Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS w nasionach ulepszonej gorczycy białej dla potrzeb prac hodowlanych

Transkrypt

1 Tom XXIV Rośliny Oleiste 2003 Krzysztof Michalski Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Zakład Roślin Oleistych w Poznaniu Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS w nasionach ulepszonej gorczycy białej dla potrzeb prac hodowlanych Measurement of glucosinolate content with NIRS in seed of improved white mustard for breeding purposes Słowa kluczowe: Keywords: gorczyca biała, Sinapis alba, glukozynolany, analiza chemiczna, NIRS white mustard, Sinapis alba, glucosinolates, quick chemical analysis, NIRS W pracach hodowlanych istnieje potrzeba szybkiej metody oznaczania zawartości i składu glukozynolanów w nasionach. Na podstawie opracowanej wcześniej kalibracji dla rzepaku podjęto próbę zastosowania jej także do badań nad materiałami hodowlanymi gorczycy białej niskoglukozynolanowej, której skład glukozynolanów jest zbliżony do rzepaku dwuzerowego. Wstępne pomiary wykazały duże różnice spektralne pomiędzy nasionami rzepaku i gorczycy (globalne H, będące miarą zgodności widma ze zbiorem kalibracyjnym było rzędu 10, przy dopuszczalnej wartości 3). Otrzymane w ten sposób wyniki są niepewne i było konieczne wykonanie nowej kalibracji, opartej wyłącznie na nasionach gorczycy białej. Do kalibracji użyto 300 próbek gorczycy pochodzących ze zbioru w roku Nasiona zanalizowano na zawartość glukozynolanów metodą chromatografii gazowej desulfoglukozynolanów używając jako wzorca wewnętrznego sinigrynę. Zeskanowane widma (na aparacie NIRSystems 6500) i wyniki analiz poddano obróbce za pomocą programu WINISI 1.50 otrzymując równania dla poszczególnych glukozynolanów (glukonapina, glukobrassicanapina, progoitryna, napoleiferyna, glukotropeolina, glukozynolany indolowe) oraz dla sumarycznej zawartości glukozynolanów. Otrzymane wyniki charakteryzują się nieco większym błędem niż Breeding work needs to have quick analytical method for glucosinolate analysis. On the basis of earlier calibration, which was calculated for the whole seed of rapeseed an attempt was made to measure glucosinolate content in white mustard seeds (mustard was bred for low glucosinolate content, so their composition is in close proximity with double low rapeseed). Initial measurements showed serious spectral differences between seeds of rapeseed and of the white mustard (global H above 10 with acceptable level below 3). Results with such global H are uncertain, thus it was necessary to calculate new calibration equation on the basis of white mustard seed samples. Calibration set consisted of 300 samples harvested in the year Seeds were analyzed for glucosinolate content with gas chromatography of desulphoglucosinolates method. Sample spectra were scanned with 6500 NIRSystems spectrophotometer. Calibration was calculated using WINISI 1.50 package for single glucosinolates and for total sum of glucosinolates as well. Obtained results have error approximately 1 µm/g higher than rapeseed calibration but it still could be used for breeding material screening. Calibration will be evaluated in next years for better robustness.

