AUTOREFERAT PAWEŁ ZAJDEL ZAKŁAD CHEMII LEKÓW KATEDRA CHEMII FARMACEUTYCZNEJ WYDZIAŁ FARMACEUTYCZNY

Transkrypt

1 AUTOREFERAT PAWEŁ ZAJDEL ZAKŁAD CHEMII LEKÓW KATEDRA CHEMII FARMACEUTYCZEJ WYDZIAŁ FARMACEUTYCZY Kraków 2012

2 SPIS TREŚCI 1. Ogólna charakterystyka dorobku naukowego Prezentacja osiągnięć stanowiących podstawę habilitacji Wykaz publikacji stanowiących podstawę habilitacji Prezentacja wyników stanowiących podstawę habilitacji Wprowadzenie Receptory 5-HT 7 nowy cel terapeutyczny w afektywnych chorobach OU Antagoniści receptorów 5-HT 7 wymogi strukturalne Wysokowydajne metody syntezy chemicznej na fazach stałych Cel badań Wyniki badań i dyskusja Podsumowanie wyników badań stanowiących podstawę habilitacji Omówienie pozostałych osiągnięć naukowych Działalność naukowo-badawcza przed uzyskaniem stopnia doktora Działalność naukowo-badawcza po uzyskaniu stopnia doktora Piśmiennictwo Współpraca naukowa Udział w projektach badawczych Recenzje prac naukowych Staże i szkolenia zagraniczne agrody i wyróżnienia

3 1. OGÓLA CHARAKTERYSTYKA DOROBKU AUKOWEGO W latach studiowałem na Wydziale Farmaceutycznym Collegium Medicum Uniwersytetu Jagiellońskiego. Pracę magisterską pod tytułem Synteza i właściwości fizykochemiczne amidowych pochodnych pirolidyno-2,5-dionu, wykonałem pod kierunkiem Dr Jolanty Obniskiej w Katedrze Chemii Farmaceutycznej CM UJ, uzyskując, w 1998 roku, tytuł magistra farmacji. Po ukończeniu studiów we wrześniu 1998 roku zostałem zatrudniony na stanowisku asystenta w Katedrze Chemii Farmaceutycznej CM UJ kierowanej przez prof. dr hab. Alfreda Zejca. Od tego momentu zostałem włączony w tematykę prac badawczych obejmujących badania chemicznofarmakologiczne nowych związków o przewidywanej aktywności na ośrodkowy układ nerwowy pod kierunkiem prof. dr hab. Macieja Pawłowskiego. Znaczące wzbogacenie mojego warsztatu metodycznego w dziedzinie chemii peptydów i syntezy na nośnikach polimerowych, nastąpiło dzięki odbyciu, w latach , trzech pięciomiesięcznych staży doktorskich, w ramach polsko-francuskiego programu stypendialnego cotutelle, w Laboratorium Aminokwasów, Peptydów i Białek (LAPP), Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Montpellier I w Montpellier (Francja), w zespole kierowanym przez prof. Jeana Martineza. Stopień naukowy doktora nauk farmaceutycznych w dyscyplinie chemia leków, został mi nadany uchwałą Rady Wydziału Farmaceutycznego UJ CM w Krakowie oraz Uniwersytetu Montpellier I (Francja), w roku 2006, na podstawie rozprawy doktorskiej pt. ovel aryl-alkyl-piperazines with - acylated amino acids as serotoninergic receptors ligands wykonanej w systemie co-tutelle, pod kierunkiem prof. dr hab. Macieja Pawłowskiego i prof. Jeana Martineza. Rozprawa ta została wyróżniona decyzją Rady Wydziału Farmaceutycznego UJ CM. a tym etapie rozwoju naukowego mój łączny dorobek naukowy obejmował współautorstwo 7 prac eksperymentalnych o sumarycznym współczynniku IF równym 15,901. Od 1 czerwca 2006 roku jestem zatrudniony na stanowisku adiunkta w Zakładzie Chemii Leków Katedry Chemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum. Mój aktualny dorobek naukowy obejmuje 21 prac oryginalnych, opublikowanych w czasopismach znajdujących się na tzw. Liście Filadelfijskiej (IF wynosi 50,513), 1 patent, 1 zgłoszenie patentowe i 3 prace przeglądowe (sumaryczny IF wynosi 52,977). Opublikowane prace były cytowane 115 razy, a odpowiadający im indeks Hirscha wynosi 6. Wyniki badań prezentowałem w charakterze zaproszonego referenta na konferencji międzynarodowej i krajowej VII Joint Meeting on Medicinal Chemistry w Katanii i II Konwersatorium Chemii Medycznej w Lublinie oraz w formie 2 referatów własnych (w tym podczas 29th European Peptide Symposium w Gdańsku). Jestem ponadto 3

4 współautorem 34 doniesień zjazdowych prezentowanych na międzynarodowych i krajowych konferencjach i sympozjach naukowych. Jestem również współautorem III wydania podręcznika akademickiego pod redakcją A. Zejca, M. Gorczycy pt. Chemia leków. Aktualnie kieruję 1 projektem badawczym finansowanym przez MiSW, w kolejnym jestem głównym wykonawcą. W ubiegłych latach uczestniczyłem w 2 projektach finansowanych przez MiSW. Od 2009 jestem kierownikiem zadania w projekcie dofinansowanym przez CBiR. Biorę również udział w realizacji jednego z zadań badawczych projektu strukturalnego współfinansowanego przez Unię Europejską. 2. PREZETACJA OSIĄGIĘĆ STAOWIĄCYCH PODSTAWĘ HABILITACJI WYIKAJĄCE Z ART. 16, UST. 2 USTAWY Z DIA 14 MARCA 2003 R. O STOPIACH AUKOWYCH I TYTULE AUKOWYM ORAZ O STOPIACH I TYTULE W ZAKRESIE SZTUKI (DZ.U. R 65, POZ. 595, Z PÓŹ. ZM.) Przedstawionym do oceny jest cykl publikacji składający się z 7 prac opublikowanych w latach i prezentujący Ligandy receptorów 5-HT 7 o potencjalnych właściwościach przeciwdepresyjnych i przeciwlękowych nowe koncepcje syntezy na nośnikach polimerowych. We wszystkich pracach, za wyjątkiem patentu, jestem pierwszym autorem i w większości autorem korespondującym. Wymienione prace zostały opublikowane w czasopismach zagranicznych o sumarycznym IF wynoszącym 19, WYKAZ PUBLIKACJI STAOWIĄCYCH PODSTAWĘ HABILITACJI P-1. Zajdel, P.; Pawłowski, M.; Martinez, J.; Subra, G. Combinatorial chemistry on solid-support in the search for central nervous system agents. Comb. Chem. High Throughput Screening 2009, 12, (IF 2009 = 2,117) P-2. Zajdel, P.; Subra, G.; Verdie, P.; Gabzdyl, E.; Bojarski, A.J.; Duszyńska, B.; Martinez, J.; Pawłowski, M. Sulfonamides with -alkyl- -dialkylguanidine moiety as 5-HT 7 receptor ligands. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, (IF 2009 = 2,650) P-3. Zajdel, P.; Marciniec, K.; Maślankiewicz, A.; Paluchowska, M.H.; Satała, G.; Partyka, A.; Jastrzębska-Więsek, M.; Wróbel, D.; Wesołowska, A.; Duszyńska, B.; Bojarski, A.J.; Pawłowski, M. Arene- and quinoline-sulfonamides as novel 5-HT 7 receptor ligands. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, (IF 2011 = 2,978) P-4. Zajdel, P.; Marciniec, K.; Maślankiewicz, A.; Satała, G.; Duszyńska, B.; Bojarski, A.J.; Partyka, A.; Jastrzębska-Więsek, M.; Wróbel, D.; Wesołowska, A.; Pawłowski, M. Quinoline- and isoquinoline- 4

