2. Marchlewicz A., Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyńska D., Bacillus thuringiensis B 1 (20151)) is a gram-positive bacteria able to degrade

Transkrypt

1 dr hab. Aleksandra Ziembińska-Buczyńska, prof. PŚ Gliwice, r. Katedra Biotechnologii Środowiskowej Wydział Inżynierii Środowiska i Energetyki Politechnika Śląska RECENZJA rozprawy doktorskiej Pani mgr Doroty Górny, przedstawiona w formie j ednotematycznego cyklu publikacji pt. Biodegradacja naproksenu przez szczep Bacillus thuringensis Bl(2015b) promotor: dr hab. Danuta Wojcieszyńska 1. Charakterystyka rozprawy i ocena cyklu publikacji, wchodzących w jej skład Recenzja dysertacji Pani mgr Doroty Górny została wykonana w oparciu o materiały przesłane przez Dziekana Wydziału Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach. Przedstawiona do oceny rozprawa doktorska zgodnie z przepisami określonymi Ustawą z dnia 13 marca stopniach i tytule naukowych oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (tekst jedn. Dz. U. z 2017 r. poz. 1789), została zaprezentowana w formie jednotematycznego cyklu 4 wieloautorskich publikacji, w których wkład autorstwa Doktorantki oszacowany został na 45 do 80%. Prace te, wyszczególnione poniżej, stanowią rozprawę doktorską o wspólnym tytule: Biodegradacja naproksenu przez szczep Bacillus thuringensis B 1 (2015b): 1. Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyńska D., Biodegradation and biotransformation of polycyclic non-steroidal anti-inflammatory drugs", Reviews in Environmental Science and Biotechnology, 2015, 14: (IF 4,352, punktacja MNiSW 35); 1

2 2. Marchlewicz A., Domaradzka D., Guzik U., Wojcieszyńska D., Bacillus thuringiensis B 1 (20151)) is a gram-positive bacteria able to degrade naproxen and ibuprofen, Water Air and Soil Pollution, 2015, 227:197 (IF 1,702 punkacja AffiSW 25); 3. Górny D., Guzik U., Hupert-Kocurek K., Wojcieszyńska D., Naproxen ecotoxicity and biodegradation by Bacillus thuringiensis Bl(2015b) strain, Ecotoxicology and Environmental Safety, 2019, 167: (IF 4,0, punktacja MNiSW 30); 4. Górny D., Guzik U., Hupert-Kocurek K., Wojcieszyńska D., A new pathway for naproxen utilisation by Bacillus thuringiensis Bl(2015b) and iłs decomposition in the presence of organic and inorganic contaminants, Journal of Environmental Management, 2019, 239:1-7 (IF- 4,449, punktacja MNiSW- 35). Prace wchodzące w skład rozprawy doktorskiej opublikowano w latach Ogólna liczba punktów za cykl prac stanowiących rozprawę doktorską według wykazu czasopism naukowych MNiSW z dnia 25 stycznia 2017 r., zgodny z rokiem ukazania się pracy wynosi 125. Natomiast ich sumaryczny Impact Factor (IF) zgodny z rokiem ukazania się prac wynosi 14,503. Wymienione powyżej prace, wchodzące w skład rozprawy doktorskiej, zostały poprzedzone opisem, który zawierał kolejno: 1. autoreferat, obejmujący: wprowadzenie do tematyki badań, cel pracy doktorskiej, materiały i metody zastosowane w badaniach, uzyskane wyniki wraz z ich dyskusją, spis bibliografii, 2. prace wchodzące w skład rozprawy, 3. podsumowanie pracy, 4. streszczenie w języku polskim i angielskim, 5. oświadczenia współautorów prac, wchodzących w skład rozprawy o ich procentowym udziale w ich powstanie. Wkład autorski Pani mgr Doroty Górny w powstanie ww. prac polegał na udziale w opracowaniu koncepcji badań oraz udziale we wszystkich etapach eksperymentu oraz udziale 2

