dr hab. prof. AWF Agnieszka Zembroń-Łacny DOPING GENOWY 1 CIEMNA STRONA TERAPII GENOWEJ

Transkrypt

1 dr hab. prof. AWF Agnieszka Zembroń-Łacny DOPING GENOWY 1 CIEMNA STRONA TERAPII GENOWEJ

2 użycie komórek, genów, elementów genetycznych lub modyfikacji ekspresji genów do celów nieterapeutycznych, mające na celu zwiększenie osiągnięć sportowych

3 realizowano 21 projektów w następujących obszarach: Genomika/Transkryptomika, Proteomika, Metabolomika, Detekcja wirusów i Bioinformatyka

4

5 WPROWADZENIE DOPING GENOWY

6 Co to jest gen, genomika oraz terapia genowa i jakie może przynieść korzyści? Co to jest doping genowy i na ile może zwiększyć potencjał sportowca? Jakie niebezpieczeństwa powikłań zdrowotnych grożą osobom stosującym doping genowy? Jakie środki można stosować w zapobieganiu dopingowi genowemu i jakie są metody jego wykrywania?

7 GENOM JĄDROWY CZŁOWIEKA: 2 m DNA 3 mld par zasad 46 chromosomy autosomowe (23 pary) chromosomy X i Y GENOM genów CZŁOWIEK PROTEOM białek GENOMIKA PROTEOMIKA

8 GENOM 25 tys. genów THE HUMAN GENOME 2000 rok HUMAN GENOME PROJECT HUGO Project CELERA GENOMICS PROTEOM 400 tys. białek THE HUMAN PROTEOME HUMAN PROTEOME ORGANISATION HUPO Project

9 Uczymy się dziś języka, poprzez który Bóg stworzył świat. Tony Blair KOD GENETYCZNY KOD BOGA

10

11 CO TO JEST GEN? fragment DNA o określonej sekwencji nukleotydów kodujący sekwencję aminokwasów budujących określone białko Geny oprócz sekwencji kodujących (egzony) zawierają sekwencje niekodujące (introny) w terapii genowej stosuje się bezintronową sekwencję DNA, w celu zmniejszenia objętości genu

12 DNA-nośnik informacji genetycznej GENOM EKSPRESJA GENÓW transkrypcja TRANSKRYPT mrna kopie aktywnych genów kodujących białka translacja PROTEOM zestaw białek komórki

13 DEGRADACJA I B NF B SKURCZ MIĘŚNI Ca 2+ H 2 O 2 NO AP-1/2 C/EPP E-Myb CREB EGR-1 GABP HLF HIF-1/2 Pax-8 PEBP2 FOXO Hox B-5 HSF JNK NF1/CTF NFAT NFY/CB Nrf-2 Oct-2 SP-1 STAT USF p53 PROMOTOR TRANSKRYPCJA GEN TRANSPORT GLUKOZY SYNTEZA CYTOKIN I CZYNNIKÓW WZROSTOWYCH TRANSFORMACJA WŁÓKIEN MIĘŚNIOWYCH BIOGENEZA MITOCHONDRIÓW

14 ORGANIZMY TRANSGENICZNE INŻYNIERIA GENETYCZNA i BIOTECHNOLOGIA organizmy modyfikowane genetycznie GMOs (ang. genetically modified organisms), inaczej organizmy zawierające przenoszony gen tzw. TRANSGEN TRANSGEN = transgeniczny DNA

15 TERAPIA GENOWA 1990 pierwsze skuteczne zastosowanie terapii genowej przez Amerykanina Andersona z National Institutes of Health, leczenie ostrego złożonego niedoboru odporności (SCID) 1999 śmierć Jesse Gelsinger a w czasie próby terapii genowej wady cyklu mocznikowego 2002 przerwanie prób terapii genowej zespołu anglo-francuskiego w leczeniu SCID po zachorowaniu kilku pacjentów na białaczkę, z których dwóch zmarło 2006 pełna remisja czerniaka złośliwego dzięki terapii genowej przeprowadzonej przez Amerykanina Rosenberg a z National Cancer Institute 2008 skuteczne zastosowanie terapii genowej do leczenia genetycznej, wrodzonej ślepoty Leber a