5 sulfonamide derivatives of LCAP as potent CS multi-receptor 5-HT 1A /5-HT 2A /5-HT 7 and D 2 /D 3 /D 4 agents: the synthesis and pharmacological evaluation. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, (IF 2011 = 2.978) P-5. Martinez, J.; Zajdel, P.; Pawłowski, M.; Subra, G. Pipecolic linker and its use for chemistry on solid support. Patent WO 2010/ A1. P-6. Zajdel, P.; omezine, G.; Masurier,.; Amblard, M.; Pawłowski, M.; Martinez, J.; Subra, G. A new highly versatile handle for chemistry on a solid support: the pipecolic linker. Chem. Eur. J. 2010, 16, (IF 2010 = 5,476) P-7. Zajdel, P.; Masurier,.; Sanchez, P.; Pawłowski, M.; Kreiter, A.; omezine, G.; Enjalbal, C.; Amblard, M.; Martinez, J.; Subra, G. Recycling the versatile pipecolic linker. J. Comb. Chem. 2010, 12, (IF 2010 = 3,122) Syntezę arylosulfonamidowych pochodnych -alkilo- -dialkilguanidyn (P-2), aryloi heteroarylo-sulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych pochodnych aryloalkilo- lub/i alkiloamin (P-3, P-4) wykonano w Zakładzie Chemii Leków Katedry Chemii Farmaceutycznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie. Badania nad opracowaniem linkera pipekolowego i rozwojem nowych metod syntezy na nośnikach polimerowych (P-5, P-6, P-7) są prowadzone w Krakowie we współpracy z Laboratorium Aminokwasów, Peptydów i Białek, Instytutu Biocząsteczek Max Mousseron, Uniwersytetu Montpellier I we Francji. Syntezę bloków budulcowych o strukturze chlorków kwasów chinolino- i izochinolinosulfonowych, potrzebnych do syntezy odpowiednich, finalnych pochodnych chinolino(izochinolino) sulfonamidowych (P-3, P-4) wykonano w Katedrze Chemii Organicznej Śląskiego Uniwersytetu Medycznego w Sosnowcu. Badania farmakologiczne in vitro zostały wykonane w Zakładzie Chemii Leków Instytutu Farmakologii PA w Krakowie (P-2, P-3, P-4), w Zakładzie Cytobiologii i Histochemii Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie (P-3) oraz w Firmie CEREP w Celle l'evescault we Francji. Badania farmakologiczne in vivo zostały wykonane w Zakładzie Farmacji Klinicznej Uniwersytetu Jagiellońskiego Collegium Medicum w Krakowie (P-3, P-4). 5

6 2.2. PREZETACJA WYIKÓW STAOWIĄCYCH PODSTAWĘ HABILITACJI WPROWADZEIE Schorzenia typu depresyjnego, obok schizofrenii i zaburzeń lękowych, zaliczane są do grupy afektywnych zaburzeń ośrodkowego układu nerwowego. Według przewidywań Światowej Organizacji Zdrowia, w 2020 roku depresja znajdzie się na drugim miejscu światowej listy chorób o ciężkim przebiegu, wywołujących cierpienia psychiczne i fizyczne oraz będących przyczyną przedwczesnej śmierci. a obraz depresji składa się wiele symptomów, które można podzielić na emocjonalne, poznawcze (kognitywne) oraz behawioralno-biologiczne. Chory cierpi z powodu obniżonego nastroju, podlegającego wahaniom w ciągu dnia, utraty zdolności do odczuwania przyjemności (anhedonia) i anergii, a u niektórych pacjentów dominuje obawa przed przyszłością i poczucie lęku. Do zaburzeń poznawczych należy spadek sprawności intelektualnej, zaburzenia koncentracji i uwagi, obniżenie możliwości samooceny, poczucie małej wartości z towarzyszącym poczuciem winy, pesymistyczna ocena teraźniejszości i przyszłości, którym często towarzyszą myśli samobójcze. Do objawów behawioralno-biologicznych zaliczamy zaburzenia łaknienia (zmniejszony apetyt połączony często ze spadkiem masy ciała), zaburzenia aktywności fizycznej (zmniejszenie aktywności, wzmożona męczliwość) oraz zaburzenia snu z wcześniejszym wybudzaniem się. Mimo postępu, współczesna farmakoterapia depresji nie dysponuje idealnym lekiem zmniejszającym ryzyko nawrotu choroby. W większości przypadków, leki przeciwdepresyjne osiągają swój pełny efekt terapeutyczny z dużym opóźnieniem (latencja), często po kilku tygodniach. U około 30% pacjentów, rozpatrywanych jako biochemicznie odmienne indywidualności, przyjmowanie leków przeciwdepresyjnych nie wiąże się z oczekiwaną poprawą. Ograniczeniem skuteczności farmakoterapii jest również rozwijająca się w trakcie stosowania tolerancja na leki, a w dłuższej perspektywie obserwuje się zaburzenia seksualne, przyrost masy ciała i zaburzenia funkcji poznawczych. Skłania to do poszukiwania nowych substancji leczniczych i rozwijania nowych kierunków leczenia depresji. 6

7 RECEPTORY 5-HT 7 OWY CEL TERAPEUTYCZY W AFEKTYWYCH CHOROBACH OU Badania nad rolą i funkcją serotoniny (5-hydrokstryptamina, 5-HT) mają bardzo długą historię i sięgają lat pięćdziesiątych ubiegłego stulecia. Serotonina uczestniczy w kontroli wielu funkcji fizjologicznych, m.in. uczenia się, pamięci, snu, bólu, temperatury ciała, rytmów biologicznych. Badania udowodniły zaangażowanie serotoniny w etiologii takich chorób jak depresja, lęk, schizofrenia, migrena, czy zaburzenia funkcji układu sercowo-naczyniowego, pokarmowego i wydalniczego. Zróżnicowane efekty działania 5-HT pozostają jednak nie do końca wyjaśnione. Składa się na to szeroka reprezentacja neuronów 5-HT oraz duża liczba podtypów receptorów serotoninowych. 1,2 Receptory 5-HT 7 są ostatnimi z opisanych, na początku lat dziewięćdziesiątych, przedstawicielami rodziny metabotropowych receptorów serotoninowych, sprzężonych z białkiem Gs. Ich aktywacja stymuluje cyklazę adenylową i skutkuje podwyższeniem poziomu camp. Receptory te zostały sklonowane z materiału ludzkiego i kilku gatunków gryzoni, wykazując znaczącą zbieżność międzygatunkową. 3 ajwyższą koncentrację receptorów 5-HT 7 w OU człowieka i gryzoni obserwuje się w rejonie wzgórza, podwzgórza (szczególnie w jądrze nadskrzyżowaniowym), korze mózgowej i hipokampie. Receptory 5-HT 7 zlokalizowane są również w narządach obwodowych nerkach, śledzionie, jelitach oraz w mięśniach gładkich naczyń krwionośnych. Badania immunocytochemiczne wskazały na wpływ receptorów 5-HT 7 na aktywność pre- i post-synaptycznych neuronów GABA i neuronów glutamatergicznych. Obecność receptorów 5-HT 7 w obrębie podwzgórza, koresponduje z ich zaangażowaniem w kontrolę rytmów okołodobowych (karkadialnych), termoregulację i sterowanie czynnościami endokrynnymi. Regulacja rytmów karkadialnych; procesów zasypiania i nastroju, jest ściśle powiązana z funkcjonowaniem jądra nadskrzyżowaniowego. Wykazano, że zmiana faz w jądrze nadskrzyżowaniowym, indukowana podaniem 8-OH-DPAT (nieselektywnego agonisty receptorów 5-HT 1A i 5-HT 7 ) jest wynikiem pobudzenia receptorów 5-HT 7, a nie 5-HT 1A, jak do tej pory uważano. 4 Lokalizacja receptorów 5-HT 7 we wzgórzu i korze mózgowej może mieć znaczenie dla kontroli snu, regulacji nastroju oraz w procesach biochemicznych prowadzących do rozniecania ognisk padaczkowych. Obecność receptorów 5-HT 7 w hipokampie związania jest z ich zaangażowaniem w procesy uczenia się i zapamiętywania. Proponowany jest również mechanizm, w którym receptorom 5-HT 7 przypisuje się rolę wazoaktywną i neurogenną, odpowiedzialną za powstawanie objawów migreny. 5,6 7

