Molekularna organizacja komórki

Transkrypt

1 Arkadiusz Kozubek Aleksander F. Sikorski Jan Szopa Molekularna organizacja komórki II. Lipidy, liposomy i błony biologiczne pod redakcją A. Kozubka Wydanie II, poprawione Wrocław 1996 Wydawnictwo Uniwersytetu Wrocławskiego

2 Recenzent Maria Warwas Opracowanie typograficzne Maciej Szłapka Copyright 1993 by Uniwersytet Wrocławski - Wydawnictwo ISBN Łamanie wykonano w Pracowni Składu Komputerowgo ΤΥΡΟ-GRAF Wydrukowano we Wrocławskiej Drukarni Naukowej

3 Spis treści Wstęp 9 1. Lipidy Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych Ekstrakcja lipidów z materiału zwierzęcego 18 l.1.2. Ekstrakcja lipidów rozpuszczalnikami o małej toksyczności Ekstrakcja lipidów z erytrocytów Ekstrakcja lipidów z materiału roślinnego Izolacja i analiza lipidów Frakcjonowanie lipidów metodą chromatografii na CM-celulozie Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) 24 l.2.3. Analiza fosfolipidów w chromatografii cienkowarstwowej 25 l.2.4. Oznaczanie fosforu w rozdzielonych w TLC frakcjach fosfolipidowych Analiza lipidów roślinnych w chromatografii cienkowarstwowej Izolacja i oczyszczanie lecytyny jajecznej 28 l.2.7. Izolacja monogalakto- i dwugalaktodwuglicerydów z całkowitych lipidów roślinnych 30 l.2.8. Izolacja lipidów fenolowych (5-n-alk(en)ylorezorcynoli) z ziaren żyta 31 l.2.9. Chromatografia cienkowarstwowa lipidów rezorcynolowych Oznaczanie składu nasyconych i nienasyconych homologów lipidów rezorcynolowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej 33 l Oznaczanie składu homologów lipidów rezorcynolowych pod względem długości łańcucha alifatycznego w chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu Oczyszczanie lipidów rezorcynolowych oraz izolacja poszczególnych ich homologów Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach Transestryfikacja lipidów Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej l.3.3. Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych w chromatografii gazowej Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie lipidów całkowitych metodą wanilinową... 39

4 Spis treści Oznaczanie cholesterolu całkowitego Oznaczanie glikolipidów metodą fenolową Oznaczanie fosforu w fosfolipidach Oznaczanie fosfolipidów w zawiesinach wodnych (np. w liposomach) 43 l.4.6. Oznaczanie lipidów rezorcynolowych Detekcja lipidów w chromatografii cienkowarstwowej Detekcja nieswoista Detekcja swoista Amfifilowe właściwości lipidów Wyznaczanie krytycznego stężenia micelizacji na przykładzie związku powierzchniowo czynnego 53 l.6.2. Właściwości termotropowe fosfolipidów - wyznaczanie temperatury przejścia fazowego metodą optyczną 54 l.6.3. Samoorganizacja cząsteczek fosfolipidów - powstawanie liposomów Utlenianie lipidów 59 l.7.1. Oznaczanie produktów peroksydacji reagujących z kwasem tiobarbiturowym Wybrane enzymy metabolizmu lipidów 61 l.8. l. Lipaza trójglicerydowa - test dyfuzyjny na wykazywanie aktywności Fosfolipaza A Oznaczanie aktywności fosfolipazy A Fosfolipaza D Izolacja częściowo oczyszczonej fosfolipazy D 64 l.8.6. Hydroliza fosfatydylocholiny przez fosfolipazę D Wykorzystanie fosfolipazy D do konwersji lecytyny do innych fosfolipidów Lipoksygenazy - enzymatyczne utlenianie lipidów Utlenianie kwasu linolowego przez lipoksygenazę soi Błony biologiczne Białka i lipidy błon erytrocytów Porównanie składu lipidowego błon erytrocytów przeżuwaczy i nieprzeżuwaczy Izolacja i analiza ilościowa i jakościowa białek cieni erytrocytów Oznaczanie białka metodą Lowry'ego Oznaczanie cukrów całkowitych Właściwości barierowe błon biologicznych Transport bierny małych nieelektrolitów 76

5 Spis treści Wybiórczość transportu ułatwionego jonów poprzez błonę biologiczną Indukowana przepuszczalność dwuwarstwy fosfolipidowej dla jonów. Jonofory Płynność błony biologicznej Ocena płynności błon pęcherzyków lipidowych sporządzonych z mieszaniny fosfatydylocholiny i cholesterolu (9:1) metodą depolaryzacji fluorescencji z użyciem difenyloheksatrienu Liposomy jako modele w badaniach procesu fuzji błon biologicznych l. Badanie fuzji liposomów poprzez śledzenie mieszania zawartości ich przestrzeni wodnych Elementy technologii liposomowej Techniki preparacji liposomów Efekt stosowanej techniki preparacyjnej na pojemność liposomów Duże jednowarstwowe liposomy obciążone" sacharozą, metodą solubilizacji detergentem niejonowym i dializy Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach Wpływ składu lipidowego na objętość zamkniętą Określanie trwałości i stabilności liposomów Uwalnianie karboksyfluoresceiny jako miernik stabilności liposomów Badanie wpływu surowicy na trwałość liposomów Dodatek Temperatury i entalpie głównego przejścia fazowego fosfolipidów (Tabela 4) Temperatury przejścia dwuwarstwa-h II fosfatydyloetanolamin (Tabela 5) Orientacyjne masy cząsteczkowe niektórych lipidów (Tabela 6) Struktura i niektóre właściwości wybranych związków powierzchniowo czynnych (Tabela 7) 107

6 Wstęp Lipidy (od greckiego słowa lipos - tłuszcz) są drobnocząsteczkowymi związkami organicznymi występującymi w komórkach zwierząt, roślin i mikroorganizmów lub na ich powierzchni. Lipidy pełnią kluczową rolę jako aktywne składniki błon biologicznych, a także w wielu procesach metabolicznych. Są również formą zapasową paliwa metabolicznego. Pierwszą analizę elementarną lipidów przeprowadził Lavoisier wykazując, że tłuszcze i oleje składają się głównie z węgla i wodoru. Scheele badając lipidy odkrył glicerol i wykazał jego obecność w tłuszczach zwierzęcych i olejach roślinnych. Chevreul w 1811 r. wydzielił z mydeł kwasy tłuszczowe, a w 1812 r. odkrył w kamieniach żółciowych cholesterol. Podzielił on tłuszcze na dwie grupy - tłuszcze zmydlające się i niezmydlające się i wykazał, że tłuszcze zmydlające się są estrami glicerolu i kwasów tłuszczowych. W tym samym czasie niemiecki lekarz Vogel stwierdził występowanie cholesterolu w ścianach naczyń krwionośnych człowieka. W 1877 r. Hoppe-Seiler wydzielił z żółtka jaja oraz z mózgu lipid nazwany lecytyną (z greckiego lekitos - żółtko jaja). W 1884 r. angielski lekarz G. Tudicum w swojej książce dotyczącej budowy mózgu wskazywał biologiczną uniwersalność fosfolipidów. W szczególności napisał, że fosfatydy są chemiczną duszą każdej bioplazmy, zwierzęcej i roślinnej. Mogą pełnić różnorodne funkcje dzięki posiadaniu kontrastowych właściwości. Szczególnie istotna jest ich zdolność do tworzenia roztworów koloidalnych. Bez tych właściwości mózg, jak i każda bioplazma nie mogłyby funkcjonować. Badacz ten wydzielił również z mózgu związki zawierające azot i fosfor, które nazwał kefaliną, sfingomielina i cerebrozydem. Dalsze postępy badań lipidów następowały powoli i dopiero od lat pięćdziesiątych XX w. po opracowaniu nowych metod rozdzielania i analizy tych związków stały się możliwe znaczące postępy. Nowo uzyskiwane dane pozwoliły na zweryfikowanie dotychczas przyjętej opinii o funkcji biologicznej lipidów. Funkcje zapasowe i energetyczne zostały zepchnięte na plan dalszy - głównymi okazały się te, które dotychczas były mało dostrzegane - udział w budowie i funkcji błon biologicznych, procesach biosyntezy i modyfikacji białek w komórce, przemianach energii (fotosynteza), a także w międzykomórkowym przekazywaniu informacji, jak również w wielu istotnych przemianach metabolicznych (np. lipidowe hormony, witaminy, barwniki czy kwasy żółciowe). Jedną z najbardziej intrygujących cech lipidów jest ich nadzwyczajna różnorodność. Powody istnienia takiej różnorodności są niezbyt znane, tym niemniej coraz więcej uwagi poświęca się badaniom jej roli np. w budowie i funkcji błon biologicznych, w których lipidy stanowią średnio 50% składu (od 80% w osłonce mielinowej do 20% w mitochondriach). Nawet pojedyncza błona może zawierać ponad 100 unikalnych typów lipidów. Dlaczego tak wiele i czy każda błona ma unikalny skład lipidowy? Powody tej heterogenności są jeszcze mało znane, chociaż coraz częściej stwierdza się aktywną rolę lipidów w procesach przebiegają-

7 Wstęp 10 cych z udziałem błon biologicznych. W tych badaniach istotne są następujące zagadnienia: - mieszanina lipidów powinna co najmniej tworzyć stabilną strukturę dwuwarstwową, w której białka mogłyby wykazywać swą aktywność, - jedne typy lipidów mogą być wymagane do stabilizacji np. rejonów o silnym zakrzywieniu, połączeń między błonami czy też optymalnej interakcji z określonymi białkami, - inne lipidy są ważnymi czynnikami regulatorowymi. Szczególnie istotne są pochodne fosfatydyloinozytolu występujące w błonach komórek eukariotycznych, - pewne lipidy biorą także udział w szlakach biosyntezy. Na przykład fosfatydyloglicerol u E. coli dostarcza reszt glicerofosforanowych dla biosyntezy periplazmatycznych oligosacharydów, - dla optymalnej aktywności pewnych enzymów mogą być również wymagane pewne swoiste lipidy, - lipidy, a w szczególności gangliozydy, pełnić mogą istotną rolę w regulacji wzrostu komórki, wiązaniu do swoistych receptorów w błonie plazmatycznej, a także w procesie adhezji, - inne składniki lipidowe również mogą pełnić specjalne funkcje. Dotyczy to m.in. dolicholu, ubichinonów, menachinonów, karotenoidów, a także czynnika aktywującego krwinki płytkowe. Opisane w dalszej części tego skryptu ćwiczenia mają na celu zilustrowanie tematyki lipidowej oraz wstępu do problematyki błon biologicznych. Nie pretendują jednak do roli wyczerpującej ilustracji wszystkich zagadnień możliwych do napotkania w czasie studiowania biochemii i biofizyki lipidów i błon biologicznych.

8 1. Lipidy Przez dziesiątki lat postęp w chemii lipidów pozostawał daleko w tyle za badaniami innych głównych związków biologicznych, szczególnie węglowodanów i białek. Powodowane było to faktem, iż łatwiej było opracować metody izolacji i badań tych związków, dzięki czemu bardzo często uzyskiwano je w stanie jednorodnym i krystalicznym. Tłuszcze i inne związki z nimi związane są z reguły bezpostaciowe i trudne do izolacji i rozdzielenia metodami stosowanymi w początkach wieku. Inną przyczyną zaniedbań w badaniach lipidów było przekonanie o ich biologicznej bierności. Jeszcze w chwili obecnej w wielu podręcznikach można spotkać się ze stwierdzeniem, że lipidy służą głównie jako źródło i magazyn energii. W tym braku naukowego zainteresowania lipidami zdarzały się jednak wyjątki, jak np. wykazanie przydatności oleju z azjatyckich drzew z rodzaju Hydnocarpus w leczeniu trądu, czy też aktywności witaminowych i hormonalnych różnych lipidów izoprenoidowych. Szczególnym bodźcem dla rozwoju badań stały się kontrowersje dotyczące możliwego biologicznego efektu utwardzanych" przez katalityczną hydrogenację olejów. Wyjątkowo intensywny rozwój badań lipidów zaobserwowano w ostatnich 50 latach. Przyczyną tego rozwoju było uświadomienie sobie istotnej biologicznej roli lipidów i to w wielu poprzednio nieoczekiwanych aspektach. Rozwój technik badawczych stał się także bodźcem dla dalszych odkryć dotyczących biologicznej i technologicznej istotności lipidów. Pierwszą poważną próbą klasyfikacji lipidów były prace Bloora z 1920 i 1925 r., w których opisuje lipidy jako dużą klasę związków biologicznych obejmujących kwasy tłuszczowe i ich naturalne pochodne, a także inne chemicznie do nich podobne związki występujące w naturze. Bloor określał dalej lipidy jako związki, które: - Są nierozpuszczalne w wodzie, lecz rozpuszczają się w rozpuszczalnikach tłuszczowych", takich jak eter etylowy, chloroform, benzen czy wrzący etanol. Ta właściwość jest najistotniejszą cechą różniącą lipidy od innych głównych grup związków pochodzenia biologicznego. Później okazało się jednak, że właściwość ta nie jest absolutna, np. niektóre lipidy tworzą zawiesiny w wodzie przypominające roztwory prawdziwe. Wykazano również, że pewne lipidy mogą być nierozpuszczalne w niektórych rozpuszczalnikach organicznych - np. fosfatydylocholiny w acetonie, fosfatydyloetanolaminy w etanolu, a sfingomieliny czy glikolipidy w eterze etylowym. - Są związane z kwasami tłuszczowymi będąc aktualnie bądź potencjalnie ich estrami. - Występują w żywych organizmach. Ostatnie dwie cechy zostały wprowadzone dla wykluczenia związków organicznych nie posiadających biochemicznego związku z tłuszczami i kwasami tłusz-

9 1. Lipidy 12 czowymi, a które z racji swojej rozpuszczalności mogłyby być klasyfikowane jako lipidy. Klasyfikacja Bloora obejmowała trzy grupy lipidów: - lipidy proste (estry kwasów tłuszczowych z alkoholami), - lipidy złożone (estry kwasów tłuszczowych zawierające dodatkowe grupy lub reszty funkcjonalne), - pochodne lipidów (związki powstające z powyższych grup podczas hydrolizy). Od czasu opracowania klasyfikacji Bloora odkryto ogromną liczbę nowych lipidów i ich kompleksów, tak że obecnie klasyfikacja lipidów obejmuje bardzo wiele grup związków, w tym i syntetycznych. Oparta na strukturze chemicznej podana poniżej klasyfikacja biochemiczna lipidów została opracowana na podstawie uzupełnionych klasyfikacji Katesa z 1972 r. i Burtona z 1974 r. Zgodnie z nią lipidy dzielą się na następujące klasy: 1. Węglowodory Klasa ta obejmuje najprostsze typy lipidów występujących jako proste, rozgałęzione czy też nienasycone łańcuchy o różnej długości Proste, nasycone węglowodory (parafiny) 1.2. Węglowodory o łańcuchu pojedynczo rozgałęzionym Występują przeważnie w dwu rodzajach: serii iso- ο wzorze ogólnym oraz serii anteiso Węglowodory o wielorozgałęzionym łańcuchu - nasycone izoprenoidy l.4. Proste jednonienasycone węglowodory Przedstawiciele tej grupy o nieparzystej liczbie atomów węgla powstałe prawdopodobnie przez dekarboksylację naturalnych, parzystowęglowych jednonienasyconych kwasów tłuszczowych. Np. 10- lub 8- heptadecen odpowiednio z kwasu wakcenowego i olejowego, a 8-pentadecen z kwasu palmitoolejowego Jednorozgałęzione, nienasycone węglowodory. Występują jako serie isoi anteiso Wielonienasycone izoprenoidy 1.7. Karotenoidy Grupa ta zawiera wielonienasycone węglowodory izoprenoidowe o 40 atomach węgla. Niektóre z wiązań podwójnych występują w układzie sprzężonym. Silnie pochłaniają światło i często są jaskrawo kolorowe. 2. Alkohole Naturalne alkohole alifatyczne występują częściej w postaci estrowej lub eterowej niż w stanie wolnym. Łańcuchy ich mogą być proste, rozgałęzione, a także nienasycone o różnej długości. Alkohole te są głównie alkoholami I i II rzędowymi, a rzadziej III rzędowymi Proste, nasycone alkohole Najczęściej występującymi są alkohole I rzędowe. U bakterii wykazano obecność również alkoholi II rzędowych, takich jak 2-oktadekanol i 2-eikozanol.

