nieredukujące), alkohole i kwasy cukrowe. Preferowane tu poliole mają masę cząsteczkową poniżej około 600 kd (np. w zakresie od około 120 do około 400 kd). Określenie cukier redukujący" oznacza cukier zawierający grupę półacetalową, redukującą jony metali lub reag u- jącą kowalencyjnie z lizyną i innymi grupami aminowymi białek, a określenie cukier nieredukujący" oznacza cukier, który nie ma właściwości cukru redukującego. Przykładami cukrów redukujących są fruktoza, mannoza, maltoza, laktoza, arabinoza, ksyloza, ryboza, ramnoza, galaktoza i glukoza. Cukry

7 PL B1 7 nieredukujące obejmują sacharozę, trehalozę, sorbozę, melezytozę i rafinozę. Mannitol, ksylitol, erytrytol, treitol, sorbitol i glicerol stanowią przykłady alkoholi cukrowych. Kwasy cukrowe obejmują L-glukonian i jego sole z metalami. W przypadku gdy wymagane jest, żeby preparat zachowywał trwałość pomimo zamrażania i rozmrażania, korzystne jest, by poliol nie krystalizował w temperaturze zamarzania (np. -20 C) co destabilizowałoby przeciwciała w preparacie. Poliol może także działać jako środek osmotyczny. W jednej postaci wynalazku, jednym ze składników preparatu jest mannitol w stężeniu 5 do 20 mg/ml. W korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi 7,5 do 15 mg/ml. W korzystniejszej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi mg/ml. Stosowane tu określenie bufor" odnosi się do roztworu buforowego, który przeciwdziała zmianom ph za pośrednictwem składników, którymi są sprzężony kwas i zasada. Bufor zgodnie z wynalazkiem ma ph w zakresie od około 4 do około 8; korzystnie od około 4, 5 do około 7; a najkorzystniej, ph w zakresie od około 5,0 do około 6,5. Przykłady buforów kontrolujących ph w tym zakresie obejmują octan (np. octan sodu), bursztynian (taki jak bursztynian sodu), glukonian, histydynę, cytrynian i inne bufory kwasów organicznych. Pod względem farmakologicznym, w kontekście według wynalazku, określenie ilość skuteczna terapeutycznie" lub skuteczna ilość" przeciwciała odnosi się do ilości skutecznie zapobiegającej lub leczącej zaburzenia, w leczeniu którego stwierdzono skuteczność przeciwciała. Określenie zaburzenie" oznacza jakikolwiek stan, w którym leczenie przeciwciałem przynosi korzyści. Obejmuje on przewlekłe i ostre zaburzenia lub choroby obejmujące takie stany patologiczne, które usposabiają do wystąpienia danego zaburzenia. Określenie środek konserwujący" oznacza związek, który może być zawarty w preparacie w celu istotnego zmniejszenia w nim aktywności bakteryjnej, a tym samym ułatwienia na przykład wytwarzania preparatów do różnorodnego zastosowania. Przykłady potencjalnych środków konserwujących obejmują chlorek oktadecylodimetylobenzyloamoniowy, chlorek heksametonium, chlorek benzalkonium (mieszaninę chlorków alkilobenzylodimetyloamoniowych, w których grupami alkilowymi są związki długołańcuchowe) i chlorek benzetonium. Inne rodzaje środków konserwujących obejmują alkohole aromatyczne, takie jak fenol, butyl i alkohol benzylowy, alkiloparabeny, takie jak metylo- lub propyloparaben, katechol, rezorcyna, cykloheksanol, 3-pentanol i m-krezol. Określenie leczenie" odnosi się zarówno do postępowania terapeutycznego jak i profilaktyki lub działań zapobiegawczych. Osoby wymagające leczenia obejmują osoby już cierpiące na dane zaburzenie jak również te, u których ma być stosowana profilaktyka tego zaburzenia. Stosowane tu określenia podawanie pozajelitowo" i podawany pozajelitowo" oznaczają sposoby podawania, inne niż podawanie dojelitowo i miejscowo, zazwyczaj przez zastrzyk, które obejmują, bez ograniczeń: zastrzyk i wlew dożylny, domięśniowy, dotętniczy, dooponowy, wewnątrztorebkowy, dooczodołowy, dosercowy, śródskórny, dootrzewnowy, dotchawiczy, podskórny, podnaskórkowy, dostawowy, podtorebkowy, podpajęczynówkowy, dordzeniowy i domostkowy. Stosowane tu określenia podawanie ogólnoustrojowe", podawany ogólnoustrojowo", pod a- wanie obwodowe" i podawany obwodowo", np. podawanie podskórnie, oznaczają podawanie związku, leku lub innego środka w sposób inny, niż bezpośrednio do ośrodkowego układu nerwowego, tak, aby znalazł się w organizmie pacjenta, a zatem był poddany metabolizmowi i innym podobnym procesom. Określenie farmaceutycznie dopuszczalny nośnik" jest znane w dziedzinie i obejmuje farmaceutycznie dopuszczalny środek, kompozycję lub podłoże, odpowiednie do podawania ssakom. Nośniki obejmują płynne lub stałe wypełniacze, rozcieńczalniki, zaróbki, rozpuszczalniki lub środki kapsułkujące, biorące udział w przenoszeniu lub transportowaniu danego środka z jednego narządu, lub części ciała, do innego narządu, lub części ciała. Każdy nośnik musi być dopuszczalny" czyli być zgodny z innymi składnikami preparatu i nieszkodliwy dla pacjenta. Stosowane tu określenie ludzki TNF " (przedstawione tu za pomocą skrótu htnf, lub po prostu htnf) dotyczy ludzkiej cytokiny, która występuje w postaci 17 kd wydzielanej i postaci 26 kd związanej z błoną, której biologicznie czynna postać składa się z trimeru niekowalencyjnie związanych cząsteczek 17 kd. Budowę htnf opisano dokładniej np. w Pennica, D., i in. (1984) Nature 312: ; Davis, J.M., i in. (1987) Biochemistry 26: ; i Jones, E.Y., i in. (1989) Nature 338: Określenie ludzki TNF " obejmuje rekombinowany ludzki TNF (rhtnf ), który można wytworzyć za pomocą standardowych sposobów rekombinacyjnej ekspresji lub nabyć drogą kupna (R&D Systems, Catalog nr 210-TA, Minneapolis, MN).

