Marcin Mielecki 16 IX 2014 Zakład Biosyntezy Białka Instytut Biochemii i Biofizyki PAN. Autoreferat pracy doktorskiej:

Transkrypt

1 Marcin Mielecki 16 IX 2014 Zakład Biosyntezy Białka Instytut Biochemii i Biofizyki PAN Autoreferat pracy doktorskiej: Tytuł pracy: Oddziaływanie kinaz białkowych JAK oraz RIO z pochodnymi kwasu cynamonowego Tytuł w języku angielskim: Study of the interactions of protein kinases JAK and RIO with the analogs of cinnamic acid Promotor: Recenzenci: dr hab. Krystyna Grzelak dr hab. Magdalena Stobiecka prof. dr hab. Zygmunt Kazimierczuk Pochodne kwasu cynamonowego są ważnymi składnikami wielu naturalnych produktów pochodzenia roślinnego (owoce, warzywa, zioła czy propolis). Wykazują one ważne aktywności przeciwnowotworowe, jak: chemioprewencyjne, antyproliferacyjne czy antymetastatyczne. Analogi strukturalne benzylowego amidu kwasu cynamonowego (CABA, ang. cinnamic acid benzyl amide) zostały zaprojektowane przez prof. Priebe i współpracowników. Związki z tej grupy hamują wzrost i indukują apoptozę linii komórkowych pochodzących z różnych modeli nowotworowych. Efekt ten jest przynajmniej częściowo związany ze zdolnością tych analogów do supresji ścieżek sygnalnych JAK/STAT w komórce. Celem moich badań było wyjaśnienie na poziomie molekularnym możliwości bezpośredniego oddziaływania analogów CABA z kinazami JAK (JAK2), jak również próba identyfikacji nowych inhibitorów atypowych kinaz RIO (RIO1) w tej grupie związków. W swoich badaniach posługiwałem się różnymi metodami biochemicznymi analizy aktywności enzymatycznej kinaz, modelowaniem molekularnym, jak również nowatorskimi metodami 1

2 elektrochemicznymi. We współpracy z krajowymi oraz zagranicznymi ośrodkami badawczymi wykonana ponadto została fluorescencyjna analiza oddziaływania pochodnych CABA z kinazą RIO1, jak również krystalografia makromolekularna kompleksu kinazy RIO1 z wybraną pochodną CABA. W pierwszym etapie moich badań opracowałem wydajną procedurę otrzymywania homogennego preparatu rekombinowanej kinazy JAK2 w systemie bakulowirusa. Preparat charakteryzował się wyższym stopniem oczyszczenia i stabilności w porównaniu z dostępnymi wówczas komercyjnymi preparatami tej kinazy. Odkryłem, że oczyszczana przeze mnie kinaza JAK2 jest stabilizowana w roztworze w obecności niektórych rodzajów detergentów. Scharakteryzowałem ponadto jej aktywność autofosforylacyjną oraz fosforylacyjną (w obecności naturalnego substratu peptydowego tej kinazy). W przypadku otrzymywanej przeze mnie w systemie bakteryjnym rekombinowanej kinazy RIO1 opisałem aktywność autofosforylacyjną. Nie udało mi się natomiast wykazać jej aktywności fosforylacyjnej (w obecności uniwersalnych białkowych substratów kinaz). Z badanej grupy pochodnych CABA zidentyfikowałem inhibitory kinazy JAK2: WP1702, WP1130 oraz WP1065. Wykazałem, iż niektóre z nich znacznie efektywniej hamują formę zaktywowaną (autofosforylowaną, DFG-in) kinazy aniżeli formę niezaktywowaną (DFG-out), ze stałymi powinowactwa rzędu 10 6 M -1 (IC 50 około 3 M). Zidentyfikowałem ponadto mechanizm inhibicji badanej kinazy. Wykazuje on cechy zarówno inhibicji współzawodniczej dwusubstratowo (WP1702), jak i allosterycznie niewspółzawodniczej (WP1065). Odkryłem ponadto nietypowy mechanizm inhibicji charakterystyczny dla analogu WP1130, który sklasyfikowałem jako pozytywnie kooperatywny. Zaproponowałem model wyjaśniający ten mechanizm. Konsekwencją założeń tego modelu byłoby oddziaływanie typu induced-fit. Wyniki tej części pracy pozwoliły mi na sformułowanie ważnego wniosku, iż bezpośrednia inhibicja aktywowanej kinazy JAK2 przez niektóre analogi CABA przyczynia się do obserwowanej w komórkach nowotworowych supresji ścieżek sygnalnych JAK2/STAT. Ostatnie doniesienia literaturowe coraz częściej wskazują, iż atypowe kinazy z rodziny RIO mogą być atrakcyjnym celem ukierunkowanych molekularnie terapii przeciwnowotworowych. Wyniki wstępne uzyskane w grupie prof. Bogdana Lesynga wskazały na możliwość oddziaływania analogów CABA z kinazami z tej rodziny. Postanowiłem zatem dokładnie zbadać możliwość inhibicji kinazy atypowej RIO1 przez analogi CABA. W toku badań wyselekcjonowałem pierwsze inhibitory kinaz RIO z grupy CABA: WP1609, WP1086 i WP1683 (IC 50 około 4 M), a także wykazałem ATP- 2