10 Podział lipidów Alkohole Jednorozgałęzione Znane są dwa typy tych alkoholi: seria iso- oraz seria anteiso Alkohole wielorozgałęzione - nasycone izoprenoidy Alkohole zawierające łańcuch mieszany, np. bicyklopentanofitanol Alkohole nienasycone Jednonienasycone alkohole są zwykle analogiczne do jednonienasyconych kwasów tłuszczowych Alkohole izoprenoidowe (terpenole i poliprenole) Występują powszechnie w świecie bakterii, roślin i zwierząt. Znane są również alkohole poliizoprenoidowe, posiadające w cząsteczce jedną nasyconą jednostkę izoprenoidową, jak np. baktoprenol (n=l l, C 55). Również fitol jest częściowo nasyconym poliizoprenoidem Sterole Związki te są szeroko rozprzestrzenione u organizmów eukariotycznych - zwierząt (zoosterole), roślin (fitosterole), a także drożdży. Inne steroidy, jak dinosterol, występują w organizmach morskich. Fukosterol, klondrillasterol i proferasterol występują wraz z ergosterolem i cholesterolem u pierwotniaków. W komórkach bakteryjnych wykazano obecność sterolopodobnych lipidów - hopanoidów Alkohole witaminowe Należą tu witaminy rozpuszczalne w tłuszczach Długołańcuchowe poliole (polialkohole) Są to rzadkiego typu lipidy występujące przede wszystkim w organizmach bakteryjnych. 3. Długołańcuchowe aminoalkohole Ta klasa lipidów obejmuje zasadniczo pochodne lub homologi sfingozyny - C18 aminodiolu. Te długołańcuchowe zasady występują z reguły jako składniki sfingolipidów - ceramidów, cerebrozydów, sfingozylofosfatydów (sfingomielin) i gangliozydów. 4. Aldehydy Długołańcuchowe aldehydy występują w formie wolnej, jak np. w wydzielinach oleistych roślin czy też feromonach owadzich lub w postaci eterów winylowych (alk-1-enylo eterów) w analogach glicerydów i fosfatydów (plazmalogenach) 4. l. Proste, nasycone aldehydy 4.2. Nienasycone aldehydy 4.3. Aldehydy Cyklopropanowe Są analogami cyklopropanowych kwasów tłuszczowych i występują u niektórych bakterii (np. Clostridium butyricum) jako składniki plazmalogenów Aldehydy izoprenoidowe Niektóre z tych związków są lotnymi składnikami roślin oraz feromonów owadzich.

11 1. Lipidy Ketony Długołańcuchowe ketony są szeroko rozpowszechnione w naturze i występują głównie w formie wolnej. Są wśród nich 5.1. Metyloketony 5.2. Ketony symetryczne 5.3. Ketony nienasycone, rozgałęzione i cykliczne. Występują u bakterii, a także są feromonami. 6. Fenole i chinony nieizoprenoidowe (lipidy fenolowe) Związki te są pochodnymi fenolu i dwuhydroksybenzenów zawierającymi długie łańcuchy węglowodorowe. Występują w świecie roślin oraz bakterii. 7. Chinony o izoprenoidowym łańcuchu bocznym 8. Kwasy tłuszczowe Długołańcuchowe kwasy karboksylowe występują w wielu odmianach różniących się stopniem rozgałęzienia, liczbą wiązań podwójnych, obecnością innych grup funkcjonalnych oraz długością łańcuchów. Zwykle występują w formie zestryfikowanej, np. jako woski, glicerydy, fosfatydy itp Proste, nasycone kwasy tłuszczowe Powszechnie występują u roślin, zwierząt i bakterii Jednorozgałęzione, nasycone kwasy tłuszczowe Występują w formach iso- oraz anteiso Wielorozgałęzione kwasy tłuszczowe; nasycone izoprenoidy Wykazano w Mykobakteriach Cyklopropanowe i cyklopropenowe kwasy tłuszczowe Wydzielono z bakterii i roślin Cyklopentenowe kwasy tłuszczowe Wykazano w materiałach roślinnych Proste, jednonienasycone kwasy tłuszczowe Powszechnie występujące w materiałach biologicznych. W większości przypadków występują jako izomery cis Wielonienasycone kwasy tłuszczowe Powszechnie występujące w materiałach roślinnych i zwierzęcych, zasadniczo brak ich u bakterii Acetylenowe kwasy tłuszczowe Wykazane w materiałach roślinnych Hydroksykwasy tłuszczowe Występują jako różne izomery. α-hydroksykwasy są składnikami cerebrozydów. β-hydroksykwasy są składnikami lipopolisacharydów ścian komórkowych bakterii Gram-ujemnych, a także komórek drożdżowych; są też intermediatami w β-oksydacji kwasów tłuszczowych. ω-hydroksykwasy są intermediatami w ω- oksydacji kwasów tłuszczowych prowadzonej przez bakterie. Złożone, rozgałę-

12 Podział lipidów 15 zionę hydroksy kwasy tłuszczowe występują u takich bakterii, jak Mycobacteria, Nocardia i Corynebacteria Ketokwasy tłuszczowe Dwukarboksylowe kwasy tłuszczowe Prostaglandyny Ta grupa związków obejmuje nienasycone hydroksy lub keto-hydroksy pochodne C 20 kwasu cyklopentanowego. Powstają w trakcie tzw. cyklooksygenacji czteronienasyconego C 20 kwasu tłuszczowego - kwasu arachidonowego. Występują przede wszystkim w świecie zwierzęcym jako tzw. informatory wtórne drugiego rzędu. 9. Woski Są estrami kwasów tłuszczowych oraz alkoholi tłuszczowych. Występują na powierzchni skóry zwierząt, w skórce liści roślin, a także u takich bakterii, jak Mycobacteria i Corynebacteria. 9.l. Woski proste 9.2. Woski złożone 10. Estry steroli i alkoholi witaminowych Sterole i witaminy rozpuszczalne w tłuszczach z alkoholową grupą funkcyjną występują powszechnie jako estry z kwasami tłuszczowymi, często podobnymi do tych, jakie występują w glicerydach Estry steroli Estry witamin 11. Estry fenoli i kwasów tłuszczowych Wykazana ostatnio grupa związków pochodzenia roślinnego i bakteryjnego. 12. Glicerydy Szeroko rozprzestrzeniona grupa związków nazywana również tłuszczami obojętnymi. Są estrami glicerolu i występują jako: Monoglicerydy Monoestry glicerolu Dwuglicerydy Diestry glicerolu Trójglicerydy Triestry glicerolu. Naturalne zawierają co najmniej dwa różne kwasy tłuszczowe. 13. Etery glicerolowe Łańcuchy węglowodorowe przyłączone są do rdzenia glicerolu wiązaniami eterowymi Alkiloetery glicerolu Podobnie jak u glicerydów występują w tej grupie mono-, dwu- i trój-alkiloetery Alk-1-enylo etery glicerolu

13 1. Lipidy Acylowane alkiloetery glicerolu Acylowane alk-1-enylo etery glicerolu (plazmalogeny obojętne) 14. Fosfolipidy (fosfatydy) Główne składniki błon biologicznych organizmów żywych Glicerofosfatydy Są to pochodne 1,2-dwuacylo-sn-glicerofosforanu (kwasu fosfatydowego). Jest on połączony z resztami aminoalkoholowymi lub wielowodorotlenowymi. Resztami aminoalkoholowymi są reszty seryny, etanolaminy i choliny, a resztami wielowodorotlenowymi reszty glicerolu oraz ufosforylowane inozytole Sfingofosfatydy Zawierają one zamiast glicerolu sfingozynę, aminoalkohol. 15. Glikolipidy Są długołańcuchowymi pochodnymi cukrów oraz istotnymi składnikami pewnych błon biologicznych Glikozylodwuglicerydy Składają się z mono-, dwu- lub trójsacharydów przyłączonych glikozydowo do grup hydroksylowych dwuglicerydu. Występują głównie w materiałach roślinnych i bakteryjnych Glikozydy hydroksykwasów tłuszczowych Estry kwasów tłuszczowych i cukrów Pochodne fosfatydowo-cukrowe Fitoglikolipidy Lipopolisacharydy Wysokocząsteczkowe kompleksy polisacharydowo-lipidowe ścian bakterii Gram-ujemnych Glikozydy sterolowe Cerebrozydy (heksozydy ceramidowe) Są glikozydami długołańcuchowych N-acylowych zasad. Występują w materiałach zwierzęcych i roślinnych Gangliozydy Złożone cerebrozydy, w których reszta ceramidowa przyłączona jest do reszty cukrowej zawierającej galaktozaminę i kwas sialowy. 16. Lipidy zawierające siarkę Grupy hydroksylowe tych lipidów są estryfikowane resztą siarczanową Siarczany długołańcuchowych alkoholi Siarczany cerebrozydów Siarczany glikolipidów Sulfoglikozylodwugliceryd Istotne składniki chloroplastów roślinnych. 17. Lipidy zawierające aminokwasy Jest to grupa lipidów obejmująca niefosfolipidowe pochodne.

14 1. 1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych N-acylo aminokwasy i pochodne estrowe O-acylokarnityny Peptydolipidy 1.1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych Postępowanie ekstrakcyjne powinno umożliwić ilościowe wymycie lipidów i nie powinno powodować ich degradacji. Efektywność postępowania zależy w dużym stopniu od właściwości chemicznych samych lipidów oraz od rodzaju i siły ich wiązań z innymi składnikami komórki. Głównymi oddziaływaniami są: 1. oddziaływania hydrofobowe oraz Van der Waalsa, którymi lipidy niepolarne, jak np. estry steroli, glicerydy czy węglowodory wiążą się poprzez swe łańcuchy węglowodorowe z innymi lipidami lub hydrofobowymi regionami cząsteczek białkowych, 2. wiązania wodorowe i elektrostatyczne, w których uczestniczą lipidy polarne i którymi wiążą się z białkami i lipoproteidami, 3. wiązania kowalencyjne, którymi np. kwasy tłuszczowe związane są estrowo, amidowo lub glikozydowo do struktur białkowych lub polisacharydowych. Wiązania hydrofobowe łatwo zerwać stosując do ekstrakcji rozpuszczalniki niepolarne, takie jak eter etylowy, chloroform czy benzen. Lipidy polarne, występujące głównie w komórkowych strukturach błonowych wymagają do ekstrakcji rozpuszczalników polarnych, takich jak etanol lub metanol w celu zerwania wiązań wodorowych. Lipidy związane kowalencyjnie mogą być ekstrahowane dopiero po hydrolizie tych wiązań, np. w reakcji zmydlania. Najczęściej używanymi rozpuszczalnikami do ekstrakcji lipidów są mieszaniny chloroformu z metanolem. W niektórych jednak przypadkach wymagane jest dodanie jeszcze jednego, bardziej polarnego składnika (np. wodorotlenku amonowego). Uzyskane ekstrakty często przemywa się w celu usunięcia ewentualnie wymytych podczas ekstrakcji takich składników komórkowych, jak cukry, aminokwasy czy sole. Uzyskane ekstrakty filtruje się, a następnie zagęszcza w atmosferze obojętnej (azot, argon) i przechowuje się w postaci stężonych roztworów chloroformowych (chloroform nasycony gazem obojętnym) w niskiej temperaturze (-20 0 C do C).

15 1. Lipidy Ekstrakcja lipidów z materiału zwierzęcego (wg Bligh E. G., Dyer W. J., Can. J. Biochem. Phys., 37 (1959) ) Materiał, odczynniki i roztwory: zawiesina komórek lub organelli; chloroform (2 x destylowany); metanol o małej zawartości wody l x destylowany; 10 mm bufor Tris-HCl ph 7.4 lub M NaCl. Sprzęt: rozdzielacz szklany; wyparka próżniowa; wirówka typu K23. Postępowanie: Do l obj. zawiesiny komórek lub organelli dodać 2 obj. metanolu i wymieszać przez kilkunastokrotne obrócenie rozdzielacza. Dodać l obj. chloroformu i mieszanie faz powtórzyć przez około 5 min. Dodać l obj. buforu lub roztworu NaCl oraz l obj. chloroformu, Ponownie wymieszać fazy, a następnie rozdzielacz odstawić dla ich rozdzielenia. Dla przyśpieszenia rozdzielenia faz można zastosować wirowanie (w probówkach szklanych!) przez 10 min przy 3000 obr. /min. Zebrać dolną, chloroformową fazę, do pozostałości w rozdzielaczu dodać l obj. (w stosunku do ilości metanolu użytej na początku) chloroformu i ponownie mieszać fazy przez 5 min. Po rozdzieleniu zebrać fazę chloroformową. Postępowanie powtórzyć jeszcze raz. Uwaga: Silne wytrząsanie nie polepsza ekstrakcji, a powoduje trudności w rozdzielaniu faz. Uzyskane trzy ekstrakty chloroformowe połączyć, zmierzyć ich objętość i przemyć je mieszając z równą objętością roztworu wodnego. Przemyty ekstrakt chloroformowy odparować na wyparce próżniowej. Uzyskane lipidy rozpuścić w określonej objętości chloroformu i przechowywać w -70 C Ekstrakcja lipidów rozpuszczalnikami o małej toksyczności (wg Radin N. S., w: Methods in Enzymology, Vol. 72 (1981) 5-7) Opisane postępowanie, jak i inne klasyczne metody ekstrakcji lipidów z tkanek używają niezmiennie dwóch typów rozpuszczalników, które są zarówno toksyczne w postaci par, jak i silnie drażniące w postaci cieczy. Co więcej, podczas przechowywania chloroformu powstaje w nim fosgen i HCl. W klasycznych me-

16 1. 1. Ekstrakcja lipidów z materiałów biologicznych 19 todach ulegają również ekstrakcji związki nielipidowe, w tym również część białek. Stwierdzono, że mieszanina heksanu z izopropanolem jest tak samo dobrym rozpuszczalnikiem dla ekstrakcji lipidów jak klasyczne mieszaniny chloroformmetanol, a przewyższa je pod względem niskiej toksyczności. Mieszanina heksanu z izopropanolem ma również mniejszą prężność par od mieszanin chloroformu z metanolem, co zmniejsza ryzyko zagrożenia pożarowego. Mieszanina ta nie ekstrahuje białek, ekstrahuje o wiele mniej materiału nielipidowego, w tym niepożądanych barwników, ma mniejszą gęstość, a także nie absorbuje w ultrafiolecie. Co więcej, białka pozostające po ekstrakcji są w większości nie zdenaturowane i można je łatwo odzyskać. Materiały, odczynniki i roztwory: materiał biologiczny; izopropanol, redestylowany; heksan, redestylowany; oraz cykloheksan i roztwór 10 g bezwodnego Na 2 SO 4 w 150 ml wody - gdy przemywanie ekstraktu jest konieczne. Postępowanie: Przygotować mieszaninę ekstrakcyjną: heksan : izopropanol 3:2 (v/v). Ekstrahowany materiał (upakowane komórki, tkanki) homogenizować przez sek. w mikserze z mieszaniną ekstrakcyjną w stosunku 18 ml/g materiału. Jednorodną zawiesinę przesączyć przez sączek ze spieku szklanego. Pozostałość na sączku zawiesić w 3 ml mieszaniny i pozostawić na kilka minut przed jej przesączeniem, powtórzyć to przemywanie jeszcze raz. Przy ekstrakcji lipidów z surowicy lub pełnej kiwi należy stosować większe ilości mieszaniny ekstrakcyjnej - 33 ml/ml surowicy oraz zastosować stopniowe dodawanie materiału do miksowanej mieszaniny ekstrakcyjnej. Ilość zawartego w ekstrakcie heksan-izopropanol materiału nielipidowego jest tak mała, że nie przeszkadza w analizach chromatograficznych. O ile jest to konieczne, można zastosować jego przemywanie poprzez wymieszanie z 0.5 obj. roztworu siarczanu sodowego i odstawienie do rozdzielenia faz. Faza górna zawiera ekstrakt lipidowy w zredukowanej objętości. Proces przemywania jest korzystny również z tego powodu, że usuwa z mieszaniny składnik o wyższej temperaturze wrzenia, a zatem ułatwia proces odparowywania rozpuszczalników z ekstraktu. Ekstrakt lipidowy odparować w wyparce próżniowej stosując nieco wyższą temperaturę (40-45 C) oraz dodawanie dla ułatwienia odparowywania cykloheksanu.

