Ocena wybranych parametrów odpowiedzi immunologicznej limfocytów z krwi obwodowej w obecności grafenu

Transkrypt

1 Ocena wybranych parametrów odpowiedzi immunologicznej limfocytów z krwi obwodowej w obecności grafenu Ilona Aneta Dudek Promotor: prof. dr hab. n. med. Dariusz Szukiewicz Wstęp. Grafen, nanomateriał węglowy, należy do rodziny alotropowych nonomateriałów węglowych, za którego okrycie i opisanie właściwości Andriej Gejm i Konstantin Nowosiołow zostali uhonorowani w 2010 roku Nagrodą Nobla w dziedzinie fizyki. Grafenowe atomy ułożone są w heksagonalną sieć krystaliczną, co nadaje całości charakterystyczną strukturę plastra miodu. Atomy węgla połączone są między sobą za pomocą wiązania typu σ, tworzonego przez elektrony walencyjne ulegające hybrydyzacji sp2. Wiązanie to, zapewnia bardzo dużą wytrzymałość mechaniczną, stabilność chemiczną i termiczną. Dzięki temu nanomateriał ten uważany jest za najtwardszy nanomateriał i zarazem najcieńszy spośród obecnie znanych. Niesparowany elektron z orbitalu 2pz, tworzy wiązanie typu π, skierowane prostopadle do heksagonalnej płaszczyzny grafenu, dzięki czemu grafen posiada dużą przewodność elektryczną. Wiązanie π, zapewnia możliwość płynnego przyłączania grup funkcyjnych, protein, leków, sond fluorescencyjnych oraz kwasów nukleinowych. Dodatkowo, sztywność zginania jednowarstwowego grafenu, jest zbliżona do dwuwarstwy lipidowej błony komórek, dlatego uważa się, że nanomateriał ten idealnie nadaje się do konstrukcji ultra cienkich membran biologicznych oraz rusztowań komórkowych. Pomimo wielu spektakularnych wyników badań, wdrożenie grafenu do użytku wydaję się być jeszcze odległe w czasie. Spowodowane jest to bardzo dużą rozbieżnością wyników badań toksykologicznych. Istnieje dużo doniesień naukowych mówiących o tym, że nanocząstki grafenu przebijają błonę komórkową, tym samym powodują śmierć komórek Z drugiej strony wielu badaczy wykazało, że grafen charakteryzuje się wysoką biozgodnością względem komórek eukariotycznych. O ile wiadomo, że cechy grafenu takie jak wielkość cząstek czy powierzchnia właściwa diametralnie wpływają na zmianę jego właściwości fizykochemicznych, o tyle wpływ tych cech na toksyczność grafenu pozostaje niewyjaśniony. Cel pracy: Celem pracy było zbadanie wybranych parametrów odpowiedzi immuno-logicznej limfocytów z krwi obwodowej w obecności grafenu poprzez: Ocenę wpływu grafenu na żywotność limfocytów. Ocenę interakcji grafen-komórka.