8 8 PL B1 Stosowane tu określenie przeciwciało" odnosi się do cząsteczek immunoglobulin składających się z czterech łańcuchów polipeptydowych, dwóch łańcuchów ciężkich (H) i dwóch łańcuchów lekkich (L) połączonych ze sobą wiązaniami disulfidowymi. Każdy łańcuch ciężki składa się z regionu zmiennego łańcucha ciężkiego (określanego tu skrótem HCVR lub VH) i regionu stałego łańcucha ciężkiego. Region stały łańcucha ciężkiego składa się z trzech domen, CH1, CH2 i CH3. Każdy łańcuch lekki składa się z regionu zmiennego łańcucha lekkiego (określanego tu skrótem LCVR lub VL) i regionu stałego łańcucha lekkiego. Region stały łańcucha lekkiego składa się z jednej domeny, CL. Regiony VH i VL mogą być dalej podzielone na regiony hiperzmienne, nazywane regionami określającymi komplementarność (CDR), położone naprzemiennie z regionami o mniejszej zmienności, nazywanymi regionami zrębowymi (FR). Każdy VH i VL składa się z trzech regionów CDR i czterech regionów FR, uszeregowanych w następującej kolejności od końca aminowego do końca karboksylowego: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. W jednej postaci wynalazku, preparat zawiera przeciwciało o sekwencjach CDR1, CDR2 i CDR3, takimi jak te przedstawione w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Stosowane tu określenie część przeciwciała wiążąca antygen" (lub po prostu część przeciwciała") odnosi się do jednego lub większej liczby fragmentów przeciwciała, które zachowują zdolność swoistego wiązania z antygenem (np. htnf ). Wykazano, że fragmenty pełnej długości przeciwciał mogą spełniać rolę przeciwciał polegającą na wiązaniu antygenu. Przykłady fragmentów wiążących objętych określeniem część przeciwciała wiążąca antygen" obejmują (i) fragment Fab, jednowartościowy fragment składający się z domen VL, VH, CL i CH1; (ii) fragment F(ab') 2, dwuwartościowy fragment zawierający dwa fragmenty Fab związane mostkiem disulfidowym w regionie zawiasowym; (iii) fragment Fd składający się z domen VH i CH1; (iv) fragment Fv składający się z domen VL i VH przeciwciał jednoramiennych, (v) fragment dab (Ward i in., (1989) Nature 341: ), który składa się z domeny VH; i (vi) wyizolowany region określający komplementarność (CDR). Ponadto, chociaż dwie domeny fragmentu Fv, VL i VH, są kodowane przez odrębne geny, mogą być one połączone, przy zastosowaniu metod rekombinacyjnych, za pomocą syntetycznej grupy łączącej, która umożliwia ich powstanie jako pojedynczego łańcucha białkowego, w którym regiony VL i VH łączą się w parę z wytworzeniem jednowartościowej cząsteczki (znanej pod nazwą jednołańcuchowy Fv (scfv); patrz np. Bird i in. (1988) Science 242: ; i Huston i in. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: ). Określenie część przeciwciała wiążąca antygen" obejmuje także takie jednołańcuchowe przeciwciała. Obejmuje ono również inne postacie jednołańcuchowych przeciwciał, takie jak fragmenty przeciwciała o podwójnej swoistości (diabody). Fragmenty przeciwciała o podwójnej swoistości są dwuwartościowymi, swoistymi względem dwóch antygenów przeciwciałami, których domeny VH i VL ulegają ekspresji w pojedynczym łańcuchu polipeptydowym, za pomocą grupy łączącej zbyt krótkiej by umożliwić łączenie się dwóch domen takiego samego łańcucha, co powoduje łączenie się tych domen z komplementarnymi domenami innych łańcuchów w rezultacie tworząc dwa miejsca wiążące antygen (patrz np. Holliger, P., i in. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: ; Poljak, R.J., i in. (1994) Structure 2: ). W jednej postaci wynalazku, preparat zawiera fragment wiążący antygen przedstawiony w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Ponadto, przeciwciało lub jego część wiążącą antygen może stanowić część większej cząsteczki immunoadhezyjnej, utworzonej przez kowalencyjne lub niekowalencyjne wiązanie przeciwciała lub części przeciwciała z jednym lub większą liczbą innych białek lub peptydów. Przykłady takich cząsteczek immunoadhezyjnych obejmują zastosowanie regionu rdzeniowego streptawidyny w celu wytworzenia tetramerycznej cząsteczki scfv (Kipriyanov, S.M., i in. (1995) Human Antibodies and Hybridomas 6:93-101) oraz zastosowanie reszty cysteinowej, markera peptydowego i C-końcowego znacznika polihistydynowego w celu wytworzenia dwuwartościowej i biotynylowanej cząsteczki scfv (Kipriyanov, S.M., i in. (1994) Mol. Immunol. 3J, : ). Fragment przeciwciała, taki jak fragmenty Fab i F(ab') 2 można wytworzyć z całego przeciwciała stosując typowe techniki, takie jak trawienie całych przeciwciał papaina lub pepsyną. Ponadto, przeciwciała, fragmenty przeciwciał i cząsteczki immunoadhezyjne można otrzymać stosując, jak opisano, standardowe techniki rekombinowacji DNA. Stosowane tu określenie ludzkie przeciwciało", obejmuje przeciwciała o zmiennych i stałych regionach pochodzących z sekwencji immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych. Ludzkie przeciwciała według wynalazku mogą obejmować reszty aminokwasów niekodowanych przez sekwencje immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych (np. w wyniku losowych lub ukierunkowanych mutacji in vitro lub w wyniku mutacji somatycznych in vivo), np. w CDR, a w szczególności w CDR3. Jednakże, stosowane tu określenie ludzkie przeciwciało" nie obejmuje przeciwciał, w których sekwencje

9 PL B1 9 CDR pochodzące z komórek zarodkowych innych gatunków ssaków, takich jak mysz, zostały wszczepione do ludzkich sekwencji zrębowych. Stosowane tu określenie rekombinowane ludzkie przeciwciało" obejmuje wszystkie ludzkie przeciwciała przygotowywane, ulegające ekspresji, wytwarzane lub izolowane za pomocą metod rekombinacji, takie jak przeciwciała ulegające ekspresji z zastosowaniem zrekombinowanego wektora ekspresyjnego, którym transfekowano komórki gospodarzy (co dokładniej opisano poniżej w rozdziale II), przeciwciała izolowane ze biblioteki kombinatorycznej rekombinowanych ludzkich przeciwciał (co dokładniej opisano poniżej w rozdziale III), przeciwciała izolowane ze zwierzęcia (np. myszy), które są transgeniczne dla ludzkich genów immunoglobuliny (patrz np. Taylor, L.D., i in. (1992) Nuci. Acids Res. 20: ) lub przeciwciała przygotowane, ulęgające ekspresji, wytworzone lub izolowane za pomocą jakichkolwiek innych sposobów polegających na składaniu sekwencji ludzkiego genu immunoglobuliny wraz z innymi sekwencjami DNA. Takie rekombinowane ludzkie przeciwciała mają zmienne i stałe regiony pochodzące od sekwencji immunoglobulin ludzkich komórek zarodkowych. W niektórych postaciach, jednakże, takie rekombinowane ludzkie przeciwciała poddaje się mutagenezie in vitro (lub, przy użyciu zwierząt transgenicznych dla ludzkich sekwencji Ig, mutagenezie somatycznej in vivo), a zatem, sekwencje aminokwasowe regionów VH i VL rekombinowanych przeciwciał są sekwencjami, które pomimo, że pochodzą od i są pokrewne sekwencjom VH i VL ludzkich komórek zarodkowych, mogą nie występować w sposób naturalny in vivo w repertuarze przeciwciał ludzkich komórek zarodkowych. Stosowane tu określenie wyizolowane przeciwciało" odnosi się do przeciwciał zasadniczo wolnych od innych przeciwciał o odmiennych właściwościach antygenowych (np. wyizolowane przeciwciało, które wiąże się swoiście z htnf będące zasadniczo wolne od przeciwciał swoiście wiążących antygeny inne niż htnf ). Wyizolowane przeciwciało, które wiąże się swoiście z htnf może, jednakże, przejawiać reaktywność krzyżową względem innych antygenów, takich jak cząsteczki TNF od innych gatunków. Ponadto, wyizolowane przeciwciało może być zasadniczo wolne od innych substancji komórkowych i/lub środków chemicznych. Stosowane tu określenie przeciwciało neutralizujące", (lub