Kontrola ekspresji genów przez hipoksję. Wykład 3. Biochemia stresu oksydacyjnego

Transkrypt

1 Kontrola ekspresji genów przez hipoksję Wykład Biochemia stresu oksydacyjnego Literatura: Grzegorz Bartosz Druga twarz tlenu Barry Halliwell & John Gutteridge Free radicals in biology and medicine

2 Hipoksja fizjologiczne i biochemiczne mechanizmy reakcji na niedobór tlenu Biochemiczne mechanizmy regulacji aktywności czynnika transkrypcyjnego HIF-1: rola hydroksylacji i hydroksylaz prolinowych.

3 dolne drogi oddechowe górne drogi oddechowe UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA Funkcje układu oddechowego: Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla

4 dolne drogi oddechowe górne drogi oddechowe UKŁAD ODDECHOWY CZŁOWIEKA Funkcje układu oddechowego: Zapewnia wymianę gazową między organizmem a otoczeniem Oczyszcza, ogrzewa i nawilża wdychane powietrze Pomaga w utrzymaniu równowagi kwasowo-zasadowej Pobiera tlen i przekazuje go do krwi, a odbiera z niej i usuwa z organizmu dwutlenek węgla

5 WENTYLACJA PŁUC Wymianę gazową w płucach warunkuje sprawne współdziałanie układów wentylacyjnego i krążeniowego Układ wentylacyjny płuc ma za zadanie usuwać dwutlenek węgla i dostarczać tlen do pęcherzyków płucnych Krążenie płucne zapewnia ciągły przepływ krwi przez układ naczyń włosowatych płuc, dzięki temu nadmiar dwutlenku węgla przenoszony jest do pęcherzyków płucnych, a tlen przechodzi z pęcherzyków płucnych do krwi Mechanika oddychania polega na cyklicznych ruchach oddechowych klatki piersiowej na zasadzie pracy pompy ssącej, które poprzez zmianę ciśnienia powodują przepływ powietrza do płuc i z płuc na zewnątrz, czyli powodują ich wentylację

6 WYMIANA GAZOWA Wymiana gazowa w płucach odbywa się dzięki różnicy ciśnień tlenu i dwutlenku węgla we krwi tętniczej i żylnej

7 WYMIANA GAZOWA CA CO 2 + H 2 O <=> H + + HCO 3 - Anhydraza węglanowa (CA) katalizuje odwracalną reakcję powstawania jonu wodorowęglanowego HCO 3 - z wody i dwutlenku węgla.

8 Ciśnienie parcjalne tlenu w różnych tkankach i narządach jest różne 21% ~ % ~15-20% ~5 % ~14 % ~ % Brahimi-Horn et al., 2007

9 HIPOKSJA Stan kliniczny, w którym utlenowanie tkanek jest niewystarczające Może występować zarówno w warunkach fizjologicznych, jak i patologicznych Może dotyczyć całego organizmu lub ograniczać się do jednego narządu Uszkodzenie mięśnia sercowego Wrodzone wady serca Choroby układu oddechowego Choroby układu krążenia

10 RODZAJE HIPOKSJI Wyróżniamy 5 rodzajów hipoksji: 1. anoksyczna (hipoksyczna) - zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach 2. histotoksyczna - spowodowana zahamowaniem procesów utleniania w tkankach, najczęściej w wyniku zatruć (np. cyjankiem potasu, tlenkiem węgla) 3. zastoinowa (krążeniowa) - spowodowana przez spowolniony przepływ krwi przez narządy 4. wysokościowa - niedotlenienie tkanek podczas pobytu na znacznych wysokościach nad poziomem morza 5. anemiczna - w wyniku zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. po krwotoku lub zatruciu tlenkiem węgla, zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych

11 HIPOKSJA HIPOKSYCZNA Zmniejszenie dyfuzji tlenu w płucach spowodowane: niskim ciśnieniem parcjalnym tlenu w powietrzu atmosferycznym zaburzeniami oddychania (choroby serca lub płuc) obecnością ciał obcych w drogach oddechowych obturacją oskrzeli copyright Getty Images, Inc.