8 ie bez znaczenia jest fakt, że wysokie powinowactwo do receptorów 5-HT 7 wykazują dostępne w terapii leki z grupy trójcyklicznych leków przeciwdepresyjnych oraz typowych i atypowych leków przeciwpsychotycznych. 7,8 Wyniki badań klinicznych wskazały możliwość zastosowania atypowych neuroleptyków (np. risperidon, olanzapina, aripiprazol) w terapii skojarzonej z SSRI; efektem takiej kombinacji była zwiększona skuteczność SSRI w przypadku depresji lekoopornych oraz depresji dwubiegunowej. 9 U pacjentów z depresją stwierdzono skrócenie latencji pierwszego epizodu fazy snu REM (ang. Rapid Eye Movement, szybkie ruchy gałek ocznych), równocześnie ze zwiększeniem liczby stadiów snu REM, dysregulację zasypiania, nocne przebudzenia, okresową bezsenność i wczesne poranne przebudzenia. Udowodniono, że selektywne skrócenie czasu fazy snu REM szybko eliminuje nastrój depresyjny. 10 Bezpośrednie zaangażowanie receptorów 5-HT 7 w regulację snu, zostało udowodnione u myszy pozbawionych receptorów 5-HT 7, jak i u myszy normalnych, po podaniu antagonistów tych receptorów (SB i SB ). W tych przypadkach dochodzi do opóźnienia pojawienia się fazy REM oraz skrócenia czasu trwania i liczby występujących w czasie snu epizodów REM, tj. zmian przeciwnych do tych, jakie obserwowane są u pacjentów z depresją. 11 W badaniach behawioralnych u zwierząt normalnych, po podaniu antagonistów receptorów 5-HT 7 zaobserwowano skrócenie czasu bezruchu w teście wymuszonego pływania i teście zawieszenia za ogon. Tego efektu nie zaobserwowano u myszy genetycznie pozbawionych receptorów 5-HT Łączne podanie nieaktywnych dawek związku SB i citalopramu skutkowało nasileniem pożądanego efektu przeciwdepresyjnego leku z grupy SSRI. 13 Podobne efekty, skrócenie czasu bezruchu w teście wymuszonego pływania, odnotowano stosując podprogowe dawki SB i leków przeciwdepresyjnych (m.in. imipramina, reboksetyna, moklobemid) u gryzoni. 12,14,15 Doniesienia literaturowe wskazują ponadto na potencjalne zaangażowanie receptorów 5-HT 7 w regulację stanów lękowych. Działanie takie wydaje się szczególnie ważne w aspekcie współistnienia zaburzeń lękowych i depresyjnych. Wyniki badań wskazują, że u około 30% chorych na depresję występują objawy lęku napadowego, a u 50% chorych z lękiem rozwija się depresja. Ponadto, fobie społeczne, będące jedną z postaci zaburzeń lękowych, poprzedza wystąpienie depresji aż u 70% chorych. Zastosowanie antagonisty SB ujawniło jego efekt przeciwlękowy w teście konfliktu wg Vogla oraz teście podniesionego labiryntu krzyżowego u szczurów. Aktywność przeciwlękową związku SB udowodniono również w teście czterech płytek u myszy. 16 Wyniki badań uzyskane dla leków z grupy neuroleptyków, amisulprydu i arypiprazolu, otwierają nowe perspektywy dla badań nad znaczeniem receptorów 5-HT 7, jako nowego celu terapeutycznego w leczeniu depresji. Amisulpryd, w wielu krajach zarejestrowany w terapii schizofrenii, we Włoszech stosowany jest również w terapii dystemii, łagodnej postaci depresji. Ostatnio udowodniono, że efekt 8

9 przeciwdepresyjny, tego od lat znanego antagonisty D 2 /D 3 receptorowego, jest wynikiem kompetycyjnego blokowania receptorów 5-HT Mechanizm ten potwierdzono w badaniach na zwierzętach z genetycznie usuniętymi receptorami 5-HT 7, w których amisulpryd nie wykazał działania przeciwdepresyjnego. Arypiprazol, oprócz głównego wskazania w schizofrenii, posiada rejestrację w terapii uzupełniającej w depresji i chorobie dwubiegunowej. W testach przedklinicznych, arypiprazol wykazywał działanie charakterystyczne dla leków przeciwdepresyjnych, tj. skracał czas bezruchu myszy w teście zawieszenia za ogon oraz w teście wymuszonego pływania. Efekt ten nie jest obserwowany u myszy genetycznie pozbawionych receptorów 5-HT Ponadto arypiprazol, podobnie jak SB , zwiększał efekt przeciwdepresyjny fluoksetyny (przedstawiciela SSRI) ATAGOIŚCI RECEPTORÓW 5-HT 7 WYMOGI STRUKTURALE Poszukiwania związków charakteryzujących się powinowactwem do receptorów 5-HT 7 rozpoczęły się od identyfikacji szerokiej klasy nieselektywnych ligandów będących analogami tryptaminy, związkami o strukturze ergolinowej oraz zróżnicowanych strukturalnie atypowych neuroleptyków. Klasyfikacja ligandów receptorów 5-HT 7 była przedmiotem prac przeglądowych 6,19,20 i nie jest celem niniejszego opracowania. Z historycznego punktu widzenia jednak, na uwagę zasługują przedstawiciele arylosulfonamidowych pochodnych pirolidyny SB i SB , o cechach antagonistów receptorów 5-HT 7 ; do dnia dzisiejszego znajdujących zastosowanie jako związki narzędziowe w farmakologii doświadczalnej (Rycina 1). HO S O O H S O O O Cl SB K i(5-ht7) = 1.2 nm K i(5-ht1a) > 5 µm SB K i(5-ht7) = 3.2 nm K i(5-ht1a) = 250 nm Rycina 1. Arylosulfonamidy jako ligandy receptorów 5-HT 7. Liczną grupę antagonistów receptorów 5-HT 7 stanowią długołańcuchowe pochodne arylopiperazyny (LCAP), arylotetrahydropirydyny, β-karboliny, tetrahydroizochinoliny, czy perhydroizochinoliny, z fragmentami terminalnymi o strukturze arylosulfonamidowej, arylosulfonów, tetrahydrobenzindolu, oraz różnie podstawionego oksindolu (Rycina 2). Ze względu na podobieństwo strukturalne do ligandów receptorów 5-HT 1A, pochodne LCAP wykazujące wysokie powinowactwo do receptorów 5-HT 7, często pozbawione są zadowalającej selektywności względem receptorów 5-HT 1A i 5-HT 2A. Wymogi strukturalne dla antagonistów receptorów 5-HT 7 zostały określone przez kilka grup badawczych Pomimo różnic w elementach składowych poszczególnych modeli 9