2 Ocenę cytotoksyczności grafenu poprzez zbadanie jego wpływu na stopień aktywacji układu dopełniacza, mieloperoksydazy oraz kaspazy 9. Ocenę genotoksyczności grafenu poprzez zbadanie stopnia aktywacji histonu gamma H2AX. Ocenę odpowiedzi immunologicznej, poprzez ocenę profilu wydzielania cytokin prozapalnych i przeciwzapalnych. Dodatkowym celem było zbadanie czy istotny wpływ na wybrane parametry mają właściwości fizyko-chemiczne grafenu oraz dawka, stężenie i czas inkubacji. Materiał i metody: Do badań zostały wykorzystane trzy formy komercyjnie dostępnego grafenu A02, A03 i A04, w postaci suchego pudru oraz grafen osadzony na płytce krzemionkowej (GrSiO2). Do badań wykorzystano krew pełną, pobraną od zdrowych dawców. Limfocyty były izolowane metodą wirowania w gradiencie gęstości. Komórki były inkubowane z trzema rodzajami grafenu każdy o stężeniu 0,01 µg/ml, 0,1 µg/ml, 1 µg/ml w dawce 50 µl, 100 µli 150 µl oraz z GrSiO2. W celu analizy wpływu grafenu na wydzielanie cytokin przez limfocyty, wyizolowane komórki zostały podzielone na trzy populacje komórek: CD8+, CD8- oraz populację wszystkich komórek. Do izolacji komórek został wykorzystany zestaw do izolacji kolumienkowej CD8 MicroBeads Human. Pomiar żywotności komórek został przeprowadzony przy użyciu testu CellTiter- Blue Cell Viability Assay. Każdy pomiar był przeprowadzony w trzech powtórzeniach, w dziesięciu niezależnych hodowlach komórek. Uzyskane wyniki zostały opracowane w programie Statistica 13.1 przy pomocy testu jednoczynnikowej analizy wariancji ANOVA. W celu zbadania interakcji komórek z grafenem, po inkubacji, z hodowli komórkowej wykonano preparaty. Część preparatów została przeznaczona do analizy pod mikroskopem świetlnym. Pozostałe preparaty zostały poddane procesowi dehydratacji i pokryte cienką warstwą złota. Preparaty były oglądane pod skaningowym mikroskopem elektronowym Phenom Pro. Pomiar ilości składnika C5a dopełniacza, mieloperoksydazy, kaspazy 9 oraz histonu gama H2AX, jak również pomiar zawartości IL4, IL10, IL6 oraz TNF-α został przeprowadzony metodą ELISA z wykorzystaniem komercyjnych zestawów. Każdy pomiar został dokonany w trzech powtórzeniach. Uzyskane wyniki opracowano statystycznie przy użyciu testu T-Studenta dla prób niezależnych. Wyniki: Analiza statystyczna ANOVA wskazała istotne statystycznie zróżnicowanie żywotności w związku z rodzajem grafenu. Stężenie jak i dawka zastosowanych roztworów

3 również okazały się być istotnymi statystycznie parametrami warunkującymi toksyczność badanych nanomateriałów. Największy wpływ okazał się mieć czas ekspozycji komórek na badane nanozwiązki. Największa liczba komórek żywych znajdowała się w przypadku grafenu A04 w dawce 100 µl i stężeniu 0,01 µg/ml, najmniejsza zaś w A02 w dawce 150 µl i 0,1 µg/ml. W badanych preparatach, pod mikroskopem świetlnym, były widoczne liczne agregaty cząstek grafenu o zróżnicowanej wielkości. Na podstawie analizy morfologii limfocytów nie zauważono by ich budowa była zmieniona. Analiza przeprowadzona za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego wykazała, że na powierzchni wszystkich trzech rodzajów grafenu, dochodziło do kształtowania się biofilmu. W oglądanych preparatach, były widoczne płytki krwi, białka osocza i komórki oblepiające agregaty nanocząstek grafenu. W analizie statystycznej przeprowadzonej w populacji komórek inkubowanych z grafenem w stężeniu 0,01 mg/µl i 0,1 mg/µl, istotnie statystycznie różnice w ilości składnika C5a występowały między próbą ślepą a wszystkimi pozostałymi próbami badanymi. Największy poziom C5a, występował w populacji komórek inkubowanych z grafenem A02. W populacji komórek inkubowanych z grafenem w stężeniu 0,01 mg/µl, istotnie statystycznie różnice w ilości MPO występowały między próbą ślepą a wszystkimi pozostałymi próbami badanymi. W stężeniu 0,1 mg/µl, tak jak w stężeniu 0,01 mg/µl między próbą ślepą a wszystkimi pozostałymi próbami badanymi występowały istotne statystycznie różnice. We wszystkich dawkach i stężeniach, hodowla komórek inkubowanych z A03 odznaczała się największą zawartością mieloperoksydazy, zaś najmniejsza ilość MPO znajdowała się w przypadku komórek hodowanych z GrSiO2 i A04. W populacji komórek inkubowanych z grafenem (0,01 mg/µl i 0,1 mg/µl), istotnie statystycznie różnice w ilości kaspazy 9 