3 współzawodniczy mechanizm inhibicji. Wyniki moich badań zostały wsparte zbieżnymi wynikami uzyskanymi z zastosowaniem spektroskopii fluorescencyjnej, jak również krystalografii makromolekularnej. Uzyskane wyniki pozwoliły mi stwierdzić, iż badane analogi CABA mogą służyć jako tzw. związki wiodące do projektowania silniejszych inhibitorów kinaz RIO. Nasuwa się również wniosek, iż obserwowana aktywność antyproliferacyjna analogów CABA może być częściowo związana z ich zdolnością do hamowania atypowych kinaz RIO. Opisana powyżej część pracy pozwala na sformułowanie ważnego wniosku, że analogi CABA są mechanistycznie zróżnicowaną grupą inhibitorów pochodzenia naturalnego o plejotropowej aktywność biologicznej. Co warto podkreślić, niewspółzawodnicze inihibitory, jak WP1065, mogą uzupełniać istniejące inhibitory ATP-współzawodnicze. Jest to możliwe dzięki zwiększonej selektywności działania, a także niewrażliwości na oporność de novo komórek nowotworowych w stosunku do inhibitorów ATP-współzawodniczych. W czasie stażu w Zakładzie Biosensorów Instytut Rozrodu Zwierząt i Badania Żywności, pod kierunkiem prof. Jerzego Radeckiego i prof. Hanny Radeckiej, opracowałem metodologię konstrukcji bioczujnika elektrochemicznego umożliwiającego immobilizację rekombinowanej kinazy RIO1 za pośrednictwem znacznika heksahistydynowego. Bioczujnik ten został oparty na samoorganizującej monowarstwie organotioli zawierającej chelator jonów metali przejściowych oraz na centrum koordynacyjnym utworzonym przez kationy miedzi (II). Posługiwałem się takimi technikami elektrochemicznymi, jak: spektroskopia impedancyjna, woltamperometria cykliczna czy woltamperometria fali prostokątnej. Wstępne wyniki wskazują, że za pomocą skonstruowanego przeze mnie bioczujnika możliwe jest badanie oddziaływań kinazy RIO1 z potencjalnymi inhibitorami. Rozpoczęte badania zostały następnie rozszerzone o nowe aspekty. Opracowana metodologia została użyta do konstrukcji bioczujnika opartego na rekombinowanej kinazie JAK2 (otrzymywanej przeze mnie), a także modyfikacji płytek złotych do badań SPR. Z tej części pracy wynika, że technika badania oddziaływania kinaz ze związkami drobnocząsteczkowymi oparta na bioczujniku elektrochemicznym oraz woltamperometrii fali prostokątnej charakteryzuje się wysokim stopniem czułości (10-7 M), ale niewystarczającym stopniem selektywności, który wymaga poprawy. W czasie realizacji swojej pracy doktorskiej miałem okazję zajmować się ważnym zagadnieniem, jakim jest poszukiwanie strategii leczenia chorób nowotworowych, jak również proliferacyjnych. Jedna z tych strategii polega na supresji aktywowanych ścieżek sygnalnych, od których zależna jest proliferacja i przeżycie komórek nowotworowych, na 3