3 w opracowaniu uzyskanych wyników, przeprowadzeniu ich analiz oraz napisaniu manuskryptu. Zaangażowanie doktorantki w przeprowadzenie eksperymentów oraz przygotowanie publikacji oceniam wysoko. Głównymi celami rozprawy doktorskiej było: wyizolowanie szczepu lub szczepów o zdolnościach do degradacji naproksenu, określenie toksyczności ogólnej i chronicznej ww. związku na wybrane organizmy modelowe oraz na wyizolowany szczep/szczepy środowiskowe, określenie zmian w składzie kwasów tłuszczowych izolowanego szczepu bakterii pod wpływem naproksenu, zoptymalizowanie warunków rozkładu naproksenu, dobór kometabolitów w procesie degradacji, opracowanie modelu kinetycznego rozkładu leku, określenie wpływu kozanieczyszczeń na proces degradacji naproksenu, izolacja i identyfikacja metabolitów pośrednich szlaku degradacji, izolacja i identyfikacja enzymów zaangażowanych w rozkład naproksenu, opracowanie mikrobiologicznego szlaku rozkładu naproksenu. Pomimo faktu, że Doktorantka wskazała cele pracy i ogólnie wyjaśniła, dlaczego wybrała taki właśnie temat swoich badań, w przygotowanej rozprawie brakuje mi wyraźnie zaznaczonej tezy pracy. Można natomiast założyć, że stosunkowo mało obszerny przegląd literaturowy, stanowiący w autoreferacie podstawę do wskazania wyznaczonych w rozprawie celów badań wynika z faktu, że Doktorantka włączyła w cykl publikacji stanowiących rozprawę doktorską pracę przeglądową pt. Biodegradation and biotransformation of polycyclic non-steroidal antiinflammatory drugs, opublikowaną w 2015 roku w Reviews in Environmental Science and Biotechnology, stanowiącą obszerny wstęp teoretyczny do recenzowanej pracy. W celu spełnienia wskazanych wyżej celów rozprawy doktorskiej Pani mgr Dorota Gómy przeprowadziła szereg prac laboratoryjnych, opisanych w kolejnych trzech publikacjach stanowiących dalszą część rozprawy doktorskiej. Aby wyizolować czyste kultury bakterii zdolnych do biodegradacji naproksenu Doktorantka użyła powierzchniowej warstwy gleby z terenów poprodukcyjnych Zakładów Chemicznych Organika-Azot S.A w Jaworznie. Materiał badawczy był wybrany zgodnie z zasadami prawidłowego screeningu mikroorganizmów użytecznych biotechnologicznie, 3

4 ponieważ wybrana gleba charakteryzowała się znaczną różnorodnością związków o strukturze aromatycznej, stąd można było założyć, że występują w niej mikroorganizmy zdolnych do rozkładu związków aromatycznych, o skondensowanych pierścieniach, do których należy naproksen. W kolejnych etapach badań Doktorantka wstępnie obrobiła próbki, przeprowadziła izolację materiału bakteriologicznego oraz testowała szczepy pod kątem rozkładu naproksenu. Ze względu na niską wydajność rozkładu naproksenu w układzie monosubstratowym, w dalszych badaniach degradacyjnych stosowała hodowle kometaboliczne, a wybór optymalnego do tego celu źródła węgla również poprzedziły badania laboratoryjne. W badaniach Pani mgr Górny przeprowadziła również ocenę wpływu PH i temperatury na degradację naproksenu oraz wyznaczyła parametry kinetyczne degradacji tego związku. W kolejnych etapach badań Doktorantka skupiła się na ocenie toksyczności naproksenu względem jednego wybranego szczepu Bl(2015b), zidentyfikowanego jak Bacillus thuringensis, który wykazywał największy potencjał w biodegradacji naproksenu. Badała również wpływ naproksenu na skład kwasów tłuszczowych wyizolowanego szczepu BI (20151)). Ponadto, w rozprawie opisano badania wpływu metali ciężkich, związków aromatycznych oraz rozpuszczalników organicznych na degradację naproksenu, co jest ważne w kontekście potencjalnego zastosowania wyizolowanego szczepu w procesie bioremediacji w warunkach polowych. Znaczną część analiz poświęcono badaniom nad szlakiem degradacji naproksenu przez szczep BI (2015b). Doktorantka w części metodycznej oraz wynikowej wprowadziła informację o przeprowadzeniu testu MARA (wraz z podaniem wartości MTC), testu Ames'a MPF oraz analizy MIDI-MIS, nie rozszyfrowując tych skrótów, ani nie opisując, na czym polegają wspomniane badania. Wskazane byłoby wyjaśnienie zasad działania tych metod. Również w całości rozprawy Doktorantka stosuje określenie rozkładu kometabolicznego/kometabolizmu. Wyj aśnienie tego pojęcia byłoby zasadne. Na stronie 12 autoreferatu Doktorantka pisze, że Oporność B. thuringiensis BI (2015b) może wynikać ze zmian składu kwasów tłuszczowych w błonie komórkowej. Czy Doktorantka mogłaby rozwinąć myśl i wyjaśnić jaki jest związek składu kwasów tłuszczowych i oporności na naproksen? 4