występowały między próbą ślepą a wszystkimi pozostałymi próbami badanymi. Największy poziom kaspazy 9 występował w populacji komórek inkubowanych z grafenem A04, a najmniejszy z GrSiO2. Analiza statystyczna nie wykazała istotnych różnic w wynikach uzyskanych pomiędzy poszczególnymi zawiesinami grafenów. W populacji komórek inkubowanych z grafenem w obydwu stężeniach, istotne statystycznie różnice w ilości histonu występowały pomiędzy próbą ślepą a wszystkimi pozostałymi próbami badanymi. Największy poziom γ-h2ax występował w populacji komórek inkubowanych z grafenem A03, najmniejszy zaś w populacji komórek inkubowanych z GrSiO2. Najbardziej zauważalne różnice w ilości IL10 pomiędzy komórkami inkubowanymi z grafenem A02, A03 i A04 były widoczne przy stężeniu 0,01 μg/ml. W populacji komórek CD8- ilość IL10 była bardzo mała, praktycznie na takim samym poziomie jak w przypadku

4 IL10 znajdującej się w populacji komórek niestymulowanych. W populacji komórek CD8+, największa ilość IL10 występowała w przypadku grafenu A04. W populacji wszystkich leukocytów dysproporcja pomiędzy IL10 w populacji A02 i A03 a A04 była jeszcze bardziej widoczna. Poziom interleukiny był najwyższy w przypadku A04. W populacji komórek CD8- największe stężenie IL4 występowało w grupie komórek inkubowanych z A03. Pod względem statystycznym, stężenie to było takie samo, jak w grupie komórek inkubowanych z mitogenem. W populacji komórek CD8+ jak i w populacji wszystkich komórek, największe stężenie było zauważalne w grupie A03. W populacji komórek CD8-, największa ilość IL6, występowała w przypadku A02. W populacji komórek CD8+ zawartość IL6 nieznacznie wzrosła. Również tutaj, największa ilość IL6 znajdowała się w grupie A02 zaś najmniejsza w A04. W populacji wszystkich komórek zawartość IL6 wzrosła najbardziej w przypadku A02. W populacji komórek CD8- najwyższe stężenie TNF-α zostało odnotowane w przypadku A02 i A03. Podobna sytuacja występowała w populacji komórek CD8+. Zawartość TNF-α w grupie A03 i A02 była praktycznie 2 krotnie wyższa niż ilość znajdująca się w A04. W populacji wszystkich komórek największa ilość TNF-α znajdowała się w grupie A03. Różnice miedzy populacjami inkubowanymi z różnymi formami grafenu, w każdym analizowanym przypadku, były istotnie statystyczne. Wnioski. Czas inkubacji okazał się parametrem który najbardziej wpływa na toksyczność nanoczątek grafenu. Prawie równoważny wpływ mają dawka oraz stężenie. Po eliminacji tych czynników można zauważyć duży wpływ rozmiaru nanocząstek. Grafen A02 (SSA: 15 m 2 /g, AFT: 8nm, APS: 4500nm) jak i A03 o małych nanocząstkach (SSA: 80m 2 /g, AFT: 12nm, APS: 500nm), okazał się być znacznie bardziej toksyczne niż grafen A04 o dużych nanocząstkach (SSA: 15m 2 /g, AFT: 60nm, APS: 7000nm). Analiza SEM wykazała silną adsorpcję składników pożywki hodowlanej i komórek do powierzchni nanocząstek co może świadczyć o chemotaktycznym wpływie grafenu na badane komórki. Dalsze badania toksyczności wykazały, że wielkość powierzchni właściwej i rozmiar nanocząstek również mają znaczący wpływ na mechanizm interakcji grafenu z komórkami. W przypadku aktywacji układu dopełniacza, największa ilość składnika C5 znajdowała się w grupie komórek inkubowanych z grafenem A02. W przypadku kaspazy 9, największą zdolność aktywacji wykazywał grafen A04. W przypadku, analizy poziomu MPO jak i γ-h2ax, największy wpływ na jej ilość miał grafen A03. Prawdopodobnie nanocząstki o małych rozmiarach i dużej powierzchni właściwej, silniej aktywują stres oksydacyjny co w konsekwencji doprowadza do zaburzenia struktury DNA komórki. Grafen A04 jak

5 i GrSiO2, okazał się być najbezpieczniejszą formą grafenu względem limfocytów ludzkich. Można zatem wnioskować, że grafen o dużych rozmiarach jak i grafen osadzony na ciele stałym jest najbardziej biokompatybilną formą w odniesieniu do badanych komórek. Z uzyskanych wyników analizy profilu wydzielania IL10, IL4, IL6 i TNF-α, można wywnioskować, że w zależności od powierzchni właściwej, jaki i wielkości nanocząstek, grafen może tłumić lub wzmacniać odpowiedz immunologiczną. GrSiO2 jak i grafen A04, powodował znaczny wzrost stężenia IL10, z kolei nie wpływał na produkcję pozostałych, prozapalnych cytokin. Można zatem przypuszczać, że duże nanocząstki grafenu posiadają zdolność tłumienia reakcji