16 Co zawiera TRANSGEN (gen przenoszony) gen wykorzystywany w transekcji? sekwencja bezintronowa insert kodujący terapeutyczny gen promotor kierujący transkrypcją transgenu tzw. kaseta ekspresyjna rejon inicjacji replikacji (origin - ori), umożliwiający tworzenie kopii genu ogonek polia chroniący przed degradacją przez nukleazy

17 Plazmidowy wektor ekspresyjny, inaczej konstrukt ekspresyjny

18 IN VIVO Jak najefektywniej wprowadzić gen do komórki? ZAINFEKOWAĆ retrowirusy adenowirusy wirusy towarzyszące adenowirusom WEKTORY

19 TERAPIA GENOWA germinalna somatyczna in vivo ex vivo WEKTORY retrowirusy adenowirusy liposomy plazmidy (nagi DNA) metody fizyczne: elektroporacja, ultradźwięki, iniekcja hydrodynamiczna, mikrowstrzeliwanie

20 Liczba protokołów klinicznych Rodzaje wektorów wykorzystywanych w próbach klinicznych terapii genowej

21 Strategie i zastosowanie terapii genowej komplementacja defektu genetycznego np. mukowiscydoza, anemia sierpowata, hemofilie korekta mutacji np. pląsawica Huntingtona zahamowanie ekspresji zmutowanego genu (inaktywacja genów), stosowane w przepadku chorób infekcyjnych i nowotworowych eliminacja komórek, stosowane w przepadku chorób infekcyjnych i nowotworowych nadanie komórkom nowych cech fenotypowych np. terapia proangiogenna lub antyangiogenna (nowotwory)

22 Zastosowanie terapii genowej 1% 8% 9% 8% 1% Nowotwory Choroby infekcyjne Choroby neurologiczne Choroby układu krążenia Choroby monogenowe Choroby wzrostu 65%

23 AVASTIN blokuje VEGF różne typy nowotworów IRESSA blokuje EGFR niedrobnokomórkowy rak płuc ERBITUX blokuje EGF rak jelita grubego HERCEPTYNA blokuje receptor HER2 rak piersi KNOCK-OUT

24 GENOGLADIATORZY

25 Znanych jest około 239 genów sprawności fizycznej (ang. fitness-genes): 214 genów znajduje się na chromosomach autosomalnych 7 na chromosomie X 18 genów w mitochondrialnym DNA Bray et al. Med Sci Sports Exerc 2009

26 SZYBKOŚĆ i WYTRZYMAŁOŚĆ

27 Składniki pigułek wysiłku fizycznego GW1516 GW-501/516 agonista PPAR C 21 H 18 NO 3 S 2 2-[2-methyl-4-([4-methyl-2-[4-(trifluoromethyl)phenyl) - 1,3-thiazol-5-yl]methylsulfanyl]phenoxy]acetic acid AICAR AICA rybonukleotyd agonista AMPK C 9 H 15 N 4 O 8 P aminoimidazole carboxamide ribonucleotide

28 GW1516 agonista PPAR Charakterystyka PPAR IZOFORMY TKANKI LIGANDY fizjologiczne i syntetyczne PPAR PPAR PPAR brunatna tkanka tłuszczowa, nerki, serce, mięśnie szkieletowe biała tkanka tłuszczowa, serce, mięśnie szkieletowe, serce, wątroba, przełyk, nerki biała tkanka tłuszczowa, jelita, nerki, wątroba, śledziona, siatkówka, mięśnie szkieletowe limfocyty, monocyty i makrofagi kwasy tłuszczowe (FA), fibraty kwasy tłuszczowe (FA), eikozanoidy kwasy tłuszczowe (FA), prostaglandyna J 2 (15dPGJ2), tiazolidynodion (TZD)