przeciwciało neutralizujące aktywność htnf ") dotyczy przeciwciał, których związanie się z htnf powoduje hamowanie aktywności biologicznej htnf. Hamowanie aktywności biologicznej htnf można określić za pomocą pomiaru jednego lub większej liczby wskaźników aktywności biologicznej htnf, takich jak działanie cytotoksyczne spowodowane przez htnf (in vitro albo in vivo), aktywacja komórek wywołana przez htnf i wiązanie się htnf z receptorami htnf. Te wskaźniki aktywności biologicznej htnf można oszacować za pomocą jednego lub większej liczby z kilku standardowych, znanych w dziedzinie, testów in vitro lub in vivo, przedstawionych w opisach patentowych US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. Korzystnie, zdolność przeciwciała do neutralizacji aktywności htnf określa się poprzez hamowanie cytotoksyczności wywołanej przez htnf względem komórek L929. Jako dodatkowy lub alternatywny parametr aktywności htnf można określić zdolność przeciwciała do hamowania ekspresji ELAM-1 na HUVEC wywołanej przez htnf, jako wskaźnik aktywacji komórek wywołanej przez htnf. Stosowane tu określenie technika powierzchniowego rezonansu plazmonowego", dotyczy zjawiska optycznego umożliwiającego analizę swoistych biologicznych oddziaływań w czasie rzeczywistym za pomocą wykrywania zmian w stężeniu białka w macierzy czujników biologicznych, np. stosując układ BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Szwecja i Piscataway, NJ). Dokładniejszy opis, patrz Jonsson, U., i in. (1993) Ann. Biol. Clin. 51:19-26; Jonsson, U., i in. (1991) Biotechniques 11: ; Johnsson, B., i in. (1995) J. Mol Recognit. 8: ; i Johnnson, B., i in. (1991) Anal. Biochem. 198: Stosowane tu określenie K off " oznacza stałą dysocjacji przeciwciała z kompleksu przeciwciało/antygen. Stosowane tu określenie K d " odnosi się do stałej dysocjacji konkretnego oddziaływania przeciwciało-antygen. II. Przeciwciała preparatu Wynalazek dotyczy płynnego preparatu farmaceutycznego w postaci roztworu wodnego zawierającego przeciwciała w ilości skutecznej terapeutycznie w roztworze buforowym powodującym, że ph preparatu mieści się pomiędzy około 4 i około 8, a cały preparat ma przedłużony dopuszczalny okres przechowywania, wynoszący korzystnie co najmniej około 18 miesięcy. W innej postaci, płynny preparat farmaceutyczny w postaci roztworu wodnego według wynalazku ma zwiększoną trwałość. W kolej-

10 10 PL B1 nej postaci wynalazku, preparat nie jest wrażliwy na światło. W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku pozostaje trwały po co najmniej 3 cyklach zamrażanie/rozmrażanie. W jeszcze innej postaci, preparat farmaceutyczny według wynalazku jest odpowiedni do pojedynczego zastosowania jako zastrzyk podskórny. Przeciwciała, które można stosować w preparacie obejmują przeciwciała poliklonalne, monoklonalne, rekombinowane, jednołańcuchowe, przeciwciała hybrydowe, przeciwciała chimeryczne, przeciwciała humanizowane, lub ich fragmenty. Stosować można także cząsteczki o budowie podobnej do przeciwciał zawierające jedno lub dwa miejsca wiążące antygen oraz fragment Fc immunoglobulin. Przykładem cząstki o budowie podobnej do przeciwciał jest składnik czynny: etanercept lub infliksimab. Przeciwciałami korzystnymi do zastosowania w preparacie są przeciwciała ludzkie, które klonuje się z ludzkich komórek lub z archiwów genowych stanowiących zasób ludzkich przeciwciał. Pośród ludzkich przeciwciał, szczególnie korzystne są przeciwciała skierowane przeciwko antygenowi TNF, w tym ludzkiemu TNF (czyli htnf ). W jednej postaci, preparat według wynalazku zawiera połączenie przeciwciał (dwóch lub większej liczby) lub koktajl" przeciwciał. Przykładowo, preparat może zawierać przeciwciało D2E7 i jedno lub większą liczbę przeciwciał dodatkowych. W korzystnej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, przy czym obie stałe określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. W kolejnej korzystnej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało, lub jego część wiążącą antygen, tak jak to przedstawiono w opisie patentowym US nr i , załączonych tu na zasadzie odsyłacza. W jednym aspekcie, preparat według wynalazku zawiera przeciwciała D2E7 i fragmenty przeciwciał, przeciwciała pokrewne D2E7 i fragmenty przeciwciał, oraz inne ludzkie przeciwciała i fragmenty przeciwciał o właściwościach odpowiadających D2E7, takich jak wiązanie się z dużym powinowactwem z htnf o powolnej kinetyce dysocjacji i dużej zdolności do neutralizacji. W innej postaci, preparat według wynalazku zawiera przeciwciało ludzkie, lub jego część wiążącą antygen, które dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K d wynoszącą 1 x 10-8 M lub mniej i stałą K off wynoszącą 1 x 10-3 s -1 lub mniej, co określa się za pomocą techniki powierzchniowego rezonansu plazmonowego, oraz powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-7 M lub mniej. Korzystniej, wyizolowane ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, dysocjuje od ludzkiego TNF ze stałą K off wynoszącą 5 x 10-4 s -1 lub mniej, lub nawet korzystniej, ze stałą K off wynoszącą 1 x 10-4 s -1 lub mniej. Korzystniej, wyizolowane ludzkie przeciwciało, lub jego część wiążąca antygen, powoduje zniesienie cytotoksyczności ludzkiego TNF w standardowym teście L929 in vitro z IC 50 wynoszącym 1 x 10-8 M lub mniej, a jeszcze korzystniej, z IC 50 wynoszącym 1 x 10-9 M lub mniej, a jeszcze korzystniej z IC 50 wynoszącym 5 x M lub mniej. W korzystnej postaci, preparat zawiera przeciwciało, które jest wyizolowanym rekombinowanym przeciwciałem ludzkim, lub jego częścią wiążącą antygen. W kolejnej korzystnej postaci, preparat zawiera przeciwciało, które neutralizuje również aktywację komórek wywołaną przez TNF, co oszacowano stosując standardowy test wykrywający ekspresję ELAM-1 na ludzkich komórkach śródbłonka żyły pępkowej (HUVEC) wywołaną przez TNF in vitro. III. Wytwarzanie preparatu Wynalazek dotyczy preparatów (np. preparatów białkowych i/lub preparatów przeciwciał) o lepszych właściwościach w porównaniu z preparatami uznanymi w dziedzinie. Przykładowo, preparaty według wynalazku mają dłuższy dopuszczalny okres przechowywania i/lub większą trwałość w porównaniu z preparatami uznanymi w dziedzinie. W korzystnym aspekcie, preparaty według wynalazku zawierają białko w dużym stężeniu, np. stężenie białka powyżej około 45 mg/ml, stężenie białka powyżej około 50 mg/ml, stężenie białka powyżej około 100 mg/ml lub stężenie białka powyżej około 150 mg/ml. W korzystnej postaci wynalazku, białko stanowią przeciwciała. W kolejnej korzystnej postaci, przeciwciałem jest przeciwciało D2E7. Wynalazek dotyczy także wodnej kompozycji farmaceutycznej zawierającej poliol, środek powierzchniowo czynny i układ buforujący zawierający cytrynian i/lub fosforan o ph około 4 do 8, w ilości wystarczającej do wytworzenia przeciwciała do zastosowania terapeutycznego w stężeniu przekraczającym około np. 45 mg/ml. Wytwarzanie danego przeciwciała przeprowadza się standardowymi sposobami znanymi w dziedzinie. W korzystnej postaci wynalazku, zastosowane w preparacie przeciwciało ulega ekspre-