5 Na stronie 13 autoreferatu Doktorantka wspomina zjawisko powinowactwa bakterii do rozkładanych substratów, pisząc, że Maksymalna szybkość degradacji naproksenu (qmax) wynosiła 1,26 0,06 mg/l/dzień, natomiast stała Ks wynosiła 6,86 0,80 mg/l i była ona wyższa niż wartość uzyskana podczas degradacji ibuprofenu (Marchlewicz i wsp., 20171)). Wynika to z mniejszego powinowactwa bakterii do naproksenu niż ibuprofenu, co przekłada się na dłuższą degradację naproksenu. Czy Autorka mogłaby wyjaśnić z czego wynika taka różnica w powinowactwie tych dwóch związków do bakterii? W publikacji pt. Bacillus thuringiensis Bl(2015b) is a gram-positive bacteria able to degrade naproxen and ibuprofen, Doktorantka prowadziła badania w stężeniach naproksenu i ibuprofenu odpowiednio, 6 mg/l i 20 mg/l. Z czego wynikał wybór takich właśnie stężeń tych związków? W tej samej pracy w metodyce wspomniano o zabezpieczaniu i przechowywaniu szczepów bakteryjnych w stanie zamrożenia (freezing bacterial Stock). Czy Doktorantka mogłaby opisać bliżej procedurę przygotowania i przechowywania szczepów? Do charakteryzowania biochemicznego wyizolowanych szczepów zastosowano w tej pracy test API Coryne. Dlaczego wybrano właśnie ten test, znając morfologię mikroskopową badanego szczepu (laseczki)? W rozdziale 2.4. metodyki zastosowano układy kontrolne: abiotyczny oraz z bakteriami wyeliminowanymi przez autoklawowanie. Autorka pisze również, że gęstość optyczna drugiej ze wspomnianych kontroli była taka sama jak badanych kultur (zakładam, że w czasie początkowym eksperymentu). Wyjaśniono, że chodzi o wyeliminowanie kwestii adsorpcji na biomasie bakteryjnej. Jeśli wiadomo, że badany szczep należy do bakterii przetrwalnikujących, czy nie ma w tej kontroli możliwości wzrostu komórek wegetatywnych, potencjalne zdolnych do rozkładu substratu, pochodzącch z przetrwalników? Czy uwzględniono ten fakt w szacowaniu jaka część badanego związku ulega sorpcji na biomasie? W publikacji pt. Naproxen ecotoxicity and biodegradation by Bacillus thuringiensis B 1 (20151)) strain, w rozdziale 2.4. badania wpływu naproksenu na skład kwasów tłuszczowych B. thuringensis prowadzono w podłożu płynnym, zawierającym 4,8 g/l i 5,2 g/l tego związku. Z czego wynikało wybranie takich stężeń substratu? 5

6 Co Doktorantka miała na myśli, pisząc w podsumowaniu tej publikacji, że do bioremadiacji środowiska z naproksenu należy wykorzystywać mikroorganizmy o rozszerzonej zdolności do rozkładu naproksenu (extended ability to decompose naproxen)? 2. Ocena zasadności podjętej tematyki badawczej Problem naukowy, którego rozwiązania podjęła się w recenzowanej rozprawie Doktorantka, dotyczy wykorzystania mikroorganizmów izolowanych ze środowiska, w którym mają one kontakt ze związkami aromatycznymi, do bioremediacji naproksenu. Tematyka ta wpisuje się w aktualne trendy rozwoju zarówno mikrobiologii, jak i szerzej, w zagadnienia ochrony środowiska oraz biotechnologii. Zasadność przyjętej tematyki badawczej oceniam pozytywnie. Szczepy środowiskowe, zaadoptowane do rozkładu ksenobiotyków i posiadające pełną charakterystykę biochemiczną i molekularną to znakomite narzędzie bioremadiacji środowiska. Pozwalają one na szybkie i efektywne usuwanie zanieczyszczeń, nie stanowiąc jednocześnie zagrożenia dla pozostałych części ekosystemu, dzięki wcześniejszym badaniom, pozwalającym je szczegółowo scharakteryzować. Jest to tematyka bardzo aktualna, ważna nie tylko z punktu widzenia nauk podstawowych, ale również ze względu na możliwość stosowania takich mikroorganizmów i procedur w praktyce, w szeroko pojętej ochronie środowiska i biotechnologii. 3. Osiągnięcia pracy Ze względu na potencjalnie negatywny wpływ na środowisko wielopierścieniowych niesteroidowych leków przeciwzapalnych, do j akich należy naproksen, poszukiwania skutecznych metod eliminacji takich związków są tematem ważny i aktualny. Rozprawa doktorska Pani mgr Doroty Górnej to opracowanie materiałów dotyczących izolacji i pełnej charakterystyki oraz testowania możliwości zastosowania szczepu bakteryjnego Bacillus thuringensis BI (2015b) do usuwania naproksenu ze środowiska. Za osiągnięcie w tej dysertacji uznaję wyizolowanie i szerokie scharakteryzowanie szczepu Bacillus thuringensis BI (2015b), zdolnego do efektywnej biodegradacji naproksenu oraz przeprowadzenie analiz pozwalających na oszacowanie możliwości zwiększenia efektywności tego procesu, co będzie pozwalało zastosować ten mikroorganizm jako szczepionkę w procesie bioaugmentacji w warunkach polowych. 6