13 HIPOKSJA HISTOTOKSYCZNA Zahamowanie czynności enzymów biorących udział w reakcjach wykorzystujących tlen (mimo dostępności tlenu tkanki nie są zdolne do jego wykorzystania, co wywołuje sytuację analogiczną do jego braku). cyjanek (CN - ) siarkowodór (H 2 S) azydek tlenek węgla (CO) Działanie trujące polega na blokowaniu procesu oddychania na poziomie komórkowym poprzez nieodwracalną inhibicję oksydazy cytochromowej, będącej kluczowym enzymem łańcucha oddechowego (kompleks IV) i fosforylacji oksydacyjnej. T. F. Cummings, Occupational Medicine 2004

15 HIPOKSJA ZASTOINOWA Powstaje wskutek niedokrwienia Może być przykładem hipoksji przewlekłej Uwarunkowana spowolnionym przepływem krwi przez narządy, np. w następstwie niewydolności mięśnia sercowego, wstrząsu, zakażenia lub oderwanej blaszki miażdżycowej blokującej światło naczynia Może prowadzić do uszkodzeń serca, wątroby, mózgu i nerek ischemic stroke udar niedokrwienny

17 HIPOKSJA WYSOKOŚCIOWA Choroba wysokościowa (choroba d'acosty, ang. acute mountain sickness, ASM) - Z reguły pojawia się na wysokościach powyżej 2500 m n.p.m., gdzie dostępność tlenu w powietrzu zaczyna być za mała na potrzeby organizmu człowieka Początkowo dochodzi do wzrostu ciśnienia krwi i tętna, a w dalszej kolejności do spadku ciśnienia krwi, co skutkuje omdleniem Zwiększa się ilość erytrocytów we krwi co powoduje jej zagęszczenie Może dojść do obrzęku płuc i obrzęku mózgu, a w przypadku braku interwencji lekarskiej ASM może zakończyć się zgonem Profilaktyka stopniowa, powolna aklimatyzacja i adaptacja do warunków panujących na dużych wysokościach Image courtesy Photographer: Jörg Jahn Agency: Dreamstime.com

19 HIPOKSJA ANEMICZNA zmniejszenia pojemności tkankowej krwi, np. przez zmniejszenie zawartości hemoglobiny w krwinkach czerwonych pod wpływem dużego krwotoku Niewystarczające stężenie hemoglobiny (Hb) w krwinkach czerwonych, co powoduje zmniejszoną zawartość tlenu we krwi Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek

20 HIPOKSJA ANEMICZNA Odpowiedź organizmu: Stymulacja produkcji czerwonych krwinek Erytropoetyna (EPO) glikoproteinowy hormon peptydowy, którego główną funkcją jest stymulacja różnych etapów erytropoezy, co prowadzi do zwiększenia produkcji erytrocytów przez szpik kostny.

21 OBJAWY NIEDOTLENIENIA Niedotlenienie objawia się różnie w zależności od prędkości pojawiania się, stopnia obniżenia prężności tlenu oraz od możliwości rekompensowania niedoboru tlenu Znaczne niedotlenienie pojawiające się nagle (np. dekompresja kabiny samolotu) wywołuje utratę przytomności w ciągu sekund, a po upływie ok. 5 minut prowadzi do nieodwracalnego zniszczenia tkanki mózgowej Ostre niedotlenienie objawia się zaburzeniami koordynacji ruchowej, niewyraźną mową, może również prowadzić do utraty przytomności Przy niedotlenieniu przewlekłym (choroba serca lub płuc, długotrwałe przebywanie na wysokości m n.p.m.) pojawia się duszność, trudności w oddychaniu, występuje oddech typu Cheyne'a-Stokesa (cykle narastających a następnie zmniejszających się ruchów oddechowych powtarzane w nieregularnych odstępach) Klinicznie objawy niedotlenienia: sinica (widoczna najlepiej na wargach, płatkach usznych i pod płytkami paznokciowymi), tachykardia oraz wzrost częstości i głębokości oddychania

22 Bez względu na rodzaj występującej hipoksji każdy organizm posiada zdolności adaptacyjne umożliwiające adaptację komórek i tkanek do stanu niskiej ilości tlenu. Kluczowym elementem związanym z adaptacją organizmu do niskiego stężenia tlenu jest czynnik indukowany hipoksją HIF (ang. Hypoxia Inducible Factor)

