STAN FIZJOLOGICZNY DROŻDŻY PIWOWARSKICH PODCZAS FERMENTACJI BRZECZEK STĘŻONYCH 1

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia () 1, 5-1 ISSN 1 5X (print) ISSN 3 5 (on-line) STAN FIZJOLOGICZNY DROŻDŻY PIWOWARSKICH PODCZAS FERMENTACJI BRZECZEK STĘŻONYCH 1 Ewelina Dziuba, Barbara Foszczyńska, Joanna Chmielewska, Marzena Styczyńska, Karolina Łoźna Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Streszczenie. Podczas fermentacji brzeczek piwowarskich standardowej (1% ekstraktu) oraz stężonych typu HG (% ekstraktu) i VHG (1% ekstraktu) określono parametry fizjologiczne drożdży Saccharomyces cerevisiae (Safale US-5 i Safbrew T-5). Oznaczono: zawartość biomasy, udział komórek pączkujących, średnicę komórek oraz stężenie jonów magnezu po zaszczepieniu i w wybranych momentach fermentacji. Drożdże Safale US-5 lepiej przystosowały się do warunków wysokiego stężenia brzeczki, zawartość biomasy szybciej osiągała maksimum, a komórki przez długi okres pączkowały oraz utrzymywały stałą średnicę. Na ich dobrą kondycję wskazywało również wydzielanie jonów Mg + do brzeczki na początku procesu fermentacji. Słowa kluczowe: browarnictwo, średnica komórek, brzeczki stężone WSTĘP Zdolność drożdży do rozmnażania w początkowej fazie fermentacji decyduje w efekcie końcowym o jakości piwa. W procesie klasycznym ilość rozpuszczonego tlenu w brzeczce umożliwia wzrost komórkom. Fermentacja przebiega wówczas prawidłowo, a uzyskane piwo cechuje harmonijny profil smakowo-aromatyczny. Natomiast rozmnażanie drożdży w brzeczkach stężonych jest trudniejsze, ponieważ wraz ze wzrostem zawartości ekstraktu w brzeczce maleje rozpuszczalność tlenu. Obecnie wiele browarów stosuje technologię High Gravity Brewing (HGB), która oferuje wymierne korzyści ekonomiczne. Umożliwia ona zwiększenie produkcji piwa z mniejszej objętości stężonej brzeczki [Stewart 1]. Zdaniem Johnstona i in. [1979] drożdże Saccharomyces cerevisiae mają zdolność do utrzymywania wielkości komórki i aby rozpocząć pączkowanie, komórka musi osiągnąć Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Ewelina Dziuba, Katedra Technologii Rolnej i Przechowalnictwa, Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu, ul. Chełmońskiego 37/1, 51-3 Wrocław, ewelina.dziuba@up.wroc.pl

2 E. Dziuba i in. rozmiar krytyczny, chociaż w mniej korzystnych warunkach wzrostu rozmiar komórki jest mniejszy [Rupes ]. Oczywiste jest, że warunki środowiska fermentacyjnego, np. podwyższona zawartość ekstraktu w brzeczce, mogą wpływać na rozmiary komórki i jej zdolność do pączkowania. Niewiele publikacji opisuje zmiany wielkości komórek podczas fermentacji brzeczek stężonych. Celem niniejszej pracy była ocena wpływu zawartości ekstraktu w brzeczce piwowarskiej na przyrost biomasy dwóch szczepów drożdży (Safale US-5 i Safbrew T-5), rozmiary tworzących ją komórek oraz udział w niej komórek pączkujących. Analizowano również zależność stanu fizjologicznego drożdży od stężenia jonów Mg + w brzeczce. MATERIAŁ I METODY Materiałem badawczym były dwa szczepy drożdży piwowarskich Saccharomyces cerevisiae, zakupione w postaci suszonej biomasy w firmie Browamator: Safale US-5 (oznaczone w pracy jako US-5), Safbrew T-5 (oznaczone w pracy jako T-5). Drożdże suszone poddano rehydratacji, a