4 drodze inhibicji kinaz białkowych. Moja praca badawcza wpisuje się w ten właśnie nurt. W przypadku kandydatów na leki przeciwnowotworowe kluczowe jest zrozumienie mechanizmu działania tych związków. Temu celowi, co należy podkreślić, sprzyja realizacja tych badań w niekomercyjnych jednostkach badawczych. W czasie realizacji swojej pracy miałem ponadto okazję zapoznać się z wieloma nowoczesnymi metodami badawczymi, jak: otrzymywanie rekombinowanych białek w różnych systemach ekspresyjnych, spektroskopowa analiza aktywności enzymatycznej kinaz, klasyczna bioinformatyka strukturalna kompleksów białko-ligand, jak również elektrochemiczne metody analizy oddziaływania kinaz ze związkami drobnocząsteczkowymi za pomocą nowatorskich bioczujników elektrochemicznych. Miałem ponadto zaszczyt współpracować z wieloma wybitnymi ekspertami w swoich dziedzinach, jak: prof. Krystyną Grzelak (heterologiczna ekspresja białek), prof. Bogdanem Lesyngiem (biofizyka molekularna) czy prof. Waldemarem Priebe (eksperymentalne terapie przeciwnowotworowe). Opieka nad dwiema pracami magisterskimi (mgr Ingi Szurgot oraz mgr Kamili Kowy), a także praktykami studenckimi była okazją do współpracy z młodymi zdolnymi umysłami. Chciałbym zaznaczyć, iż w czasie realizacji pracy nie ominęły mnie również trudności i problemy badawcze. Były one związane z różnymi technikami i materiałem badawczym, jak np. niską stabilnością rekombinowanej kinazy JAK2 w roztworach wodnych czy nowatorskim podejściem do badania oddziaływań kinaza-związek drobnocząsteczkowy za pomocą bioczujników elektrochemicznych. Nie wszystkie z napotkanych przeszkód udało się rozwiązać zgodnie z oczekiwaniami. Trudności były jednak okazją do rozwoju w danej dziedzinie, a także impulsem do stawiania nowych tez i kontynuowania rozpoczętych badań. Moja rozprawa doktorska oparta jest na poniższym zbiorze publikacji: 1. Mielecki, M.; Milner-Krawczyk, M.; Grzelak, K; Mielecki, D.; Krzyśko, K.A.; Lesyng, B.; Priebe, W. Analogs of cinnamic acid benzyl amide as nonclassical inhibitors of activated JAK2 kinase. Current Cancer Drug Targets, 2014, 14 (7), IF = Mielecki, M.; Krawiec, K.; Kiburu, I.; Grzelak, K.; Zagórski, W.; Kierdaszuk, B.; Kowa, K.; Fokt, I.; Szymanski, S.; Świerk, P.; Szeja, W.; Priebe, W.; Lesyng, B.; LaRonde- LeBlanc, N. Development of novel molecular probes of the Rio1 atypical protein kinase. Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Proteins and Proteomics, 2013, 1834 (7), IF =

5 3. Mielecki, M.; Wojtasik, J.; Zborowska, M.; Kurzątkowska, K.; Grzelak, K.; Dehaen, W.; Radecki, J.; Radecka, H. Oriented immobilization of His-tagged kinase RIO1 protein on redox active N-(IDA-like)-Cu(II) monolayer deposited on gold electrode The base of electrochemical biosensor. Electrochimica Acta, 2013, 96 (0), IF = Wojtasik, J.; Mielecki, M.; Kurzątkowska, K.; Grzelak, K.; Verwilst, P.; Dehaen, W.; Radecki, J.; Radecka, H. Pentetic acid (DPTA) Cu(II) monolayer deposited on gold electrode - The base of biosensors for electrochemical screening of kinase JAK2 and potential inhibitor interactions. Sensors and Actuators B: Chemical, 2014, 196 (0), IF = Kurzątkowska, K.; Mielecki, M.; Grzelak, K.; Verwilst, P.; Dehaen, W.; Radecki, J.; Radecka, H. Immobilization of His-tagged kinase JAK2 onto the surface of a plasmon resonance gold disc modified with different copper (II) complexes. Talanta, 2014, 130 (0), IF =