23 Reakcja komórek na obniżone ciśnienie parcjalne tlenu 1) Odpowiedź ostra poprzez aktywację kanałów jonowych wrażliwych na tlen; w komórkach dochodzi do szeregu zmian związanych z pobudliwością, kurczliwością i funkcjami wydzielniczymi 2) Odpowiedź przewlekła poprzez wzrost ekspresji czynników transkrypcyjnych indukowanych niedotlenieniem (HIFs ang. hypoxia inducible factors), które z kolei zmieniają ekspresję genów kodujących białka odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiające adaptację komórek do hipoksji Lopez-Barneo, J Appl Physiol, 2004

24 ODPOWIEDŹ OSTRA Kłębek szyjny (łac. glomus caroticum; ang. carotid body) chemoreceptor obwodowy, okrągły twór o średnicy około 4-6 milimetrów, leżący w rozwidleniu tętnicy szyjnej wspólnej. Jest unaczyniony przez gałązkę tętnicy szyjnej zewnętrznej a unerwiony jest przez gałązkę nerwu językowo-gardłowego. Ma właściwości chemorecepcyjne, jest wrażliwy na zwiększone stężenie dwutlenku węgla (hiperkapnia) spadek ciśnienia tlenu (hipoksja) kwasicę które pobudzając kłębek szyjny, doprowadzają do skurczu tętnic, zwolnienia akcji serca oraz hiperwentylacji.

25 Kłębki szyjne, jako najważniejsze obwodowe chemoreceptory W generowaniu reakcji na bodziec hipoksyjny biorą udział głównie kłębki szyjne oraz kłębki aortalne. kłębki szyjne odpowiadają za ok. 90% odpowiedzi na hipoksję, zaś ich udział w procesie oddychania w warunkach normalnych wynosi ok % kłębki szyjne składają się z dwóch typów komórek: komórek typu I i typu II. Komórki typu I są komórkami chemosensorycznymi, zaś komórki typu drugiego pełnią rolę podporową w komórkach typu I występują liczne ziarnistości zawierające neuroprzekaźniki, takie jak aminy katecholowe (w tym dopamina), acetylocholina, substancja P, czy co wskazuje zaangażowanie wielu neuroprzekaźników i neuromodulatorów w przekaźnictwo bodźca pobudzenie kłębków szyjnych przez bodziec hipoksyjny powoduje zmianę potencjału błonowego i wydzielenie z pęcherzyków presynaptycznych neuroprzekaźników, które, już na poziomie nerwu, w zależności od swojego charakteru odpowiednio modulują jego aktywność

26 Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model membranowy Reakcja komórek kłębka szyjnego na zmniejszone ciśnienie parcjalne tlenu depolaryzacja Lopez-Barneo et al., Eur Respir J, 2008

27 Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model membranowy HIPOKSJA Zamknięcie kanału K + O 2 Depolaryzacja komórek kłębka typu I EGZOCYTOZA NEURO- TRANSMITERA Prawdopodobnie neurotransmiterem pobudzającym zakończenia nerwowe jest acetylocholina Pobudzenie zakończenia nerwowego Otwarcie kanałów Ca 2+ zależnych od potencjału

28 Model membranowy Aktywacja chemoreceptorów obwodowych - model mitochondrialny potencjał oksydoredukcyjny Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006

29 HIF-1 w roli łącznika? Postuluje się różne mechanizmy łączące zmiany zachodzące w mitochondriach oraz depolaryzację błony komórkowej i/lub uwalnianie neurotransmitera. Uważa się, iż jednym z czynników łączących te dwa zjawiska może być czynnik transkrypcyjny HIF-1, który odgrywa istotną rolę w utrzymaniu homeostazy tlenowej.