10 farmakoforowych, można dostrzec w nich elementy wspólne. Sugeruje się, że miejsce wiążące receptora 5-HT 7 znajduje się w dwóch obszarach między domenami TM 4 6 oraz TM 7 3. O O S I K i(5-ht7) = 19 nm O O O S II K i(5-ht7) = 8 nm H O DR-4404 K i(5-ht7) = 2,1 nm H O III K i (5-HT2A) = 17,5 nm K i (5-HT7) = 7 nm Cl Rycina 2. Wybrani przedstawiciele ligandów receptorów 5-HT 7. Zaangażowanie różnych oddziaływań wynika z różnej budowy poszczególnych klas ligandów. Podstawowym, wspólnym elementem w strukturze ligandów, jest zasadowy atom azotu oddziaływujący z Asp 3.32 w III domenie TM oraz układ aromatyczny oddalony o 6,9 7,7 Å od atomu azotu. 23 Trzecim elementem jest układ o charakterze akceptora wiązań wodorowych lub drugi układ aromatyczny, zlokalizowany między domenami 4 a 6, w odległości 4,3 7,8 Å od zasadowego atomu azotu. Ważnym elementem w projektowaniu ligandów 5-HT 7 receptorowych jest dopasowanie terminalnego fragmentu aromatycznego do wolnej kieszeni receptora WYSOKOWYDAJE METODY SYTEZY CHEMICZEJ A FAZACH STAŁYCH Wysokowydajne metody chemiczne (ang. HTC High-Throughput Chemistry) to szereg zróżnicowanych technik, mających na celu syntezę, w sposób szybki i wydajny, dużej liczby analogów strukturalnych, głównie o potencjalnej aktywności biologicznej, określanych mianem bibliotek związków. Rozwój tych metod przypadł na lata dziewięćdziesiąte ubiegłego stulecia, będąc konsekwencją postępu w zakresie technik biologii molekularnej i inżynierii genetycznej. Identyfikacja nowych celów biologicznych oraz opracowanie wysokowydajnych metod przesiewowej oceny aktywności biologicznej (ang. HTS High-Throughput Screening) stały się kołem zamachowym dla opracowania wysokowydajnych metod chemicznych. Pionierem w rozwoju tych metod był Profesor Bruce Merrifield, który w 1963 roku, jako pierwszy, opublikował syntezę krótkiego peptydu na nośniku polistyrenowym. 24 Według zaprezentowanej koncepcji; C-końcowy aminokwas został zakotwiczony wiązaniem kowalencyjnym do nośnika stałego i poprzez sekwencyjne dołączanie kolejnych aminokwasów zsyntetyzowano tetrapeptyd. Tak 10

11 uzyskany produkt został, w ostatnim etapie, uwolniony od podłoża (Rycina 3). Ta przełomowa praca stworzyła podwaliny dla nowej dziedziny w chemii organicznej, którą nazwano syntezą na fazie stałej. Określenie to oddaje zamysł jaki towarzyszył Merrifieldowi, jednak nie do końca jest zgodny ze stanem faktycznym. Właściwy proces nie odbywa się sensu stricto tylko na powierzchni nośnika, a w spęczniałej pod wpływem rozpuszczalnika, usieciowanej strukturze polimerowej żywicy. Synteza Merrifielda otworzyła nieograniczone możliwość syntezy peptydów i białek, które do tej pory były nieosiągalne, a jeżeli tak, to w bardzo małych ilościach w wyniku pracochłonnej, tradycyjnej syntezy w roztworze. Rycina 3. Ogólny schemat syntezy organicznej na nośnikach polimerowych (X grupa funkcyjna linkera, np.: CH 2 Cl, H 2 ; Y grupa odchodząc produktu końcowego, np.: COOH, COH 2 ). Prawdziwy rozwój syntezy na nośnikach polimerowych nastąpił w latach dziewięćdziesiątych, kiedy żywicę polimerową zastosowano w syntezie małocząsteczkowych związków organicznych. 25 Zwiększające się zapotrzebowanie na syntezę zróżnicowanych strukturalnie bibliotek związków, przyczyniło się do zaadoptowania do syntezy na nośnikach polimerowych, wielu standardowych procesów chemicznych, stosowanych w syntezie w roztworze. W konsekwencji, dostępne metody nie ograniczały się tylko do formowania wiązań amidowych. Aby zwiększyć arsenał procesów chemicznych prowadzonych na nośnikach polimerowych, opracowano specjalne struktury, określane mianem łączników (linkerów, ang. linker). 26 Mają one charakter związków dwufunkcyjnych; z jednej strony na stałe połączonych wiązaniem kowalencyjnym z nośnikiem polimerowym, z drugiej służącym do mocowania pierwszego substratu do nośnika oraz uwolnienia produktu finalnego w ściśle określonych warunkach, pod wpływem specyficznego czynnika. W przypadku przyłączanych po linkera związków dwufunkcyjnych, np. aminokwasów, linkery stanowią pewnego rodzaju grupę ochronną, blokując jedno z miejsc aktywnych w cząsteczce. Linkery zwykle mają wydłużoną strukturę. Dzięki odsunięciu substratu od podłoża zapewniają one większą swobodę konformacyjną, co zwiększa reaktywność oraz zbliża warunki syntezy do tych panujących w roztworze. Idealny linker winien być tani, łatwy w syntezie i łączeniu do żywicy, stabilny w zróżnicowanych warunkach reakcji. ie bez znaczenia jest zdolność i uwalniania produktu 11

12 końcowego w łagodnych warunkach, aby nie zniszczyć właściwego produktu oraz nie doprowadzić do przedwczesnego odłączenia w trakcie realizacji wieloetapowej syntezy. iestety, wiele z dostępnych linkerów nie spełnia powyższych kryteriów. Dlatego trwają prace nad rozwojem nowych koncepcji linkerów do prowadzenia syntez na nośnikach polimerowych. Trudno zastosować jedną, uniwersalną klasyfikację linkerów; może opierać się ona na rodzaju czynnika zastosowanego do uwolnienia produktu finalnego i środowiska, w jakim dany linker jest stabilny (środowisko kwaśne, zasadowe, promieniowanie UV, czynniki utleniająco-redukujące), na rodzaju substratów, które można przyłączyć do nośnika oraz struktury chemicznej odłączanych produktów. Klasyczne linkery uwalniają produkty finalne pozostawiając niezmodyfikowane miejsce przyłączenia o charakterze amin, alkoholi lub kwasów karboksylowych. Do tej kategorii zaliczamy linkery typu safety catch, czyli rozszczepialne po aktywacji (np. linker Kennera). 27 Rycina 4. Ogólny podział dostępnych linkerów. Rozwój metod syntezy na fazach stałych doprowadził do opracowania łączników przekształcających grupy funkcyjne odłączanych produktów (uwolnienie różnicujące). Tego typu linkery umożliwiają, przykładowo, uzyskanie związków o strukturze amidowej lub imidowej z wyjściowych analogów o strukturze kwasu karboksylowego. Innym rozwiązaniem są łączniki bezśladowe (uwolnienie bezśladowe), tworzące wiązanie C H lub C C w odłączonym związku (Rycina 4). Przykładem tego typu łączników są linkery sililowe. 28 Pierwotna koncepcja chemii kombinatorycznej, zdefiniowana jako szybka synteza jak największej liczby bibliotek, strukturalnie zbliżonych związków, liczących jednorazowo nawet do 100 tysięcy cząsteczek, nie podwyższyła liczby substancji wprowadzonych do badań klinicznych. Pierwszą generację bibliotek charakteryzowała duża liczebność składników mieszanin. Skutkowało to długim 12

