dr hab. prof. AWF Agnieszka Zembroń-Łacny DOPING GENOWY 4 CIEMNA STRONA TERAPII GENOWEJ

Transkrypt

1 dr hab. prof. AWF Agnieszka Zembroń-Łacny DOPING GENOWY 4 CIEMNA STRONA TERAPII GENOWEJ

2

3 AVASTIN modulacja ekspresji VEGF IRESSA modulacja ekspresji EGFR ERBITUX modulacja ekspresji EGF TERAPIA GENOWA CZYNNIKI WZROSTU

4

5 WYKRYWANIE DOPINGU GENOWEGO Beiter et al. Gene doping detection assay. Gene Therapy 2011

6 Dlaczego czynniki wzrostu? SYGNAŁ ROŚNIJ I DZIEL SIĘ ODBIÓR PRZEKAZANIE ODPOWIEDŹ

7 KOMÓRKI SATELITARNE (ang. stem cells) potencjał regeneracyjny mięśni Mauro A. Biophys J 1962 Siedem komórek satelitarnych zasocjowanych z jednym włóknem mięśniowym może odtworzyć setki nowych miocytów! University College London,

8 Mackey i wsp. J Appl Physiol 2007, technika NCAM Molgol et al. Biol Res

9 REGENERACJA/HIPERTROFIA MIĘŚNI miocyty wielojądrowe miotuby American College of Sports Medicine

10 Wpływ wysiłku na liczbę komórek satelitarnych: Wysiłek Badani Zmiany l. komórek satelitarnych Piśmiennictwo Pojedyncza biopsja Pojedyncza próba: wysiłek ekscentryczny Pojedyncza próba: 36 km bieg 14 tyg. trening wytrzymałościowy ciężarowcy vs. nietrenujący nietrenujący młodzi vs. starsi mężczyźni nietrenujący młodzi mężczyźni 70% - 100% więcej u ciężarowców niż nietrenujących 24 h po: 141% młodzi, 51% starsi 4 dni po: 192% Kadi i wsp. 1999, Erikssson i wsp Dreyer i wsp Crameri i wsp sportowcy 8 dni po: 27% Mackey i wsp aktywni starsi mężczyźni 10 tyg. trening siłowy nietrenujący młodzi mężczyźni 16 tyg. trening siłowy nietrenujący młodzi vs. starsi mężczyźni 29% Charifi i wsp % Kadi i wsp wyłącznie u młodych Petrella i wsp STOSOWANE TECHNIKI: N-CAM immunofluorescencyjne z zastosowaniem przeciwciał przeciwko N-CAM EM mikroskopia elektronowa, konfokalna

11 FAZY NAPRAWY MIĘŚNI USZKODZENIE MIĘŚNI DEGENERACJA nekroza włókien ODPOWIEDŹ ZAPALNA I IMMUNOLOGICZNA REGENERACJA REORGANIZACJA

12 Wysiłek 24h po wysiłku Dzień - 2 tygodnie po wysiłku Podczas wysiłku Po wysiłku Wypoczynek Odhezja Mechaniczne uszkodzenia transmigracja mięśni PMN Cząsteczki adhezyjne Uzbrojenie selektyny CK Cytokiny CK Makrofagi Cytokiny Czynniki wzrostu Fagocytoza Mb Mb Czynniki chemotaktyczne Uszkodzone włókna Fragmenty tkanki mięśniowe mięśniowej ROS enzymy Fagocytoza Proliferacja komórek satelitarnych Morocyty Komórki śródbłonkowe Fragmenty tkanki Komórki Odbudowane/zregenerowane mięśniowej satelitarne włókna mięśniowe wg Peake et al. Exerc Immunol Rev 2005 Zembron-Lacny i Ostapiuk-Karolczuk Sport Wycz ,2,3 faza: NEKROZA ODPOWIEDŹ ZAPALNA REGENERACJA Wysiłek 24h po wysiłku Dzień - 2 tygodnie po wysiłku Mechaniczne uszkodzenie mięśni Adhezja transmigracja Proliferacja komórek satelitarnych PMN Uzbrojenie Cząsteczki adhezyjn e selektyny Monocyty Mb CK Komórki śródbłonkowe Cytokiny Mb Czynniki chemotakt yczne CK Cytokiny Makrofagi Czynniki wzrostu ROS enzymy Fagocytoza Fagocytoza Uszkodzone włókna mięśniowe Fragmenty tkanki mięśniowej Fragmenty tkanki mięśniowej Komórki satelitarne Odbudowane włókna mięśniowe