30 HIF-1 w roli łącznika? Komórki hodowane w warunkach obniżonego stężenia tlenu i w obecności inhibitorów łańcucha oddechowego w mitochondriach wykazują obniżoną aktywność czynnika HIF-1α. U myszy pozbawionych jednego allelu genu Hif1α (Hif1α +/- ) dochodzi do upośledzenia depolaryzacji komórek kłębka w odpowiedzi na nagłą hipoksję i do braku poprawy wentylacji płuc. Baby, S.M. et al., communicated, 2005 CIH ang. chronic intermittent hypoxia tzw. przerywana, przewlekła hipoksja, naśladująca epizody hipoksji obserwowane u chorych z zespołem bezdechu sennego Peng, YJ et al., J Physiol, 2006

31 HIF-1 HIF-1α + HIF-1β

32 CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM (HYPOXIA INDUCIBLE FACTORS HIFs) Badania poświęcone elementowi odpowiedzi na hipoksję (hypoxia response element - HRE) w genie erytropoetyny doprowadziły do odkrycia czynnika transkrypcyjnego HIF-1 (Semenza i Wang, 1992, Mol. Cell. Biol. 12: ) HIF-1 reguluje ekspresję wielu genów, m. in. erytropoezy, angiogenezy, enzymów szlaku glikolitycznego HIF-2 ma szczególne znaczenia dla stymulacji produkcji erytropoetyny w wątrobie Rola biologiczna HIF-3 nie jest do końca poznana, przy czym wiadomo, że przynajmniej jeden wariant splicingowy negatywnie reguluje ekspresję HIF-1 i HIF-2

33 AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α HIF-1β & pvhl- Białko von Hippel-Lindau Mole et al., IUBM, 2001

34 REGULACJA HIFα HIPOKSJA NORMOKSJA HIF-1 HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 2-KETOGLUTARAN Fe 2+ BURSZTYNIAN HIF-1 OH OH pvhl stabilizacja zależna od ubikwityny degradacja w proteasomach e.g. VEGF

35 STABILIZACJA HIF-1α w WARUNKACH NIEDOTLENIENIA Acker & Plate 2007

36 CZYNNIKI INDUKOWANE NIEDOTLENIENIEM HIFs to heterodimer zbudowany z podjednostek: HIF i HIF O ketoglutaran PHDs CO 2 + bursztynian FIH-1 P402 P564 N803 p300 N-TAD C-TAD P402 P564 N803 HIF-1α bhlh PAS ODD TAD p300 P405 P531 N847 HIF-2α bhlh PAS ODD TAD p300

37 HYDROKSYLAZY PROLINOWE PHD1 hydroksylacja P402 & P564 PHD2 - hydroksylacja P402 & P564 PHD3 - hydroksylacja P564 kofaktory: tlen, żelazo, α-ketoglutaran, kwas askorbinowy

38 FIH-1 ang. factor inhibiting HIF Hydroksylaza asparaginowa

39 AKTYWACJA I DEGRADACJA HIF-1α Lahiri S et al., Progr Bioph Mol Biol, 2006

40 ODPOWIEDŹ PRZEWLEKŁA Utrzymanie optymalnej dostawy tlenu Erytropoeza Erytropoetyna Transport żelaza Transferyna Receptor transferyny Ceruloplazmina O 2 HIF-1 Kontrola układu naczyniowego Angiogeneza VEGF VEGFR-1 PAI-1 Napięcie ściany naczyń inos endotelina-1 oksygenaza hemowa -1 (HO-1) Regulacja proliferacji i żywotności Zatrzymanie cyklu komórkowego p21 Autofagia BNIP3 Czynniki wzrostowe IGF-1 białka wiążące IGF-1 i 3 (IGFBP-1 i 3) Metabolizm energetyczny komórki Glikoliza LDH kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) aldolaza A i C Transport glukozy transporter glukozy 1 i 3 (GLUT1 i 3) Inne białka Dehydrogenaza fosfo-3-glicerolu

41 Zmiany metaboliczne w komórce niedotlenionej HIF-1 wzrost ekspresji transporterów glukozy GLUT1 oraz GLUT3; wzrost ekspresji enzymów glikolitycznych; wzrost ekspresji dehydrogenazy mleczanowej A (LDH-A); wzrost ekspresji dehydrogenazy pirogronianowej (PDK); zmiana w podjednostce COX (COX4-1 na COX4-2); W odpowiedzi na niedotlenienie, wzrost aktywności HIF-1 prowadzi do zwiększonego transportu glukozy do komórek, nasilenia glikolizy, konwersji pirogronianu do mleczanu, autofagia mitochondriów proces adaptacyjny służący ochronie komórki przed skutkami stresu i śmiercią Cadenas et al., Cardiovasc Res, 2010