11 PL B1 11 sji w komórkach CHO, a następnie oczyszcza się je za pomocą serii standardowych etapów chromatografii. W kolejnej korzystnej postaci, przeciwciało skierowane jest przeciwko htnf i wytwarza się je zgodnie ze sposobami przedstawionymi w opisie patentowym US nr i , załączonymi tu na zasadzie odsyłacza. Po wytworzeniu danego przeciwciała, wytwarza się preparat farmaceutyczny zawierający to przeciwciało. Skuteczną terapeutycznie ilość przeciwciała występującego w preparacie określa się np. biorąc pod uwagę pożądaną objętość dawki i sposób (sposoby) podawania. W jednej postaci wynalazku, stężenie przeciwciała w preparacie mieści się pomiędzy około 1 do około 150 mg przeciwciała na ml płynnego preparatu. W korzystnej postaci, stężenie przeciwciała w preparacie mieści się pomiędzy około 5 do około 80 mg na ml. W kolejnej korzystnej postaci, stężenie przeciwciała w preparacie mieści się pomiędzy około 25 do około 50 mg/ml. Preparat jest szczególnie odpowiedni do dużych dawek przeciwciał wynoszących ponad 15 mg/ml. W korzystnej postaci, stężenie przeciwciała wynosi 50 mg/ml. W innej postaci wynalazku, stężenie przeciwciała w preparacie wynosi około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, około mg/ml, lub około 75 mg/ml. Wynalazek obejmuje również pośrednie zakresy wymienionych stężeń, np. około mg/ml. Przykładowo, wynalazek obejmuje jakikolwiek zakres wartości będący kombinacją dowolnych z powyższych wartości jako górnej i/lub dolnej granicy. W jednej postaci, wynalazek dotyczy preparatu o przedłużonym dopuszczalnym okresie przechowywania, zawierającego składnik czynny, korzystnie przeciwciało, w połączeniu z mannitolem, monohydratem kwasu cytrynowego, cytrynianem sodu, dihydratem fosforanu disodu, dihydratem diwodorofosforanu sodu, chlorkiem sodu, Polysorbate 80, wodą i wodorotlenkiem sodu. W kolejnej postaci, preparat według wynalazku ma przedłużony dopuszczalny okres przechowywania w stanie ciekłym, wynoszący co najmniej około 18 miesięcy. W celu dalszego wydłużenia dopuszczalnego okresu przechowywania można również stosować zamrażanie preparatu według wynalazku. Preparat w postaci roztworu wodnego wytwarza się umieszczając przeciwciało w roztworze buforowym. Bufor według wynalazku utrzymuje ph w zakresie od około 4 do około 8, korzystnie od około 4,5 do około 6,0, korzystniej od około 4,8 do około 5,5, a najkorzystniej, utrzymuje ph pomiędzy około 5,0 do około 5,2. Zakresy pośrednie względem wymienionych wartości ph także wchodzą w zakres wynalazku. Przykładowo, wynalazek obejmuje także zakresy wartości wykorzystujące kombinację dowolnej z wyżej wymienionych wartości jako górną i/lub dolną granicę. Przykłady buforów, które regulują ph w tym zakresie obejmują octan (np. octan sodu), bursztynian (taki jak bursztynian sodu), glukonian, histydynę, cytrynian i inne bufory na bazie kwasów organicznych. W korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera układ buforujący, w którego skład wchodzi cytrynian i fosforan w celu utrzymywania ph w zakresie od około 4 do około 8. W kolejnej korzystnej postaci, zakres ph wynosi od około 4,5 do około 6,0, korzystniej od około ph 4,8 do około 5,5, a najkorzystniej od około 5,0 do około 5,2. W kolejnej korzystnej postaci, układ buforujący zawiera monohydrat kwasu cytrynowego, cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu i/lub dihydrat diwodorofosforanu sodu. W kolejnej korzystnej postaci, układ buforujący zawiera około 1, 3 mg/ml kwasu cytrynowego (np. 1,305 mg/ml), około 0,3 mg/ml cytrynianu sodu (np. 0,305 mg/ml), około 1,5 mg/ml dihydratu fosforanu disodu (np. 1,53 mg/ml), około 0,9 mg/ml dihydratu diwodorofosforanu sodu (np. 0,86) oraz około 6,2 mg/ml chlorku sodu (np. 6,165 mg/ml). W kolejnych korzystnych postaciach, układ buforujący zawiera 1-1,5 mg/ml kwasu cytrynowego, 0,25 do 0,5 mg/ml cytrynianu sodu, 1,25 do 1,75 mg/ml dihydratu fosforanu disodu, 0,7 do 1,1 mg/ml dihydratu diwodorofosforanu sodu oraz 6,0 do 6,4 mg/ml chlorku sodu. W kolejnej postaci, ph preparatu reguluje się wodorotlenkiem sodu. W skład preparatu wchodzi także poliol, który działa jako środek regulujący osmotyczność i może stabilizować przeciwciało. Poliol dodaje się do preparatu w ilości, która zależy od pożądanego stopnia izotoniczności preparatu. Korzystnie, preparat w postaci roztworu wodnego jest izotoniczny. Ilość dodawanego poliolu może także zależeć od masy cząsteczkowej poliolu. Przykładowo, w porównaniu z disacharydem (takim jak trehaloza) można dodać mniejszą ilość monosacharydu (np. mannitolu). W korzystnej postaci wynalazku, poliolem stosowanym w preparacie jako środek osmotyczny jest mannitol. W korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około 5 do 20 mg/ml. W kolejnej korzystnej postaci wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około 7,5 do 15 mg/ml. W korzystniejszej postaci preparatu według wynalazku, stężenie mannitolu wynosi około mg/ml.

12 12 PL B1 W najkorzystniejszej postaci, stężenie mannitolu wynosi około 12 mg/ml. W innej postaci wynalazku, poliolem wchodzącym w skład preparatu jest sorbitol. Do preparatu przeciwciał dodaje się także detergent lub środek powierzchniowo czynny. Przykładowe detergenty obejmują detergenty niejonowe, takie jak polisorbaty (np. Polysorbate 20, 80 itp.) lub poloksamery (np. Poloxamer 188). Dodaje się taką ilość detergentu, aby następowało zmniejszenie agregacji przeciwciała i/lub minimalizacja powstawania cząstek w preparacie i/lub zmniejszanie adsorpcji. W korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera środek powierzchniowo czynny, którym jest polisorbat. W kolejnej korzystnej postaci wynalazku, preparat zawiera detergent, którym jest Polysorbate 80 lub Tween 80. Tween 80 jest określeniem używanym dla polioksyetylenowanego (20) monooleinianu sorbitolu (patrz Fiedler, Lexikon der Hifsstoffe, Editio Cantor Verlag Aulendorf, wydanie 4, 1996). W korzystnej postaci, preparat zawiera pomiędzy około 0,1 i około 10 mg/ml Polysorbate 80, korzystniej pomiędzy około 0,5 i około 5 mg/ml. W kolejnej korzystnej postaci, w preparacie według wynalazku znajduje się około 0,1% Polysorbate 80. W korzystnej postaci wynalazku, preparat jest 0,8 ml roztworem w fiolce zawierającym składniki przedstawione w tabeli 1, poniżej. T a b e l a 1 Jedna fiolka 0,8 ml roztworu do wstrzykiwania 1 ) zawiera: Składnik Ilość Funkcja substancja czynna: przeciwciało (D2E7) 2) 40,0 mg substancja czynna zaróbki: mannitol 9,6 mg środek osmotyczny monohydrat kwasu cytrynowego kwas cytrynowy cytrynian sodu cytrynian sodu dihydrat fosforanu disodu dihydrat dwuzasadowego fosforanu sodu dihydrat diwodorofosforanu sodu dihydrat jednozasadowego fosforanu sodu 1,044 mg bufor 0,244 mg bufor 1,224 mg bufor 0,688 mg bufor chlorek sodu 4,932 mg środek osmotyczny Polysorbate 80 0,8 mg detergent woda do iniekcji woda do iniekcji 759, ,048 mg rozpuszczalnik wodorotlenek sodu 3) 0,02-0,04 mg regulacja ph Łącznie 1) Gęstość roztworu: 1,022 g/ml 2) Stosuje się jako koncentrat 3) Dodaje się jako roztwór 1 M 817,6 mg W jednej postaci, preparat zawiera wymienione powyżej substancje (tj. przeciwciało, bufor, poliol i detergent) i jest zasadniczo wolny od jednego lub większej liczby środków konserwujących, takich jak alkohol benzylowy, fenol, m-krezol, chlorobutanol i chlorek benzetonium. W innej postaci, preparat może zawierać środek konserwujący, szczególnie wtedy, gdy preparat jest preparatem wielodawkowym. Preparat może zawierać jeden lub większą liczbę innych farmaceutycznie dopuszczalnych nośników, zaróbek lub stabilizatorów, takich jak te opisane w Remington's Pharmaceutical Sciences wydanie 16, red. Osol, A. (1980), pod warunkiem, że nie wpływają one w sposób istotny szkodliwie na pożądane właściwości preparatu. Dopuszczalne nośniki, zaróbki lub stabilizatory są nietoksyczne dla biorców w stosowanych dawkach oraz stężeniach i obejmują: dodatkowe bufory; współrozpuszczalniki; przeciwutleniacze, w tym kwas askorbinowy i metioninę; środki chelatujące, takie jak EDTA; kompleksy metali (np. kompleksy Zn-białko); biodegradowalne polimery, takie jak poliestry; i/lub przeciwjony tworzące sole, takie jak sodowe.