2 308 Krzysztof Michalski w przypadku odpowiadających im kalibracji dla nasion rzepaku (o około 1 µm), niemniej otrzymane wyniki można wykorzystać do wstępnej selekcji materiałów. Równanie będzie rozwijane poprzez dołączanie nowych próbek w celu zwiększenia odporności na zmiany związane z wpływami środowiska, w którym rosły rośliny. Wstęp W hodowli nowych odmian gorczycy istotna jest znajomość składu i zawartości glukozynolanów. Analiza chemiczna jest kosztowna i czasochłonna, testy glukozowe zawodne i mało dokładne, przy czym otrzymuje się jedynie sumaryczną zawartość glukozynolanów. Obecnie istnieją tylko dwie metody fizyczne przydatne w badaniach nasion i materiałów hodowlanych. Pierwsza z nich na podstawie rezonansu magnetycznego protonów (NMR) pozwala określić zawartość tłuszczu i wody (metoda pulsacyjna), druga to spektrometria w bliskiej podczerwieni (NIR) wprowadzona przez Norrisa (1965) pozwalająca określić zawartość związków, których grupy funkcyjne zawierają wiązania charakterystyczne, takie jak CH, OH, NH i inne organiczne związki wodoru. Początkowo stosowano aparaty wyposażone w specyficzne filtry, o ograniczonej zdolności pomiarowej. Do lat 70-tych z uwagi na ograniczony dostęp do komputerów metoda była stosowana jedynie do podstawowych składników, a i tak wymagało to żmudnego wyliczania równań regresji. Przełom w dostępności do komputerów, a następnie pojawienie się względnie tanich spektrofotometrów spowodowało skokowy wzrost zastosowań techniki NIR w analizie. Analiza ilościowa w NIR opiera się na wzbudzaniu nadtonów związków wykazujących absorpcję w podczerwieni. Istniejąca korelacja ilościowa pomiędzy stężeniem grup funkcyjnych w badanej próbce a intensywnością absorpcji jest podstawą analizy ilościowej. Możliwa jest także analiza jakościowa, lecz wiąże się to z dostępnością bibliotek i ich walidacją. Analiza jakościowa ma zastosowanie raczej do rozpoznawania czystych substancji chemicznych w farmacji, natomiast nie wydaje się możliwe rozpoznawanie za jej pomocą nasion roślin różnych odmian. Wczesne prace (Michalski 1987, Renard 1987) pokazywały możliwość oznaczania glukozynolanów za pomocą NIR, choć precyzja pomiaru była ograniczona, również z uwagi na dokładność ówczesnych metod oznaczania glukozynolanów. Współcześnie obserwuje się stały postęp dokładności oznaczania glukozynolanów (Font 1999, Pruvot 1999, Velasco 1999), a także rozszerzanie pola zastosowań na inne składniki, jak np. estry kwasu sinapowego (Mollers 1999) czy zawartość tłuszczu i białka (Patel 1999, Marcroft 1999, Potter 1999, Michalski 2000). Dokładność metody NIR oparta na korelacjach widma z badanymi składnikami chemicznymi nie jest w stanie przekroczyć granicy jaką jest dokładność metody referencyjnej. Podjęto próbę pomiaru zawartości glukozynolanów na pod-

3 Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS stawie równań opracowanych dla rzepaku (Michalski 2001), lecz widma gorczycy wykazywały dużą niezgodność ze zbiorem widm prób użytych do kalibracji, co spowodowało konieczność opracowania równań specyficznych tylko dla gorczycy białej. Materiały i metody Wstępnie zeskanowano i zmierzono za pomocą równania (Michalski 2001) dla rzepaku 500 próbek gorczycy białej, o zmienionym składzie glukozynolanów (niskoglukozynolanowe, skład podobny do rzepaku dwuzerowego). Do pomiarów użyto spektrofotometru NIRSystems 6500 pracującego w zakresie widma nm. Obliczenia matematyczne i kalibrację wykonano za pomocą pakietu WINISI II wersja 1.50 Próbki pochodziły z prac badawczych IHAR ze zbioru w 2002 roku. Zostały w nich oznaczone zawartości poszczególnych glukozynolanów stosowaną w Laboratorium Biochemicznym IHAR metodą chromatografii gazowej silylowanych desulfoglukozynolanów (Michalski 1996). Sumaryczna zawartość glukozynolanów mieściła się w zakresie 11 do 50 µm/g. Wyniki Próbki nasion zeskanowano i próbowano ocenić w nich zawartość glukozynolanów wykorzystując wcześniej opracowane równanie dla nasion rzepaku. Do oceny zgodności mierzonych widm ze zbiorem kalibracyjnym wykorzystywane są parametry Global H i Neighborhood H wyliczane na bazie dystansów Mahalanobisa, pierwszy z nich ocenia zgodność badanej próbki z całym zbiorem kalibracyjnym, a drugi wyszukuje w zawężonym polu najbardziej podobne próbki, co upewnia analityka, iż w zbiorze kalibracyjnym znajdują się próbki zbliżone do mierzonych. Podczas pomiaru zawartości glukozynolanów za pomocą równania opracowanego dla nasion rzepaku parametr oceny statystycznej Global H dawał wartości rzędu 10 i więcej przy dopuszczalnej wartości poniżej 3, również Neighbourhood H przekraczał przyjęte granice (poniżej 1). Graficznie tę sytuację przedstawiono na rysunku 1, wyraźnie widoczne jest wydzielenie się podzbioru gorczycy w stosunku do zbioru kalibracyjnego dla rzepaku. Bazując na zebranych widmach i wynikach analiz podjęto próbę wykonania kalibracji przeznaczonej do oznaczania glukozynolanów w nasionach gorczycy białej. W tabeli 1 i na rysunkach 2 9 pokazano wyniki obliczeń. W obliczeniach pominięto sinalbinę (brak w próbach kalibracyjnych), natomiast dołączono glukotropeolinę, która powstaje w niektórych liniach gorczycy zastępując sinalbinę.

