Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 1

Transkrypt

1 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 1 ĆWICZENIE 8 ILOŚCIOWE OZNACZANIE CUKRÓW REDUKUJĄCYC 8.1. Właściwości funkcjonalne sacharydów Smak odczuwa się za pomocą receptorów smakowych, które w postaci kubków smakowych umiejscowione są w jamie ustnej, w największym stężeniu na języku. Liczba kubków smakowych jest różna u poszczególnych ludzi, dlatego odczuwanie smaku jest właściwością osobniczą. Sacharydy w większości przypadków charakteryzują się słodkim smakiem. Za wzorzec smaku przyjmuje się 10% wodny roztwór sacharozy, dla takiego roztworu jednostka słodkości, tzw. słodkość względna (ang. relative sweetness) wynosi 1,0. W tabeli 8.1. zamieszczono wartości RS dla roztworów innych sacharydów. Tabela 8.1. Względna słodkość (RS) 10% roztworów wodnych różnych związków ( Chemia żywności WNT, Warszawa 2002) Związek RS Związek RS Sacharoza β-d-fruktopiranoza Cukier inwertowany α-d-glukopiranoza β-d-glukopiranoza α-d-mannopiranoza β-d-mannopiranoza D-galaktopiranoza Maltoza α-d-laktoza β-d-laktoza 1,00 1,80 1,30 0,70 0,80 0,30 Gorzka 0,32 0,32 0,20 0,30 D-galaktosacharoza Rafinoza Stachinoza Ksylitol Mannitol Sorbitol Miód Melasa Sacharyna Apartam Dihydrochalkon neohesperydyny Bez smaku 0,01 0,10 0,85-1,2 0,4 0,6 0,97 0, Jak widać w tabeli, wraz ze wzrostem liczby jednostek monosacharydowych słodkość sacharydów zanika. Wyjątkiem jest sacharoza, która zbudowana jest z dwóch reszt cukrowych, ale tylko reszta glukozy oddziaływuje z receptorem na języku. Obecnie dostępne są także inne, niesacharydowe środki słodzące, jak monelina (naturalne białko) razy słodsza od sacharozy, talina (sól glinowa taumatyny, innego białka) 3500 razy słodsza od sacharozy, kwas N-cykloheksyloaminosulfonowy, aspartam, sacharyna (rys. 8.1).

2 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 2 Rys.8.1. Popularne substancje słodzące W Polsce w użyciu są następujące naturalne, sacharydowe środki słodzące: D-glukoza, D-fruktoza, laktoza, sacharoza, maltoza, syropy skrobiowe, ekstrakty słodowe, alkohole cukrowe, miód i syrop klonowy. D-glukoza ze względu na szybkie wchłanianie jest źródłem energii dla chorych. Jest popularnym dodatkiem słodzącym do piwa, napojów orzeźwiających i czekolady. Do jej metabolizmy potrzebna jest insulina, dlatego nie jest wskazana dla diabetyków, sprzyja także rozwojowi próchnicy. D-fruktoza najlepiej rozpuszczalna w wodzie spośród sacharydów, stosowana w słodzeniu soków, ponieważ nie krystalizuje podczas przechowywania. Jest higroskopijna, więc zapobiega utracie wilgoci w przechowywaniu produktów żywnościowych, np. owoców kandyzowanych. Sacharyd ten metabolizowany jest do glikogenu, bez udziału insuliny, więc jest polecany dla diabetyków. Dodatkowe pozytywne cechy D-fruktozy to przyspieszanie metabolizmu etanolu i niewywoływanie próchnicy. Laktoza, czyli cukier mlekowy (4,8-5,1% w mleku ssaków), jest słabo rozpuszczalna w wodzie. Wydajnym źródłem laktozy jest serwatka, która zawiera 67-75% tego cukru w suchej masie. Laktoza używana jest jako nośnik innych środków słodzących i dodatek polepszający smak produktów mlecznych. Negatywną stroną stosowania laktozy jest fakt, że do jej metabolizowania potrzeba jest β-d-galaktozydaza. U wielu ssaków enzym ten zanika z wiekiem, nie mają go także niektóre dzieci w wyniku błędu genetycznego. Picie mleka i fermentowanych napojów mlecznych u takich osób może wywoływać odczyny alergiczne. Sacharoza jest najczęściej stosowanym środkiem słodzącym w racji dostępności i przyjemnego smaku, szybko się wchłania i metabolizuje. Powoduje to duży okresowy nadmiar glukozy w organizmie, która przekształcana jest wtedy w lipidy. Syropy skrobiowe są produktami scukrzenia skrobi, w Polsce przede wszystkim ziemniaczanej. W zależności od stopnia przemiany uzyskuje się różne syropy. Najpierw otrzymuje się syrop