immunologicznej. W przypadku A02 jak i A03, nanocząstki silnie wpływały na produkcję cytokin IL4, IL6 i TNF-α. A03 silniej stymulował produkcję IL4, zaś A02 IL6 i TNF-α. Można zatem przypuszczać, że parametrem warunkującym wydzielanie prozapalnych cytokin jest SSA. Prawdopodobnie nanocząstki o dużej powierzchni właściwej mają zdolność indukcji odpowiedzi humoralnej, zaś nanocząstki o mniejszej SSA - komórkowej. Grafen o małych rozmiarach nanocząstek i dużej powierzchni właściwej, poprzez silny wpływ na produkcję cytokin prozapalnych, okazał się być znacznie bardziej immunotoksyczny niż grafen o dużych nanocząstkach. Na podstawie uzyskanych wyników można również wnioskować, że grafen osadzony na ciele stałym jest najbardziej obojętną formą grafenu względem limfocytów. Assessment of selected parameters of immune response of peripheral blood lymphocytes in the presence of grapheneintroduction Graphene, a carbon nanomaterial, belongs to the family of allotropic carbon nanomaterials. In 2010, for its coverage and description of properties Andre Gejm and Konstantin Novoselov were awarded the Nobel Prize in Physics. The graphene atoms are arranged in a hexagonal crystal lattice, which gives the whole its characteristic honeycomb structure. Carbon atoms are connected with each other through σ bond, formed by valence electrons with hybridisation sp 2. This bond provides a very high mechanical strength, chemical and thermal stability. As a result, this nanomaterial is considered to be the hardest and at the same time the thinnest nanomaterial from among currently known. An unpaired electron from atomic orbital 2pz creates the bond type π which is located perpendicular to the hexagonal plane of graphene and thus graphene has a high electrical conductivity. The π bond ensures a smooth addition of functional groups,

6 proteins, drugs, fluorescent probes and nucleic acids. Additionally, the flexural rigidity of the single-layer graphene is similar to the lipid bilayer of cells membrane and therefore, this nanomaterial is considered to be ideal for the construction of ultrathin biological membranes and cellular scaffolding. Despite numerous spectacular study results the implementation of graphene for use seems to be still far apart in time. This is caused by a very large disparity in the results of toxicological tests. There are many scientific contribution saying that nanoparticles of graphene penetrates cell membrane and thereby causes death of cells. On the other hand, great number of researchers showed that graphene is highly biocompatible with eukaryotic cells. As far as is known, graphene features such as a particle size and a specific surface area have a radical impact on changes of its physicochemical properties, however, an impact of these features on the toxicity of graphene remains unexplained. Aim of the study: The aim of the study was to examine selected parameters of immune response of peripheral blood lymphocytes in the presence of graphene through: Assessment of graphene impact on lymphocyte viability. Assessment of graphene-cell interaction. Assessment of graphene cytotoxicity by examination its impact on activation of complement system, myeloperoxidase and caspase 9. Assessment of graphene genotoxicity by examination of the activation rate of gamma histone H2AX. Assessment of the immune response by evaluation of the secretion profile of proinflammatory and anti-inflammatory cytokines. An additional aim was to examine whether the physical and chemical properties of graphene, as well as the dose, concentration and incubation time have a significant impact on the selected parameters. Material and methods: For the study were used three forms of commercially available graphene, A02, A03 and A04, as a dry powder and graphene deposited on silicon thin slice (GrSiO2) Furthermore, for the study was used whole blood collected from healthy donors. Lymphocytes were isolated in density gradient centrifugation procedure. Cells were incubated with three types of graphene each at a concentration of 0.01 µg/ml, 0.1 µg/ml, 1 µg/ml, at a dose 50 µl, 100 µl 150 µl and with GrSiO2. For the analysis of graphene impact on secretion of cytokine by lymphocytes, isolated cells were divided into three cell populations: CD8+, CD8- and all cell populations. For isolation of the cells was used CD8 MicroBeads Human