17 1. Lipidy Ekstrakcja lipidów z erytrocytów (wg Rodriguez-Vico F., Martinez-Cayuela M., Zafra M. F., Garcia-Peregrin E., Ramirez H., Lipids 26(l991)77-80) Przykładowym zastosowaniem ekstrakcji lipidów rozpuszczalnikami o małej toksyczności jest podana poniżej procedura ekstrakcji lipidów z erytrocytów, umożliwiająca równocześnie oznaczanie białek w pozostałości poekstrakcyjnej. Materiały i odczynniki: zawiesina krwinek przemytych buforem PBS 1 ; heksan; izopropanol; chloroform; metanol. Sprzęt: probówki wirówkowe; wirówka typu K23; wyparka próżniowa. Postępowanie: 250 μl upakowanych krwinek umieścić w naczyniu (duża probówka, zlewka) i zmieszać przy ciągłym wytrząsaniu z 25 ml mieszaniny heksanu z izopropanolem (3:2). Odwirować całość przy 4000 x g przez 15 min. Supernatant przenieść ilościowo za pomocą pipetki pasterowskiej do suchej (!) kolbki do wyparki próżniowej. Odparować rozpuszczalniki w wyparce (temp. maks. do 40 C). Suchą pozostałość lipidową rozpuścić w 200 μl mieszaniny chloroform-metanol (2:1) i przechowywać w -70 C Ekstrakcja lipidów z materiału roślinnego Materiały, odczynniki i roztwory: materiał roślinny (liście lub wydzielone chloroplasty); chloroform; metanol; l% roztwór NaCl; izopropanol. Sprzęt: rozdzielacz; M NaCl zawierający 5mM bufor fosforanowy

18 1.2. Izolacja i analiza lipidów 21 szkło podstawowe; kolba do wyparki; wyparka próżniowa. Postępowanie: 20 g liści lub 25 ml upakowanych chloroplastów umieścić w rozdzielaczu na 500 ml. Dodać 100 ml metanolu i wytrząsać przez kilka minut. Dodać 200 ml chloroformu i całość wytrząsać przez obracanie przez kilka minut. Dodać 100 ml metanolu i dodatkowo mieszać przez chwilę. Dodać 150 ml roztworu chlorku sodowego i mieszać całość przez dodatkowe kilka minut. Pozostawić na co najmniej 30 min dla rozdzielenia faz. Zebrać fazę dolną (około 200 ml). Do fazy górnej dodać 200 ml chloroformu i całość mieszać przez kilka minut; pozostawić do rozdzielenia faz. Zebrać fazę dolną i połączyć ją z zebraną poprzednio fazą dolną. Do połączonych faz dodać 200 ml roztworu NaCl i wytrząsać przez kilka minut; pozostawić na 60 min dla rozdzielenia faz. Zebrać fazę dolną i odparować z niej rozpuszczalnik. Dla ułatwienia odparowania wody dodać do fazy dolnej izopropanolu (około 50 ml). Uzyskane lipidy przechowywać w -70 C rozpuszczone w małej ilości chloroformu Izolacja i analiza lipidów Po wyekstrahowaniu lipidów zwykle rozdziela się je na grupy na podstawie różnic w rodzaju i ilości grup jonowych (fosforanowych, aminowych) i niejonowych (hydroksylowych, karbonylowych) obecnych w ich cząsteczkach. Do tego celu stosuje się najczęściej techniki chromatograficzne. Do całkowitego rozdzielenia mieszaniny lipidów stosuje się różne techniki chromatograficzne. a) Chromatografia adsorbcyjna Może być prowadzona na kolumnach w chromatografii cieczowej (LC, HPLC) 2 lub cienkich warstwach (TLC) 3, najczęściej żelu krzemionkowego, w celu rozdzielenia złożonej mieszaniny na poszczególne klasy lipidów. Obserwowana czasami tendencja do rozdzielania się lipidów w obrębie danych klas nie wpływa na rozdział samych klas. W odpowiednich warunkach można rozdzielić węglowodory, alkohole, aldehydy i kwasy tłuszczowe, a także frakcjonować poszczególne typy fosfoglicerydów czy też glikolipidów. 2 3 LC - Liquid Chromatography, HPLC - High Performance (Pressure) Liquid Chromatography. TLC - Thin Layer Chromatography.

19 1. Lipidy 22 b) Chromatografia argentacyjna Chromatografia jest prowadzona na kolumnach lub warstwach żelu krzemionkowego impregnowanego solami srebra, najczęściej azotanem srebrowym. Pozwala ona na rozdzielenie każdej klasy lipidów na grupy związków posiadających tę samą liczbę i konfigurację wiązań podwójnych. Np. alkohole alifatyczne mogą być równocześnie rozdzielane na nasycone, jedno-, dwu- i trójnienasycone, a także na izomery cis i trans nienasycone. Zasada rozdziału polega na niskoenergetycznym kompleksowaniu elektronów π wiązań podwójnych z jonami Ag +, które występuje i jest zrywane podczas normalnego procesu chromatograficznego. Jeżeli w czasie chromatografii część soli srebra ulega wymywaniu eluentem, nie powoduje to zaburzeń w samym rozdziale. Sól srebrową obecną we frakcji lipidowej po rozdziale można usunąć przez rechromatografię na samym żelu krzemionkowym lub przez jej przemycie wodą. c) Chromatografia faz odwróconych (Reversed Phase, RP) Jest techniką rozdzielania mieszanin realizowaną przy użyciu różnych nośników, modyfikowanym parafiną a obecnie najczęściej chemicznie żelu krzemionkowym. Modyfikowane chemicznie żele mają przyłączone do reszt silanolowych (SiOH) alifatyczne łańcuchy węglowodorowe o różnej długości. Wraz z ich zwiększeniem zwiększa się hydrofobowość nośnika. Takie chemicznie modyfikowane żele mają w nazwie dodatkowe oznaczenie RP od Reversed Phase". Obecnie najczęściej stosuje się nośniki typu RP-2, RP-8 oraz RP-18, zwane też ODS (od octadecylsilica"). Elucję w tej technice prowadzi się z reguły układami dwuskładnikowymi, z których jednym jest zawsze woda, np. metanol-woda, acetonitryl-woda, aceton-woda. Technika faz odwróconych umożliwia rozdzielanie mieszanin związków różniących się długością łańcucha lub też liczbą wiązań podwójnych. Ponieważ stwierdzono, że w porównaniu do związku nasyconego jedno wiązanie podwójne wywołuje efekt identyczny, jak skrócenie łańcucha o dwa atomy węgla, dlatego rozdzielenie mieszanin zawierających homologi różniące się zarówno długością, jak i liczbą wiązań podwójnych jest zwykle niemożliwe. Stosując jednak chromatografię na fazach odwróconych w obecności soli srebrowych, opisaną powyżej mieszaninę można rozdzielić. d) Chromatografia jonowymienna Wykazano, że lipidy niejonowe, obojnacze (zwitterjonowe) i kwaśne mogą być efektywnie rozdzielane na kolumnach wypełnionych wymieniaczami jonowymi. Najczęściej stosuje się pochodne celulozy - DEAE-celulozę i CM-celulozę. e) Chromatografia gazowo-cieczowa Technika ta umożliwia rozdział składników mieszaniny lipidów po ich przeprowadzeniu w lotne pochodne zarówno w zależności od długości łańcucha, jak i od liczby wiązań podwójnych. Osiąga się również oddzielenie i rozdział związków o łańcuchach prostych od związków mających łańcuchy rozgałęzione. Często udaje się nawet rozdział izomerów konformacyjnych.

20 l 2. Izolacja i analiza lipidów 23 Zasady chromatografii oraz techniki są bardziej szczegółowo opisane np. w książce Chromatografia i jej zastosowania, A. Berthillier, PWN, Warszawa Frakcjonowanie lipidów metodą chromatografii na CM-celulozie (wg Comfurius P., Zwaal R. F. A., Biochim. Biophys. Acta 488 (1977) 36-42) Materiały i odczynniki: karboksymetyloceluloza drobnoziarnista, forma sodowa (CM-52); metanol; chloroform. Sprzęt: kolumna szklana np. 2.5 x 30 cm z zaworem teflonowym; rozdzielacz ze szlifem pasującym do wlotu kolumny; zlewki do zbierania frakcji; (azot w butli). Przygotowanie kolumny: Zregenerowaną i napęczniałą celulozę zawiesić w metanolu i dekantować kilkakrotnie dla usunięcia bardzo drobnych włókien. Na dnie kolumny umieścić korek z waty szklanej i wypełnić kolumnę w 1/3 metanolem. Wymieszać dokładnie celulozę tak, by uzyskać jednorodną zawiesinę. Część zawiesiny (ok. 1/4) wlać do kolumny uważając, by nie wprowadzić pęcherzyków powietrza. Podłączyć do kolumny azot o zwiększonym ciśnieniu, tak by nadmiar metanolu został dosyć szybko przepchnięty przez formujące się złoże. Dodać następną porcję zawiesiny CM-celulozy i powtórzyć operację. Postępując w ten sposób wypełnić kolumnę do 2/3-3/4 wysokości złożem. Powierzchnię złoża zabezpieczyć korkiem z waty szklanej oraz warstwą kulek szklanych (ok. 1-2 cm grubości) dla ochrony przed uszkodzeniem celulozy w czasie nanoszenia próbek oraz zmiany rozpuszczalników. Kolumnę przechowywać dbając o zachowanie warstwy rozpuszczalnika nad powierzchnią złoża. Rozdział mieszaniny lipidów: Przed naniesieniem próbki metanol z kolumny należy wymyć przez jej przemycie 10 obj. (tu: l obj. kolumny jest równa objętości zajętej przez przygotowane złoże) chloroformu. Próbkę lipidów w roztworze chloroformowym o stężeniu do 50 mg/ml nanieść na kolumnę pamiętając, by nie przeładować kolumny (maksymalna pojemność złoża - 5 mg lipidu na l ml objętości złoża). Po naniesieniu próbki i przemyciu ścianek kolumny lipidy eluuje się z szybkością do 250 ml/godz, (można pomagać sobie ciśnieniem azotu) podanymi w Tabeli l roztworami metanolu w chloroformie.

21 1. Lipidy 24 Tabela 1. Schemat elucji klas lipidowych z CM-celulozy % metanolu w chloroformie , a następnie 0 (po 10 obj.) eluowany lipid wolne kwasy tłuszczowe, cholesterol, pigmenty, glicerydy dwufosfatydyloglicerol fosfatydylocholina sfingomielina, monogalaktodwuglicerol fosfatydyloetanolamina kwas fosfatydowy dwugalaktodwuglicerol fosfatydyloglicerol lizofosfatydylocholina fosfatydyloseryna fosfatydyloinozytol regeneracja Po elucji 5 obj. każdej mieszaniny skontrolować eluent na obecność danego lipidu. Jeżeli będzie jeszcze obecny, to należy kontynuować elucję jeszcze 2 obj. tego samego układu. Eluent zbierać we frakcjach o wielkości równej l obj. kolumny. Zatrzymanie elucji na noc nie wpływa na jakość rozdziału. Frakcje analizować na zawartość lipidów w chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym w dowolnym układzie, np. chloroform/metanol/kwas octowy/woda (60:50:1:4). Frakcje zawierające czyste lipidy połączyć i odparować w wyparce próżniowej. Lipidy rozpuścić w określonej ilości chloroformu i przechowywać w -70 C. Procedurę można przystosować do rozdziału 1g próbek mieszaniny lipidów Rozdział fosfolipidów w wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej (HPLC) (wg Shefiq-ur-Rehman, J. Chromatogr. 567 (1991) 29-37) Materiały i odczynniki: ekstrakt lipidów z materiału biologicznego; acetonitryl (HPLC-grade); metanol (HPLC-grade); kwas o-fosforowy 85%; n-heksan; izopropanol; (standardy fosfolipidów - PC, PE, PS, SM). Sprzęt: chromatograf cieczowy wraz z detektorem UV; kolumna 250 x 4.6 mm wypełniona żelem krzemionkowym; podstawowe szkło laboratoryjne.

22 l 2. Izolacja i analiza lipidów 25 Postępowanie: Przygotować układ elucyjny - acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:10:1.8) i odgazować go przy użyciu pompy próżniowej. Zrównoważyć kolumnę przez przepompowanie przez nią przez 30 min układu przy przepływie 1.5 ml/min. Detektor ustawić na 203 nm. Znaną ilość ekstraktu przenieść do probówki i odparować rozpuszczalnik w strumieniu azotu. Suchą pozostałość rozpuścić w mieszaninie heksanu z izopropanolem (3:1), tak by stężenie lipidów było równe ich stężeniu w oryginalnym ekstrakcie. Za pomocą mikrostrzykawki wprowadzić 50 μl próbki do systemu nastrzykowego a następnie na kolumnę, zaznaczyć punkt wstrzyknięcia na papierze rejestratora. Rozdział prowadzić do chwili wymycia wszystkich frakcji (około 15 min). Orientacyjne czasy retencji wynoszą: PS - 3 min; PE - 4 min; PC - 6 min; SM - 8 min. Alternatywnie można użyć innych układów: a) acetonitryl/metanol/kwas fosforowy (100:40:0.8) - rozdział trwa około 30 min, b) acetonitryl/metanol/kwas siarkowy (100:3:0.05) - rozdział przy przepływie l ml/min trwa około 50 min. Stosując metodę triangulacyjną obliczyć powierzchnie szczytów, a następnie procentową zawartość poszczególnych lipidów w analizowanym ekstrakcie Analiza fosfolipidów w chromatografii cienkowarstwowej (wg Higgins J. A., w: Biological membranes - a practical approach (red. Findlay J. B. C., Evans W. H.), IRL Press, Oxford 1987, s ) Materiały i odczynniki: ekstrakt lipidów; płytki do TLC powleczone żelem krzemionkowym; chloroform; metanol; kwas octowy; kryształki jodu (w pojemniku). Sprzęt: komora chromatograficzna; mikrokapilary do nanoszenia próbek; suszarka.