3 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 3 maltotetraozowy o słodkości 0,2 zawierający ok. 15% D-glukozy i ok. 10% maltozy. Dalsze scukrzanie prowadzi do syropów maltozowych zawierających ok. 43% D-glukozy i 20% maltozy. W końcu otrzymuje się syropy glukozowe zawierające 92% D-glukozy, 4% maltozy i ok. 2% wyższych sacharydów. Syropy te można izomeryzować do syropów fruktozowych. Ekstrakty słodowe, które są wodnymi ekstraktami słodu jęczmiennego oprócz 4-5% sacharozy, śladów fruktozy, glukozy i maltozy, zawierają także białka, sole mineralne i enzymy. Alkohole cukrowe są odporniejsze od sacharydów na niskie p, ich słodki smak trwa przez dłuższy czas i odczuwa się jednocześnie wrażenie chłodu. Są metabolizowane bez udziału insuliny. Miód ma skład zależny od czasu zbioru, położenia geograficznego i rodzaju kwiatów, z których nektar został zebrany przez pszczoły. Oprócz D-fruktozy i maltozy miód zawiera wiele rzadkich sacharydów np. kojibiozę (α-d-glcp-(1 2)-α-D-Glcp); turanozę (α-d-glcp-(1 3)-D-Fruf); gentozę (α-d-glcp-(1 4)-α-D-Glcp-(1 2)-D-Glcp) itp., a także wolne aminokwasy, barwniki, woski, pyłek kwiatowy, enzymy i składniki mineralne. W miodzie znajduje się też ok. 120 związków aromatycznych i składniki toksyczne, jeżeli nektar był zbierany z roślin trujących, chociaż wiele roślin trujących daje miód nietrujący. Termiczne lub enzymatyczne przekształcenia sacharydów mogą prowadzić do otrzymania związków zapachowych znanych jako wtórne aromaty żywności. Pochodzą one z obróbki zarówno czystych sacharydów (wówczas za zapach odpowiadają pochodne furanu), jak i reakcji sacharydów z aminokwasami lub hydroksykwasami. Sacharydy wykorzystuje się także do produkcji barwników żywności. W wyniku tzw. palenia cukru, w temp o C przez kilka godzin, powstaje brunatny produkt nazywany karmelem. Mimo swej głębokiej brunatnej barwy, karmel ma małą siłę barwiącą i stosuje się go raczej jako dodatek poprawiający aromat i smak. Karmel do celów barwiących otrzymuje się przez palenie cukru wobec amoniaku w temperaturze o C (tzw. karmel amoniakalny). Ponieważ zawiera on niewielkie ilości neurotoksycznego 4(5)-metyloimidazolu, dąży się do wyeliminowania karmelu amoniakalnego z produkcji lub ograniczenia spożycia produktów barwionych karmelem. Karmel używany jako dodatek podlega standaryzacji, dopuszcza się stosowanie 10 typów karmeli, które różnią się sposobem produkcji, przede wszystkim rodzajem zastosowanego katalizatora. W produktach spożywczych zidentyfikowano ponad 100 rodzajów cukrów. D-glukoza i D-fruktoza znajdują się głównie w miodzie, owocach i warzywach, laktoza w mleku ssaków, sacharoza w burakach cukrowych i trzcinie cukrowej, a skrobia w ziarnach zbóż, w przetworach zbożowych i w