29

30 GW1516 ligandy MIĘŚNIE SZKIELETOWE błona komórkowa cytoplazma RXR 9-cis RA RXR PPAR PPAR RXR PPAR PPRE TRANSKRYPCJA jądro TRANSPORT I OKSYDACJA KWASÓW TŁUSZCZOWYCH CYKL KREBSA ŁAŃCUCH ODDECHOWY I TERMOGENEZA WŁÓKNA ST MIOGLOBINA TROPONINA BIOGENEZA MITOCHONDRIÓW

31 GW1516 SKUTKI METABOLICZNE SERCE WZROST KURCZLIWOŚCI transport i utlenianie kwasów tłuszczowych MIĘŚNIE WZROST WYTRZYMAŁOŚCI transport i utlenianie kwasów tłuszczowych, nasilona termogeneza wzrost liczby mitochondriów i włókien ST TKANKA TŁUSZCZOWA ZAPOBIEGANIE OTYŁOŚCI transport i utlenianie kwasów tłuszczowych nasilona termogeneza uwalnianie adiponektyny GW1516 TĘTNICE WZROST LIPOPROTEIN HDL WĄTROBA OBNIŻONY WYRZUT GLUKOZY wzrost aktywności szlaku heksozomonofosforanowego MAKROFAGI DZIAŁANIE PRZECIWZAPALNE wiązanie i uwalnianie BCL-6 Barish i wsp. J Clin Invest 2006

32 GW1516

33 AICAR konwersja AMP aktywacja AMPK metaboliczny wskaźnik paliwa lub czujnik energii

34 TRENING/POWTARZANE SKURCZE MIĘŚNI AMP/ATP LKB1 KALMODULINA Ca 2+ AMPK KALCYNEURYNA CaMKs p38mapk? PGC-1 MEF2 TRANSFORMACJA WŁÓKIEN MIĘŚNIOWYCH BIOGENEZA MITOCHONDRIÓW EKSPRESJA BIAŁEK GLUT4

35 AICAR SKUTKI METABOLICZNE Barish i wsp. J Clin Invest 2006

36 GW1516 TRENING AICAR STRES aktywacja kinaz AMPK cytoplazma jądro PGC-1 RXR PPARδ geny wytrzymałości DNA SUPER WYTRZYMAŁOŚCIOWY FENOTYP

37 GW TRENING + AICAR trening+gw genów AICAR+GW genów Narkar i wsp. Cell 2008

38 Mikromacierze GW: GW1516 TR: trening TR + GW: trening + GW1516 VP16-PPARδ

39

40 AICAR SPORT wzrost wytwarzania i wydzielania z moczem (N = 373M + 126K) rodzaj uprawianej dyscypliny wpływa na poziom w moczu np. piłkarze nożni 1912 ng/ml, ciężarowcy 1319 ng/ml wysoki poziom w okresie startowym w porównaniu do przejściowego (Thomas et al. Anal Bioanal Chem 2010)

41 AICAR ANTYDOPING po doustnym podaniu 5% wchłanialności, półokres trwania 1,4 godz po dożylnym podaniu (10, 25, 50, 100 mg/kg) około 8% dawki pojawia się w moczu w ciągu 10 godz (Dixon i wsp. J Clin Pharmacol 1991; Dixon i wsp. J Clin Pharmacol 1993) po dożylnym podaniu maksymalne stężenie w moczu wynosi 100 µg/ml wartość 100-krotnie wyższa od najwyższego stężenia obserwowanego u sportowców (Thomas i wsp. Anal Bioanal Chem 2010)

42 WYKRYWANIE DOPINGU GW1516 I AICAR

43 Czarny rynek dopingowy EXERCISE PILLS

44 Czarny rynek dopingowy

45 INFORMACJE Brown TA. Genomy. Wyd. Naukowe PWN Chrostowski K. Doping genowy nowe zagrożenie dla sportu. Sport Wyczynowy 2005; 9-10: Henderson M. 50 teorii genetyki. Wyd. naukowe PWN Podolska K. Podstawy terapii genowej. Zembroń-Łacny A. Exercise pills inżynieria genetyczna sport. Sport Wyczynowy 2010; 3:

46 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