23 1. Lipidy 26 Postępowanie: W odległości 20 mm od jednego z brzegów płytki delikatnie zaznaczyć ołówkiem linię startową, na której będą nanoszone próbki. Badaną mieszaninę lipidów ( μg) nanieść na linii startowej w postaci kreski o długości l0 mm (uzyskuje się ją nanosząc małe plamki jedna obok drugiej); podobnie nanieść standardy lipidów. Plamki wysuszyć strumieniem powietrza. Komorę chromatograficzną wyłożyć po bokach arkuszami bibuły i umieścić w niej około 150 ml układu rozwijającego - chloroform/metanol/kwas octowy/woda (60:50:1:4). Przykryć komorę i pozostawić na 30 min w celu wysycenia parami rozpuszczalników. Włożyć płytkę z naniesionymi próbkami i rozwijać do czasu dojścia frontu rozpuszczalnika na odległość mm od górnej jej krawędzi. Wyjąć i wysuszyć płytkę strumieniem powietrza pod digestorium(!). Wywołać chromatogram przez jego umieszczenie w pojemniku z jodem lub przy użyciu wybranych z podanych w dalszej części układów detekcyjnych (zob. s. 44 i następne). Jeśli do wywoływania chromatogramu używano jodu, plamy lipidów obrysować miękkim ołówkiem bezpośrednio po wyjęciu płytki z pojemnika Oznaczanie fosforu w rozdzielonych w TLC frakcjach fosfolipidowych (wg Rouser G., Siakotos A. N., Fleischer S., Lipids l (1966) 85-86) Roztwory: 70% kwas nadchlorowy; 2.5% roztwór molibdenianu amonowego; 10% roztwór kwasu askorbinowego (na świeżo!). Sprzęt: probówki pyreksowe; kulki szklane; pipety; łaźnia do spalań; wirówka stołowa; spektrokolorymetr z kuwetami szklanymi; mikrowytrząsarka. Postępowanie: Odbarwić chromatogram przez umieszczenie płytki w strumieniu ciepłego powietrza (pracować pod wyciągiem!). Z każdej z obrysowanych na chromatogramie plam fosfolipidowych wydra-

24 1.2. Izolacja i analiza lipidów 27 pać żel i przenieść do oddzielnych, opisanych probówek. Wykonanie - warstewkę żelu otaczającą plamę zdrapać za pomocą żyletki i odrzucić. Następnie żel plamy zdrapać dokładnie i ostrożnie na kawałek papieru do ważenia i przenieść ilościowo do odpowiedniej probówki. Dla uzyskania ślepych" w odpowiednich probówkach umieścić podobne co w plamie ilości żelu, lecz zdrapane z miejsc nie barwiących się jodem. Do każdej probówki dodać (zachować ostrożność! ) po 0.3 ml kwasu nadchlorowego, przykryć je kulkami szklanymi, umieścić w bloku grzejnym i spalić materiał organiczny przez ogrzewanie w 180 C przez 45 min. Po tym czasie wyjąć probówki i pozostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Do każdej probówki dodać po l.4 ml wody destylowanej, wymieszać zawartość. Dodać po 0.2 ml roztworu molibdenianu, wymieszać. Dodać po 0.2 ml roztworu kwasu askorbinowego i ponownie całość wymieszać na mikrowytrząsarce. Przykryć probówki kulkami szklanymi i umieścić we wrzącej łaźni wodnej na 5 min. Wyjąć probówki i ochłodzić w strumieniu zimnej wody. Oddzielić żel krzemionkowy przez sączenie bądź przez wirowanie (5 min przy 2000 obr. /min). Absorbancję supernatantów zmierzyć w mikrokuwetach szklanych przy 797 nm wobec odpowiednich prób ślepych. Każda z klas fosfolipidów obecnych w ekstraktach zawiera tylko jedną grupę fosforanową. Zależność pomiędzy ilością fosforanu i absorbancją jest liniowa do ok. 1.0 A Analiza lipidów roślinnych w chromatografii cienkowarstwowej (wg Fisher W., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca Raton, 1984, Vol. I s ) Materiały i odczynniki: ekstrakt lipidów roślinnych; płytki do TLC powleczone żelem krzemionkowym, HPTLC firmy Merck; chloroform; metanol; aceton; kwas octowy; kryształki jodu (w pojemniku). Sprzęt: komora chromatograficzna; mikrokapilary do nanoszenia próbek; suszarka.

25 1. Lipidy _28 Postępowanie: W odległości 15 mm od jednego z brzegów płytki delikatnie zaznaczyć ołówkiem linię startową, na której będą nanoszone próbki. Badaną mieszaninę lipidów ( μg) nanieść na linii startowej w postaci kreski o długości l0 mm (uzyskuje się ją nanosząc małe plamki jedna obok drugiej); podobnie nanieść standardy lipidów. Plamki wysuszyć strumieniem powietrza. Komorę chromatograficzną wyłożyć po bokach arkuszami bibuły i umieścić w niej około 50 ml układu rozwijającego - chloroform/aceton/metanol/kwas octowy/woda (50:20:10:10:5). Przykryć komorę i pozostawić na 30 min w celu wysycenia parami rozpuszczalników. Włożyć płytkę z naniesionymi próbkami i rozwijać do czasu dojścia frontu rozpuszczalnika na odległość 2-5 mm od górnej jej krawędzi. Wyjąć i wysuszyć płytkę strumieniem powietrza pod digestorium(!). Wywołać chromatogram przez jego umieszczenie w pojemniku z jodem lub przy użyciu wybranych z podanych w dalszej części układów detekcyjnych. Jeśli do wywoływania plam użyto jodu, plamki zaraz po wyjęciu płytki z pojemnika obrysować miękkim ołówkiem. Usunąć jod z płytki przez nadmuch ciepłym powietrzem (wyciąg!) i spryskać odczynnikiem wywołującym na glikolipidy. Zidentyfikować poszczególne lipidy posługując się schematem (rys. 1). FRONT BARWNIKI MGDG PG DGDG SQOC PC Pl START Rys. 1. Schemat rozdziału lipidów roślinnych w chromatografii cienkowarstwowej na żelu krzemionkowym MGDG - monogalaktodwugliceryd, PG - fosfatydyloglicero1. DGDG - digalaktodwugliceryd, SQDG - sulfolipid, PC -fosfatydylocholina, PI - fosfatydyloinozytol Izolacja i oczyszczanie lecytyny jajecznej (wg Van Deenen L. L. M., de Haas G. H Adv. Lipid Res. 2 (1964) ) Materiały i odczynniki: 20 jajek kurzych; aceton techniczny l x destylowany;

26 1.2. Izolacja i analiza lipidów 29 metanol cz.d.a. l x destylowany; chloroform techniczny 2 x destylowany; amoniak stężony; woda destylowana. Sprzęt: sączek ze spiekiem G4; kolba ssawkowa; mieszadło mechaniczne; wyparka próżniowa; kolumna szklana (30 x 500 mm) na szlifach i z zaworem teflonowym wypełniona żelem krzemionkowym Si60, μm, np. firmy Baker. Postępowanie: Oddzielić dokładnie żółtka od białek. Wymyć z żółtek lipidy obojętne przez ekstrakcję za pomocą 500 ml acetonu przy mieszaniu mechanicznym przez kilka minut; przesączyć przez sączek G4. Uzyskany osad przemyć jeszcze co najmniej 6-krotnie porcjami 500 ml acetonu do chwili uzyskania bezbarwnego przesączu. Uwaga: 1. Ze względu na obecność lecytyn nienasyconych procedura powinna być prowadzona w atmosferze azotu. 2. Kluczową sprawą jest uzyskanie po przemyciu naprawdę bezbarwnego przesączu, inaczej można mieć problemy w dalszych etapach oczyszczania. Z zebranego z sączka białego osadu ekstrahować trzykrotnie fosfolipidy porcjami 500 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (1: 1). Ekstrakty połączyć i jeszcze raz przesączyć. Odparować rozpuszczalniki w wyparce próżniowej (maks. 35 C). Uzyskaną masę fosfolipidów rozpuścić w małej objętości chloroformu. Roztwór fosfolipidów nanieść na zrównoważoną w chloroformie kolumnę i eluować chloroformem do wymycia całości barwnego materiału. Lecytynę wymyć za pomocą układu chloroform/metanol/ amoniak/woda (68:28:2:2). Zbierać frakcje 50 ml. Obecność i czystość lecytyny we frakcjach sprawdzić przy użyciu TLC. Frakcje zawierające czystą lecytynę połączyć i odparować w wyparce. Lecytynę rozpuścić w małej ilości chloroformu i oznaczyć jej zawartość poprzez oznaczenie fosforu. Uwaga: Jeżeli uzyskana lecytyna nie jest dostatecznie czysta, należy powtórzyć chromatografię kolumnową lub zastosować HPLC. Kolumnę zregenerować metanolem i ponownie zrównoważyć w chloroformie. Orientacyjna wydajność - 1g PC o czystości > 95%/l żółtko.

27 1. Lipidy Izolacja monogalaktoi dwugalaktodwuglicerydów z całkowitych lipidów roślinnych (wg van't Hof R., van Klompenburg W., Pilon M., Kozubek A., de Korte-Kool G., Demel R. A., Weisbeek P. J., de Kruijff B., J. Biol. Chem. 268 (1993) ) Materiały i odczynniki: kolumna chromatograficzna wypełniona żelem krzemionkowym firmy Baker zawieszonym w mieszaninie chloroformu z acetonem (1:1); chloroform; metanol; aceton. Sprzęt: naczynia do zbierania frakcji; płytki HPTLC do chromatografii cienkowarstwowej; komora do chromatografii cienkowarstwowej; kolby do wyparki; wyparka próżniowa; pojemnik z jodem. Postępowanie: Kolumnę przemyć 200 ml mieszaniny chloroform/aceton (1:1). Lipidy roślinne (około 50 mg) rozpuszczone w l ml chloroformu nanieść na szczyt złoża i rozpocząć elucję tym samym układem z szybkością 3 ml/min. Eluować używając rozpuszczalnika w ilości co najmniej 10 obj. kolumny. Eluat zbierać do jednego naczynia do chwili wypłynięcia drugiego bladozielonego pasma, następnie zebrać kilka małych (20-30 ml) frakcji, tak by mieć pewność, że pigmenty są całkowicie oddzielone od interesujących nas lipidów, które (monogalaktodwuglicerydy) eluują się zaraz po pigmentach. Następnie elucję prowadzić kolejno: 10 obj. acetonu i 10 obj. mieszaniny chloroform/metanol (9:1) zbierając frakcje ml. Dwugalaktodwuglicerydy eluują się obu układami. Resztę lipidów eluować z kolumny 4 obj. mieszaniny chloroformu z metanolem (1:1). Odparować rozpuszczalniki z zebranych frakcji i po ich rozpuszczeniu w małej ilości chloroformu zanalizować w chromatografii cienkowarstwowej. Frakcje zawierające czyste MGDG i DGDG połączyć i umieścić w C.

28 1.2. Izolacja i analiza lipidów Izolacja lipidów fenolowych (5-n-alk(en)ylorezorcynoli) z ziaren żyta (wg Kozubek A., Acta Aliment. Polon. 9 (1985) ) Lipidy rezorcynolowe są grupą związków lipidowych będących długołańcuchowymi pochodnymi l,3-dwuhydroksy-5-alk(en)ylo-benzenu, są więc homologami orcyny. Lipidy rezorcynolowe występują w materiałach roślinnych, w tym w ziarniakach Gramineae oraz w przetrwalnikach (cystach) bakterii glebowych, takich jak Azotobacter i Micrococcus. Biologiczna rola tych związków nie jest jeszcze poznana, chociaż wiele wskazuje na możliwość ich uczestnictwa w regulacji biosyntezy innych lipidów oraz w mechanizmach obronnych. Charakterystyczną cechą lipidów rezorcynolowych ziaren zbóż jest fakt występowania w nich szerokiego spektrum homologów. Wykazano homologi nasycone, jednonienasycone, a także dwunienasycone. W każdej z tych grup występują z kolei homologi posiadające nieparzystą liczbę atomów węgla w łańcuchach alifatycznych - w ziarnach żyta od Cl3 do C27. Na przykładzie tych związków można prześledzić strategię stosowaną do uzyskania określonego pojedynczego związku lipidowego. Materiały i odczynniki: ziarna żyta; bibuła; aceton; heksan; acetonitryl. Sprzęt: dużej objętości butla lub erlenmajerka; kolba do wyparki; rozdzielacz; wyparka próżniowa; wirówka, np. K-70. Postępowanie: Umieścić ziarna żyta w naczyniu i zalać równą objętością acetonu. Zabezpieczyć przed parowaniem rozpuszczalnika i pozostawić na 24 godziny. Ekstrakt przesączyć przez sączek fałdowany z bibuły, a pozostałość ekstrahować ponownie równą objętością acetonu. Połączyć ekstrakty i odparować z nich aceton w wyparce. Otrzymaną po odparowaniu acetonu pozostałość (tzw. olej acetonowy) rozpuścić w heksanie w temperaturze około 50 C. Roztwór umieścić w zamrażarce na kilka godzin. Wytrącony osad oddzielić od supernatantu przez wirowanie na zimno w szklanych probówkach (około 3000 obr/min przez 20 min).

29 1. Lipidy 32 Supernatant zachować, a osad ponownie rozpuścić w heksanie, wymrozić i odwirować. Uzyskany po tym wirowaniu osad zawiera w większości homologi nasycone, należy go zebrać i po wysuszeniu zachować. Supernatanty heksanowe połączyć i odparować z nich heksan - uzyskany tzw. olej heksanowy zawiera głównie homologi nienasycone. Dla ich oczyszczenia olej heksanowy rozpuścić w 180 ml heksanu, umieścić w rozdzielaczu, dodać 150 ml acetonitrylu (trucizna!) i wytrząsać całość przez 10 min; odstawić do rozdzielenia faz. Zebrać fazę dolną, a górną wytrząsać ponownie ze 150 ml acetonitrylu; po rozdzieleniu faz zebrać fazę dolną i połączyć ją z poprzednio uzyskaną. Z połączonych faz odparować acetonitryl w wyparce próżniowej - uzyska się kilka mililitrów gęstej cieczy zawierającej mieszaninę nasyconych i nienasyconych homologów 5-n-alkilorezorcynolu; przechować ją w -20 C Chromatografia cienkowarstwowa lipidów rezorcynolowych (wg Mejbaum-Katzenellenbogen W., Tłuścik F., Kozubek A., Acta Soc. Bot. Polon. 47 (1978) ) Materiały, odczynniki i roztwory: płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone żelem krzemionkowym Si 60; chloroform; aceton; 0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl. Sprzęt: komory do chromatografii cienkowarstwowej; kuweta do wywoływania chromatogramów; suszarka; kapilary do nanoszenia próbek. Postępowanie: Na płytki o wymiarach 10 x 10 cm pokryte żelem krzemionkowym Si 60 nanieść w odległości 15 mm od dolnej krawędzi μl ekstraktów zawierających lipidy rezorcynolowe. Po wysuszeniu plamek strumieniem powietrza rozwijać w układzie chloroform/aceton 95:5 do chwili osiągnięcia przez front rozpuszczalnika górnej krawędzi płytki. Wysuszyć płytkę i plamy rozdzielonych frakcji wywołać przez spryskanie lub zanurzenie jej w roztworze Fast Red B lub Fast Blue B.