4 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 4 ziemniakach (Tabela 8.2.). Tabela 8.2. Zawartość sacharydów w wybranych produktach spożywczych Rodzaj produktu Łączna zawartość sacharydów [%] Wieprzowina, wołowina Ser gouda tłusty Ogórek Ser twarogowy tłusty Pomidor Mleko 2% tłuszczu Marchew Pomarańcza Brzoskwinia Jabłko Banan Chleb Ziarno pszenicy Ziarno żyta Kasza jęczmienna 0,0 0,1 2,9 3,5 3,6 4,9 8,7 11,3 11,9 12,1 23,5 56,2 70,5 74,2 74, METODY OZNACZANIA ZAWARTOŚCI SACARYDÓW Jak wykazano w ćwiczeniu 7 (reakcje Benedicta i Barfoeda), wszystkie monocukry i niektóre disacharydy wykazują właściwości redukujące. Za właściwości redukujące monosacharydów odpowiedzialna jest grupa aldehydowa lub α-ketonowa występująca w liniowej formie sacharydu. Właściwości te wykorzystuje się najczęściej w ilościowym oznaczaniu zawartości cukrów, dodatkowo można wykorzystać także zdolność do skręcenia płaszczyzny światła spolaryzowanego oraz zdolność do ulegania fermentacji. Metody oznaczania sacharydów można podzielić na: Metody fizyczne: densymetryczne, refraktometryczne, polarometryczne; Metody wykorzystujące właściwości redukujące: a) Miareczkowe (metoda Fehlinga, Lane-Eynona, Bertranda, Luffa-Schoorla); b) Spektrofotometryczne (metoda antronowa, rezorcynowa, Nelsona, metoda DNS); Metody enzymatyczne (metoda z oksydazą glukozową, metoda z dehydrogenazą glukozo- 6-fosforanu).

5 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących Metody fizyczne Metody fizyczne mogą być stosowane tylko do oznaczania cukrów rozpuszczalnych w wodzie. Metody densytometryczne - polegają na pomiarze gęstości wodnych roztworów sacharydów za pomocą areometru lub pikometru i odczytaniu z odpowiednich tablic odpowiadających im zawartości sacharydów w próbce. W przypadku pomiarów w roztworach zawierających oprócz sacharydów inne składniki rozpuszczalne w wodzie, uzyskany wynik odpowiada ekstraktowi ogólnemu i ma charakter przybliżony. Metody refraktometryczne mierzy się w nich współczynnik załamania światła (refrakcji) przez cząsteczki sacharydu rozpuszczonego w wodzie. W przypadku czystych roztworów sacharydów uzyskuje się bardzo dokładne i powtarzalne wyniki, ale dla roztworów wieloskładnikowych, w których pomiar współczynnika załamania jest wypadkową wszystkich rozpuszczonych w wodzie substancji, wynik ten określa ekstrakt ogólny, analogicznie jak w metodach densymetrycznych. Metoda ta znalazła szerokie zastosowanie w badaniach produktów spożywczych z uwagi na prostotę i szybkość analizy oraz możliwość wykonywania oznaczeń seryjnych. Metody polarymetryczne polegają na pomiarze kąta skręcania płaszczyzny światła spolaryzowanego, przechodzącego przez badany roztwór sacharydu. Analizy wykonuje się za pomocą specjalnych polarymetrów zwanych sacharymetrami; badany roztwór musi być bezbarwny, klarowny i bez zawiesin koloidalnych Metody oparte na właściwościach redukujących Oligosacharydy i polisacharydy zbudowane są z odpowiednich monosacharydów połączonych wiązaniami glikozydowymi. Wiązania te powstają w wyniku reakcji hemiacetalowej grupy O (tzn. grupy O przy anomerycznym atomie węgla) jednego monosacharydu z dowolną grupą O drugiego monosacharydu. Właściwości redukujące zależą więc od tego, czy w disacharydzie znajduje się wolna hemiacetalowa grupa O. W przypadku maltozy, celobiozy i laktozy wytworzenie wiązania glikozydowego zachodzi z udziałem hemicetalowej grupy O tylko jednej reszty cukrowej. emiacetalowa grupa O drugiej reszty cukrowej pozostaje wolna. Disacharydy te wykazują zatem właściwości redukujące i ulegają mutarotacji. W przypadku sacharozy hemiacetalowe grupy O obu reszt cukrowych biorą udział w utworzeniu wiązania glikozydowego. Z tego względu cukier ten nie wykazuje właściwości redukujących i zdolności do mutarotacji (rysunek 8.2.). W takim przypadku przeprowadza się hydrolizę do monosacharydów i oznacza jako tzw. cukry ogółem.