13 3 i 4 faza: REGENERACJA I REORGANIZACJA MIĘŚNI NADTLENEK WODORU TLENEK AZOTU CYTOKINY pochodzenia mięśniowego - MIOKINY CZYNNIKI WZROSTOWE Kuang et al. Cell Stem Cell 2008

14 3 I 4 FAZA: REGENERACJA I REORGANIZACJA MIĘŚNI H 2 O 2 NO MIOKINY CZYNNIKI WZROSTOWE IL-1 IL-1ra IL-6 IL-8 IL-10 IL-15 IL-18 TNF cross talk BDNF HGF FGF IGF-I (IGF-IEa, IGF-IEb, IGF-IEc) LIF TGF (negative regulator) PDGF VEGF

15 3 faza: REGENERACJA MIĘŚNI 5-7 dni po uszkodzeniu proliferacja i migracja komórek satelitarnych różnicowanie i fuzja mioblastów, synteza białek (aktyna mięśniowa, miozyna, troponina, tropomiozyna, kinaza kreatynowa i in.) uzupełnienie puli komórek satelitarnych, regeneracja i hipertrofia mięśni

16 4 FAZA: REORGANIZACJA RONS Ca 2+ -AR/cAMP AMPK NIEDOTLENIENIE RONS WYSIŁEK RONS Ca 2+ -AR/cAMP AMPK PGC-1 HIF-1 PGC-1 ERR- VEGF ERR- ERR-,, NRF-1,2 mttfa MEF2 PPAR ANGIOGENEZA BIOGENEZA MITOCHONDRIÓW TRANSFORMACJA WŁÓKIEN TRANSPORT GLUKOZY, UTLENIANIE GLUKOZY KWASÓW TŁUSZCZOWYCH I

17 OSOCZE BOGATOPŁYTKOWE regeneracja tkanek PŁYTKI KRWI zawierają około 30 czynników wzrostowych m.in. płytkopochodny czynnik wzrostu PDGF (platelet derived growth factor), transformujący czynnik wzrostu TGF (transforming growth factor), nabłonkowy czynnik wzrostu EGF (epidermal growth factor), insulinopodobny czynnik wzrostu IGF (insulin-like growth factor) oraz czynnik wzrostu śródbłonka naczyń VEGF (vasoendothelial growth factor) osocze ubogie w płytki płytki i WBC RBC boja oddzielająca czerwone krwinki od osocza bogatopłytkowego

18 Płytkopochodny czynnik wzrostu PDGF regulujące różnicowanie i podziały komórki, odgrywa istotną rolę w angiogenezie wytwarzany w trzech izoformach PDGF-AA, PDGF-AB i PDGF- BB na drodze tzw. splicingu alternatywnego, podobnie jak IGF- 1 komórki satelitarne uwalniają czynnik PDGF-BB, który pobudza je do wzrostu i podziałów

19 Trening sportowy - zapaśnicy OKRES PRZYGOTOWAWCZY (styczeń) OKRES PRZEDSTARTOWY (kwiecień) CK H 2 O 2 NO IL-1 TNF PDGF-BB

20 HIPOKSYCZNY TRENING INTERWAŁOWY HTI lekkoatleci EPO VEGF IGF-I PDGF-BB krew pobierano rano na czczo przed i po cyklu hipoksji, czas ekspozycji 3-5 minut, oddychanie w warunkach normoksji 5 minut, liczba powtórzeń w jednym seansie 10-12, dwa seansy dziennie w ciągu jednego dnia treningowego; stężenie O2 w powietrzu wdychanym 14%

21 Czynnik wzrostowy hepatocytów (ang. hepatocyte growth factor; hepapoietin A; scatter factor) HGF kluczowy regulator masy mięśniowej wytwarzany m.in. przez miocyty i komórki satelitarne uwalniany pod wpływem tlenku azotu