7 Kit. Cells viability was measured using the CellTiter-Blue Cell Viability Assay test. Each measurement was carried out in three repetitions, in ten independent cell cultures. The obtained results were analysed in Statistica 13.1 by one-way analysis of variance (one-way ANOVA). For the examination of cells interaction with graphene, after incubation, were made preparations of cell cultures. Some of the preparations were designed for analysis under a light microscope. The other preparations were dehydrated and covered with a thin layer of gold. The preparations were examined under the scanning electron microscope Phenom Pro. Measurement of quantity of C5a complement component, myeloperoxidase, caspase 9 and gamma histone H2AX, as well as the measurement of quantity IL4, IL10, IL6 and TNF-α was carried out by ELISA method with the use of commercial kits. Each measurement were made in three repetitions. The obtained results were statistically analysed using the Student's T-test for independent samples. Results: Results of ANOVA statistical analysis showed statistically significant differentiation of viability by graphene type. The concentration and dose of the solutions used also proved to be a statistically significant parameter determining the toxicity of the tested nanomaterials. The greatest impact was exerted by the time of cells exposure to the studied nanocompounds. The highest number of living cells was found in the case of graphene A04 at a dose of 100 µl and a concentration of 0.01 µg/ml, the lowest in the case of graphene A02 at a dose of 150 µl and a concentration of 0.1 µg/ml. In the examined preparations under a light microscope were visible numerous aggregates of graphene particles of various sizes. On the basis of analysis of lymphocytes morphology, no notice was given that their structure was changed. Scanning electron microscope analysis showed that on the surface of all three types of graphene was formed a biofilm. In the examined preparations were visible platelets, plasma proteins and cells covering the aggregates of graphene nanoparticles. In the statistical analysis conducted in the population of incubated cells with graphene at a concentration of 0.01mg/µl and 0.1 mg/µl statistically significant differences in the quantity of C5a component were observed between the blank test and all other tested samples. The highest level of C5a was observed in the population of incubated cells with graphene A02. In the population of incubated cells with graphene at a concentration of 0.01 mg/µl, statistically significant differences in MPO quantity were observed between the blank test and all other samples. At a concentration of 0.1 mg/µl, as in a concentration of 0.01 mg/µl there were statistically significant differences between the blank test and all other test samples. In

8 all doses and concentrations, culture of incubated cells with A03 showed the highest quantity of myeloperoxidase, while the lowest quantity of MPO was found in cells cultured with GrSiO2 and A04. In the population of incubated cells with graphene (0.01mg/µl and 0.1mg/µl), statistically significant differences in the quantity of caspase 9 occurred between the blank test and all other examined samples. The highest level of caspase 9 was observed in the population of cells incubated with graphene A04, the lowest with GrSiO2. Statistical analysis also did not show statistically significant differences among results obtained between each graphene suspensions. In the population of incubated cells with graphene at both concentrations statistically significant differences in histone quantity were observed between the blank test and all other examined samples. The highest level of γ-h2ax was observed in the population of incubated cells with graphene A03, the lowest in the population of incubated cells with GrSiO2. The most noticeable differences in IL10 quantity between cells incubated with graphene A02, A03 and A04 were observed at a concentration of 0.01 μg/ml. In the population of CD8- cells the quantity of IL10 was very small, virtually at the same level as IL10 in the population of cells of non-stimulated. In the CD8+ cell population the highest IL10 quantity was in the case of graphene A04. In