42 HIF-1 REGULUJE EKSPRESJĘ PODJEDNOSTEK OKSYDAZY CYTOCHROMOWEJ Cell Apr 6;129(1): HIF-1 regulates cytochrome oxidase subunits to optimize efficiency of respiration in hypoxic cells. Fukuda R, Zhang H, Kim JW, Shimoda L, Dang CV, Semenza GL. Abstract O(2) is the ultimate electron acceptor for mitochondrial respiration, a process catalyzed by cytochrome c oxidase (COX). In yeast, COX subunit composition is regulated by COX5a and COX5b gene transcription in response to high and low O(2), respectively. Here we demonstrate that in mammalian cells, expression of the COX4-1 and COX4-2 isoforms is O(2) regulated. Under conditions of reduced O(2) availability, hypoxiainducible factor 1 (HIF-1) reciprocally regulates COX4 subunit expression by activating transcription of the genes encoding COX4-2 and LON, a mitochondrial protease that is required for COX4-1 degradation. The effects of manipulating COX4 subunit expression on COX activity, ATP production, O(2) consumption, and reactive oxygen species generation indicate that the COX4 subunit switch is a homeostatic response that optimizes the efficiency of respiration at different O(2) concentrations. Thus, mammalian cells respond to hypoxia by altering COX subunit composition, as previously observed in yeast, but by a completely different molecular mechanism.

43 HIF-1 vs HIF-2 HIF-1 HIF-2 Element odpowiedzi na hipoksję (HRE) 5 -A/GCGTG-3 kinaza fosfoglicerynianowa (PGK) dehydrogenaza mleczanowa (LDH) anhydraza węglanowa IX (CAIX) BNIP-3 VEGF adrenomedullina GLUT-1,-3 erytropoetyna Oct-4 (Oct-3/4) CYCLIN D1 TWIST1 TGF-

44 HIF-1 vs HIF-2 HIF-1 ulega ekspresji w wielu różnych tkankach i narządach, natomiast ekspresja HIF-2 jest ograniczona do następujących: płuca serce nerki śródbłonek naczyniowy

45 HIF-1 vs HIF-2 HIF-2α jest stabilizowany w wyższych stężeniach tlenu akumulacja HIF-2α w niedokrwionych organach wskazuje, iż czynnik ten może odgrywać istotną rolę w procesie adaptacji do hipoksji w warunkach hipoksji (1% O 2 ), HIF-1α ulega przejściowej stabilizacji i powoduje szybką odpowiedź tkanek na hipoksję, natomiast HIF-2α ulega stopniowej, powolnej akumulacji i powoduje późną odpowiedź tkanek na hipoksję Patel and Simon, Cell Death and Differentiation 2008 Lorenz Poellinger, communicated Smolenice 2010

46 HIPOKSJA W LABORATORIUM

47 INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs HIPOKSJA NORMOKSJA HIF-1 stabilizacja HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 2-KETOGLUTARAN DMOG Fe 2+ BURSZTYNIAN HIF-1 OH OH pvhl Deferoksamina CoCl 2 zależna od ubikwityny degradacja w proteasomach e.g. VEGF

48 DMOG (Dimethyloxaloylglycine) Inhibitor kompetycyjny wrażliwych na tlen hydroksylaz prolinowych (PHDs) Stabilizuje ekspresję HIF w warunkach normalnego (fizjologicznego) ciśnienia parcjalnego tlenu Powszechnie stosowany jako czynnik naśladujący hipoksję DMOG 2-ketoglutaran

49 MODEL IN VITRO Human Microvascular Endothelial Cells (HMEC-1) ważna funkcja w procesie angiogenezy unieśmiertelniona linia komórkowa produkują VEGF w ilościach możliwych do oznaczenia dostępnymi testami ELISA

50 AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 Western blot HIF-1α HIF-2α normoxia hypoxia α-tubulin normoxia hypoxia α-tubulin control DMOG 500 µm HIF-1α α-tubulin control DMOG 500 µm HIF-2α α-tubulin

51 AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 HIF-1α α-tubulin control AdGFP 100 MOI AdHIF-1α (MOI) HIF-2α α-tubulin control AdGFP 100 MOI AdHIF-2α (MOI)