30 1.2. Izolacja i analiza lipidów 33 Lipidy rezorcynolowe wykazują swoistą fioletowoczerwoną barwę oraz wartości R f ok Oznaczanie składu nasyconych i nienasyconych homologów lipidów rezorcynolowych w cienkowarstwowej chromatografu argentacyjnej (wg Kaczmarek J., Tłuścik F., Genet. Polon. 25 (1984) ) Materiały, odczynniki i roztwory: płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone żelem krzemionkowym Si 60; chloroform; aceton; 0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl; 20% azotan srebrowy w 75% metanolu. Sprzęt: komory do chromatografii cienkowarstwowej; kuweta do wywoływania chromatogramów; suszarka; kapilary do nanoszenia próbek. Postępowanie: Płytki impregnować przez zanurzenie na min w roztworze azotanu srebrowego. Odsączyć z nadmiaru roztworu i wysuszyć w 105 C przez 15 min. Analizowane próbki (10-50 μl) nanieść w odległości 15 mm od dolnej krawędzi płytki i po odparowaniu rozpuszczalnika suszarką chromatogram rozwijać w układzie chloroform/aceton (95:5) do chwili osiągnięcia przez front układu górnej krawędzi płytki. Po wysuszeniu chromatogramy przemyć 3 x po 15 min w 300 ml wody destylowanej. Przemyte płytki zanurzyć na 20 min w roztworze Fast Red B. Nadmiar barwnika odmyć przez płukanie płytki 3 x w 200 ml 0.05 M HCl. Żel z wybarwionych pasm wydrapać z wilgotnych płytek i umieścić w probówkach. Barwnik ekstrahować 6 ml acetonu (30 min ekstrakcji) i po oddzieleniu ekstraktów od żelu (sączenie lub wirowanie) określić ich absorbancję przy 470 nm. Próbę odnośnikową przygotować przez ekstrakcję żelu zdrapanego z miejsc nie wybarwionych.

31 1. Lipidy 34 Poczynając od frontu rozpuszczalnika kolejność migracji homologów jest następująca: nasycone, jednonienasycone i dwunienasycone. Obliczenia: Procentową zawartość nasyconych i nienasyconych homologów obliczyć w oparciu o sumę absorbancji oznaczanych frakcji Oznaczanie składu homologów lipidów rezorcynolowych pod względem długości łańcucha alifatycznego w chromatografii cienkowarstwowej na tlenku glinu (wg Tłuścik F., Kozubek A., Chem. Anal. 29 (1984) 79-84) Materiały, odczynniki i roztwory: płytki do chromatografii cienkowarstwowej powleczone tlenkiem glinu (Merck 5581); metanol; 0.1% Fast Red B w 0.05 M HCl. Sprzęt: komory do chromatografii cienkowarstwowej; kuweta do wywoływania chromatogramów; suszarka; kapilary do nanoszenia próbek. Postępowanie: Próbki nanosić na płytki (5 x 20 cm) w postaci kresek długości l cm w odległości mm od dolnej ich krawędzi. Po odparowaniu rozpuszczalnika rozwijać na drodze cm w układzie metanol-12% wody. Płytki zanurzać w układzie nie więcej niż na 5 mm. Po rozwinięciu płytki wysuszyć i zanurzyć na 30 min w roztworze Fast Red B. Osuszyć wybarwione chromatogramy między bibułą, wydrapać żel z wybarwionych pasm i przenieść go do czystych i suchych probówek. Barwnik z żelu ekstrahować 6 ml acetonu przez 30 min wstrząsając probówki od czasu do czasu. Żel oddzielić przez sączenie lub wirowanie. Określić absorbancje ekstraktów przy 470 nm. Jako próby odnośnikowej użyć ekstraktu z żelu wydrapanego z miejsc nie wybarwionych. Dla pewnej identyfikacji homologów wraz z próbą badaną rozdzielać standard pentadecylorezorcynolu (Cl5-AR). Ruchliwość homologów zmniejsza się wraz ze wzrostem długości ich łańcucha alifatycznego. Obliczenia: Procentową zawartość poszczególnych homologów obliczyć na podstawie sumy absorbancji oznaczanych frakcji.

32 1.2. Izolacja i analiza lipidów Oczyszczanie lipidów rezorcynolowych oraz izolacja poszczególnych ich homologów (wg Kozubek A., Acta Aliment. Polon. 9 (1985) ) Materiały i odczynniki: żel krzemionkowy do chromatografii kolumnowej; kolumna do chromatografii argentacyjnej w HPLC; kolumna do chromatografii na odwróconych fazach (RP-18) w HPLC; paski folii pokryte żelem krzemionkowym do chromatografii cienkowarstwowej; nadchloran srebrowy; Fast Blue B; chloroform; metanol; aceton. Sprzęt: kolumna szklana do chromatografii; chromatograf cieczowy preparatywny z kolumnami; kolby do wyparki; wyparka próżniowa. Postępowanie: Kolumnę szklaną wypełnić zawieszonym w mieszaninie chloroformu z acetonem (95:5) żelem krzemionkowym. Na szczyt złoża nanieść preparat lipidów rezorcynolowych rozpuszczony w 2-4 ml chloroformu; eluować kolumnę tym samym układem. Początkowo zbierać frakcje do jednego dużego naczynia kontrolując wyciek z kolumny testem kroplowym na obecność lipidów rezorcynolowych - na pasek folii pokryty żelem krzemionkowym nanosić po kropli eluatu, wysuszyć i pokryć kroplą 0.05% wodnego roztworu Fast Blue B; fioletowoniebieskie zabarwienie wskazuje na ich obecność. Od tej chwili zbierać eluat do oddzielnego naczynia. Zakończyć zbieranie, gdy test kroplowy nie wykaże już obecności lipidów rezorcynolowych. Frakcję zawierającą lipidy rezorcynolowe odparować na wyparce. Zbadać czystość preparatu w chromatografii cienkowarstwowej (zob. poniżej). W celu rozdzielenia i uzyskania homologów różniących się stopniem nasycenia łańcuchów bocznych uzyskany preparat należy rozdzielić w chromatografii argentacyjnej. W tym celu 200 μl roztworu uzyskanych w poprzednich etapach preparatu należy wstrzyknąć na kolumnę HPLC impregnowaną nadchloranem srebrowym i rozdzielić w układzie chloroform/metanol (95:5) zawierającym 20 mmoli/l AgClO 4. Proces rozdziału śledzić za pomocą detektora UV przy 280 nm. Frakcje wypływające z kolumny zbierać do oddzielnych naczyń.

33 1. Lipidy 36 Odparować z nich rozpuszczalnik i zanalizować je w argentacyjnej chromatografii cienkowarstwowej (zob. s. 33). Uzyskane frakcje nasyconych, jedno- i dwunienasyconych lipidów rezorcynolowych rozdzielić na homologi różniące się długością łańcuchów alifatycznych w wysokociśnieniowej chromatografii cieczowej na fazach odwróconych stosując kolumnę wypełnioną hydrofobowym żelem krzemionkowym (Si 60 RP-18) i elucję mieszaniną metanolu z wodą (96:4). Detekcja UV przy 280 nm. Poszczególne homologi zbierać do oddzielnych naczyń, odparować z nich rozpuszczalnik i rozpuścić w określonej ilości metanolu. Oznaczyć stężenie lipidów rezorcynolowych metodą z Fast Blue B (zob. rozdział dotyczący metod ilościowych). Przechowywać w 0 0 C Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych w glicerydach i fosfolipidach Aby stwierdzić, jakiej długości reszty acylowe występują w badanych przez nas lipidach, należy przeprowadzić hydrolizę tych lipidów w celu uwolnienia kwasów tłuszczowych, które następnie zostaną poddane analizie chromatograficznej. Ponieważ najbardziej popularną metodą analizy kwasów tłuszczowych jest chromatografia gazowa, konieczne jest przeprowadzenie kwasów tłuszczowych w lotne pochodne, zwykle estry metylowe. Najczęstszym postępowaniem umożliwiającym równoczesną hydrolizę glicerydów i fosfolipidów i ich modyfikację jest alkoholiza w środowisku kwaśnym. Uzyskane estry metylowe mogą być analizowane bezpośrednio w chromatografii gazowej lub też w chromatografii cienkowarstwowej (szczególnie jakościowo) Transestryfikacja lipidów (wg Christie W. W., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. 1. s ) Odczynniki i roztwory: heksan; 5% HCl w bezwodnym metanolu (A) lub 1% stężony kwas siarkowy w absolutnym metanolu (B) lub 14% trójfluorek boru w metanolu (C); 5% NaCl; 4% węglan potasu; bezwodny siarczan sodu w substancji.

34 1.3. Oznaczanie składu reszt kwasów tłuszczowych 37 Sprzęt: mikrostrzykawki; zakręcane probówki reakcyjne; łaźnia wodna. Postępowanie: l ml roztworu benzenowego zawierającego mg lipidów umieścić w zakręcanej probówce i dodać 3 ml odczynnika modyfikującego (A, B lub C). Zakręcić probówkę i umieścić w temperaturze 60 C na 30 min. Po ochłodzeniu próbki dodać 5 ml 5% roztworu NaCl i po wymieszaniu ekstrahować mieszaninę 3-krotnie 5 ml porcjami n-heksanu. Ekstrakty heksanowe połączyć, przemyć 10 ml 4% roztworu węglanu potasu, a następnie osuszyć bezwodnym siarczanem sodu. Osuszone ekstrakty zagęścić przez odparowanie części rozpuszczalnika np. strumieniem azotu i użyć do dalszej analizy Rozdział estrów metylowych kwasów tłuszczowych w cienkowarstwowej chromatografii argentacyjnej (wg Ackman R. G., w: Handbook of chromatography (red. Mangold H. K.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. 1. s ) Materiały, odczynniki i roztwory: płytki do chromatografii cienkowarstwowej pokryte żelem krzemionkowym; 10% azotan srebrowy w 50% metanolu; heksan; eter etylowy; roztwór 2',7'-dichlorofluoresceiny (zob. s. 45). Sprzęt: komora chromatograficzna; suszarka; lampa UV. Postępowanie: Przygotowane płytki zanurzyć w płaskim naczyniu do 10% roztworu azotanu srebrowego, wytrząsać delikatnie przez 2-3 min, odsączyć od nadmiaru roztworu i wysuszyć na powietrzu przez 5 min, a następnie w 70 C przez 30 min. Roztwór estrów metylowych w heksanie nanieść na płytki w postaci kresek i chromatogram rozwijać jednokrotnie lub dwukrotnie (po rozwinięciu wysuszyć płytkę i ponownie rozwinąć chromatogram w tym samym kierunku i w tym samym układzie rozpuszczalników) w układzie heksan/eter etylowy (95:5).

35 1. Lipidy 38 Po rozwinięciu chromatogramu płytki wysuszyć i w celu detekcji plam spryskać roztworem dichlorofluoresceiny, oglądać chromatogramy pod lampą UV (366 nm). Poczynając od frontu rozpuszczalnika kolejność migracji jest następująca: nasycone, jedno- i dwunienasycone estry kwasów tłuszczowych. Można również zaobserwować rozdzielanie izomerów cis i trans (izomery trans migrują szybciej od izomerów cis). Stosując płytki do chromatografii preparatywnej można wydzielić poszczególne grupy estrów w ilości wystarczającej do ich analizy w chromatografii gazowej Analiza estrów metylowych kwasów tłuszczowych w chromatografii gazowej Sprzęt: chromatograf gazowy z detektorem FID 4 i rejestratorem; butle z gazami: helem, wodorem i powietrzem; kolumna kapilarna z fazą stacjonarną SE-54; mikrostrzykawka do nanoszenia próbek. Postępowanie: Ustawić następujące parametry pracy chromatografu: kolumna 25 m x 0.25 mm, gaz nośny He, ciśnienie MPa, 18:1 20:0 16:0 18:2 18:3 18:0 0 min Rys. 2. Rozdział mieszaniny estrów metylowych kwasów tłuszczowych w kapilarnej chromatografii gazowej na kolumnie z SE-54 4 Flame Ionization Detector - detektor płomieniowo-jonizacyjny.

36 1.4. Metody ilościowe analizy lipidów 39 detektor płomieniowo-jonizacyjny; H 2, MPa; O 2, 0.1 MPa; temperatura komory nastrzykowej C, temperatura detektora C, rozdział izotermiczny w temperaturze 190 C, czułość wzmacniacza 1x10 9 lub 3 x l0 9, wielkość próbki l μl, dzielnik l :50 Po ustabilizowaniu termicznym i elektronicznym aparatu wstrzyknąć do komory nastrzykowej l μl roztworu heksanowego estrów metylowych kwasów tłuszczowych; zaznaczyć moment wstrzykiwania na rejestratorze. Śledzić proces rozdziału przez 30 min. W celu porównania i identyfikacji frakcji przeprowadzić rozdział mieszaniny standardowej metylowanych kwasów tłuszczowych. Na Rys. 2 przedstawiono typowy chromatogram wzorców. Określić ilościowy skład reszt acylowych w analizowanej mieszaninie Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie lipidów całkowitych metodą wanilinową Odczynniki i roztwory: kwas siarkowy stężony; 0.01 M wanilina w 11.5 M kwasie o-fosforowym (do 115 ml 85% kwasu ortofosforowego dodać 20 ml wody), odczynnik trwały przez rok; wzorzec mg cholesterolu rozpuścić w 100 ml metanolu. Podstawą oznaczania jest reakcja fosfowaniliny z wiązaniem nienasyconym. Reakcję dodatnią dają również ketony, wyższe alkohole, związki z aktywną grupą metylenową, hydrazyny i niektóre leki. Postępowanie: W suchej probówce umieścić próbę badaną (50 μl) i dodać do niej 2 ml kwasu siarkowego, po ostrożnym wymieszaniu ogrzewać przez 20 min we wrzącej łaźni wodnej, ochłodzić, podobnie postąpić z próbą wzorcową używając 50 μl roztworu cholesterolu. Pobrać do probówek po 0. l ml powyższych hydrolizatów (próby badanej lub wzorca), dodać 4 ml odczynnika wanilinowego, wymieszać i odstawić na 20 min. Odczytać absorbancje próby badanej oraz wzorcowej przy 525 nm wobec próby ślepej odczynnikowej zawierającej zamiast hydrolizatu 0.1 ml stężone-

37 1. Lipidy 40 go kwasu siarkowego. Odczyty powinny być dokonane w ciągu 30 min od zakończenia reakcji. Obliczenia: μg lipidu w próbie = Oznaczanie cholesterolu całkowitego (wg Courchaine A. J., Miller W. H., Stein D. B. Jr., Clin. Chem. 5 (1959) ) Produkty reakcji cholesterolu z silnym kwasem dają barwne kompleksy z solami żelazowymi. Odczynniki i roztwory: kwas octowy; odczynnik żelazowy - 4 ml FeCl 3 (2.5 g FeCl 3 x 6 H 2 O rozpuścić w 100 ml 85% kwasu ortofosforowego) uzupełnić ostrożnie do 50 ml stężonym kwasem siarkowym; odczynnik jest trwały do utraty klarowności; wzorzec - 10 mg cholesterolu rozpuścić w 100 ml kwasu octowego. Postępowanie: Próbkę lipidów zawierającą do 100 μg cholesterolu umieścić w suchej probówce i odparować z niej rozpuszczalnik. Do pozostałości dodać l.5 ml stężonego kwasu octowego i l ml odczynnika żelazowego. Po dokładnym wymieszaniu odczekać 10 min i odczytać absorbancję próby przy 550 nm wobec ślepej odczynnikowej. Ilość cholesterolu w próbie określić z krzywej kalibracyjnej sporządzonej dla μg cholesterolu Oznaczanie glikolipidów metodą fenolową (wg Roughan P. G., Batt R. D., Anal. Biochem. 22 (1968) 74-88) Stężone kwasy odwadniają reszty cukrowe gliko- i galaktolipidów do oksymetylenofurfurali, które z fenolem dają barwne produkty. Odczynniki i roztwory: stężony kwas siarkowy; 5% (w/v) roztwór fenolu w wodzie; wzorzec cukru mm roztwór wodny galaktozy.