6 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 6 C 2 O O O O O C 2 O O O C 2 O O O Rys Sacharoza (β-d-fruktofuranozylo-(2 1)-α-D-glukopiranozyd) Metody oparte na właściwościach redukujących nie są specyficzne tylko dla sacharydów, gdyż inne substancje np. niektóre kwasy organiczne (kwas askorbowy), zasady purynowe, niektóre aldehydy i aminokwasy (np. Cys), także wykazują właściwości redukujące. Aby uniknąć podwyższenia wyników, usuwa się je w procesie odbiałczania i/lub klarowania. Jedną z najlepszych metod odbiałczania i klarowania jest metoda Correza. Stosuje się dwa roztwory: heksacyjanożelazian(ii) potasu i siarczan(vi) cynku(ii), które dodaje się w jednakowej objętości. W trakcie klarowania zachodzi reakcja: 2 ZnSO 4 + K 4 Fe(CN) 6 Zn 2 Fe(CN) 6 + K 2 SO 4 Powstający koloidalny heksacyjanożelazian(ii) cynku(ii) opadając w formie osadu współstrąca ze sobą związki wielkocząsteczkowe. Największe znaczenie w ilościowym oznaczaniu sacharydów w produktach spożywczych mają metody oparte na redukcji soli miedzi(ii) w środowisku alkalicznym. Odczynniki miedziowe stosowane w metodach miareczkowych to zasadowe roztwory siarczanu(vi) miedzi(ii), zawierające winian sodowo-potasowy lub cytrynian sodu, glicerynę lub inny związek tworzący rozpuszczalny kompleks z jonami miedzi. W środowisku zasadowym w podwyższonej temperaturze następuje przeprowadzenie sacharydów w formę łańcuchową, która ulega enolizacji. Powstałe endiolowe formy sacharydów utleniają się do kwasów (np. z glukozy powstaje kwas glukonowy); jednocześnie następuje redukcja jonów Cu 2+ do jonów Cu 1+, które łącząc się z jonami wodorotlenkowymi, dają czerwony osad tlenku miedzi(i). Metoda Fehlinga - polega ona na miareczkowym oznaczaniu ilości redukujących sacharydów w roztworze, odpowiadających całkowitej redukcji miedzi zawartej w roztworze odczynników Fehlinga I (CuSO 4 x 5 2 O) i Fehlinga II (winian sodowo-potasowy NaKC 4 4 O 6 x 4 2 O) wprowadzonych w jednakowej objętości. Winian sodowo-potasowy tworzy z jonami Cu 2+ ciemnoniebieski, rozpuszczalny w wodzie kompleks; koniec miareczkowania rozpoznaje się po zaniku barwy niebieskiej, świadczącej o braku jonów Cu 2+. Metoda Bertranda stosuje się ją do oznaczania sacharydów w roztworach silnie zabarwionych. Oznaczanie sacharydów przeprowadza się metodą pośrednią na podstawie ilości roztworu