52 luciferase activity HIF1α activity [% of control] AKTYWACJA HIFs W HMEC-1 Badanie aktywności genu reporterowego HRE luciferaza EMSA h 3h 6h 12h 24h HIF-1 HRE hypoxia response element element odpowiedzi na niedotlenienie [relative units] HIFs # control # DMOG ( M) TransAm ELISA DMOG 250 μm # control DMOG DMOG + DMOG + Wild type Mutated competitor competitor # p<0,05 vs control, *p<0,05 vs cells treated with DMOG *

53 VEGF mrna [relative expression] Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF VEGF promoter activity [% of control] VEGF mrna [relative expression] Badanie aktywności genu reporterowego 1500 * VEGF promotor lucyferaza 1000 * 500 Real-time PCR 0 AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α 3 * 20 * AdGFP AdHIF-1α 0 AdGFP AdHIF-2α *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation

54 control 3h DMOG 3h Aktywacja HIFs zwiększa ekspresję VEGF control 6h DMOG 6h VEGF protein [% of control] control 12h DMOG 12h control 24h DMOG 24 h VEGF protein [% of control] Northern blot ELISA 500 # VEGF ELISA 800 * 0 normoxia hypoxia 600 * AdGFP AdHIF-1α AdHIF-2α # p<0,05 vs normoxia, *p<0,05 vs AdGFP Florczyk et al., in preparation

55 INNE SPOSOBY STYMULACJI HIFs HIPOKSJA NORMOKSJA HIF-1 HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 2-KETOGLUTARAN Fe 2+ BURSZTYNIAN HIF-1 OH OH pvhl stabilizacja Deferoksamina CoCl 2 zależna od ubikwityny degradacja w proteasomach e.g. VEGF

56 CoCl 2 AKTYWUJE HIF Zwiększenie poziomu białka HIF-1α pod wpływem CoCl 2 w osteoblastach Kim at al., Cytokine. 2002

57 aktywność lucyferazy [% kontroli] CoCl 2 zwiększa aktywność HRE oraz aktywację promotora VEGF VEGF promotor lucyferaza HRE lucyferaza HRE 400 * * kontrola CoCl M Loboda A et al., 2006

58 REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1 Guzy and Schumacker, Exp Physiol, 2006

59 REAKTYWNE FORMY TLENU vs HIF-1 Hagen T, Taylor CT, Lam F, Moncada S (2003) Redistribution of intracellular oxygen in hypoxia by nitric oxide: effect on HIF1alpha. Science 302: Hipoteza redystrybucji tlenu Chandel NS, Maltepe E, Goldwasser E, Mathieu CE, Simon MC, Schumacker PT, (1998) Mitochondrial reactive oxygen species trigger hypoxia-induced transcription. Proc Natl Acad Sci U S A 95: Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT) zakłada, iż mitochondrialna oksydaza cytochromowa mająca większe powinowactwo do tlenu niż PHDs i FIH-1 w warunkach hipoksji zmniejsza dostępność tlenu dla tych enzymów, hamując ich aktywność, co prowadzi do stabilizacji HIF-α. zakłada, iż zwiększenie produkcji O 2 przez mitochondrialny kompleks III podczas hipoksji prowadzi do zwiększenia poziomu RFT w cytoplaźmie, które bezpośrednio lub pośrednio hamują aktywność PHDs i FIH-1 zwiększając poziom HIF-α. Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010

60 Hipoteza reaktywnych form tlenu (RFT) Komórki Rho(0), pozbawione mitochondrialnego DNA Brak mitochondrialnego DNA powoduje upośledzenie funkcjonowania mitochondriów i zmniejsza generację RFT w hipoksji. W komórkach Rho(0) w warunkach niedotlenienia nie występuje aktywacja ekspresji genów regulowanych przez HIF Dodanie H 2 O 2 do komórek typu dzikiego jak i do komórek Rho(0) stabilizuje HIF-1α zarówno w normoksji jak i w hipoksji. Rola produkowanych przez mitochondria RFT w indukowanej przez niedotlenienie stabilizacji HIF-α została potwierdzona w komórkach nie posiadających kluczowych elementów łańcucha oddechowego (cytochrom c, żelazowo-siarkowe białka Rieske), po zastosowaniu inhibitorów kompleksu I (rotenon) i kompleksu III (jak myksotiazol i stigmatelina), lub genetycznej delecji kompleksów łancucha oddechowego