22 HGF transfer genu HGF gene therapy (from Ueki et al., 1999) REGENERACJA KARDIOMIOCYTÓW USZKODZENIE MIĘŚNIA SERCOWEGO

23 HGF transfer genu REGENERACJA KARDIOMIOCYTÓW USZKODZENIE MIĘŚNIA SERCOWEGO Ahmed et al. AnnThorac Surg 2003

24 HGF transfer genu regeneracja kardiomiocytów; uszkodzenie mięśnia sercowego Deuse et al. Circulation. 2009

25 GENY WYTRZYMAŁOŚCI naczynia krwionośne VEGF wprowadzenie genu VEGF stymulacja angiogenezy tworzenie nowych naczyń krwionośnych angiogeneza ten sam efekt jest osiągany przez aktywację HIF-1/2 (czynniki transkrypcyjne EPO); wykład 2

26 GENY WYTRZYMAŁOŚCI cd. komórki śródbłonka VEGF pobudzenie angiogenezy erytrocyty komórki śródbłonka błona podstawowa mięśnie gładkie fibroblasty angiogeneza

27 CZYNNIK WZROSTU ŚRÓDBŁONKA NACZYŃ KRWIONOŚNYCH jego ekspresja w komórkach śródbłonka i komórkach immunologicznych następuje pod wpływem czynnika indukowanego NIEDOTLENIENIEM (HIF1/2) wiąże się do receptorów VEGFR na komórkach śródbłonka uruchamiając szlak kinazy tyrozynowej prowadzący do angiogenezy wywołuje poszerzenie naczyń krwionośnych stymulując produkcje tlenku azotu NO pobudza ekspresję receptorów przebudowy naczyń krwionośnych VEGF

28 Współdziałanie koaktywatorów transkrypcji i czynników transkrypcyjnych w aktywacji VEGF i stymulacji angiogenezy: PGC-1 ERR- RONS Ca 2+ camp AMPK NIEDOTLENIENIE trening wysokogórski trening hipoksyjny NO HIF-1/2 WYSIŁEK RONS Ca 2+ camp AMPK PGC-1 VEGF ERR- ERR- NRF-1,2 tfam MEF2s ANGIOGENEZA biogeneza mitochondriów transformacja włókien

29

30 Ciekawostka: przystosowanie Tybetańczyków do dużych wysokości zmiany w 30 różnych genach, spośród których połowa odpowiada zużycie tlenu mutacje znajdują się w pobliżu genu EPAS1, zwanego genem supersportowców (występuje u 78% Tybetańczyków) zmiany w genomie mieszkańców Tybetu zaszły niedawno, niecałe 3000 lat temu! Opracowaniem nowych terapii genowych dla osób chorych na schorzenia związane z niedoborem tlenu np. epilepsja, schizofrenia

31 Gen EPAS1 gen EPAS1 jest zlokalizowany na 2 chromosomie koduje czynnik transkrypcyjny, który odpowiada za odpowiedź organizmu na niski poziom tlenu regulacja ekspresji genu VEGF

32 Co potrafią Tybetańczycy? produkują 10-krotnie więcej NO, który powoduje rozkurcz naczyń krwionośnych podczas snu ich płuca pracują znacznie lepiej niż u normalnego człowieka w warunkach obniżonej zawartości tlenu ich naczynia w płucach nie kurczą się do macicy i łożyska dociera więcej tlenu dziecko z prawidłową masą urodzeniową

33 TLENEK AZOTU NO

34

35 INFORMACJE Józków P, Mędraś M. Hormon wzrostu i IGF-1 jako substancje dopingujące w sporcie wyczynowym. Endokrynol Pol 2009; 60: Chrostowski K. Doping genowy nowe zagrożenie dla sportu. Sport Wyczynowy 2005; 9-10: KOMISJA DO ZWALCZANIA DOPINGU W SPORCIE Harridge SDR, Velloso CP. IGF-I and GH: Potential use in gene doping. Growth Hormone & IGF Research 2009; 19:

36 DZIĘKUJĘ ZA UWAGĘ