13 czasem koniecznym na rozpracowanie aktywnej mieszaniny (dekonwolucję) i resyntezę poszczególnych składników bibliotek; nierzadko, konsekwencją tego było uzyskanie rozbieżnych wyników. 29,30 Od tego czasu, zmieniła się główna ideologia wysokowydajnych metod chemicznych. Celem jej jest aktualnie synteza racjonalnie zaprojektowanych, małych bibliotek związków o dużym zróżnicowaniu strukturalnym. We wstępnej selekcji związków często stosowane są metody wirtualnego skriningu, które mają na celu identyfikację struktur wykazujących najwyższe prawdopodobieństwo wiązania z określonym celem biologicznym. Stosowane metody obliczeniowe in silico opierają się na ocenie właściwości fizykochemicznych cząsteczek, parametrów farmakokinetycznych lub bardziej zaawansowaną analizę sposobu oddziaływania projektowanych związków w miejscu wiążącym celu biologicznego. 31,32 Charakterystykę oraz postęp w rozwoju wysokowydajnych metod chemicznych (generacja I-III) przedstawiono na Rycina 5. Rycina 5. Wysokowydajne metody chemiczne w procesie poszukiwania nowych leków na przestrzeni ostatniego dwudziestolecia. Ponadto, aby zapewnić powtarzalność wyników uzyskiwanych w testach biologicznych, poszczególne związki winny być oczyszczone chromatograficznie. Zmieniała się również skala prowadzonych syntez i wymogiem dnia dzisiejszego jest uzyskanie minimum mg związku. 33 Ilości te pozwalają na opracowanie repozytorium związków dla weryfikacji aktywności wobec nowych, potencjalnych celów biologicznych. 34 Reasumując, wysokowydajne metody chemiczne nie stanowią aktualnie narzędzia do syntezy dużych bibliotek związków, będących wynikiem chemicznych metod kondensacji. Podejścia syntetyczne ewoluowały; z trywialnych przemian na fazie stałej, do oryginalnych metod umożliwiających syntezę zaprojektowanych, w oparciu o metody chemoinformatyczne, zróżnicowanych strukturalnie bibliotek związków. 13

14 2.3. CEL BADAŃ Celem farmakologicznym badań obejmujących habilitację jest znalezienie nowych ligandów receptorów 5-HT 7 o cechach antagonistów tych receptorów. W świetle dotychczasowych danych wskazujących na zaangażowanie receptorów 5-HT 7 w patomechanizm afektywnych schorzeń ośrodkowego układu nerwowego depresji i lęku, antagoniści receptorów 5-HT 7 wydają się być obiecującą grupą dla opracowania nowej generacji leków przeciwdepresyjnych. 35 Realizując cel chemiczny habilitacji podjęto badania syntetyczne, mające na celu znalezienie, wśród kilku zróżnicowanych strukturalnie analogów LCAP, aktywnych ligandów receptorów monoaminergicznych, ze szczególnym uwzględnieniem receptorów 5-HT 7. Skoncentrowano się na opracowaniu nowych metod do syntezy na nośnikach polimerowych. Wypracowane narzędzia postanowiono zastosować w syntezie zaprojektowanych ligandów. Uzyskane wyniki badań biologicznych in vitro i funkcjonalnych in vivo, oraz ocena zależności struktura-aktywność, pozwolą na określenie wpływu zaproponowanych modyfikacji strukturalnych na powinowactwo do receptorów monoaminergicznych i profil aktywności wewnętrznej nowych ligandów receptorowych. Badania behawioralne umożliwią określenie potencjalnych efektów przeciwdepresyjnych, przeciwlękowych, także przeciwpsychotycznych zsyntetyzowanych związków, a więc ich przydatność jako nowych, selektywnych ligandów receptorów 5-HT 7 i/lub preparatów o wieloreceptorowym mechanizmie działania (receptory 5-HT, dopaminowe), mających cechy leków stosowanych w terapii schorzeń ośrodkowego układu nerwowego depresji, lęku i/lub schizofrenii. Zakres przeprowadzonych badań obejmujących habilitację przedstawiono poniżej: 1. Przeprowadzenie studium literaturowego dotyczącego zastosowań metod HTC, którego wynikiem jest opracowanie przeglądowe, obejmujące aplikacje technik syntezy na fazach stałych w poszukiwaniu nowych związków biologicznie aktywnych o potencjalnym zastosowaniu w terapii schorzeń ośrodkowego układu nerwowego (publikacja P-1); 2. Opracowanie metodyki syntezy na modularnych nośnikach; arylosulfonamidowych pochodnych z ugrupowaniami -alkilo- -dialkiloguanidynowymi i ocenę ich aktywności jako potencjalnych ligandów receptorów 5-HT 7 (publikacja P-2); 3. Zastosowanie własnych metod syntezy na nośnikach stałych w poszukiwaniu ligandów receptorów 5-HT 7 o strukturze chinolino- i izochinolino-sulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych arylo- i alkilo- amin. Ze względu na bliską homologię strukturalną między receptorami serotoninowymi i dopaminowymi, biorąc również pod uwagę typ struktury i jej zróżnicowanie, zaplanowano ocenę zsyntetyzowanych połączeń w znacznie rozszerzonym skriningu in vitro; określającym powinowactwo i selektywność tych połączeń wobec receptorów 5-HT 1A, 5-HT 2A, 5-HT 6, oraz dla wybranych pochodnych do receptorów dopaminowych D 2, D 3, D 4 i adrenergicznych 14

15 α 1. Wyznaczenie, dla najbardziej interesujących związków, technikami in vitro i in vivo, profilu aktywności wewnętrznej (agonista-antagonista), pozwoli na bardziej racjonalnie ukierunkowanie wyboru odpowiednich modeli zwierzęcych w celu zbadania potencjalnej aktywności przeciwdepresyjnej, przeciwlękowej i przeciwpsychotycznej (publikacja P-3, P-4); 4. Opracowanie nowego, kwasolabilnego narzędzia, zwanego linkerem pipekolowym, do syntezy zróżnicowanych strukturalnie grupy związków o potencjalnej aktywności biologicznej, w tym ligandów receptorów dla monoamin. Określono wydajność nowej metody syntezy na fazie stałej, ustalono mechanizm uwalniania zróżnicowanych strukturalnie związków od linkera, zbadano możliwości zastosowania nowego narzędzia w chemii organicznej, także chemii peptydów. W ostatnio realizowanym etapie prac, w kontekście licznych możliwych aplikacji, określono również możliwość wielokrotnego wykorzystania nowego linkera w syntezie chemicznej (patent P-5, publikacja P-6, P-7); 2.4. WYIKI BADAŃ I DYSKUSJA Publikacja P-1: Zajdel, P.; Pawłowski, M.; Martinez, J.; Subra, G. Combinatorial chemistry on solidsupport in the search for central nervous system agents. Comb. Chem. High Throughput Screening 2009, 12, Wynikiem przeprowadzonego studium literaturowego było usystematyzowanie aktualnej wiedzy o wysokowydajnych metodach syntezy, ze szczególnym uwzględnieniem możliwości prowadzenia reakcji na nośnikach stałych. Opracowanie uwzględniło zastosowania opisanej w piśmiennictwie metodologii w identyfikacji struktur wiodących o potencjalnym zastosowaniu w terapii schorzeń ośrodkowego układu nerwowego oraz związków narzędziowych dla farmakologii doświadczalnej (np. silny antagonista receptorów 5-HT 2A MDL 100,907). Przykłady opisanych, innowacyjnych metod syntezy, stały się punktem wyjścia do opracowania własnych technik, służących do rozszerzenia platformy syntetycznej wykorzystującej stałe nośniki polimerowe w badaniach nad poszukiwaniem związków biologicznie aktywnych o potencjalnej aktywności przeciwdepresyjnej, przeciwlękowej i/lub przeciwpsychotycznej. 15