7 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 7 manganianu(vii) potasu zużytego na miareczkowanie jonów Fe 2+ odpowiadających stechiometrycznie ilości sacharydów redukujących zawartych w badanym roztworze. Oznaczenie polega na ilościowej redukcji jonów Cu 2+ do Cu + przez sacharydy zawierające w cząsteczce wolne grupy redukujące, która zachodzi w środowisku silnie alkalicznym (p ok. 12) i w temp. wrzenia roztworu. Wytworzone jony miedzi(i) ulegają utlenieniu w reakcji z trzecim płynem Bertranda do jonów Cu 2+, a jony Fe 3+ redukcji do jonów Fe 2+. Ilość jonów Fe 2+ oznacza się przez miareczkowanie mianowanym roztworem manganianu(vii) potasu. Metoda Luffa Schoorla zasada oznaczenia opiera się na reakcji redukcji jonów Cu 2+ zawartych w płynie Luffa przez sacharydy redukujące obecne w badanym roztworze. Reakcja zachodzi w środowisku zasadowym (p ok. 9,5) w temperaturze wrzenia. W skład płynu Luffa wchodzi: siarczan(vi) miedzi(ii), węglan sodu, kwas cytrynowy. W środowisku zasadowym sacharydy redukują siarczan(vi) miedzi(ii) do tlenku miedzi(i). Wprowadzenie do roztworu jodku potasu (KI) i kwasu siarkowego(vi) powoduje wydzielenie jodowodoru (I). Reaguje on z niezredukowanym przez sacharydy siarczanem (VI) miedzi(ii) i powstaje jodek miedzi(i). Nadmiar jodu (z dodatku KI) odmiareczkowuje się tiosiarczanem(vi) sodu. Do metod spektrofotometrycznych zalicza się metody: Metoda z wykorzystaniem kwasu 3,5-dinitrosalicylowego (DNS) - w środowisku zasadowym grupy nitrowe kwasu 3,5-dinitrosalicylowego redukowane są do grup aminowych, a jednocześnie cukry ulegają utlenieniu do odpowiednich kwasów onowych. Powstające pochodne aminowe mają barwę pomarańczową, a pomiar intensywności zabarwienia oznacza się przy λ = 550 nm. Metoda antronowa polega ona na odwodnieniu sacharydów przez ogrzewanie ze stężonymi kwasami (octowym, siarkowym(vi), solnym). Powstały z pentoz - furfural i z heksoz - 5-hydroksymetylofurfural tworzą z antronem barwny roztwór. Pomiar intensywności zabarwienia wykonuje się przy długości fali λ = 620 nm. Metoda Nelsona polega na redukcji w środowisku alkalicznym jonów Cu 2+ do Cu + przez cukier redukujący. Powstałe jony Cu + redukują następnie kwas arsenomolibdenowy, a utworzone w tej reakcji niebieskie tlenki molibdenu oznacza się przy długości fali λ = 520 nm. Metoda rezorcynowa pozwala oznaczyć ketosacharydy, a także wyznaczyć zawartość ketopentoz i ketoheksoz obok siebie. Metoda ta polega na odwodnieniu ketosacharydów przez ogrzewanie z kwasem solnym, a następnie reakcji powstałych produktów z rezorcyną, w wyniku której tworzą się barwne kompleksy. Pomiar intensywności zabarwienia wykonuje się: dla ketoheksoz, przy długości fali λ = 520 nm, dla ketopentoz, przy długości fali λ = 620 nm.

8 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 8 Metody enzymatyczne stosuje się głównie do oznaczania glukozy i fruktozy, przy czym w przypadku glukozy korzysta się najczęściej z oksydazy glukozowej lub dehydrogenazy glukozo- 6-fosforanowej. Metoda z oksydazą glukozową w obecności tlenu oksydaza glukozowa katalizuje utlenianie β-dglukozy do D-glukono-δ-laktonu. Jednocześnie następuje redukcja koenzymu FAD do FAD 2 i ponowne utlenienie do FAD, któremu towarzyszy przeniesienie atomów wodoru na tlen cząsteczkowy i powstanie nadtlenku wodoru ( 2 O 2 ). Powstały 2 O 2, w obecności związku będącego donorem atomów wodoru np. di-o-anizydyny, jest rozkładany przez peroksydazę, a odwodorowany związek staje się barwny (np. żółty w przypadku di-o-anizydyny). Metoda z dehydrogenazą glukozo-6-fosforanowej glukozo-6-fosforan reaguje z NADP +, który w obecności dehydrogenazy fosforoglukonianowej jest przekształcany w NADP. Ilość powstałego NADP jest proporcjonalna do ilości glukozy i oznaczana spektrofotometrycznie. Metody enzymatyczne stosuje się przede wszystkim do oznaczania glukozy we krwi oraz innych płynach ustrojowych, a także w miodzie WYKONANIE ĆWICZENIA Celem ćwiczenia jest ilościowe oznaczenie cukrów redukujących w produktach żywnościowych metodą opartą na kwasie 3,5-dinitrosalicylowym. Odczynniki i aparatura 1. wzorcowy roztwór glukozy (3,6 mg/ml) 2. odczynnik A: 250mM ZnSO 4 3. odczynnik B: 1% roztwór DNS (rozpuścić 10g kwasu 3,5-dinitrosalicylowego w 500ml wody, dodać 200ml 2M NaO, 300g winianu sodowo-potasowego i uzupełnić wodą do objętości 1000ml) 4. odczynnik C: 85mM K 4 [Fe(CN) 6 ] 5. 3M NaO 6. 6M NaO 7. 6M Cl 8. probówki chemiczne (20 szt.) 9. pipeta automatyczna 10. szkło: pipety serologiczne o pojemności: 1, 2, 5 i 10 ml, kolbki miarowe 10 ml i 25 ml (4 szt.), kolbka stożkowa, lejek, zlewki (2 szt.) 11. łaźnia wodna 100 C 12. spektrofotometr 13. sok jabłkowy jednodniowy i w kartonie 14. piwo jasne