61 ROLA KOMPLEKSU III W STABILIZACJI HIF Klimova i wsp. zaproponowali hipotezę dotyczącą szczególnej roli kompleksu III w stabilizacji HIF-α podczas niedotlenienia Mimo, iż zarówno kompleks I i III mogą generować anionorodnik ponadtlenkowy tylko kompleks III może go uwalniać zarówno do przestrzeni międzybłonowej jak i do macierzy mitochondrialnej. Wewnętrzna błona mitochondrialna jest nieprzepuszczalna dla drobnocząsteczkowych związków anionorodnik ponadtlenkowy uwalniany do macierzy mitochondrialnej nie jest przenoszony do cytozolu tylko przekształcany do H 2 O 2 poprzez MnSOD Rodnik uwolniony do przestrzeni międzybłonowej, może przechodzić do do cytozolu

62 HIPOTEZA REAKTYWNYCH FORMY TLENU ROS mogą hamować aktywność PHDs na kilka sposobów: mogą wpływać na szlaki przekazywania sygnału prowadząc do potranslacyjnych modyfikacji PHDs mogą modyfikować mostki disiarczkowe w PHDs mogą utleniać Fe 2+ zmniejszając jego dostępność dla PHDs HYDROKSYLAZY PROLINOWE O 2 CO 2 Fe 2+ α-ketoglutaran BURSZTYNIAN Stachurska A et al, Postępy Biochemii, 2010

63 ANTYOKSYDANTY OBNIŻAJĄ POZIOM HIF-1α DPI (ang. diphenyleneiodonium chloride) PDTC (ang. ammonium pyrrolidinedithiocarbamate) NAC (ang. N-acetyl-cysteine) Mechanizm patogenezy H.pylori ROS wytwarzane przez bakterie H. pylori przyczyniają się do stabilizacji HIF-1a, nawet w warunkach normoksji, co może tłumaczyć kancerogenny wpływ tego drobnoustroju na komórki błony śluzowej żołądka Park HJ et al., Clin Cancer Res. 2003

64 CYKL KWASU CYTRYNOWEGO vs HIF-1 Mitochondria mogą regulować aktywność HIF nie tylko przez RFT, ale również poprzez związki uczestniczące w cyklu kwasu cytrynowego, który ma miejsce w macierzy mitrochondrialnej. szczawiooctan HIF-1α fumaran PHDs bursztynian

65 Aktywacja HIF-1 niezależna od hipoksji Czynniki wzrostu: PDGF TGF-β HGF CoCl 2 trombina HIF-1α NO angiotensyna II CO LPS Cytokiny: IL-1 TNF-α siarkowodór Wiele z tych czynników może działać poprzez generację RFT

66 Siarkowodór aktywuje HIF-1 in vivo Caenorhabditis elegans 0,5% 50ppm Wzrost ekspresji HIF-1 i translokacja do jądra komórkowego (50ppm) (0,5%) Budde & Roth, Mol Biol Cell, 2010

67 Aktywacja HIF-1 przez tlenek węgla powietrze CO (250 ppm) Makrofagi RAW Western blot EMSA Aktywność genu reporterowego po transfekcji phif-1α-luc Immunofluorescencja CO indukuje także ekspresję HIF-1 in vivo Tu: makrofagi pęcherzykowe wyizolowane z myszy C57Bl/6 po ekspozycji na CO lub powietrze przez 2 h CORM cząsteczka uwalniająca tlenek węgla, ang. carbon monoxide releasing molecule Chin BY, PNAS, 2007

68 PODSUMOWANIE Hipoksja to stan, w którym stopień utlenowania tkanek jest niewystarczający Związanie czynnika HIF-1 ze specyficzną sekwencją DNA (5 - (A/GCGTG-3 ), tzw. elementem odpowiedzi na niedotlenienie (HRE), oraz przyłączenie szeregu kofaktorów uruchamia transkrypcję wielu genów, których produkty białkowe są odpowiedzialne za utrzymanie homeostazy tlenu i ułatwiają adaptację komórek do hipoksji Wiele czynników może aktywować HIF-1 niezależnie od hipoksji, np. poprzez RFT, zmniejszając tym samym skuteczność terapii antynowotworowych

69 Zapraszam na wykład 4 Slajdy dostępne na stronie Zakładu Biotechnologii Medycznej