16 Publikacja P-2: Zajdel, P.; Subra, G.; Verdie, P.; Gabzdyl, E.; Bojarski, A.J.; Duszyńska, B.; Martinez, J.; Pawłowski, M. Sulfonamides with -alkyl- -dialkylguanidine moiety as 5-HT 7 receptor ligands. Bioorg. Med. Chem. Lett. 2009, 19, Opierając się na doniesieniach literaturowych, opisujących ligandy receptorów 5-HT 7 z grupy pochodnych o strukturze arylosulfonamidowej, biorąc pod uwagę również wyniki badań będących przedmiotem zastrzeżeń patentowych, które ujawniają grupę związków o strukturze amidynomocznikowej zaprojektowano serię arylosulfonamidowych pochodnych -alkilo- - dialkilguanidyn, uwzględniając obecność tych dwóch elementów strukturalnych, jako fragmentów preferencyjnie rozpoznawanych przez receptory 5-HT 7 (Fig. 1, Fig. 2, publikacja P-2). Wynikiem badań było opracowanie metody syntezy na modularnych podłożach stacjonarnych (Lanterny SynPhase), z linkerem typu BAL, oraz synteza serii 36 zaprojektowanych związków zawierających ugrupowanie guanidynowe wbudowane we fragment drugorzędowej aminy. Według standardowej procedury pochodne guanidynowe uzyskuje się w reakcji amin z odpowiednio Bocblokowanymi pochodnymi amidynowymi. Ponieważ usunięcie grup blokujących Boc, w środowisku kwasu trifluorooctowego, skutkowałoby uwolnieniem syntetyzowanych połączeń od linkera typu BAL, ugrupowanie guanidynowe odtworzono w wyniku sekwencji reakcji przeprowadzonych na pierwszorzędowej aminie alifatycznej. Finalne -alkilo- -dialkiloguanidyny uzyskano w reakcji pochodnej methylotioamidynowej z aminą drugorzędową (Schemat 1, publikacja P-2). Wyselekcjonowani przedstawiciele serii wykazywali, w testach farmakologicznych in vitro, umiarkowane powinowactwo do receptorów 5-HT 7 (Tabela 2, publikacja P-2). Analiza zależności struktura-aktywność wskazała, że wprowadzenie zdelokalizowanego, dodatniego ładunku w centrum zasadowym cząsteczki obniżyło powinowactwo do testowanych receptorów 5-HT. Wartym podkreślenia jest fakt, że zsyntetyzowane związki praktycznie nie wykazywały powinowactwa do receptorów 5-HT 1A. Ten aspekt wydaje się szczególnie istotny, gdyż według danych literaturowych pochodne 2-metoksyfenylopiperazynowe klasyfikowano, jako silne ligandy receptorów 5-HT 1A. 36,37 Reasumując, w wyniku przeprowadzonych badań zidentyfikowałem nową grupę ligandów receptorów 5-HT 7 o strukturze arylosulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych arylopiperazyn z wbudowanym ugrupowaniem guanidynowym, jako elementem strukturalnym determinującym selektywność 5-HT 7 /5-HT 1A receptorową. 16

17 Publikacja P-3: Zajdel, P.; Marciniec, K.; Maślankiewicz, A.; Paluchowska, M.H.; Satała, G.; Partyka, A.; Jastrzębska-Więsek, M.; Wróbel, D.; Wesołowska, A.; Duszyńska, B.; Bojarski, A.J.; Pawłowski, M. Arene- and quinoline-sulfonamides as novel 5-HT 7 receptor ligands. Bioorg. Med. Chem. 2011, 19, Jedną z przesłanek skłaniających do podjęcia badań w grupie chinolinosulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych arylopiperazyn, były dane literaturowe wskazujące na korzystny wpływ bioizosterycznej podmiany fragmentu naftylowego, w obrębie obszaru aryloamidowego, w grupie amidowych pochodnych LCAP, układem skondensowanej azyny. 38,39 Konsekwencją tego typu modyfikacji, wprowadzającej dodatkowe oddziaływania wolną parą π-elektronową atomu azotu, może być lepsza stabilizacja kompleksu ligand-receptor w miejscu wiążącym celu biologicznego. ie bez znaczenia jest korzystny wpływ tego typu modyfikacji na rozpuszczalność związków w wodzie. Ten ostatni parametr wydaje się niezmiernie ważny w aspekcie częstych problemów z biodostępnością struktur wiodących. Publikacja P-3 przedstawia badania chemiczno-farmakologiczne w grupie chinolinosulfonamidowych pochodnych LCAP, jako potencjalnych ligandów receptorów 5-HT 7. W syntezie zaplanowanej serii pochodnych zastosowano metodologię opracowaną do syntezy na modularnych podłożach stacjonarnych, stosując syntony o strukturze tert-butylodifenylosililoblokowanego 3-aminopropan-1-olu i 4-aminobutan-1-olu jako intermediaty odpowiadające różnej długości łańcucha alkilenowego (Schemat 2, publikacja P-3). Uzyskane chinolinosulfonamidy, z giętkim łącznikiem alkilenowym, charakteryzowały się zróżnicowanym powinowactwem do receptorów 5-HT 7 i 5-HT 1A (odpowiednio nm i 3, nm) i praktycznie nie wykazywały aktywności względem receptorów 5-HT 2A i 5-HT 6 (Tabela 2, publikacja P-3). Analiza zależności struktura-aktywność wskazała, że obecność fragmentu 2-metoksyfenylopiperazyny (2-MPP) stanowi warunek konieczny dla uzyskania wysokiego powinowactwa do receptorów 5-HT 7 i 5-HT 1A. Związki zawierające ugrupowania znanych bioizosterów 2-MPP tetrahydroizochinoliny, tetrahydrotienopirydyny oraz perhydroizochinoliny charakteryzowały się umiarkowanym lub niskim powinowactwem do receptorów 5-HT 7. W przypadku pochodnych o giętkim łączniku alkilenowym określono preferencję sposobu podstawienia układów azynosulfonowych, dla oddziaływań z receptorami 5-HT 7, dającą się ująć w szereg; pochodne 8-chinolinowe>3-chinolinowe>6-chinolinowe. Zaobserwowano również, że położenie grupy sulfonamidowej w pierścieniu benzenowym układu chinoliny jest niekorzystne dla oddziaływań z receptorami 5-HT 1A. Modyfikacja strukturalna polegająca na -alkilacji ugrupowania sulfonamidowego i mająca na celu odwzorowanie wymogów sterycznych oraz przybliżenie parametrów hydrofobowych fragmentu pirolidyny, występującego w strukturze modelowego 17