następnie przeszczepiono poprzez płynne podłoże YEPG do probówek ze skosem agarowym. Skosy stanowiły bazę materiału biologicznego do przygotowania inokulum. Podłożem fermentacyjnym były: brzeczka chmielona o zawartości ekstraktu 1% (z Browaru Namysłów), brzeczka chmielona uzupełniona maltozą do zawartości ekstraktu %, brzeczka chmielona uzupełniona maltozą do zawartości ekstraktu 1%. Doświadczenie polegało na przeprowadzeniu fermentacji brzeczki kontrolnej (1%) oraz brzeczek zagęszczonych ( i 1%) z zastosowaniem drożdży US-5 lub T-5. Każdy wariant fermentacji wykonano w trzech powtórzeniach. Fermentację prowadzono w cylindrach miarowych o poj. 1 dm 3 w temperaturze 5 C przez 9 godzin. Przed każdym cyklem fermentacyjnym brzeczkę zaszczepiano świeżo namnożoną biomasą drożdży na podłożu YEPG w taki sposób, by osiągnąć wyjściowe stężenie 1 1 komórek w 1 cm 3. Przy obliczaniu wielkości inokulum korzystano z krzywych standardowych wyznaczonych dla badanych szczepów drożdży wyrażających zależność absorbancji od liczby komórek w 1 cm 3 zawiesiny. Bezpośrednio po zaszczepieniu oraz w wybranych momentach, tj. w: 3.,., 9.,., 3.,., 7. i 9. godz. fermentacji, pobierano próby ze środkowego słupa cieczy i oznaczano w nich: stężenie komórek oraz liczbę komórek pączkujących (jako % udział w ogólnej liczbie komórek) metodą liczenia w komorze Thoma; średnicę komórek przy użyciu analizatora wielkości cząstek Mastersizer firmy Malvern Instruments Ltd. [Foszczyńska i in. 13]; + poziom jonów Mg w brzeczce z wykorzystaniem atomowej spektrometrii absorpcyjnej z atomizacją w płomieniu (spektrometr absorpcji atomowej Spektra AA firmy Varian). Oznaczenia wykonano w trzech powtórzeniach, a wyniki poddano analizie statystycznej w programie STATISTICA 1. w pakiecie ANOVA/MANOWA, oceniając wpływ szczepu drożdży, stężenia brzeczki i czasu fermentacji oraz interakcje między badanymi czynnikami przy α =,5. Małymi literami alfabetu na rysunkach,, i oznaczono grupy jednorodne statystycznie. Acta Sci. Pol.

3 Stan fizjologiczny drożdży piwowarskich... 7 WYNIKI W procesie fermentacji przyrost biomasy obydwu szczepów drożdży użytych do badań przebiegał prawidłowo (rys. 1). Stężenie komórek drożdży US-5 osiągnęło maksimum w 3. godz. procesu niezależnie od zawartości ekstraktu w brzeczce. Nieco wolniej rozmnażały się komórki drożdży T-5, których najwięcej było w. godz. fermentacji. Po osiągnięciu wartości maksymalnych poziom biomasy obydwu szczepów malał niezależnie od stężenia ekstraktu w brzeczce. Nie wykazano istotnych statystycznie różnic między stężeniem biomasy a zastosowanym szczepem drożdży czy też stężeniem brzeczki (rys. ). Natomiast analiza korelacji wykazała istotną zależność między stężeniem biomasy a czasem fermentacji (r =,3) oraz ujemne korelacje między stężeniem biomasy a zawartością komórek pączkujących (r = -,5) i średnicą komórek (r = -,5). a) US-5 Liczba komórek [1 ml 1 ] Amount of cells b) T-5 czas [godz.] NIR LSD Liczba komórek [1 ml 1 ] Amount of cells czas [godz.] Rys. 1. Stężenie biomasy drożdży US-5 (a) i T-5 (b) podczas fermentacji brzeczek o zawartości ekstraktu: 1, i 1% (NIR =,3 α =,5) Fig. 1. Concentration of yeast biomass US-5 (a) and T-5 (b) during fermentation of wort with extract content: 1,, 1% (LSD =.3, α =.5) NIR LSD Biotechnologia () 1