13 PL B1 13 Zgodnie z koniecznością wynikającą z danego leczonego stanu, opisywany preparat można także połączyć z jednym lub większą liczbą innych środków terapeutycznych, korzystnie o działaniu uzupełniającym, nie wpływającymi szkodliwie na przeciwciała preparatu. Takie środki terapeutyczne występują w preparacie w odpowiedniej ilości, która jest skuteczna do zamierzonego celu. Dodatkowe środki terapeutyczne, które można łączyć z preparatem według wynalazku przedstawiono bardziej szczegółowo w opisach patentowych US nr i , z których każdy załącza się tu na zasadzie odsyłacza. Preparaty przeznaczone do podawania in vivo muszą być sterylne. Daje się to łatwo uzyskać za pomocą filtracji przez sterylizujące membrany filtracyjne przed lub po wytworzeniu preparatu. IV. Podawanie preparatu Preparat według wynalazku można stosować ze wskazań podobnych do tych przedstawionych w opisach patentowych US nr i , z których oba załącza się tu na zasadzie odsyłacza, oraz szczegółowo opisanych poniżej. Określenie skuteczna ilość" preparatu oznacza ilość konieczną lub wystarczającą do hamowania aktywności TNF, np. zapobiegania różnym objawom morfologicznym i somatycznym zaburzenia wywoływanego przez szkodliwe działanie TNF. W innej postaci, skuteczna ilość preparatu oznacza ilość konieczną do uzyskania pożądanego skutku. Przykładowo, skuteczna ilość preparatu oznacza ilość wystarczającą do hamowania szkodliwej aktywności TNF. W innym przykładzie, skuteczną ilość preparatu stanowi 0,8 ml preparatu zawierającego 40 mg przeciwciała, jak przedstawiono w tabeli 1. Skuteczna ilość może być różna, zależnie od takich czynników jak wielkość i masa ciała osobnika, lub typu choroby. Przykładowo, wybór preparatu hamującego aktywność TNF może wpłynąć na skuteczną ilość". Biorąc pod uwagę wyżej wymienione czynniki, fachowiec w dziedzinie może, bez wykonywania zbędnych doświadczeń, określić skuteczną ilość preparatu hamującego aktywność TNF. Schemat podawania może wpływać na skuteczną ilość. Preparat hamujący aktywność TNF można podawać osobnikowi albo przed albo po rozpoczęciu się szkodliwego działania TNF. Ponadto, kilka dawek podzielonych, jak również dawek rozłożonych w czasie, można podawać dobowo lub kolejno, lub można prowadzić w sposób ciągły wlew dawki lub można ją wstrzyknąć w postaci bolusa. Ponadto, w zależności od wymogów sytuacji terapeutycznej lub profilaktycznej, dawki preparatu hamującego aktywność TNF można proporcjonalnie zwiększać lub zmniejszać. Określenia leczony", leczenie" lub sposób leczenia" oznaczają zmniejszenie lub złagodzenie co najmniej jednego objawu związanego z lub spowodowanego leczonym stanem, zaburzeniem lub chorobą. Przykładowo, leczenie może oznaczać zmniejszenie jednego lub kilku objawów zaburzenia lub całkowite zlikwidowanie zaburzenia. Faktyczne poziomy dawkowania składników czynnych (przeciwciał) w preparacie farmaceutycznym według wynalazku można zmieniać tak, aby uzyskać ilość składnika czynnego, która jest skuteczna w osiągnięciu pożądanego skutku terapeutycznego u danego pacjenta, dla danej kompozycji i sposobu podawania, bez toksyczności dla pacjenta. Wybrany poziom dawkowania będzie zależał od rozmaitych czynników, w tym od aktywności przeciwciał w preparacie, sposobu podawania, pory podawania, szybkości wydalania danego stosowanego związku, czasu trwania leczenia, innych leków, związków i/lub substancji stosowanych w połączeniu z danym związkiem, wieku, płci, masy ciała, stanu, ogólnego stanu zdrowia i historii choroby leczonego pacjenta oraz podobnych czynników dobrze znanych w dziedzinie. Lekarz lub weterynarz o przeciętnym doświadczeniu może łatwo określić i przepisać wymaganą skuteczną ilość kompozycji farmaceutycznej według wynalazku. Przykładowo, lekarz lub weterynarz może rozpocząć dawkowanie związków według wynalazku zawartych w preparacie farmaceutycznym od dawki niższej niż ta, konieczna do osiągnięcia pożądanego skutku terapeutycznego, a następnie stopniowo zwiększać dawkę, aż do osiągnięcia pożądanego skutku. Na ogół, odpowiednią dawką dobową preparatu według wynalazku będzie taka ilość preparatu, która stanowi najniższą skuteczną dawkę wywołującą efekt terapeutyczny. Taka skuteczna dawka będzie na ogół zależna od opisanych wyżej czynników. Skuteczną ilością preparatu według wynalazku jest taka ilość, która hamuje aktywność TNF u osobnika cierpiącego na zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa. W korzystnej postaci, preparat zapewnia skuteczną dawkę składnika czynnego wynoszącą 40 mg przeciwciał na zastrzyk. W innej postaci, preparat zapewnia skuteczną dawkę przeciwciała, która mieści się w zakresie od około 1 do 150 mg. Jeśli to konieczne, skuteczną dawkę dobową preparatu farmaceutycznego można podawać w dwóch, trzech, czterech, pięciu, sześciu lub

14 14 PL B1 większej liczbie dawek podzielonych podawanych oddzielnie w odpowiednich przedziałach czasu w ciągu dnia, ewentualnie, w jednostkowych postaciach dawkowania. W jednej postaci wynalazku, dawka przeciwciał w preparacie wynosi pomiędzy około 5 i około 80 mg. W innej postaci, dawka przeciwciał w preparacie wynosi pomiędzy około 25 i około 50 mg. Preparat jest szczególnie odpowiedni do stosowania w dużych dawkach przeciwciała wynoszących ponad 15 mg. W korzystnej postaci, preparat według wynalazku zapewnia przeciwciała w dawce około 40 mg. W kolejnej korzystnej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko TNF. W najkorzystniejszej postaci, przeciwciałem jest D2E7. W jednej postaci wynalazku, dawka przeciwciała w preparacie wynosi pomiędzy około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg, około mg lub około 75 mg. W korzystnej postaci, dawka przeciwciała wynosi 40 mg. W kolejnej korzystnej postaci, przeciwciało jest skierowane przeciwko TNF. W najkorzystniejszej postaci, przeciwciałem jest D2E7. Zakresy pośrednie względem wymienionych dawek, np. około mg, także stanowią część wynalazku. Przykładowo, wynalazek obejmuje także zakresy wartości wykorzystujące połączenie dowolnych z wyżej wymienionych wartości jako górnej i/lub dolnej granicy. Warto zauważyć, że wielkość dawki może być różna w zależności od stanu zaawansowania zaburzenia, które ma być łagodzone. Ponadto, należy rozumieć, że z czasem powinno się dostosować konkretny schemat dawkowania dla danego osobnika w zależności od potrzeb i fachowej oceny osoby podającej lub nadzorującej podawanie kompozycji, oraz że przedstawione tu zakresy dawk o- wania są jedynie przykładowe i nie należy ich traktować jako ograniczające zakres lub zastosowanie tej kompozycji. Wynalazek dotyczy preparatu farmaceutycznego o przedłużonym dopuszczalnym okresie przechowywania, który, w jednej postaci, stosuje się do hamowania aktywności TNF u osobników cierpiących na zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa. Zastosowanie to polega na podawaniu danemu osobnikowi przeciwciała lub części przeciwciała według wynalazku tak, aby hamować aktywność TNF u danego osobnika. Korzystnie, stosowany TNF jest ludzkim TNF, a osobnik jest człowiekiem. Alternatywnie, osobnik może być ssakiem, u którego ulega ekspresji TNF, z którym reaguje krzyżowo przeciwciało według wynalazku. Ponadto, osobnik może być ssakiem, do organizmu którego wprowadzono