38 l.4. Metody ilościowe analizy lipidów 41 Postępowanie: Do l ml roztworu fenolu wstrzyknąć próbkę chloroformowego roztworu lipidów (do 50 μl). Dodać ostrożnie (!) 4 ml stężonego kwasu siarkowego, wymieszać na mikrowytrząsarce i ostawić do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Odczytać absorbancję próby przy 485 nm wobec próby ślepej odczynnikowej. Przy 500 nmolach galaktozy absorbancja sięga 0.7 A. Oznaczyć zawartość cukru w próbie w oparciu o krzywą kalibracyjną wykonaną dla nmoli galaktozy ( μl) Oznaczanie fosforu w fosfolipidach Fosfolipidy ogrzewane z kwasem nadchlorowym ulegają destrukcji dając CO 2, H 2 O oraz PO W środowisku kwaśnym ortofosforan tworzy z molibdenianem amonowym fosforomolibdenian amonowy. Związek ten pod wpływem czynników redukujących ulega redukcji do mieszanych tlenków molibdenu, tzw. błękitu molibdenowego (Mo 2 O 5 x MoO 3 ), którego ilość określana jest kolorymetrycznie. Metoda I (wg Bartlett G. R., J. Biol. Chem. 234 (1959) ) Odczynniki i roztwory: molibdenian amonowy; stężony kwas siarkowy; dwusiarczyn sodowy Na 2 S 2 O 5 ; siarczyn sodowy Na 2 SO 3 ; kwas l -amino-2-naftaleno-4-sulfonowy; 70% kwas nadchlorowy. Roztwory robocze: Rozpuścić 2.2 g molibdenianu w 20 ml 98% kwasu siarkowego (traktując stężony jako 100%) stosując ciągłe mieszanie przez 10 min, uzupełnić wodą destylowaną do 1000 ml. Odczynnik Fiske-Subbarowa: g dwusiarczynu sodowego oraz l g siarczynu sodowego rozpuścić w 200 ml wody destylowanej, dodać 0.5 g kwasu aminonaftalenosulfonowego i mieszać przez 15 min w temperaturze ok. 40 C, odstawić na noc w ciemne miejsce, a następnie przesączyć do ciemnej butelki. Odczynnik trwały przez ok. 8 tygodni w 4 C. Roztwór standardowy: mg KH 2 PO 4 rozpuścić w 250 ml wody. 10 ml tego roztworu uzupełnić do 250 ml wodą; l ml zawiera 10 μg P i.

39 1. Lipidy 42 Postępowanie: Próbkę lipidów uwolnić od rozpuszczalników przez ogrzanie kilka min w 120 C. Dodać 300 μl kwasu nadchlorowego, wymieszać, przykryć kulką szklaną i umieścić na 30 min w bloku grzejnym ( C). Ochłodzić i dodać 3 ml molibdenianu, zmieszać. Dodać 120 μl odczynnika Fiske-Subbarowa i zmieszać. Przykryć kulką szklaną i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 15 min. Ochłodzić i odczytać absorbancję próby przy 830 nm (barwa stabilna przez 24 godz.). 90 nmoli P i daje absorbancję ok Oznaczyć ilość fosforu w próbie posługując się wykonaną krzywą kalibracyjną (10-90 nmoli P i ). Etap spalania może być tu pominięty. Metoda II (wg Rouser G., Siakotos A. N., Fleischer S., Lipids l (1966) 85-86) Roztwory: 70% kwas nadchlorowy; 2.5% wodny roztwór molibdenianu amonowego; 10% wodny roztwór kwasu askorbinowego (na świeżo!); standardowy roztwór fosforanu jw.; krzywa kalibracyjną jest liniowa do 10 μg P i. Postępowanie: Próbkę lipidów umieścić w suchej probówce, odparować rozpuszczalnik i dodać 0.9 ml kwasu nadchlorowego. Przykryć probówkę kulką szklaną i spalać 30 min w 180 C. Ochłodzić i dodać 5 ml wody spłukując przy okazji ścianki probówki. Dodać l ml molibdenianu, l ml kwasu askorbinowego oraz 2 ml wody, dokładnie wymieszać. Przykryć kulką i ogrzewać we wrzącej łaźni wodnej przez 5 min. Ochłodzić w strumieniu zimnej wody. Odczytać absorbancję klarownego supernatantu przy 825 lub 797 nm wobec ślepej odczynnikowej (w przypadku oznaczeń frakcji z TLC ślepą stanowić będzie podobna jak w próbie badanej ilość żelu, lecz zdrapana z miejsca, w którym nie wykazano fosfolipidów). Odczytać ilość fosforu w próbie posługując się krzywą kalibracyjną.

40 l.4. Metody ilościowe analizy lipidów Oznaczanie fosfolipidów w zawiesinach wodnych (np. w liposomach) (wg Hallen R. M J. Biochem. Biophys. Methods 2 (1980) ) Metoda opiera się na tworzeniu rozpuszczalnych w chloroformie kompleksów fosfolipidów z błękitem molibdenowym. Metoda jest niewrażliwa na dodatki mogące być obecne w zawiesinie, takie jak 5% etanol, 0.05 M CaCl 2, 0.1 M NaCl, 0.5% dezoksycholan sodowy, 0.01 M fosforan sodowy, 0.5% albumina surowicy, 0.5% cholesterol. Odczynniki i roztwory: chloroform; metanol; roztwór roboczy: A. 5 g molibdenianu amonowego rozpuścić w 200 ml 75% kwasu siarkowego; B. 3 g molibdenianu amonowego rozpuścić w 50 ml stężonego kwasu solnego, a następnie mieszać przez 30 min na mieszadle magnetycznym z 2 ml rtęci. Przesączyć i dodać powoli do roztworu A. Uzyskany ciemnoniebieski roztwór (C) pozostawić do ostygnięcia i przelać do ciemnej butelki. Odczynnik trwały w temperaturze pokojowej co najmniej 3 miesiące. Postępowanie: 2 ml zawiesiny fosfolipidów w roztworze wodnym (liposomów) zawierającej nie więcej niż l μmoli lipidu umieścić w zakręcanej probówce i dodać l ml roztworu C. Wymieszać i ogrzewać przez 2 min we wrzącej łaźni wodnej. Przestudzić próbę przez 5 min, a następnie dodać 3.5 ml mieszaniny chloroformu z metanolem (9:1). Zakręcić probówkę i dokładnie wymieszać fazy przez jej odwracanie. Odstawić probówkę na 30 min dla rozdzielenia faz. Pobrać fazę chloroformową (dolna) i odczytać absorbancję niebieskiego kompleksu przy 760 nm wobec chloroformu jako ślepej odczynnikowej. Krzywa kalibracyjną jest liniowa w zakresie A, co odpowiada stężeniu do 0.6 μmola lipidu Oznaczanie lipidów rezorcynolowych (wg Tłuścik F., Kozubek A., Mejbaum-Katzenellenbogen W., Acta Soc. Bot. Polon. 50 (1981) ) Metoda opiera się na tworzeniu barwnych związków dwuazowych w wyniku reakcji barwników dwuazonionych z fenolami. Lipidy rezorcynolowe dają swoiste fioletowoczerwone związki, których ilość oznaczana jest kolorymetrycznie.

41

42

43

44

45

46

47

48

49

50

51

52

53

54

55

56

57

58

59

60

61

62

63

64

65

66 3. Elementy technologii liposomowej Liposomy, jak już wspomniano (s. 58), są zamkniętymi strukturami uzyskiwanymi podczas hydratacji fosfolipidów. Możliwość ich powstawania wynika z wyjątkowo korzystnych wartości HLB fosfolipidów jako amfifilów oraz kształtu ich cząsteczek, dzięki czemu większość fosfolipidów preferuje tworzenie agregatów dwuwarstwowych. Już podczas pierwszych badań przy użyciu najprymitywniejszych liposomów, czyli wielowarstwowych pęcherzyków (zwanych też ręcznie wytrząsanymi liposomami), stwierdzono, iż struktury te są w stanie zamykać i przechowywać roztwory solutów. Ponieważ skład błony liposomalnej można łatwo zmieniać, dlatego też początkowo liposomy stanowiły jeden z głównych układów modelowych w badaniach nad właściwościami i strukturą błon biologicznych. Z czasem model ten zaczął ulegać coraz dalej idącym zmianom i obecnie skład błon liposomowych coraz bardziej zbliża się do składu błon naturalnych. Liposomy tworzy się nie tylko z różnych typów, ale i klas lipidów, wbudowuje w ich błony Sterole, a także funkcjonalne cząsteczki białek błonowych. Liposomy służą nawet do badań, w których śledzi się izolowane procesy przebiegające w organellach, a nawet komórkach. Badania nad liposomami jako modelowymi błonami biologicznymi zaowocowały również wielością metod pozwalających na otrzymywanie różnorodnych rodzajów liposomów. Te poszukiwania coraz to nowych technik uzyskiwania liposomów wynikały z faktu, że nie znaleziono jeszcze sposobu uzyskiwania uniwersalnego liposomu. Jedne techniki są proste, lecz umożliwiają otrzymywanie liposomów składających się z wielu koncentrycznie zamkniętych przedziałów wodnych, inne natomiast dają wprawdzie twory otoczone tylko jedną dwuwarstwa, lecz o zbyt małych w porównaniu do komórki rozmiarach. Jeszcze innym powodem kontynuacji prac nad liposomami, które przekształciły się w oddzielną gałąź badań zwaną technologią liposomową, była chęć praktycznego wykorzystania zdolności zamykania solutów w strukturach utworzonych z naturalnych składników błon biologicznych, a więc obojętnych immunologicznie. Głównymi celami technologii liposomowej są: - Opracowanie postępowania umożliwiającego wprowadzanie solutów do wnętrza komórek w sposób ukierunkowany i kontrolowany. Tymi solutami mogą być np. przeciwciała, antygeny, fragmenty kwasów nukleinowych, a nawet całe chromosomy. Wprowadzanie tego typu solutów umieszczonych w strukturach zamkniętych typu liposomu zapobiega m.in. niepożądanym reakcjom ubocznym i równocześnie chroni je przed np. degradacją, której ulegałyby podczas bezpo-

67 3. l. Techniki preparacji liposomów 91 średniego podawania. Jednym z efektów badań nad wprowadzaniem solutów do komórek za pośrednictwem zamkniętych struktur błonowych było stwierdzenie, że również cienie erytrocytów mogą być używane do tego celu. - Opracowania takich technologii, dzięki którym dawki leków normalnie toksycznych w stanie wolnym mogłyby ulec obniżeniu przy zachowaniu tej samej lub wyższej skuteczności. Z drugiej strony niezmiernie ważnymi zagadnieniami są: poprawienie farmakodynamiki leków podawanych w liposomach, uczynienie liposomów niewykrywalnymi przez system makrofagów oraz opracowanie metody przechowywania liposomów w stanie nie zmienionym przez odpowiednio długi okres czasu Techniki preparacji liposomów W odpowiedzi na potrzeby uzyskiwania określonego typu liposomów wymaganych dla konkretnych zastosowań, w okresie ostatniej dekady metody preparacji różnych typów liposomów uległy szybkiemu rozwojowi. Wartość metody lub kombinacji metod zależy przede wszystkim od potrzeb badacza i zakładanego sposobu ich wykorzystania. Pewne metody są bardziej użyteczne dla jednych celów, podczas gdy inne dla drugich. Ocena różnych metod opierająca się na klasyfikacji i zastosowaniach różnorodnego typu liposomów będzie podana poniżej. Jeszcze innym kryterium jest stwierdzenie, czy dana metoda nadaje się szczególnie dla skali laboratoryjnej (1-100 ml liposomów o stężeniu mg/ml), skali półprodukcyjnej (do 10l zawiesin o stężeniu mg/ml), czy też skali produkcji przemysłowej (ponad 10l o stężeniu do 400 mg/ml). Mimo wielkiej liczby rozmaitych technik preparacji uzyskiwane liposomy można podzielić na trzy główne grupy: 1. liposomy wielowarstwowe (MLV), 2. małe jednowarstwowe liposomy (SUV), 3. duże jednowarstwowe liposomy (LUV). ad l. Jeżeli nie ma ograniczeń czy też preferencji w stosunku do rozmiarów i budowy, wielowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne w przypadkach zamykania solutów lipofilowych lub też wtedy, gdy efektywność zamykania roztworów wodnych nie jest istotna. Na skalę laboratoryjną odpowiednią techniką jest klasyczna metoda hydratacji cienkiego filmu lipidowego (opisana już w poprzednim rozdziale), która może być uzupełniona wymiarowaniem" uzyskanych liposomów przez przeciskanie ich przez filtry membranowe o porach określonej średnicy. Gdy chodzi o większą skalę produkcji liposomów, należy stosować inne postępowania, takie jak liofilizacja, suszenie rozpylonej zawiesiny, czy też wstrzykiwania wraz z odparowywaniem rozpuszczalnika. Jeżeli wymagana jest wysoka zdolność enkapsulacyjna rozpuszczalnych w wodzie solutów, należy roz-

68 3. Elementy technologii liposomowej 92 1 mikrometr MLV l/mol SUV l/mol LUV l/mol Rys. 24. Główne typy liposomów i ich podstawowe parametry ważyć zastosowanie następujących metod: (a) odparowywania fazami odwróconymi, (b) metodę zamrożeniowo-rozmrożeniową lub dehydratacyjno-rehydratacyjną w połączeniu z wymiarowaniem lub (c) wymiarowania, homogenizacji czy też wstrzykiwania i odparowywania rozpuszczalnika. Metoda (c) jest szczególnie przydatna do preparacji większych ilości liposomów (do objętości l 1). ad 2. Dla pewnych zastosowań wąski zakres rozmiarów i wysoki stosunek powierzchni do objętości małych jednowarstwowych liposomów czyni je bardzo przydatnymi, szczególnie gdy nie jest wymagana wysoka wydajność enkapsulacji wodorozpuszczalnych solutów. Do ich preparacji na skalę laboratoryjną stosuje się dezintegrację ultradźwiękami, prasę Frencha lub wstrzykiwanie roztworów etanolowych. Wybór pomiędzy tymi metodami zależy od dostępności sprzętu oraz istotności obecności w preparatach resztkowych (7-10%) ilości etanolu. ad 3. Duże jednowarstwowe liposomy są szczególnie przydatne do wydajnego zamykania rozpuszczalnych w wodzie solutów z powodu preferującej objętość przestrzeni wodnej wartości stosunku objętości do powierzchni. Liposomy tego typu są również pożądane do rekonstytucji białek błonowych, a także badań nad przepuszczalnością i fuzją błon. Do rekonstytucji białek błonowych najczęściej stosowane są metody usuwania detergentów, podczas gdy najbardziej wydajną metodą uzyskiwania wysokiego stopnia zamykania rozpuszczalnych w wodzie solutów, w tym makrocząsteczek, jest metoda odparowywania fazami odwróconymi. Metody te uzupełnia się kalibrowaniem uzyskanych liposomów. Gdy proces ten wykonywany jest pod wysokim ciśnieniem, przy dużych stężeniach lipidu i przy stosowaniu filtrów błonowych o małej średnicy porów, uzyskiwane liposomy są nie tylko homogenne w wielkości, ale również posiadają wysoką zdolność enkapsulacyjną. Powstawanie pęcherzyków liposomalnych opisują dwa główne modele: model

69 3.1 Techniki preparacji liposomów 93 pączkowania" oraz model fuzji fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej". W modelu pączkowania" pęcherzyki powstają w czasie stopniowego uwadniania suchych fosfolipidów. Suche, cienkie warstewki fosfolipidów posiadają strukturę warstwową identyczną z dwuwarstwa; podczas uwadniania roztwór wodny wnika pomiędzy poszczególne dwuwarstwy powodując ich rozdzielanie i powstawanie pączkujących zaczątków pęcherzyków, podobnych do obserwowanych w echinocytozie (echinocytoza - proces tworzenia wypustek błony plazmatycznej nadających krwinkom jeżopodobny kształt). Pęcherzyki podczas mechanicznego wytrząsania hydratowanego fosfolipidu odrywają się, a jako że powstały z wielu warstw suchego fosfolipidu, stają się wielowarstwowymi liposomami. Poddanie tych pęcherzyków drganiom rezonansowym ultradźwięków powoduje dalsze odpączkowywanie małych, jednowarstwowych pęcherzyków. Podobnie homogenizujące" i reorganizujące działać będzie przeciskanie dużych pęcherzyków przez małe pory filtrów membranowych. W modelu fuzji fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej" intermediatem, niezależnie od techniki stosowanej do uzyskania finalnych liposomów są mniej lub bardziej płaskie fragmenty dwuwarstwy, z których dopiero na drodze fuzji powstają zamknięte pęcherzyki, których wielkość zależy od wtórnej ich obróbki. Na Rys. 25 przedstawiono schemat klasyfikacji różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowany zgodnie z założeniami omawianego modelu. Poniżej zostaną przedstawione niektóre z procedur stosowanych do uzyskania różnego rodzaju pęcherzyków liposomalnych. Do charakterystyki uzyskanych preparatów stosuje się m.in. określanie wartości tzw. objętości zamkniętej (captured volume) definiowanej jako objętość roztworu wodnego zamknięta przez daną ilość lipidu i jest wyrażana w litrach/mol lipidu całkowitego oraz tzw. wydajność zamykania (encapsulation efficiency) definiowana jako część roztworu, która jest zamknięta w liposomach. Ten drugi parametr jest wprost proporcjonalny do stężenia lipidu w preparacie liposomowym. Materiały, odczynniki i roztwory: chloroformowe roztwory lecytyny, cholesterolu, fosfatydyloetanolaminy, fosfatydyloseryny, kwasów tłuszczowych i innych lipidów o stężeniu 60 μmoli/ml; roztwór związku barwnego do określania parametrów zamykania w liposomach (zob. dośw. Samoorganizacja fosfolipidów"); 10% roztwór Tritonu X-100; eter etylowy; etanol absolutny; napęczniały żel Sephadex G-50 lub G-75. Sprzęt: wyparka próżniowa; dezintegrator ultradźwiękowy; ekstruder liposomowy; azot w butli.