4 E. Dziuba i in. Liczba komórek [1 x ml 1-1 ] Amount of of cells US-5 T-5 NIR-LSD 1 1 NIR-LSD szczep strain stężenie st enie brzeczki [%] wort concentration NIR-LSD czas fermentacji [h] fermentation time[h] Rys.. Porównanie stężenia biomasy w zależności od szczepu drożdży (US-5 i T-5), stężenia brzeczki (1, i 1%) oraz czasu fermentacji (α =,5) Fig.. Comparison of biomass concentration, depending on the yeast strain (US-5 and T-5), wort concentrations (1, and 1%) and the fermentation time (α =.5) W początkowej fazie fermentacji (3 godz. w próbie z US-5 i godz. w przypadku szczepu T-5) obserwowano szczególnie duży udział komórek pączkujących w brzeczce o stężeniu ekstraktu %. Ich udział malał w późniejszym okresie fermentacji (rys. 3). Po upływie godz. procesu liczba komórek pączkujących nie przekraczała 5%. Liczba komórek pączkujących była odwrotnie skorelowana z czasem fermentacji (r = -,73). Na liczbę komórek pączkujących w fermentującym medium istotnie wpływał zastosowany szczep drożdży, a podwyższenie stężenia brzeczki do 1% skutkowało obniżeniem ich zdolności pączkowania (rys. ). a) US-5 Komórki Komórki pączkujące p czkuj ce [% [% ogólnej ogólnej liczby] liczby] Budding Budding cells cells [% [% of total of total amount] amount] % % 1% NIR- LSD czas [godz.] Acta Sci. Pol.

5 Stan fizjologiczny drożdży piwowarskich... 9 b) T-5 Komórki Komórki pączkujące p czkuj ce [% ogólnej [% ogólnej liczby] liczby] Budding cells [% of total amount] Budding cells [% of total amount] % % 1% NIRczas [godz.] LSD Rys. 3. Liczba pączkujących komórek drożdży US-5 (a) i T-5 (b) podczas fermentacji brzeczek o zawartości ekstraktu: 1, i 1% (NIR = 1,79, α =,5) Fig. 3. Contribution of budding yeast cells US-5 (a) and T-5 (b) during fermentation of wort with extract content: 1,, 1 (LSD = 1.79, α =.5) Komórki pączkujące p czkuj ce [% ogólnej liczby] Budding cells [% of total amount] a b ab a b d ab a bc c d e e e US-5 T-5 NIR-LSD 1 1 NIR-LSD szczep strain stężenie st enie brzeczki brzeczki [%] wort concentration wort concentration NIR-LSD czas czas fermentacji [h] fermentation fermentation time time [h] Rys.. Porównanie ilości komórek pączkujących w zależności od szczepu drożdży (US-5 i T-5), stężenia brzeczki (1, i 1%) oraz czasu fermentacji (α =,5) Fig.. Comparison of the budding cells amount, depending on the yeast strain (US-5 and T-5), wort concentrations (1, and 1%) and the fermentation time (α =.5) Analiza interakcji wykazała, iż największą średnicę w momencie zaszczepiania miały komórki obydwóch szczepów w brzeczce o stężeniu ekstraktu 1% (rys. 5). Przedstawione dane wyraźnie wskazują, że wyższe od klasycznego stężenie ekstraktu (1%) wywarło niekorzystny wpływ na średnicę komórek drożdży, powodując znaczne jej zmniejszenie. Do 9 godz. fermentacji średnica komórek badanych szczepów była większa, w późniejszej fazie procesu istotnie malała. Ponadto wykazano istotne różnice między średnicą badanych szczepów drożdży (rys. ) większą średnicą odznaczały się komórki szczepu US-5. Poza tym średnica komórek była dobrze skorelowana z liczbą komórek pączkujących (r =,7) oraz odwrotnie skorelowana z czasem fermentacji (r = -,3). Biotechnologia () 1