18 antagonisty receptorów 5-HT 7 (związek SB ), podwyższyła powinowactwa do receptorów 5-HT 7. W przypadku -alkilowanych pochodnych, zawierających fragment PHIQ, uzyskano połączenia o zadowalającej selektywności względem receptorów 5-HT 1A. Dodatkowo, dla tych związków wyznaczono powinowactwo do receptorów α 1 -adrenergicznych. Te ostatnie receptory rozpatrywane są, jako potencjalne źródło poważnych efektów niepożądanych związanych z funkcjonowaniem układu sercowo-naczyniowego. Ponadto blokada tych receptorów może zmniejszać skuteczność leków przeciwdepresyjnych. Wynikiem badań było znalezienie, w grupie azynosulfonamidowych analogów długołańcuchowych arylopiperazyn, antagonisty receptorów 5-HT 7. Związek o strukturze -etylo--[4-(1,2,3,4, 4a,5,6,7,8,8a-dekahydroizochinolin-2-ylo)butylo]-8-chinolinosulfonamidu (zw. 54, Tabela 3, publikacja P-3), wykazujący wysokie powinowactwo do receptorów 5-HT 7 (K i = 13 nm), zadowalającą selektywność wobec receptorów 5-HT 1A, 5-HT 2A, 5-HT 6 i α 1 oraz cechy antagonisty receptorów 5-HT 7 (K B = 140 nm), w dawce 10 mg/kg istotnie skracał czas bezruchu myszy (o 22%) w teście wymuszonego pływania (Tabela 4, publikacja P-3). Obserwowany efekt był podobny do związku odniesienia tj. SB , który wykazywał istotne skrócenie czasu bezruchu myszy, również w jednej dawce 10 mg/kg. Publikacja P-4: Zajdel, P.; Marciniec, K.; Maślankiewicz, A.; Satała, G.; Duszyńska, B.; Bojarski, A.J.; Partyka, A.; Jastrzębska-Więsek, M.; Wróbel, D.; Wesołowska, A.; Pawłowski, M. Quinoline- and isoquinoline-sulfonamide derivatives of LCAP as potent CS multi-receptor 5-HT 1A /5-HT 2A /5-HT 7 and D 2 /D 3 /D 4 agents: the synthesis and pharmacological evaluation. Bioorg. Med. Chem. 2012, 20, Kontynuując badania nad syntezą i analizą zależności struktura-aktywność w grupie azynosulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych arylopiperazyn, w publikacji P-4 przedstawiono serię zaprojektowanych chinolino- i izochinolino-sulfonamidowych pochodnych 3- i 4-chlorofenylopiperazyny zawierających giętki i częściowo usztywniony łańcuch polimetylenowy. Poddając analizie powinowactwo pochodnych 3-chlorofenylopiperazynowych do receptorów 5-HT 7 w porównaniu z ich analogami z podstawnikiem 2-metoksylowym, okazało się, że wprowadzenie grupy o charakterze elektronoakceptorowym zwiększyło powinowactwo do receptorów 5-HT 7 i obniżyło powinowactwo do receptorów 5-HT 1A. W przeciwieństwie do wyników badań zaprezentowanych przez Volka i współprac. 40 przesunięcie atomu chloru w pozycję 4 okazało się niekorzystne dla oddziaływania; zarówno z receptorami 5-HT 7, jak i 5-HT 1A (Tabela 1 i 2, publikacja P-4). 18

19 Analiza wpływu pozycji heterocyklicznego atomu azotu we fragmencie chinolinosulfonamidowym, w grupie pochodnych 3-chlorofenylopiperazynowych, na powinowactwo do receptorów 5-HT 7, potwierdziła zależności zaobserwowane w serii pochodnych 2-MPP. W toku przeprowadzonych badań okazało się, że zamiana fragmentu 1-naftylowego lub 2-naftylowego odpowiednimi analogami chinolinowymi 8-chinolinowym, 3- lub 6-chinolinowym, nie wpływa w sposób istotny na powinowactwo do receptorów 5-HT 7 ; zmniejsza natomiast selektywność względem receptorów 5-HT 1A. W serii pochodnych 4-chlorofenylopiperazynowych, rodzaj fragmentu chinolinowego nie wpływał na powinowactwo do receptorów 5-HT 7. Ponadto, zamiana w obrębie fragmentu azynosulfonowego, różnie podstawionej chinoliny na 4-podstawioną izochinolinę, skutkowała 4 5-cio krotnym wzrostem powinowactwa do receptorów 5-HT 7. Dodatkowo, chlorowodorki chinolino- i izochinolino-sulfonamidów charakteryzowały się znacznie wyższą rozpuszczalnością w wodzie, w porównaniu z ich analogami naftylosulfonamidowymi. W oparciu o wyniki badań powinowactwa dla serii -alkilowanych chinolinosulfonamidów do receptorów 5-HT 7 (publikacja P-3), zaplanowano serię chinolino- i izochinolinosulfonamidów, zawierających fragment piperydynoalkilenowy w terminalnym fragmencie arylosulfonamidowym oraz ugrupowanie 4-chlorofenylopiperazynowe. Modyfikacja ta wprowadziła równoczesne, częściowe usztywnienie łańcucha polimetylenowego między fragmentem sulfonamidowym i zasadowym centrum cząsteczki. Uwzględniono także zróżnicowanie strukturalne ugrupowania sulfonamidowego, otrzymując pochodne -alkilowane w tym fragmencie. Związki uzyskane przez wprowadzenie fragmentu piperydynoetylowego charakteryzowały się najwyższym powinowactwem do receptorów 5-HT 7 i zadowalającą selektywnością 5-HT 7 /5-HT 1A receptorową. iestety zastosowane modyfikacje strukturalne nie pozwoliły na ograniczenie powinowactwa do receptorów 5-HT 2A. Uwzględniając dane literaturowe dotyczące powinowactwa chinolinokarboksamidów do receptorów D 3 i ich aktywność przeciwpsychotyczną oraz możliwość pośredniego wpływu receptorów serotoninowych na uwalnianie dopaminy; dla wyselekcjonowanych połączeń, o profilu receptorowym wskazującym na możliwość wystąpienia u tych związków aktywności charakterystycznej dla atypowych neuroleptyków, dodatkowo wyznaczono powinowactwo do receptorów D 2, D 3 i D 4 (Tabela 3, publikacja P-4). Ponieważ przedstawiciele serii azynosulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych, fleksyjnych i częściowo usztywnionych arylopiperazyn, wykazywały wysokie powinowactwo do receptorów 5-HT 7 i cechy antagonistów tych miejsc wiążących i równocześnie mieszany profil 5-HT 1A /5-HT 2A /5-HT 7 oraz 5-HT 2A /5-HT 7 receptorowy, także aktywność antagonistyczną do postsynaptycznych receptorów 5-HT 1A, 5-HT 2A i D 2 w modelach zwierzęcych in vivo (Tabela 4, publikacja P-4), wybrani przedstawiciele zostali poddani ocenie w kierunku ich potencjalnego 19