70 3. Elementy technologii liposomowej 94 PĘCHERZYK LIPOSOMOWY (fuzja) dwuwarstwowe fragmenty fosfolipidowe mechaniczne rozbicie wcześniej istniejących w zawiesinie fosfolipidowej dwuwarstw elektrostatyczne chemiczne narastanie dwuwarstw przez zmianę rozpuszczalności fosfolipidów w zawiesinie poprzez usuwanie fazy organicznej ko-rozpuszczalnika bezpośrednie tworzenie w czasie pęcznienia na szablonie chemicznie ultradźwięki zmiany ph dodanie krótko- metody jony topografia indukowana łańcuchowych wstrzykiwania chaotropowe powierzchni fosfolipidów roztworów prasa Frencha usunięcie odparowanie detergentów jonów wapnia fazami odwróconymi przeciskanie przez filtry membranowe intensywne mieszanie Rys. 25. Klasyfikacja różnych metod preparacyjnych pęcherzyków liposomalnych opracowana zgodnie z założeniami modelu tworzenia pęcherzyków przez fuzję fragmentów dwuwarstwy fosfolipidowej Efekt stosowanej techniki preparacyjnej na pojemność liposomów a) Klasyczne wielowarstwowe liposomy (MLV) (wg Bangham A. D., de Gier J., Greville G. D., Chem. Phys. Lipids l (1967) ) Postępowanie: W kolbce okrągłodennej do wyparki poj ml umieścić l ml roztworu lecytyny i odparować rozpuszczalnik do uzyskania cienkiego, suchego filmu lipidowego; kolbkę umieścić w eksykatorze próżniowym nad CaCl 2 na 2 godz. Dodać do kolbki l ml roztworu barwnika i zawiesić lipid przez energiczne

71 3.1. Techniki preparacji liposomów 95 wstrząsanie zawartości do chwili zawieszenia całości fosfolipidu i uzyskania jednorodnej mlecznej zawiesiny. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w sposób opisany na końcu tej części rozdziału. b) Wielowarstwowe liposomy o zwiększonej pojemności. Technika zamrożeniowo-rozmrożeniowa (FAT-MLV) (wg Hope M. J, Bally M B., Mayer L. D., Janoff A. S., Culhs P. R., Chem. Phys. Lipids. 40 (1986)89-107) Postępowanie: Przygotować wielowarstwowe liposomy w sposób opisany powyżej (pkt 1). Zawiesinę liposomów przenieść do plastikowej probówki i poddać ją 7-10 cyklom zamrażania w mieszaninie suchego lodu (stały CO 2 ) z acetonem i rozmrażania w ciepłej (ok C) wodzie. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. c) Wielowarstwowe liposomy otrzymywane przez dehydratację-rehydratację (wg Shew R. L., Deamer D. W., Biochim. Biophys. Acta 816 (1985) 1-10) Postępowanie: Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l. Liposomy poddać procesowi liofilizacji. Suchy materiał po zliofilizowaniu rehydratować przez delikatne wytrząsanie z l ml wody destylowanej. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. d) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV) (wg Papahadjopoulos D., Miller N., Biochim. Biophys. Acta 135 (1967) ) Postępowanie: Przygotować MLV w sposób opisany w pkt. l. Umieścić uzyskane liposomy w cienkościennej probówce plastikowej i poddać działaniu ultradźwięków w dezintegratorze lub w zaadaptowanej myjce ultradźwiękowej przez okres konieczny do uzyskania klarownej próbki. W przypadku dezintegratora stosować cykle - 3 min. dezintegracji, 5 min przerwy. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach.

72 3. Elementy technologii liposomowej 96 e) Małe jednowarstwowe pęcherzyki (SUV), metodą wstrzykiwania roztworów etanolowych (wg Batzri S., Korn E. D., Biochim. Biophys. Acta 298 (1973) ) Opisana metoda jest równie efektywna, jak ultradźwięki, ale szybsza i bezpieczniejsza (unika się oksydacji lipidów w czasie sonikowania). Uzyskane SUV w zależności od składu lipidowego mają średnice nm. Materiały: mm roztwory lipidów w czystym etanolu. Sprzęt: l ml strzykawka Hamiltona z cienką igłą umieszczona w aparacie do infuzji; naczynie szklane o średnicy ok. 2 cm i poj. ok. 15 ml otoczone płaszczem termostatującym; mieszadło magnetyczne z mieszadełkiem o wielkości odpowiedniej do naczynia szklanego; statyw z łapą. Postępowanie: μl etanolowego roztworu fosfolipidów wstrzykiwać szybko i równomiernie do naczynia zawierającego 10 ml odpowiedniego roztworu wodnego utrzymywanego w temperaturze wyższej od temperatury przejścia fazowego żel-ciekły kryształ używanego lipidu oraz intensywnie mieszanego. Końcowe stężenie etanolu nie może przekroczyć 7.5% (v/v). Etanol z gotowej zawiesiny usunąć przez 2-3-krotną dializę wobec l-litrowych porcji buforu. Uzyskane pęcherzyki można w razie potrzeby zagęszczać w aparacie Amicon przy użyciu błony XM-100A o odpowiedniej średnicy. W ten sposób można uzyskać preparaty o stężeniu mm lipidu liposomowego. W czasie ultrafiltracji należy stosować intensywne mieszanie. Straty liposomów w tym procesie nie przekraczają 2%. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. f) Preparacja dużych jednowarstwowych liposomów (LUVET) (wg Hope M. J., Bally M. B., Webb G., Cullis P. R., Biochim. Biophys. Acta 812 (1985) 55-65) Postępowanie umożliwia uzyskanie dużych jednowarstwowych i o określonych wymiarach liposomów bez stosowania detergentów czy rozpuszczalników organicznych. Liposomy mają dużą wydajność zamykania i dobrze określoną średnicę; są szczególnie przydatne do badań wiązania białek metodami stosującymi wirowania.

73 3.l. Techniki preparacji liposomów 97 Materiały i odczynniki: zawiesina FAT-MLV liposomów (zob. pkt 2); suchy lód; aceton. Sprzęt: ekstruder liposomowy; filtry membranowe z poliwęglanu - Nucleopore ( nm pory); butla z azotem. Postępowanie: Przygotować ekstruder do pracy (zob. instrukcja obsługi). Zawiesinę FAT liposomów przepuścić 10-krotnie przez pory błony kalibrującej ich rozmiary. Oznaczyć wielkość objętości zamkniętej w liposomach. g) Duże jednowarstwowe liposomy, metodą odparowywania faz odwróconych (wg Szoka F., Papahadjopoulos D., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 75(1978) ) Postępowanie: Umieścić l ml roztworu lipidu w kolbie do wyparki i odparować chloroform. Lipid rozpuścić w 6 ml mieszaniny chloroformu z eterem izopropylowym (1:2) lub w 6 ml eteru etylowego i przenieść do zlewki poj. 50 ml, dodać 3 ml roztworu wodnego barwnika (doprowadzić ph roztworu do 7.4). Zlewkę umieścić w myjce ultradźwiękowej wypełnionej ogrzaną do ok C wodą i poddać działaniu ultradźwięków przez 5-10 min do utworzenia mlecznej emulsji. Uzyskaną emulsję przenieść do kolbki o poj. 100 ml i umieścić w wyparce (łaźnia wyparki wypełniona wodą o temperaturze ok C). Odparowywać rozpuszczalnik z emulsji zwiększając próżnię w aparacie stopniowo, gdyż emulsja wykazuje tendencję do silnego pienienia się i zarzucania". Po osłabnięciu pienienia zwiększyć próżnię do maksimum (ok. 2.5 x l0 4 Pa) i kontynuować odparowywanie jeszcze przez 5 min. Przenieść liposomy do oddzielnego naczynia i oznaczyć w nich wielkość objętości zamkniętej.

74 3. Elementy technologu liposomowej Duże jednowarstwowe liposomy obciążone" sacharozą, metodą solubilizacji detergentem niejonowym i dializy (wg Mimms L. T., Zampighi T., Nozaki Y., Tanford C., and Reynolds J. A., (1981) Biochemistry 20 (1081) ) Jedno- lub kilkuwarstwowe duże (średnica nm) pęcherzyki fosfolipidowe tworzy się poprzez solubilizację fosfolipidów w łatwo usuwalnym, tzn. charakteryzującym się wysokim CMC, łagodnym detergencie, takim jak dezoksycholan lub oktyloglukozyd. Następnie usuwa się detergent metodą dializy lub sączenia molekularnego na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50. Uzyskane pęcherzyki lipidowe wypełnione są roztworem, w którym zrównoważona jest kolumna. Technikę tę można stosować do rekonstytucji błon z wyizolowanych białek i lipidów, do analizy oddziaływań białek i innych związków z błonami. Materiały i roztwory: roztwory chloroformowe lipidów; 150 mm NaCl, l mm EGTA w 10 mm buforze Tris-HCl, ph 7.5; ten sam bufor zawierający 300 mm sacharozę. Postępowanie: 10 mg lipidów np. fosfatydylocholina/cholesterol 9:1, po dokładnym odparowaniu rozpuszczalnika organicznego rozpuścić w 0.5 ml buforu do rekonstytucji zawierającym 300 mm sacharozę oraz 30 mg/ml oktyloglukozyd (n-oktylο-β-d-glukopyranozyd) lub 15 mg/ml dezoksycholan sodowy. Całość nanieść na kolumnę wypełnioną żelem Sephadex G-50 (medium, l x 25 cm) zrównoważoną buforem do rekonstytucji zawierającym 300 mm sacharozę. Chromatografię prowadzić najlepiej w 4 C z szybkością wypływu ml/min. Frakcje zawierające pęcherzyki lipidowe charakteryzują się znaczną mętnością i mogą być rozpoznane bez użycia spektrofotometru. Aby usunąć roztwór znajdujący się poza pęcherzykami należy połączone frakcje zawierające pęcherzyki rozcieńczyć dziesięciokrotnie w buforze do rekonstytucji (bez sacharozy) i odwirować przy x g Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach Postępowanie: Przygotować kolumnę o rozmiarach x mm wypełnioną napęczniałym żelem Sephadex G-50 i zrównoważyć ją roztworem, w którym był rozpuszczony barwnik zamykany w liposomach.

75 3 2. Oznaczanie objętości zamkniętej w liposomach 99 Nanieść na kolumnę badaną zawiesinę liposomów i, po jej całkowitym wniknięciu do żelu, eluować kolumnę czystym roztworem do chwili wymycia liposomów. Z zawiesiny uwolnionych od nie zamkniętego w nich barwnika liposomów pobrać dwie jednakowej wielkości próbki. W jednej oznaczyć ilość lipidu poprzez fosfor, a do drugiej dodać równą objętość 10% Tritonu X-100, zmieszać i zmierzyć jej absorbancję przy długości fali równej E max stosowanego barwnika. Oznaczyć również absorbancję (po odpowiednim rozcieńczeniu) roztworu barwnika używanego do eksperymentów. Objętość zamkniętą obliczyć wg wzoru: objętość zamknięta (l/mole lipidu) = [lipid] w l ml liposomów Wyniki przedstawić w formie tabeli porównującej preparaty uzyskane różnymi metodami Wpływ składu lipidowego na objętość zamkniętą Postępowanie: Zmieszać odpowiednie ilości roztworów lipidów dla uzyskania mieszanin o podanym poniżej stosunku molowym: 1. PC 2. PC - Chol 90:10 3. PC - Chol 70:30 4. PC - PS 50:50 5. PC - l8:0 FA 80:20 6. PC - l8:0 FA 50:50 W kolbkach do wyparki umieścić po l ml tych mieszanin i odparować z nich rozpuszczalnik. Do każdej mieszaniny dodać po l ml roztworu barwnika i przygotować z nich liposomy metodą FAT-MLV (zob. pkt 2). Oczyścić uzyskane preparaty od nie zamkniętego barwnika poprzez sączenie na kolumnie z żelem Sephadex i oznaczyć objętość zamykania uzyskanych liposomów. Wyniki przedstawić w tabeli.