9 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących 9 Wykonanie Przygotowanie soków: Do 25 ml klarownego soku w zlewce dodać 1,25 ml odczynnika A oraz 1,25 ml odczynnika C i dokładnie wymieszać. Przy pomocy 3M NaO doprowadzić p do ok. 8 (wobec papierka wskaźnikowego). Zanotować całkowitą objętość użytego NaO. Całość przesączyć przez sączek karbowany. Następnie w probówkach przygotować po 5 ml rozcieńczeń 20-, 40- i 80-krotnych w wodzie destylowanej. Przygotowanie piwa: Do zlewki odmierzyć 50 ml piwa i mieszać na mieszadle magnetycznym przez 15 min w celu odgazowania. Następnie w probówkach przygotować po 5ml rozcieńczeń 5-, 10- i 20- krotnych w wodzie destylowanej. Przygotowanie krzywej wzorcowej: Ponumerować 11 probówek od 0 do 10. Odpipetować kolejno roztwory zgodnie z tabelą 8.3, następnie do wszystkich probówek dodać po 1 ml odczynnika B i po 5 ml wody destylowanej. Zawartość wszystkich próbówek dokładnie wymieszać, każdą przykryć kawałkiem folii aluminiowej i wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej. Następnie probówki ochłodzić pod strumieniem zimnej wody i zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm, stosując jako próbę odniesienia probówkę 0. Wykreślić krzywa wzorcową A=f(c[mg/ml]). Oznaczenie zawartości cukrów redukujących w sokach i piwie: Ponumerować 19 probówek od 0 do 18. Do próbki 0 odpipetować 1 ml wody, do probówek 1-6 po 1 ml trzech rozcieńczeń soku 1 w dwóch powtórzeniach, do probówek 7-12 po 1 ml trzech rozcieńczeń soku 2 w dwóch powtórzeniach, a do probówek po 1ml trzech rozcieńczeń piwa w dwóch powtórzeniach. Do wszystkich probówek dodać po 1ml odczynnika B i po 5 ml wody destylowanej. Zawartość wszystkich probówek dokładnie wymieszać, każdą przykryć kawałkiem folii aluminiowej i wstawić na 5 min do wrzącej łaźni wodnej. Następnie probówki ochłodzić pod strumieniem zimnej wody i zmierzyć absorbancję przy długości fali 550 nm, stosując jako próbę odniesienia probówkę 0. Na podstawie uzyskanych absorbancji obliczyć zawartość cukrów w produktach spożywczych (pamiętać o rozcieńczeniach) w g/100ml. Tabela 8.3. Przygotowanie krzywej wzorcowej Nr próby Wzorzec glukozy [ml] Woda [ml] Zawartość glukozy [mg] Odczynnik B [m] Woda [ml] 0-1,000-1,0 5,0 1;2 0,125 0,875 0,45 1,0 5,0 3;4 0,250 0,750 0,90 1,0 5,0 5;6 0,500 0,500 1,80 1,0 5,0 7;8 0,750 0,250 2,70 1,0 5,0 9;10 1,000-3,60 1,0 5,0

10 Ilościowe oznaczanie cukrów redukujących PYTANIA I ZADANIA 1. Wyjaśnij na czym polegają i do czego służą reakcje Benedicta i Barfoeda. 2. Wyjaśnij, dlaczego ketozy przejawiają właściwości redukujące. 3. Uzasadnij dlaczego sacharoza nie jest cukrem redukującym. 4. Wyjaśnij na czym polega metoda oznaczania cukrów z DNS i do czego się ją wykorzystuje. 5. Krótko scharakteryzuj metody oznaczania zawartości sacharydów. 6. Jakie substancje słodzące mogą zastępować sacharydy w produktach spożywczych? 7. Jakie sacharydy najczęściej stosuje się w produktach spożywczych jako substancje słodzące? 8. Wyjaśnij czym różni się forma α- od β-d-glukopiranozy. 9. Narysuj schemat reakcji glukozy z jonami miedzi.