20 działania psychotropowego: przeciwdepresyjnego, przeciwlękowego i przeciwpsychotycznego. Badania behawioralne in vivo pozwoliły zidentyfikować związki PZ-395 i PZ-511 o żądanych i interesujących właściwościach farmakologicznych. Związek o strukturze -{4-[4-(3-chlorofenylo)- piperazin-1-yl]-butylo}-3-chinolinosulfonamidu (zw. 16, Tabela 1, publikacja P-4), o wieloreceptorowym mechanizmie działania (5-HT 1A /5-HT 2A /5-HT 7 i D 2 /D 3 ) i cechach postsynaptycznego antagonisty receptorów 5-HT 1A, 5-HT 2A, 5-HT 7, D 2, wykazał znaczący efekt przeciwdepresyjny w teście pływania u myszy (10 mg/kg, Fig. 4, publikacja P-4) oraz efekt przeciwlękowy w teście podniesionego labiryntu krzyżowego u szczurów (20 mg/kg, Tabela 5, publikacja P-5). Aktywność ta była porównywalna z imipraminą i diazepamem, zastosowanymi jako substancje referencyjne. Związek o strukturze 4-(4-{2-[4-(4-chloro-fenylo)-piperazyn-1-ylo]-etylo}- piperydyn-1-sulfonylo)-izochinoliny (zw. 36, Tabela 2, publikacja P-4), o wieloreceptorowym mechanizmie działania (5-HT 2A /5-HT 7 i D 2 /D 3 /D 4 ) i cechach postsynaptycznego antagonisty receptorów 5-HT 1A, 5-HT 2A, 5-HT 7, D 2, wykazał efekt przeciwdepresyjny w teście pływania u myszy (Fig. 4, publikacja P-4), efekt przeciwlękowy w teście podniesionego labiryntu krzyżowego u szczurów (2,5 10 mg/kg, Tabela 5, publikacja P-4) oraz silny efekt przeciwpsychotyczny, manifestujący się znoszeniem hiperaktywności lokomotorycznej wywołanej podaniem MK-801 u myszy (5 30 mg/kg, Tabela 6, publikacja P-4). Patent P-5: Martinez, J.; Zajdel, P.; Pawłowski, M.; Subra, G. Pipecolic linker and its use for chemistry on solid support. Patent WO 2010/ A1. Publikacja P-6: Zajdel, P.; omezine, G.; Masurier,.; Amblard, M.; Pawłowski, M.; Martinez, J.; Subra, G. A new highly versatile handle for chemistry on a solid suport: the pipecolic linker. Chem. Eur. J. 2010, 16, Zastosowany w syntezie na fazach stałych, areno- i azyno-sulfonamidowych pochodnych długołańcuchowych arylopiperazyn, linker typu BAL nie znajduje zastosowania w syntezie pochodnych tej klasy strukturalnej o charakterze amin drugorzędowych. Wartym podkreślenia jest fakt, że właśnie drugorzędowe aminy o tej strukturze są aktualnie przedmiotem intensywnych badań chemiczno-farmakologicznych w kierunku ich potencjalnej aktywności psychotropowej. 41,42 Syntezę tego typu związków można prowadzić na nośnikach zaopatrzonych w opracowany, we współpracy z zespołem z IBMM we Francji, linker pipekolowy (Pip). Ujawnienie linkera Pip w zaprezentowanych w niniejszym opracowaniu publikacjach zostało poprzedzone międzynarodową ochroną patentową WO/2010/

21 Koncepcja tego nowego narzędzia do syntezy na nośnikach polimerowych powstała w trakcie badań nad syntezą związków o potencjalnej aktywności przeciwdepresyjnej w grupie długołańcuchowych pochodnych arylopiperazynowych modyfikowanych fragmentami -acylowanych aminokwasów. 43 Związki zawierające fragmenty -acylowanego kwasu pipekolowego poddane działaniu kwasu trifluorooctowego, w procesie uwalniania od nośnika stałego, nieoczekiwanie uległy hydrolizie do pochodnych o strukturze pierwszorzędowych amin alifatycznych i fragmentów -acylowanego kwasu piperydyno-2-karboksylowego (Schemat 2, publikacja P-6). Przyczynę tego typu zjawiska przypisano unikalnej budowie fragmentu aminokwasowego oraz elektronodonorowemu charakterowi zastosowanego czynnika acylującego. Ustalono, że bezpośrednia, trzyetapowa synteza łącznika na żywicy, polegająca na sekwencyjnym dołączaniu kwasu cykloheksano-1,4-dikarboksylowego, estru metylowego kwasu pipekolowego i końcowa saponifikacja estru, jest wydajną pod względem kosztowym i czasowym metodą otrzymywania linkera Pip (Schemat 3, publikacja P-6). Kolejno przeprowadzone badania nad określeniem wpływu geometrii cząsteczki kwasu cykloheksano-1,4-dikarboksylowego oraz konfiguracji kwasu pipekolowego nie wykazały istotnych zmian ładowności żywicy oraz wydajności uwolnienia produktu od podłoża. Aby dokładnie określić zakres zastosowań nowo opracowanego linkera, przeprowadzono reakcje kotwiczenia reprezentatywnych związków o charakterze pierwszo- i drugorzędowych amin alifatycznych, amin aromatycznych, alkoholi pierwszo- i drugorzędowych oraz fenoli. Wartym podkreślenia jest fakt, że przyłączanie substratów do linkera Pip przebiega w wyniku prostej, jednoetapowej reakcji amidowania lub estryfikacji przy zastosowaniu czynnika aktywującego BOP. Możliwość zastosowania linkera Pip w chemii peptydów, zaprezentowano na przykładzie odwrotnej syntezy dipeptydu, syntezie pseudopeptydów oraz hydrazydowych pochodnych peptydowych. Łatwość kotwiczenia związków o charakterze amin i alkoholi umożliwia również przyłączenie fragmentów aminokwasowych za pomocą łańcucha lateralnego, otwierając możliwości dla równoczesnych manipulacji strukturalnych na C- i - końcu łańcucha peptydowego. Uzyskane wyniki są ważne z praktycznego punktu widzenia; opracowany, kwasolabilny, wysoce wydajny, nowy linker, umożliwia kotwiczenie związków o zróżnicowanym charakterze nukleofilowym. Można go rozpatrywać, jako alternatywa dla syntezy na żywicy trytylowej, w oparciu o strategię Fmoc, związków o strukturze peptydowej, peptydomimetyków oraz małocząsteczkowych związków organicznych. 21

22 Publikacja P-7: Zajdel, P.; omezine, G.; Masurier,.; Amblard, M.; Pawłowski, M.; Martinez, J.; Subra, G. Recycling the versatile pipecolic linker. J. Comb. Chem. 2010, 12, Zaproponowany w publikacji P-6 mechanizm hydrolizy pochodnych kwasu pipekolowego przebiega poprzez utworzenie produktu przejściowego oksazolinium-5-onu (munchnonu). 44 Szybkość procesu uwarunkowana jest efektem elektronodonorowym fragmentu acylującego, co zmniejsza gęstość elektronową w obrębie grupy karbonylowej kwasu pipekolowego. Zgodnie z przyjętym mechanizmem, po uwolnieniu produktu finalnego od nośnika, w przeciwieństwie do większości kwasolabilnych linkerów, tworzących w procesie hydrolizy odpowiednie karbokationy, linker Pip odtwarza swój pierwotny stan. W oparciu o przeprowadzone eksperymenty wykazano możliwość kilkukrotnego zastosowania linkera Pip w syntezie organicznej. Przeprowadzony eksperyment polegał na następującym po sobie przyłączaniu do linkera Pip i uwalnianiu od niego pięciu różnych substratów, w tym po raz pierwszy przyłączono związek o charakterze tiolu (Schemat 3, publikacja P-5). Ustalono, że przygotowanie linkera Pip do powtórnego użycia wymaga neutralizacji za pomocą mieszaniny diizopropyloetyloaminy i,-dimetyloformamidu. Zgodnie z koncepcją syntezy peptydów na nośniku stałym, w ostatnim etapie dochodzi do uwolnienia produktu od nośnika oraz odblokowania łańcuchów bocznych. W tym kontekście ważne jest usunięcie karbokationów uwolnionych z grup blokujących łańcuchy boczne, gdyż mogą one reagować z podatnymi na acylację resztami metioniny, tyrozyny lub tryptofanu. W przeprowadzonym eksperymencie stwierdzono, że dodatek silanów do mieszaniny kwasu trifluorocotowego i wody zapobiega atakowi karbokationu oksazoloniowego na grupy nukleofilowe i uniemożliwia przebieg tego typu reakcji niepożądanych. Reasumując, w porównaniu z dostępnym na światowym rynku linkerami typu Wang, czy trytylowym, linker pipekolowy odtwarza, po uwolnieniu produktu finalnego, swoją strukturę wyjściową. W toku prac udowodniono, że ta unikalna cecha linkera pipekolowego daje możliwość jego kilkukrotnego zastosowania, bez znaczącej utraty ładowności, co stanowi novum w tej dziedzinie badawczej. 22