4 Statystyka równań korelacji Calibration equation statistics Tabela 1 SD odchylenie standardowe standard deviation SECV błąd standardowy walidacji standard error of validation SEC błąd standardowy kalibracji standard error of calibration 1-VR współczynnik korelacji walidacji validation correlation coefficient R współczynnik korelacji correlation coefficient Błąd błąd metody referencyjnej dla śruty rzepak odm. Leo (800 próbek) reference method error Glukozynolany Glucosinolates Liczba próbek Number of samples Średnia Average SD Zakres Range SEC R SECV 1-VR Błąd [µm/g nasion] Glukonapina Gluconapin 505 0,32 0,23 0,10 1,40 0,17 0,5 0,2 0,4 0,44 Progoitryna Progoitrin ,6 5,103 0,7 29,2 2,0 0,84 2,7 0,7 1,0 Napoleiferyna Napoleiferin 159 0,175 0,098 0,1 0,5 0, ,1 0,3 0,3 Glukobrassicyna Glucobrassicin 378 2,16 1,5 0,1 8,5 0,9 0,61 1,1 0,4 0,17 4-OH glukobrassycyna 4-OH glucobrassicin 520 3,0 1,5 0,1 0,74 1,1 0,50 1,3 0,3 0,71 Glukotropeolina Glucotropeaolin 455 4,7 2,8 0,3 14,4 1,5 0,7 2,0 0,5 Suma glukozynolanów Total glucosuinolate content , ,6 3,0 0,80 3,7 0,7 1,6 Suma gluk. alkenowych Total of alkenyl glucosinolates ,0 5,3 10,0 41,3 2,3 0,8 2,7 0,7 1,3

5 Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS Rys. 1. Rozkład próbek dla zbioru kalibracyjnego(szare krzyżyki) i gorczycy (czarne kwadraty) na wykresie trójwymiarowym (trzy pierwsze główne składowe) Sample pattern for calibration set of rapeseed (grey cross) and for white mustard (black rectangles) on 3D graph (first three principal components) Rys. 2. Wykres kalibracji dla glukonapiny w nasionach gorczycy białej (slope nachylenie, SEC błąd standardowy kalibracji, SECV błąd standardowy walidacji, 1-VR korelacja walidacji, RSQ współczynnik determinacji) Gluconapin calibration plot for white mustard seeds (SEC standard error of calibration, RSQ root mean square, SECV standard error of crossvalidation, 1-R correlation of validation)

6 312 Krzysztof Michalski Rys. 3. Wykres kalibracji dla progoitryny w nasionach gorczycy białej Progoitrin calibration plot for white mustard seeds Rys. 4. Wykres kalibracji dla napoleiferyny w nasionach gorczycy białej Napoleiferin calibration plot for white mustard seeds

7 Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS Rys. 5. Wykres kalibracji dla glukobrassicyny w nasionach gorczycy białej Glucobrassicin calibration plot for white mustard seeds Rys. 6. Wykres kalibracji dla 4-OH glukobrassicyny w nasionach gorczycy białej 4-OH glucobrassicin calibration plot for white mustard seeds