htnf (np. poprzez podawanie htnf lub poprzez ekspresję transgenu htnf ). Preparat według wynalazku można podawać ludziom w celach terapeutycznych (szczegółowo opisanych poniżej). W jednej postaci wynalazku, płynny preparat farmaceutyczny jest łatwy do podawania, przy czym preparat, np. jest samodzielnie podawany przez pacjenta. W korzystnej postaci, preparat według wynalazku podaje się za pomocą zastrzyku podskórnego, korzystnie jednorazowego. Ponadto, preparat według wynalazku można podawać ssakowi innemu niż człowiek, u którego ulega ekspresji TNF, z którym krzyżowo reaguje przeciwciało (np. u naczelnego, świni lub myszy) do celów weterynaryjnych lub jako model zwierzęcy ludzkiej choroby. Co do tego drugiego zastosowania, takie modele zwierzęce mogą być przydatne do oceny skuteczności terapeutycznej przeciwciał według wynalazku (np. w testowaniu dawek i czasu podawania). Stosowane tu określenie zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa" obejmuje choroby i inne zaburzenia, w których wykazano lub podejrzewa się, że obecność TNF u osobnika cierpiącego na dane zaburzenie odpowiada za patofizjologię zaburzenia lub jest czynnikiem, który przyczynia się do pogorszenia przebiegu zaburzenia. Zgodnie z tym, zaburzenie, w którym aktywność TNF jest szkodliwa jest zaburzeniem, w którym oczekuje się, że hamowanie aktywności TNF złagodzi objawy i/lub postęp zaburzenia. Można to wykazać, np. przez stwierdzenie zwiększenia stężenia TNF w płynach fizjologicznych cierpiącego na dane zaburzenie osobnika (np. zwiększenie stężenia TNF w surowicy, osoczu, płynie maziowym, itp. osobnika), który można wykryć jak opisano powyżej, np. stosując przeciwciało przeciw TNF. Istnieją liczne przykłady zaburzeń, w których aktywność TNF jest szkodliwa. Przykłady zaburzeń, w których aktywność TNF jest szkodliwa przedstawiono w zgłoszeniu US nr 60/397275, załączonym tu na zasadzie odsyłacza. Przykłady szkodliwej aktywności TNF przedstawiono także w opisach patentowych US nr , , , , , i ; zgłoszeniach US nr US2001/ , US2001/ , i US2001/026801; zgłoszeniach WO 00/50079 i WO 01/49321, z których każdy załącza się tu na zasadzie odsyłacza. Poniżej, omówiono bardziej szczegółowo zastosowanie przeciwciał i fragmentów przeciwciał według wynalazku w leczeniu konkretnych zaburzeń:

15 PL B1 15 A. Posocznica Poprzez działania biologiczne obejmujące obniżanie ciśnienia tętniczego, hamowanie mięśnia sercowego, zespół zwiększonej przepuszczalności naczyń, martwicę narządów, stymulację uwalniania toksycznych mediatorów drugorzędowych i aktywację kaskady krzepnięcia, czynnik martwicy nowotworu odgrywa określoną rolę w patofizjologii posocznicy (patrz np. Tracey, K.J. i Cerami, A. (1994) Annu. Rev. Med. 45: ; Russell, D i Thompson, R.C. (1993) Curr. Opin. Biotech. 4: ). Zgodnie z tym, preparat według wynalazku można stosować do leczenia posocznicy w jakiejkolwiek postaci klinicznej, w tym we wstrząsie septycznym, wstrząsie endotoksynowym, posocznicy wywołanej przez bakterie Gram-ujemne i zespole wstrząsu toksycznego. Ponadto, w leczeniu posocznicy, preparat według wynalazku może być podawany łącznie z jednym lub większą liczbą dodatkowych środków terapeutycznych, których obecność może w większym stopniu łagodzić posocznicę, w tym inhibitor interleukiny-1 (taki jak te opisane w publikacjach PCT nr WO 92/16221 i WO 92/17583), cytokina interleukina-6 (patrz np. publikacja PCT nr WO 93/11793) lub antagonista czynnika aktywującego płytki (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP ). Ponadto, w korzystnej postaci, preparat według wynalazku podaje się pacjentom z posocznicą, u których w czasie leczenia stężenie IL-6 w surowicy lub osoczu przekracza 500 pg/ml, a korzystniej 1000 pg/ml (patrz publikacja PCT nr WO 95/20978, Daum, L., i in.). B. Choroby autoimmunizacyjne Czynnik martwicy nowotworu odgrywa rolę w patofizjologii różnorodnych chorób autoimmunizacyjnych. Przykładowo, przyjmuje się, że TNF wywołuje zapalenie tkanek i niszczy stawy w reumatoidalnym zapaleniu stawów (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej; Arend, W.P. i Dayer, J-M. (1995) Arth. Rheum. 38: ; Fava, R.A., i in. (1993) Clin. Exp. Immunol. 94: ). Przyjmuje się, że TNF także powoduje śmierć komórek wysp trzustkowych i pośredniczy w insulinooporności w cukrzycy (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej; publikacja PCT nr WO 94/08609). Przyjmuje się także, że TNF pośredniczy w cytotoksyczności względem oligodendrocytów i indukcji blaszek zapalnych w stwardnieniu rozsianym (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Chimeryczne i humanizowane mysie przeciwciała przeciwko htnf poddano badaniom klinicznym dotyczącym leczenia reumatoidalnego zapalenia stawów (patrz np. Elliott, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ; Elliot, M.J., i in. (1994) Lancet 344: ; Rankin, E.G., i in. (1995) Br. J. Rheumatol. 34: ). Preparat według wynalazku można stosować w leczeniu chorób autoimmunizacyjnych, w szczególności tych, związanych ze stanem zapalnym, w tym reumatoidalne zapalenie stawów, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, zapalenie kości i stawów i dnawe zapalenie stawów, alergia, stwardnienie rozsiane, cukrzyca spowodowana chorobą autoimmunizacyjną, autoimmunizacyjne zapalenie błony naczyniowej oka i zespół nerczycowy. Zazwyczaj, preparat podaje się ogólnoustrojowo, niemniej jednak, w pewnych zaburzeniach, korzystne może być miejscowe podawanie przeciwciała lub części przeciwciała w miejscu stanu zapalnego (np. podawanie miejscowe do stawów w reumatoidalnym zapaleniu stawów lub podawanie miejscowe do owrzodzeń w cukrzycy pojedynczo lub w połączeniu z pochodną ylidenową cykloheksanu jak opisano w publikacji PCT nr WO 93/19751). C. Choroby zakaźne Przyjmuje się, że czynnik martwicy nowotworu pośredniczy w skutkach biologicznych obserwowanych w różnorodnych chorobach zakaźnych. Przykładowo, przyjmuje się, że TNF pośredniczy w zapaleniu mózgu oraz zakrzepicy naczyń włosowatych i zawale w malarii (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Przyjmuje się także, że TNF pośredniczy w zapaleniu mózgu, indukuje uszkodzenie bariery krew-mózg, wywołuje zespół wstrząsu septycznego i aktywuje zawał wywołany zatorem żylnym w zapaleniu opon mózgowych (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Przyjmuje się, że TNF także indukuje kacheksję, stymuluje proliferację wirusową i pośredniczy w uszkodzeniu ośrodkowego układu nerwowego w zespole nabytego niedoboru odporności (AIDS) (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, przeciwciała oraz fragmenty przeciwciał według wynalazku można stosować w leczeniu chorób zakaźnych, w tym bakteryjnego zapalenia opon mózgowych (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP ), powikłania mózgowe w malarii, AIDS i zespołu związanego z AIDS (ARC) (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP ), jak również zakażenie cytomegalowirusem w wyniku transplantacji (patrz np. Fietze, E., i in. (1994) Transplantation 58: ). Preparat według wynalazku można także stosować do łagodzenia objawów związanych z chorobami zakaźnymi, w tym gorączki i bólów mięśni z powodu zakażeń (takich jak grypa) i kacheksji w wyniku zakażenia (np. w wyniku AIDS lub ARC).