the case of total population of leukocytes disproportion between IL10 in the population A02 and A03 and A04 was even more evident. The level of interleukin was highest in the case of A04. In the CD8- cell population the highest concentration of IL4 was found in the group of cells incubated with A03. Statistically, the concentration was the same as in the group of cells incubated with mitogen. In the population of CD8+ cells, as well as in the population of all cells, the highest concentration was observed in the A03 group. In the CD8- cell population the highest quantity of IL6 was found in the case of A02. In the CD8+ cell population, the quantity of IL6 slightly increased. Here also, the highest quantity of IL6 was in the A02 group and the lowest in the A04 group. In the population of all cells the quantity of IL6 increased the most in the A02 group. In the CD8- cell population the highest concentration of TNF-α was found in the case of A02 and A03. Similar situation occurred in the CD8+ cell population. The quantity of TNF-α in the group A03 and A02 was virtually 2-fold higher than the quantity in the group A04. In the population of all cells the highest quantity of TNF-α was in the A03 group. The differences between populations incubated with different forms of graphene, in each analysed case, were statistically significant.

9 Conclusions. The incubation time has shown to be the parameter that most affects the toxicity of graphene nanoparticles. The dose and concentration have almost equal impact. Once these factors have been eliminated it can be seen that significant impact has the size of the nanoparticles. Grafen A02 (SSA: 15 m 2 /g, AFT: 8nm, APS: 4500nm) and A03 with small nanoparticles (SSA: 80m 2 /g, AFT: 12nm, APS: 500nm) has shown to be much more toxic than A04 with large nanoparticles (SSA: 15m 2 /g, AFT: 60nm, APS: 7000nm). SEM analysis showed strong adsorption of the components of culture medium and cells to the surface of nanoparticles which may indicate chemotactic impact of graphene on the studied cells. Further toxicity studies have shown that the specific surface area of the nanoparticles also has a significant impact on the mechanism of graphene-cell interaction. In the case of complement system activation, the highest quantity of C5 component was found in the group of cells incubated with A02. In the case of caspase 9 graphene A04 showed the highest activation ability. In the case of analysis of MPO and γ-h2ax level, graphene A03 had the greatest impact on its quantity. Probably, small nanoparticles with a large specific surface area, strongly activate oxidative stress which, in turn, causes the disturbance of the cell DNA structure. Grafen A04, as well as GrSiO2, turned out to be the safest form of graphene in relation to human lymphocytes. It can therefore be concluded that large-size graphene and graphene deposited on solid are the most biocompatible forms in regard of tested cells. From the results of the analysis of IL10, IL4, IL6 and TNF-α secretion profiles it can be concluded that depending on the specific surface area and size of nanoparticles, graphene may suppress or strengthen the immune response. GrSiO2 and graphene A04 caused a significant increase of IL10 concentration, in turn, they did not affect the production of other proinflammatory cytokines. It can therefore be assumed that large graphene nanoparticles have the ability to immunosuppression. In the case of A02 and A03 nanoparticles had a strong impact on the production of IL4, IL6 and TNF cytokines. A03 strongly stimulated the production of IL4, while A02 - IL6 and TNF-α. Therefore, it can be assumed that SSA is the determinant of the secretion of proinflammatory cytokines. Probably, nanoparticles with a large specific surface area have the ability to induc a humoral response, while nanoparticles with a smaller SSA have the ability to induce a cellular response. Graphene with small nanoparticle sizes and a large specific surface area, due to its strong impact on the production of proinflammatory cytokines, proved to be much more immunotoxic than graphene with large nanoparticles. On the basis of the obtained results it can also be concluded that graphene deposited on solid is the most neutral form of graphene in regard of lymphocytes.