7 Niewątpliwymi walorem przedstawionej do oceny pracy doktorskiej jest wszechstronność zastosowanych przez Doktorantkę metod, zarówno z zakresu klasycznej mikrobiologii, biochemii, analizy instrumentalnej, jak i metod z zakresu ekotoksykologii. Warto dodać, że wyniki zostały dogłębnie zanalizowane metodami statystycznymi. Przedstawiona dysertacja ma charakter spójny i przemyślany. Warto również zwrócić uwagę, że badania prezentowane w pracy stanowią zarówno materiał z zakresu nauk podstawowych, wyjaśniaj ący mechanizmy rozkładu naproksenu przez wyizolowany szczep Bacillus thuringensis Bl(2015b), jak i szerokie opracowanie stanowiące podstawę do praktycznego zastosowania ww. szczepu bakterii w praktyce do eliminacji naproksenu ze środowiska. 4. Podsumowanie pracy Doktorantka przedstawiła do oceny cykl 4 jednotematycznych publikacji naukowych. Prace o charakterze praktycznym, będące wynikiem prac laboratoryjnych, poprzedzała obszerna praca przeglądowa, stanowiąca dobrze zarysowane tło problemu badawczego. Badania zostały przeprowadzone w sposób kompleksowy. W polskojęzycznym autoreferacie Doktorantka nie ustrzegła się drobnych błędów językowych, interpunkcyjnych i edycyjnych, które jednak w żaden sposób nie umniejszają merytorycznej stronie pracy i z reguły są nieuniknione. W oparciu o przeprowadzone badania Doktorantka sformułowała 8 wniosków, z których w moim odczuciu najważniejszymi są: duża oporność szczepu BI (2015b) względem naproksenu związana jest ze zmianami w składzie kwasów tłuszczonych. W układach monosubstratowych degradacja naproksenu przez badany szczep zachodzi z niską wydajnością. Zastosowanie układów kometabolicznych z glukozą oraz fenolem jako źródłem węgla umożliwia całkowitą degradację leku. Obecność chlorofenoli, metanolu oraz Cd(ll) i Co(ll) hamuje degradację naproksenu przez szczep Bl(2015b) w hodowli kometabolicznej z glukozą, natomiast etanol stymuluje degradację leku. 7

8 Na podstawie aktywności enzymów oraz zidentyfikowanych metabolitów opracowano szlak rozkładu naproksenu, którego głównymi intermediatami są O- desmetylonaproksen oraz kwas salicylowy. 5. Konkluzja końcowa Przedstawiona do oceny dysertacja potwierdza umiejętności Doktorantki w zakresie planowania i realizacji badań naukowych oraz w ich opracowaniu, podsumowywaniu i efektywnym publikowaniu w wysokopunktowanych czasopismach. W moim odczuciu rozprawa doktorska ma wysoki poziom, jest merytoryczna i wskazuje na możliwość praktycznego zastosowania uzyskanych w niej wyników w szeroko pojętej ochronie środowiska. Nie mam wątpliwości, że rozprawa doktorska Pani mgr Doroty Górnej pt. Biodegradacja naproksenu przez szczep Bacillus thuringensis Bl(2015b) spełnia warunki określone w ustawie z dnia 14 marca 2003 r. o stopniach naukowych i tytule naukowym oraz o stopniach i tytule w zakresie sztuki (tekst jedn. Dz. U. z 2017 r., poz. 1789), zgodnie z art. 179 ust. 1 ustawy z dnia 3 lipca 2018 r. Przepisy wprowadzające ustawę Prawo o szkolnictwie wyższym (Dz.U. z 2018 r. poz. 1669). Wnoszę więc o dopuszczenie Doktorantki do dalszych etapów postępowania w przewodzie doktorskim na Wydziale Biologii i Ochrony Środowiska Uniwersytetu Śląskiego w Katowicach. 8