16 16 PL B1 D. Transplantacja Przyjmuje się, że czynnik martwicy nowotworu jest kluczowym mediatorem odrzucania przeszczepu allogenicznego i reakcji przeszczepu przeciw gospodarzowi (GVHD) oraz pośredniczy w szkodliwej reakcji, którą zaobserwowano gdy do hamowania odrzucania przeszczepów nerek stosuje się szczurze przeciwciało OKT3, skierowane przeciwko kompleksowi receptora CD3 komórek T (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej; Eason, J.D., i in. (1995) Transplantation 59: ; Suthanthiran, M. i Strom, T.B. (1994) New Engl. J. Med. 331: ). Zgodnie z tym, preparat według wynalazku można stosować do hamowania odrzucenia przeszczepu, w tym do odrzucania przeszczepów allogenicznych i heterogenicznych i do hamowania GVHD. Chociaż przeciwciało lub część przeciwciała można stosować pojedynczo, korzystniejsze jest stosowanie w połączeniu z jednym lub większą liczbą innych środków, które hamują odpowiedź immunologiczną na przeszczep alogeniczny lub hamują GVHD. Przykładowo, w jednej postaci, preparat według wynalazku stosuje się w połączeniu z OKT3 do hamowania reakcji wywołanych przez OKT3. W innej postaci, preparat według wynalazku stosuje się w połączeniu z jednym lub większą liczbą przeciwciał skierowanych przeciwko innym cząstkom docelowym biorącym udział w regulacji odpowiedzi immunologicznej, takimi jak cząsteczki powierzchniowe komórek CD25 (receptor- interleukiny-2), CD11a (LFA-1), CD54 (ICAM-1), CD4, CD45, CD28/CTLA4, CD80 (B7-1) i/lub CD86 (B7-2). W jeszcze innej postaci, preparat według wynalazku stosuje się w połączeniu z jednym lub większą liczbą ogólnych środków immunosupresyjnych, takich jak cyklosporyna A lub FK506. E. Nowotwory złośliwe Przyjmuje się, że czynnik martwicy nowotworu indukuje kacheksję, stymuluje rozrost guza, zwiększa prawdopodobieństwo przerzutów i odgrywa rolę w cytotoksyczności w nowotworach złośliwych (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, preparat według wynalazku można stosować w leczeniu nowotworów złośliwych, do hamowania rozrostu nowotworu lub przerzutów i/lub do łagodzenia kacheksji spowodowanej nowotworem złośliwym. Preparat można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo do guza. F. Zaburzenia płucne Przyjmuje się, że czynnik martwicy nowotworu bierze udział w patofizjologii zespołu ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych, w tym stymuluje aktywację leukocytów i komórek śródbłonka, wywiera działanie cytotoksyczne względem pneumocytów i indukuje zespół zwiększonej przepuszczalności naczyń (patrz np. Tracey i Cerami, powyżej). Zgodnie z tym, preparat według wynalazku można stosować w leczeniu różnych zaburzeń płucnych, w tym zespołu ostrego wyczerpania oddechowego dorosłych (patrz np. publikacja PCT nr WO 91/04054), płuca wstrząsowego, przewlekłej choroby zapalnej płuc, sarkoidozy płucnej, zwłóknienia płuc i pylicy krzemowej. Preparat można podawać ogólnoustrojowo lub miejscowo do płuc, np. jako aerozol. G. Zaburzenia jelitowe Przyjmuje się, że czynnik martwicy nowotworu bierze udział w patofizjologii zaburzeń zapalnych jelit (patrz np. Tracy, K.J., i in. (1986) Science 234: ; Sun, X-M., i in. (1988) J. Clin. Invest. 81: ; MacDonald, T.T., i in. (1990) Clin. Exp. Immunol. 81; ). W leczeniu choroby Crohna badaniom klinicznym poddano chimeryczne przeciwciała mysie przeciwko htnf (van Dullemen, H.M., i in. (1995) Gastroenterology 109: ). Preparat według wynalazku można także stosować w leczeniu zaburzeń jelitowych, takich jak idiopatyczne choroby zapalne jelit, wśród których rozróżniamy dwie jednostki chorobowe: chorobę Crohna i wrzodziejące zapalenie okrężnicy. H. Zaburzenia sercowe Preparat według wynalazku można także stosować w leczeniu różnych zaburzeń sercowych, w tym niedokrwienia serca (patrz np. publikacja europejskiego zgłoszenia patentowego nr EP ) i niewydolności serca (osłabienie mięśnia sercowego) (patrz np. publikacja PCT nr WO 94/20139). I. Inne Preparat farmaceutyczny według wynalazku można także stosować w leczeniu różnych innych zaburzeń, w których aktywność TNF jest szkodliwa. Przykłady innych chorób i zaburzeń, w patofizjologii których rolę odgrywa aktywność TNF, a zatem, które można leczyć stosując preparat według wynalazku, obejmują: zaburzenia zapalne kości i choroby związane z resorpcją kości (patrz np. Bertolini, D.R., i in. (1986) Nature 319: ; Konig, A., i in. (1988) J. Bone Miner. Res. 3: ; Lerner, U.H. i Ohlin, A. (1993) J. Bone Miner. Res. 8: ; i Shankar, G. i Stern, P.H. (1993) Bone 14: ), zapalenie wątroby, w tym poalkoholowe zapalenie wątroby (patrz np. McClain, C.J. i Cohen, D.A. (1989) Hepatology 9: ; Felver, M.E., i in. (1990) Alcohol. Clin. Exp. Res.

17 PL B : ; i Hansen, J., i in. (1994) Hepatology 20: ) oraz wirusowe zapalenie wątroby (Sheron, N., i in. (1991) J. Hepatol. 12: ; i Hussain, M.J., i in. (1994) J. Clin. Pathol. 47: ), zaburzenia krzepnięcia (patrz np. van der Poll, T., i in. (1990) N. Engl. J. Med. 322: ; i van der Poll, T., i in. (1991) Prog. Clin. Biol. Res. 367:55-60), oparzenia (patrz np. Giroir, B. P., i in. (1994) Am. J. Physiol 267: H ; i Liu, X.S., i in. (1994) Burns 20:40-44), uszkodzenie tkanek w wyniku reperfuzji (patrz np. Scales, W.E., i in. (1994) Am. J. Physiol. 267:G ; Serrick, C, i in. (1994) Transplantation 58: ; i Yao, Y.M., i in. (1995) Resuscitation 29: ), powstawanie keloidu (patrz np. McCauley, R.L., i in.. (1992) J. Clin. Immunol. 12: ), powstawanie tkanki bliznowatej; gorączka; choroba ozębnej; otyłość i szkodliwe działanie promieniowania. Inne zaburzenia, w których aktywność TNF jest szkodliwa obejmują między innymi takie jak: choroba Stilla u dorosłych, choroba Alzheimera, zesztywniające zapalenie stawów kręgosłupa, astma, nowotwór i kacheksja, miażdżyca naczyń, przewlekła miażdżyca naczyń, zespół przewlekłego zmęczenia, niewydolność wątroby, przewlekła niewydolność wątroby, obturacyjna choroba płuc, przewlekła obturacyjna choroba płuc, zastoinowa niewydolność serca, zapalenie skórnomięśniowe i wielomięśniowe, makroangiopatia cukrzycowa, gruczolistość, gorączka okresowa rodzinna, zwłóknienie, hemodializa, reakcja Jarischa- Herxheimera, młodzieńcze zapalenie stawów, zespół Kawasakiego, zespół mielodysplastyczny, zawał mięśnia sercowego, zaburzenie o nazwie panciaticular vulgaris, choroba ozębnej, neuropatia obwodowa, zaburzenia wielostawowe, zapalenie wielomięśniowe, postępująca niewydolność nerek, łuszczyca, łuszczycowe zapalenie stawów, zespół Reitera, sarkoidoza, twardzina, spondyloartropatie, choroba Stilla, udar, zespół związany z terapią, zespół zapalny wywołany terapią, zespół zapalny w wyniku podawania IL-2, operacja tętniaka aorty w odcinku piersiowobrzusznym (TAAA), choroba Vasulo-Behceta, szczepionka przeciw żółtej febrze, cukrzyca typu 1, cukrzyca typu 2, ból neuropatyczny, rwa kulszowa, obrzęk mózgu, obrzęk rdzenia i/lub wokół rdzenia kręgowego, zapalenie naczyń, ziarniniakowatość Wegenera, zapalenie tętnicy skroniowej, bóle mięśni typu reumatoidalnego, zapalenie tętnic Takayasu, guzkowe zapalenie tętnic, mikroskopowe zapalenie wielonaczyniowe, zespół Churga-Strauss, zespół Felty'ego, zespół Sjogrena, mieszana choroba tkanki łącznej, nawracające zapalenie wielochrząstkowe, stan zapalny przypominający dnę moczanową, obluzowanie protez, autoimmunizacyjne zapalenie wątroby, stwardniające zapalenie dróg żółciowych, ostre zapalenie trzustki, przewlekłe zapalenie trzustki, kłębuszkowe zapalenie nerek, popaciorkowcowe zapalenie kłębuszkowe nerek lub popaciorkowcowa nefropatia IgA, choroba reumatyczna serca, kardiomiopatia, zapalenie jąder, piodermia zgorzelinowa, szpiczak mnogi, okresowy zespół związany z receptorem TNF [TRAPS], miażdżyca naczyń, sterydozależne olbrzymiokomórkowe