8 314 Krzysztof Michalski Rys. 7. Wykres kalibracji dla sumy glukozynolanów (bez glukotropeoliny) w nasionach gorczycy białej Total of glucosinolates (without glucotropeaolin) calibration plot for white mustard seeds Rys. 8. Wykres kalibracji dla sumy glukozynolanów alkenowych w nasionach gorczycy białej Sum of alkenyl glucosinolates calibration plot for white mustard seeds

9 Oznaczanie glukozynolanów za pomocą NIRS Rys. 9. Wykres kalibracji dla glukotropeoliny w nasionach gorczycy białej Glucotropeaolin calibration plot for white mustard seeds Podsumowanie Wykonana kalibracja nadaje się do pomiaru zawartości glukozynolanów w nasionach gorczycy białej o zmienionym składzie tych związków. Wyniki otrzymane za jej pomocą dla gorczycy białej o zmienionym składzie glukozynolanów nie wykazują odchyleń spektralnych mierzonych za pomocą parametrów Global H i Neighbourhood H. Obliczone równania dla poszczególnych glukozynolanów, jak również dla wartości sumarycznej mają dokładność wystarczającą do wstępnej selekcji. Summary Obtained calibration can be used for estimation of glucosinolate content in seeds of modified white mustard. For the obtained calibration equation measured results did not show spectral outliers according to Global and Neighbourhood H parameters. Obtained calibration equations for each glucosinolate and for total are precise enough for initial screening of breeding material.

10 316 Krzysztof Michalski Literatura Font R., DelRio M., Dominguez J., Fernandez-Martinez J., DeHaro A Using of NIRS for determining glucosinolate content in Brassica juncea seed. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Greenwood C., Allen J. Leong A., Pallot T., Golder T. Golebiowski T An Investigation of the stability of NIRS calibrations for the analysis of oil content in whole seed canola. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Krzymański J., Piętka T., Michalski K., Krótka K Study on winter oilseed rape (Brassica napus L.) very low in aliphatic glucosinolate content. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Marcroft S., Potter T., Salisbury P., Burton W., Ballinger D Effect of farmer retained canola seed on yield and quality. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Martens H., Naes T Multivariate calibration. John Willey and Sons, New York. Michalski K., Kołodziej K Application of NIR spectrometry for analysis of basic chemical constituents of rapeseed seeds. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXI (3): Michalski K., Krzymański J., Byczyńska B Determination of glucosinolate in intact seeds of winter rape (B. napus) by near infrared reflectance method. Proceedings of 7th International Rapeseed Congress, Mollers C., Lickfett T., Matthaus B., Velasco B Influence of P-fertilizer on phytic acid content in seeds of Brassica napus L. and development of a NIRS calibration. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Norris K.H., Hart J.R Direct spectrophotometric determination of moisture content of grain and seeds. Principles and methods of measuring moisture in liquids and solids, 4: Patel J., Elhalwagy M., Falak I., Tulsieram L S1 per se recurrent selection in three spring canola (Brassica napus) populations. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Potter T., Kay J., Ludwig I Effect of row spacing and sowing rate on canola cultivars with varying early vigour. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Pruvot J., Kraling K., Charne D., Tulsieram L Development of low glucosinolate restorer and OGU CMS winter rape hybrid. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Renard M., Bernard C., Deschamps M., Furtoss V., Lila M., Quinsac A., Regnier J.M., Riballier D Glucosinolate analysis in whole rapeseed by near infrared reflectance spectroscopy. Glucosinolates in Rapeseeds: Analytical aspects ed. J.P. Wathelet Martinus Nijhof, Velasco L., Mollers C Selection for reduced sinapic acid esters content in rapeseed. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress Canberra Velasco L., Mollers C Analysis of individual glucosinolates in Brassica spp by Near Infrared Reflectance Spectroscopy. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra, Velasco L., Mollers C., Becker H Screening for quality traits in single seeds of rapeseed by near infrared reflectance spectroscopy. Proceedings of 10th International Rapeseed Congress, Canberra,