76 3. Elementy technologii liposomowej l Określanie trwałości i stabilności liposomów Użyteczność wprowadzania wodorozpuszczalnych leków w postaci zamkniętej w liposomach, tak in vivo, jak in vitro, zależy istotnie od stabilności nośnika liposomowego, tj. szybkości, z jaką zamknięte w liposomie rozpuszczone w roztworze wodnym cząsteczki (leki, enzymy itp.) będą wyciekać w zależności od warunków zewnętrznych. Jest to szczególnie istotne w trakcie opracowywania nowych technologii, gdzie np. stabilne in vitro w roztworach soli liposomy okazują się całkowicie niestabilne w obecności surowicy lub też odwrotnie. Do badania stabilności liposomów używa się metod, w których oznacza się poziom wycieku cząsteczek markerowych zamkniętych w liposomach. Takimi cząsteczkami mogą być enzymy, związki drobnocząsteczkowe znakowane izotopowe, a także niektóre barwniki fluorescencyjne. Poniżej przedstawimy metodę badania stabilności liposomów przy użyciu karboksyfluoresceiny (CF) Uwalnianie karboksyfluoresceiny jako miernik stabilności liposomów (wg Weinstein J. N., Ralston E., Leserman L. D., Klausner R. D., Dragsten P., Henkart P., Blumenthal R., w: Liposome Technology (Gregonadis G. red.) CRC Press, Boca Raton, 1984, vol. III, s ) Zasada metody opiera się na zjawisku tzw. samowygaszania fluorescencji. Pewne barwniki fluorescencyjne tracą zdolność do fluorescencji, gdy znajdują się w roztworze w odpowiednio wysokich stężeniach. Tak więc fluorofor zamknięty w liposomach w takich stężeniach będzie emitował jedynie kilka procent światła z tej ilości, którą emituje po uwolnieniu i rozcieńczeniu w otaczającym medium, czy też cytosolu komórki. Autorzy wykazali, że dobrze rozpuszczalny w wodzie fluorofor, 5(6)-karboksyfluoresceina (CF) zamknięta w liposomach w stężeniu mm, praktycznie nie fluoryzuje, tak że cała obserwowana fluorescencja zawiesiny liposomów pochodzi od cząsteczek fluoroforu uwolnionych z wnętrza pęcherzyków do środowiska. Te właściwości karboksyfluoresceiny stały się podstawą w badaniach nie tylko stabilności liposomów, ale i do określania ich objętości zamykania, interakcji liposomów z komórkami, właściwości barierowych błon liposomalnych, a także procesów fuzji. Materiały i roztwory: roztwory chloroformowe lipidów (30 mm); 5(6)-karboksyfluoresceina (CF), (MW 377, Ex 490, Em 520); 0.14 M NaCl w 10 mm buforze Hepes (lub Tris-HCl) ph 7.4; 10% roztwór Tritonu X-100;

77 3.3. Określanie trwałości i stabilności liposomów mm bufor Tris-HCl, ph 7.4; 6 M NaOH; napęczniały w buforze Tris-HCl, ph 7.4, żel Sephadex LH 20. Oczyszczanie karboksyfluoresceiny 7.5 g CF umieścić w zlewce o poj. 50 ml, umieścić w łaźni wodnej (45-50 C) ustawionej na mieszadle magnetycznym i powoli przy stałym mieszaniu oraz kontrolowaniu ph pehametrem dodawać 6 M NaOH tak, by nie przekroczyć ph 7.5 i uzyskać całkowite rozpuszczenie fluoroforu (ok. 10 ml). Uzyskany roztwór CF nanieść na szczyt wypełnionej żelem Sephadex LH 20 zrównoważonej buforem Tris-HCl kolumny (25 x 400 mm) i eluować 10 mm buforem Tris-HCl o ph 7.4, zbierając 2 ml frakcje. Barwnik wypływa zwykle we frakcjach 8-10, co określa się przez badanie fluorescencji 20-krotnie rozcieńczonych próbek. Stężenie barwnika w połączonych frakcjach określić używając współczynnika ekstynkcji molowej E 487 = 7.5 x l0 4, rozcieńczyć buforem do stężenia 100 mm. Pozostałe na kolumnie zanieczyszczenia wymyć przez jej przemycie kolejno 5 obj. układów: etanol/bufor (1:1), etanol, etanol/chloroform (1:1), chloroform, a następnie powrócić do buforu stosując te same roztwory, lecz w odwrotnej kolejności. Przygotowanie liposomów do badań Z roztworów lipidów przygotować mieszaniny zawierające: 1. ΡC (60 μmoli); 2. PC (30 μmoli) - Chol (30 μmoli); 3. PC (30 μmoli) - PS (30 μmoli). Odparować rozpuszczalnik i przygotować w sposób opisany wcześniej liposomy (FAT-MLV) w 2 ml roztworu CF. Oddzielić liposomy od nie zamkniętej w nich karboksyfluoresceiny przez sączenie molekularne na kolumnie wypełnionej żelem Sephadex G-50 i eluowanej 0.14 M NaCl w 10 mm buforze Tris-HCl ph Badanie wpływu surowicy na trwałość liposomów Postępowanie: W kuwecie spektrofluorymetru umieścić 2 ml roztworu zawierającego surowicę o różnych rozcieńczeniach w 0.14 M NaCl - 10 mm Tris-HCl ph 7.4, odczekać na ustabilizowanie temperatury (42 C). Włączyć rejestrator i rozpocząć rejestrację zmian fluorescencji. Do kuwety wstrzyknąć 10 μl liposomów z CF i rejestrować wzrost fluorescencji przez 10 min.

78 3. Elementy technologii liposomowej 102 Dla wyznaczenia całkowitej fluorescencji CF zamkniętej w liposomach wstrzyknąć do kuwety 10 μl roztworu Tritonu X-100. Detergent spowoduje uwolnienie pozostałej w nich CF. Uzyskany poziom fluorescencji będzie określać 100% możliwej do uzyskania w danych warunkach fluorescencji. Przeprowadzić w identyczny sposób pomiary uwalniania CF z liposomów w roztworach zawierających wzrastające stężenia surowicy. Powtórzyć doświadczenie używając liposomów o innym składzie lipidowym. Uzyskane wyniki przedstawić w postaci zależności czasowej procentu uwalniania CF z liposomów inkubowanych w obecności różnych stężeń surowicy. W podobny sposób można badać też wpływ temperatury na stabilność liposomów.

79 2. Błony biologiczne Błony są strukturami charakterystycznymi dla wszystkich komórek, prokariotów i eukariotów, zwierzęcych oraz roślinnych. Błony nie tylko ograniczają kompartmenty komórki i organelli komórkowych, ale także kontrolują całą komunikację pomiędzy wnętrzem i środowiskiem zewnętrznym komórki. Ta komunikacja przyjmuje formy transportu jonów i cząsteczek do i na zewnątrz komórki, jak również formy przepływu informacji dokonującego się poprzez indukowane zmiany konformacyjne składników poszczególnych błon. Błony stanowią miejsce lokalizacji wielu enzymów kontrolujących reakcje transbłonowe", tzn. produkt i substrat znajdują się po przeciwnych stronach błony (takim procesem jest również swoisty transport przez błony), są także miejscem koncentracji wielu enzymów katalizujących następujące po sobie etapy konkretnego procesu ułatwiając w ten sposób ich interakcję. Inne enzymy zaangażowane są w biosyntezę błon i są przykładami enzymów, których substraty znajdują się w błonie. Większość podstawowych procesów biochemicznych w jakimś punkcie przebiega z udziałem błon. Przykładami mogą być tak różne procesy, jak replikacja prokariotycznego DNA, biosynteza białka, wydzielanie białek, reakcje bioenergetyczne oraz odpowiedź hormonalna. Pomimo wielkiego zróżnicowania struktur otoczonych błonami podstawy budowy błon biologicznych są w zasadzie te same. Dotyczy to również błon komórek roślinnych i bakterii. Zaproponowany w 1972 roku przez Singera i Nicolsona model zakłada, że błonę stanowi płynna mozaika lipidów w postaci dwumolekularnej warstwy, w której zanurzone są białka integralne ją penetrujące. Dwumolekularna warstwa lipidową stanowi barierę przepuszczalności (głównie dla substancji hydrofilnych) i rozpuszczalnik" dla białek. Tylko mała część lipidów oddziałuje swoiście z białkami, co powoduje, że białka mogą swobodnie dyfundować w płaszczyźnie bocznej (lateralnej) błony. Dyfuzja boczna ograniczana jest poprzez tzw. szkielet błonowy, strukturę utworzoną przez białka peryferyjne oddziałujące z białkami integralnymi. Białkami integralnymi określa się te białka, które związane są mocno z dwumolekularna warstwą lipidową, tzn. penetrują ją przynajmniej jed- Rys.14. Model mozaiki płynnych lipidów i białek globularnych Singera i Nicolsona

80 2. Błony biologiczne 70 nym odcinkiem (ok. 20 reszt aminokwasowych) swojej struktury. Takim białkiem jest np. glikoforyna A błony erytrocytu. Inne białka mogą penetrować dwuwarstwę wielokrotnie, np. dziesięciokrotnie białko przenoszące aniony. Białka te można wyekstrahować z błony tylko po zastosowaniu odczynników chaotropowych, niektórych rozpuszczalników organicznych lub, a właściwie przede wszystkim, detergentów. Szczególnie użyteczne są tu detergenty niejonowe, które nie denaturują białek. Białka peryferyjne to te, które związane są luźno z powierzchnią (głównie cytoplazmatyczną) błony. Można je wyekstrahować z błony przy użyciu roztworów wodnych o niskiej lub wysokiej sile jonowej oraz wysokim ph. Przykłady oczyszczania integralnych i peryferyjnych białek błony erytrocytu podano w skrypcie Molekularna organizacja komórki", red. J. Szopa, Wrocław, 1992, s Podstawy zasad izolacji poszczególnych organelli komórkowych i co za tym idzie ich błon przedstawiono tamże ( Molekularna...", s. 1-6) Białka i lipidy błon erytrocytów Od początku badań nad strukturą i funkcją błon, erytrocyty ssaków stały się najpopularniejszym dla nich modelem doświadczalnym z bardzo oczywistego powodu, a mianowicie posiadają tylko jeden rodzaj błony: błonę plazmatyczną. Komórka ta uległa bowiem takiej specjalizacji w trakcie ewolucji, że stanowi rodzaj woreczka wypełnionego hemoglobiną w wysokim stężeniu, co czyni ją efektywnym nośnikiem tlenu, który musi być dostarczony z płuc do pozostałych tkanek organizmu. Ponieważ błona erytrocytu jest łatwo przepuszczalna dla wody, a nieprzepuszczalna dla prawie wszystkich substancji hydrofilnych, erytrocyty pęcznieją i ulegają lizie, kiedy umieści się je w roztworze hypotonicznym. Dzięki temu można uzyskać duże ilości czystych (jednego rodzaju) błon plazmatycznych. Przybliżony chemiczny skład błon erytrocytu przedstawia się następująco: 50% białka, 40% lipidów i 10% cukrów. Błona komórkowa (plazmolemma) zwykle zawiera względnie wysokie stężenia cholesterolu. Stosunek molowy fosfolipidów do cholesterolu w błonie erytrocytów wynosi od 0.6 do 0.9. Wolne węglowodany nie są obecne w błonach. Są kowalencyjnie związane zarówno z białkami (glikoproteidy), jak i z lipidami (glikolipidy). Podwójna warstwa lipidową, w której cząsteczki posiadają swobodę szybkiej dyfuzji lateralnej (w przeciwieństwie do ruchliwości w płaszczyźnie poprzecznej błony, która jest bardzo ograniczona), stanowi środowisko dla wielu białek integralnych. Cztery rodzaje fosfolipidów stanowią 90% tej klasy związków w błonie erytrocytu. Trzy z nich są glicerofosfolipidami: fosfatydylocholina (PC, lecytyna), fosfatydyloetanoloamina (PE) oraz fosfatydyloseryna (PS), a czwarty, sfingomielina (SM), jest fosfolipidem nieglicerolowym. Należy wspomnieć, że PC i SM

81 2.1. Białka i lipidy błon erytrocytów 7l zawierają identyczne główki polarne (cholina), a PE i PS zawierają wolną grupę aminową, dzięki czemu nazywane są aminofosfolipidami. Skład fosfolipidowy erytrocytów krowy i innych przeżuwaczy charakteryzuje się prawie kompletnym brakiem fosfatydylocholiny, która zastąpiona jest sfingomielina. Od wczesnych lat siedemdziesiątych wiadomo, że błony wykazują asymetrię składu lipidowego, tzn. obie monowarstwy tworzące dwumolekularna warstwę lipidową różnią się od siebie składem: absolutną asymetrię wykazują glikolipidy - występują tylko w zewnętrznej monowarstwie. Fosfolipidy charakteryzuje także asymetria, aczkolwiek nie absolutna: zewnętrzna monowarstwa zawiera w większości fosfolipidy cholinowe (PC i SM), a wewnętrzna, cytoplazmatyczną, głównie aminofosfolipidy - fosfatydyloetanoloaminę i fosfatydyloserynę. Ten ostatni fosfolipid występuje wyłącznie w cytoplazmatycznej monowarstwie błony (Rys. 15). 50 fosfolipidy całkowite monowarstwa zewnętrzna lipidów całkowitych 25 SM PC PE PS procent monowarstwa wewnętrzna Rys. 15. Asymetria lipidów błony erytrocytów Należy pamiętać, że występowanie fosfolipidów nie jest ograniczone do błon komórek (krwi). Są one także składnikami osocza stanowiąc element lipoproteidów. Fosfatydylocholina należy do najpowszechniejszych fosfolipidów osocza, stanowiąc źródło ciągłego uzupełniania tego fosfolipidu w błonie komórek krwi. Szybkość wymiany PC pomiędzy lipoproteidami i błoną erytrocytu wynosi około 1% całkowitej ilości PC w błonie erytrocytu na godzinę. Innym ważnym nośnikiem substancji trudno rozpuszczalnych w wodzie jest albumina, która przenosi kwasy tłuszczowe i lizofosfolipidy. Białka błony erytrocytu należą do najlepiej poznanych białek błonowych. Do białek integralnych należą białka pełniące funkcje przenośników: ATP-aza wapniowa usuwająca jony wapnia z komórki, przenośnik glukozy, a przede wszystkim białko przenoszące aniony (białko 3 pasma elektroforetycznego), które stanowi nie mniej niż 25-30% białek całkowitych błony erytrocytu. Wiadomo, że

82 2. Błony biologiczne 72 BIAŁKA PERYFERYJNE A BIAŁKA INTEGRALNE B Spektryna { ankiryna ( dematyna aktyna dehydrogenaza aldehydu 3-fosfoglicerynowego BIAŁKO PRZENOSZĄCE ANIONY PAS 1 glikoforyna PAS 2 glikoforyna PAS 2 glikoforyna PAS 3 glikoforyna Rys. 16. Rozdział elektroforetyczny błony białek cieni erytrocytów w żelu poliakryloamidowym w obecności SDS A. żel barwiony na białka, B. żel barwiony na cukry białko to odpowiada za obojętną elektrycznie wymianę anionów HCO3 - /C1 - mającą kluczowe znaczenie w przenoszeniu CO 2 przez erytrocyty. Na Rys. 16 przedstawiono typowy schemat elektroforetogramu białek błon (cieni) erytrocytu w 5% żelu poliakryloamidowym w obecności SDS. Białka peryferyjne błony erytrocytu występują na wewnętrznej, cytoplazmatycznej powierzchni błony erytrocytu, gdzie główne z nich tworzą tzw. szkielet błonowy. Ta dwuwymiarowa sieć utworzona jest głównie przez tetramery spektryny, z których każdy składa się z dwóch heterodimerów zbudowanych z α i β podjednostek spektryny. Spektryna jest białkiem stanowiącym 25% wszystkich białek błony i występuje także powszechnie w innych nieerytroidalnych komórkach bardzo wielu organizmów. Tetramery spektrynowe łączą się ze sobą w tzw. kompleksach węzłowych, których oś stanowi krótki filament aktynowy (37 nm, 13 podjednostek aktynowych). W skład kompleksu wchodzą białka aktywujące oddziaływania spektryny i aktyny: białko 4.1, adducyna oraz białko zwane dematyna (białko 4.9) o nie poznanej dotąd funkcji. Centrum tetrameru spektrynowego połączone jest przez inne ważne białko błony erytrocytu ankirynę (występujące także w wielu komórkach nieerytroidalnych) z białkiem przenoszącym aniony. To połączenie, tzn. β-spektryna-ankiryna-białko, przenoszące aniony stanowi główne miejsce zakotwiczenia szkieletu błonowego do zrębu hydrofobowego błony (dwumolekularna warstwa lipidową z zanurzonymi w niej białkami integralnymi). Szkielet błony odpowiada, jak się uważa, za dyskoidalny kształt erytrocytu i zapewnia wielką elastyczność tej komórki, która wielokrotnie przechodzi przez naczynia kapilarne o średnicy znacznie mniejszej od średnicy komórki. Białka błony charakteryzują się absolutną asymetrią, co wyraża się stałą, jeśli chodzi o powierzchnię błony, lokalizacją białek peryferyjnych oraz bardzo precy-