zapalenie tętnic i mięśni, zapalenie błony naczyniowej oka i reakcje na leki. Następujące przykłady, których nie powinno się traktować jako ograniczające, ilustrują wynalazek. Treść wszystkich odsyłaczy literaturowych, zgłoszeń patentowych w toku oraz opublikowanych opisów patentowych, cytowanych w tym zgłoszeniu wyraźnie załączono tu na zasadzie odsyłacza. P r z y k ł a d y P r z y k ł a d 1: Wytwarzanie preparatu Preparat farmaceutyczny według wynalazku wytworzono według następującego protokołu. Substancje, których użyto w preparacie obejmują: mannitol, monohydrat kwasu cytrynowego (kwas cytrynowy), cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu (dwuzasadowy dihydrat fosforanu sodu), dihydrat diwodorofosforanu sodu (jednozasadowy dihydrat fosforanu sodu), chlorek sodu, Polysorbate 80, woda do iniekcji, wodorotlenek sodu, który użyto jako 1 M roztwór dla kontroli ph i koncentrat białkowy (np. koncentrat przeciwciał). Wytwarzanie 20 l buforu (równoważnik 20,180 kg - gęstość roztworu : 1,009 g/ml) Składniki odważono następująco: 240,0 g mannitolu, 26,1 g monohydratu kwasu cytrynowego, 6,1 g cytrynianu sodu, 30,6 g dihydratu fosforanu disodu, 17,2 g dihydratu diwodorofosforanu sodu, 123,3 g chlorku sodu, 20,0 g Polysorbate 80 i 19715,7 do 19716,1 g wody. Roztwór wodorotlenku sodu wytworzono przez połączenie 40,0 g wodorotlenku sodu z 1000,8 g wody do iniekcji. Następnie, wytworzono bufor rozpuszczając następujące, uprzednio odważone składniki (opisane powyżej) w około 90% wody do iniekcji: mannitol, monohydrat kwasu cytrynowego, cytrynian sodu, dihydrat fosforanu disodu, diwodorofosforan sodu, chlorek sodu i Polysorbate 80. Stwierdzono, że kolejność dodawania składników buforu była nieistotna, tak więc, może być dowolnie dobrana. Po dodaniu wszystkich składników buforu, ph roztworu nastawiono 1 M wodorotlenkiem sodu, który wytworzono według powyższego opisu. Na koniec, po dodaniu wodorotlenku sodu, dodano wodę. Następnie, przesączono roztwór buforu przez wysterylizowany filtr (hydrofilowy poli(difluorek winy-

18 18 PL B1 lidenu), o średnicy porów 0,22 m do wysterylizowanego pojemniczka. Filtrację prowadzono w środowisku sterylnego azotu. Wytwarzanie 40 l preparatu (równoważnik 40,88 kg) Następnie, przesączony roztwór buforowy dodano do rozmrożonego i połączonego we wspólnym zbiorniku koncentratu przeciwciał (składnik czynny preparatu farmaceutycznego), wytworzonego w następujący sposób. Przed przystąpieniem do wytwarzania preparatu farmaceutycznego, przeciwciało (koncentrat) rozmrożono w łaźni wodnej. Użyto 34,207 g koncentratu przeciwciała, co w przypadku koncentratu białkowego o stężeniu 60 mg białka/ml odpowiada 2,0 kg białka. Gęstość koncentratu wynosiła 1,0262 g/ml. Można stosować dowolny koncentrat białkowy w zakresie od 25,655 do 37,316, co odpowiada stężeniu białka w koncentracie białkowym 55 do 80 mg/ml. Bufor dodawano w trakcie mieszania, aż do osiągnięcia końcowej masy całkowitego roztworu. Następnie, preparat, zawierający wszystkie składniki, wysterylizowano przez filtrację, jak opisano powyżej, z tym wyjątkiem, że preparat przesączono poprzez dwa sterylne filtry membranowe o porach wielkości 0,22 m. Po sterylizacji, preparat opakowano albo w fiolki albo we wstępnie wypełniane strzykawki. W dziedzinie docenia się też fakt, że podane tu masy i/lub stosunki masa/objętość można przekształcać na mole i/lub stężenia molowe stosując znane w dziedzinie masy cząsteczkowe wymienionych składników. Przedstawione tu przykładowo masy (np. w gramach lub w kilogramach) odpowiadają podanym objętościom (np. buforu lub preparatu farmaceutycznego). W dziedzinie docenia się fakt, że masy można przeliczać na zasadzie proporcji dla różnych wymaganych objętości preparatu. Przykładowo, preparaty 32 l, 20 l, 10 l, 5 l lub 1 l zawierają odpowiednio 80%, 50%, 25%, 12,5% lub 2,5%, przedstawionych tu przykładowo mas. P r z y k ł a d 2: Badania z zamrażaniem i rozmrażaniem Po wybraniu buforu dla przeciwciała D2E7 substancję leczniczą skomponowano na tej samej matrycy co gotowy produkt. Zachowanie się substancji leczniczej, zawierającej przeciwciało D2E7 ze stężeniem białka wynoszącym 63 mg/ml, pod wpływem zamrażania i rozmrażania oszacowano poprzez naprzemienne 3-krotne przeprowadzanie substancji leczniczej ze stanu zamrożonego w stan ciekły. W tabeli N przedstawiono wyniki doświadczenia oceniającego wpływ trzech cykli szybkiego oraz powolnego zamrażania i rozmrażania w obecności i przy braku 0,1% Polysorbate 80 zaczynając odpowiednio od temperatury -80 C lub -30 C. Jak wykazano w tabeli 2, substancję leczniczą zawierającą przeciwciało D2E7 można naprzemian rozmrażać i zamrażać co najmniej 3 razy bez jakichkolwiek szkodliwych następstw zarówno dla właściwości chemicznych (kationowymienna HPLC, chromatografia wykluczania HPLC, zabarwienie, ph), fizykochemicznych (cząstki poniżej granicy widoczności, klarowność), jak i dla aktywności biologicznej (test neutralizowania TNF in vitro). W tabeli 2 przedstawiono także, że wprowadzenie Polysorbate 80 poprawia fizykochemiczne właściwości substancji leczniczej zawierającej przeciwciało D2E7 czego dowodzi mniejsza liczba cząstek poniżej granicy widoczności bez względu na to czy stosowano powolny czy szybki cykl zamrażanie/rozmrażanie (patrz zacieniowane powierzchnie w tabeli 2). T a b e l a 2: Wpływ zamrażania i rozmrażania na substancję leczniczą zawierającą przeciwciało D2E7 z/bez Polysorbate 80 Kryteria testu Polisorbat (0,1%) 1) Liczba cykli zamrażanie/rozmrażanie Powolne rozmrażanie - 30 C w chłodziarce Szybkie rozmrażanie -30 C w łaźni wodnej Powolne rozmrażanie -80 C w chłodziarce Szybkie rozmrażanie -80 C w łaźni wodnej klarowność ,0 27,8 22,5 28,1 25,3 28,2 25,8 28,0 25,6 28,1 zabarwienie - + B9 B9 B9 B9 B9 B9 B9 B9 B9 B9

19 PL B cd. tabeli 2 ph - + 5,01 5,02 5,02 5,02 5,02 5,02 5,02 5,02 5,02 5,02 cząstki poniżej granicy widoczności chromatografia wykluczenia HPLC ,8 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8 99,8 kationowymienna HPLC ,1 86,8 87,0 87,0 87,2 87,1 86,9 87,3 86,9 86,8 Test neutralizacji TNF in vitro ,0 111,8 123,8 96,2 118,0 100,9 103,3 96,7 120,5 95,8 1) + = preparat zawierający 0,1% Polysorbate 80; - = preparat bez 0,1% Polysorbate 80 P r z y k ł a d 3: Badania nad namnażaniem się mikroorganizmów Przeprowadzono testy w celu określenia czy preparat umożliwia namnażanie się mikroorganizmów. Wyniki tych doświadczeń wykazały, że preparat nie umożliwia namnażania się mikroorganizmów jeśli przechowuje się go przez 14 dni w temperaturze 20 do 25 C. Wynik ten otrzymano bezpośrednio przez posianie mikroorganizmów (np. Staphylococcus aureus, nr ATCC: 6538P, Candida albicans, nr ATCC: 10231, Aspergillus niger, nr ATCC: 16404, Pseudomonas aeruginosa, nr ATCC: 9027, próbka bakterii z otoczenia) w niskim stężeniu (NMT 100 jednostek tworzących kolonie/ml) na sterylnym preparacie. Następnie, w inokulowanych preparatach badano całkowite namnażanie się mikroorganizmów, np. zmiany w zmętnieniu. Brak zmętnienia stwierdzany w inokulowanych pojemnikach po 14 dniach wskazywał na brak namnażania. Ponadto, z pojemników nie udało się wyizolować żadnych mikroorganizmów. A zatem, wyciągnięto wniosek, że preparat nie umożliwia namnażania się mikroorganizmów w tych warunkach. Odsyłacze literaturowe Treść wszystkich cytowanych tu odsyłaczy literaturowych i opisów patentowych załącza się w całości na zasadzie odsyłacza. Rozwiązania równoważne Fachowcy w dziedzinie będą w stanie rozpoznać lub stwierdzić, na podstawie wyłącznie rutynowych badań, wiele rozwiązań równoważnych do opisanych według wynalazku. Takie równoważne rozwiązania objęte są, zgodnie z intencją, zakresem następujących zastrzeżeń patentowych.

20 20 PL B1