6 1 E. Dziuba i in. a) US % % 1% rednica Średnica komórek komórek [um] [μm] Cell diameter Cell diameter b) T NIR- czas [godz.] LSD time czas [hour] [godz.] 1% % 1% rednica Średnica komórek [um] [μm] Cell Cell diameter NIR- czas [godz.] LSD Rys. 5. Średnica komórek drożdży US-5 (a) i T-5 (b) podczas fermentacji brzeczek o zawartości ekstraktu: 1, i 1% (NIR =,1, α =,5) Fig. 5. Cell diameter of yeast US-5 (a) and T-5 (b) during fermentation of wort with extract content: 1,, 1% (LSD =.1, α =.5) Zawartość jonów magnezu podczas fermentacji brzeczek o zawartości ekstraktu 1, i 1% zaprezentowano na rysunku. Wraz ze zwiększającym się stężeniem brzeczki ilość jonów magnezu zmniejszała się. Szczep T-5 bardziej intensywnie pobierał jony magnezu w czasie fermentacji, co wyjaśnia jego gorszą kondycję. Wykazano ujemną korelację między zawartością jonów magnezu w brzeczkach a stężeniem biomasy (r = -,351) i stężeniem brzeczki (r = -,33). Zawartość jonów magnezu w brzeczkach była skorelowana z zawartością komórek pączkujących (r =,3) oraz średnicą komórek (r =,55). Można stwierdzić, że szczep US-5 lepiej przystosował się do dużych stężeń brzeczki, jego biomasa szybciej osiągała maksimum, komórki tych drożdży przez długi okres czasu pączkowały i utrzymywały stałą średnicę. Na dobrą kondycję drożdży tego szczepu wskazywało również wydzielenie jonów magnezu do brzeczki na początku procesu fermentacji. Acta Sci. Pol.

7 Stan fizjologiczny drożdży piwowarskich Średnica komórek Cell diameter [μm] Cell diameter 1 1 US-5 T-5 NIR-LSD 1 1 NIR-LSD szczep strain stężenie st enie brzeczki brzeczki [%] wort concentration t t ti NIR-LSD czas fermentacji [h] fermentation time[h] Rys.. Porównanie średnicy komórek w zależności od szczepu drożdży (US-5 i T-5), stężenia brzeczki (1, i 1%) oraz czasu fermentacji (α =,5) Fig.. Comparison of the cell diameter, depending on the yeast strain (US-5 and T-5), wort concentrations (1, and 1%) and the fermentation time (α =.5) a) US-5 Jony Mg jony + [mg Mg + 1g [mg x 1 ] 1g -1 ] Mg + ions Mg + ions 1 1% % 1% b) T-5 Jony Mg jony + [mg Mg + [mg 1g x 1 ] 1g -1 ] Mg + ions Mg + ions NIR-LSD czas [godz.] [ d ] 1% % 1% 3 9 NIR NIR-LSD czas [godz.] czas [godz ] Rys. 7. Zawartość jonów magnezu w brzeczkach (1, i 1%) podczas fermentacji z udziałem drożdży US-5 (a) i T-5 (b) (NIR =,377, α =,5) Fig. 7. Concentration of magnesium ions in worts (1, and 1%) during fermentation with yeasts US-5 (a) and T-5 (b) (LSD =.377, α =.5) Biotechnologia () 1

8 1 E. Dziuba i in. Jony jony Mg + Mg [mg + [mg 1g x 1g 1 ] -1 ] Mg + Mg ions + ions a b a a b ab a abc abc c bc US-5 T-5 NIR-LSD 1 1 NIR-LSD 3 9 szczep strain st enie stężenie brzeczki [%] wort czas fermentacji [h] fermentation time time[h] concentration wort concentration [%] NIR-LSD Rys.. Porównanie zawartości jonów Mg + w fermentujących brzeczkach w zależności od szczepu drożdży (US-5 i T-5), stężenia brzeczki (1, i 1%) oraz czasu fermentacji (α =,5) Fig.. Comparison of the content of Mg + ions in the fermentation worts depending on the yeast strain (US-5 and T-5), wort concentrations (1, and 1%) and the fermentation time (α =.5) DYSKUSJA Drożdże Saccharomyces cerevisiae zostały wybrane jako modelowy organizm do badania procesu starzenia się ze względu na ograniczoną ilość pączkowania [Wawryn i in. 1999]. Komórki zaprzestają pączkować po wielu cyklach, ale osiągają podobną końcową objętość. Te wyniki wskazują, że wzrost objętości komórki matecznej u S. cerevisiae może być głównym mechanizmem ograniczającym zdolność takiego organizmu do reprodukcji [Zadrąg-Tęcza i in. 9]. Szybkość rozmnażania jest determinowana przez wzrost jednej komórki. Zapoczątkowanie nowego cyklu podziału zależy od rozmiaru komórki, jej wieku, dostępności składników odżywczych i prawidłowego zakończenia poprzedniego cyklu [Poreda, Antkiewicz ]. W pracy zarówno stężenie brzeczki, jak i rasa badanych drożdży piwowarskich różnicowały tempo przyrostu biomasy. Po 9 godz. fermentacji zwiększała się zawartość komórek w brzeczce wraz ze wzrostem stężenia ekstraktu. Cahill i in. [] badali drożdże w warunkach propagacji i obserwowali zmiany rozmiarów komórek w brzeczkach o zwiększonej zawartości ekstraktu (do 17,5 P). Podali oni, że objętość pojedynczej komórki zwiększała się o około 3%. W niniejszej pracy prowadzona była fermentacja w warunkach podwyższonej zawartości ekstraktu brzeczki ( i 1%). W początkowym okresie fermentacji, wraz ze wzrostem stężenia ekstraktu w brzeczkach, następowało zmniejszenie rozmiarów komórek o 3%. Może to wynikać z faktu, że drożdże były propagowane przed podaniem do brzeczki w podłożu YEPG zawierającym % glukozy. Podczas inokulacji, w wyniku stresu osmotycznego, nastąpiło zmniejszenie rozmiarów komórek. Acta Sci. Pol.

9 Stan fizjologiczny drożdży piwowarskich Wielkość komórek przed rozpoczęciem pączkowania zależy od składu podłoża, to jest rodzaju i zawartości źródła węgla i azotu [Johnston i in. 1979]. Jako czynniki regulujące rozmiary komórki rozważa się masę białka oraz liczbę rybosomów [Rupes ]. Jak podali Vanoni i in. [5], średni rozmiar komórki w hodowli okresowej jest mały i prawie stały w czasie wzrostu na niefermentowanych substratach, ale w ich obecności średni rozmiar komórki wzrasta liniowo wraz z właściwą szybkością wzrostu. W warunkach niniejszego doświadczenia, prowadzonego na ulegających fermentacji źródłach węgla, komórki stosowanych drożdży zwiększały swoje rozmiary do około 9. godz. procesu. Po przekroczeniu tego czasu miały zróżnicowaną średnicę. Do końca procesu jedynie komórki szczepu US-5 zachowały stałą średnicę, natomiast rozmiary komórek drugiego z badanych szczepów były mniejsze. Jony magnezu to bardzo istotny dla witalności drożdży składnik brzeczki [Udeh, Kgatla 13]. Uczestniczą one w ochronie komórki w warunkach stresów: termicznego, hiperosmotycznego oraz etanolowego. Komórki pobierające magnez ze środowiska fermentacyjnego są słabej kondycji [Rees, Stewart 1999], co skutkuje gorszym tempem fermentacji. Badane szczepy różniły się właściwościami fizjologicznymi. Szczep US-5 w początkowej fazie fermentacji wydzielał magnez do środowiska, co świadczyło o jego dobrej kondycji. Natomiast szczep T-5 intensywnie pobierał jony Mg + w czasie drugiej doby fermentacji, zwłaszcza w brzeczce o stężeniu ekstraktu 1%, co wyjaśnia obniżoną zdolność pączkowania, a tym samym słabsze namnażanie biomasy. Dodatek maltozy w celu zatężenia brzeczki powodował zmniejszenie zawartości jonów magnezu w środowisku, jednak nie było ono niższe od sugerowanego przez Szefer i Nriagu [7]. Wybierając metodę oznaczania średnicy komórki, zdecydowano mierzyć się ją przy użyciu laserowego miernika wielkości cząstek. Pomiar tej wartości przy użyciu mikromanipulatora jest powolny i obejmuje średnicę jedynie 3 komórek [Srinorakutara 199]. Laserowy analizator pozwala w krótkim czasie zmierzyć średnicę kilku tysięcy komórek [Bowen, Ventham 199, Rywińska i in. 5]. Podsumowując, należy stwierdzić, że rozmiar komórki oraz szybkość rozmnażania się zależą od cech osobniczych drożdży i warunków środowiska. Drożdże piwowarskie wydają się być interesującym modelem do badania stanu fizjologicznego, w tym rozmiaru komórki, w środowiskach brzeczki fermentacyjnej o różnej zawartości ekstraktu. PODSUMOWANIE Spośród dwóch badanych szczepów drożdży szczep Safale US-5 lepiej przystosował się do warunków wysokiego stężenia brzeczki. Podczas fermentacji, niezależnie od zawartości ekstraktu w brzeczce, jego komórki szybciej się rozmnażały, przez długi okres pączkowały i utrzymywały stałą średnicę. Na dobrą kondycję drożdży tego szczepu wskazywało również wydzielenie przez nie jonów Mg + do brzeczki na początku procesu fermentacji. PIŚMIENNICTWO Bowen W.R., Ventham T.J., 199. Aspects of yeast flocculation. Size distribution and zeta-potential. J. Inst. Brew, 1, Biotechnologia () 1

10 1 E. Dziuba i in. Cahill G., Murray D.M., Walsh P.K., Donnelly D.,. The effect of the concentration ofpropagation wort on yeasts cell volume and fermentation performance. J. Am. Soc. Brew. Chem., 5 (1), 1. Foszczyńska B., Dziuba E., Chmielewska J., 13. Ocena możliwości pomiaru średnicy komórek drożdży piwowarskich przy użyciu laserowego analizatora wielkości cząstek. Acta Sci. Pol., Biotechnologia 1 (),. Johnston G.C., Ehrhardt C.W., Lorincz A., Carter B.L., Regulation of cell size in the yeast Saccharomyces cerevisiae. J. Bacteriol., 137 (1), 1 5. Poreda A., Antkiewicz P.,. Cykl rozwoju komórki drożdżowej, mechanizm podziału i starzenia. Agro Przemysł, 3, 7 5. Rees E.M.R., Stewart G.G., Effects of magnesium, calcium and wort oxygenation on the fermentative performance of ale and lager strains fermenting normal and high gravity wotrs. J. Inst. Brew., (), Rupes I.,. Checking cell size in yeast. Trends Genet., 1 (9), Rywińska A., Rymowicz W., Żarowska B., Zięba T., Gryszkin A., 5. Wykorzystanie laserowego analizatora cząstek do oceny stanu fizjologicznego drożdży Yarrowia lipolytica podczas ciągłej biosyntezy kwasu cytrynowego. Inżynieria i Aparatura Chemiczna,, 9 9. Srinorakutara T., 199. Study on effect of diluent osmotic pressure on yeast cell strength and cell size using a novel micromanipulation technique. World J. Micobiol. Biotechnol., 1, Stewart G.G., 1. High-gravity brewing and distilling past experiences and future prospects. J. Am. Soc. Brew. Chem., (1), 1 9. Szefer P., Nriagu J.O., 7. Mineral components in foods. CRC Press, Udeh H.O., Kgatla T.E., 13. Role of magnesium ions on yeast performance during very high gravity fermentation. J. Brew. Distilling, (), Vanoni W., Rossi R.L., Querin L., Zinzalla V., Alberghina L., 5. Glucose modulation of cell size in yeast. Biochemical Soc. Trans., 33, 9 9. Wawryn J., Krzepiłko A., Myszka A., Biliński T., Deficiency in superoxide dismutase shortens lifespan of yeast cells. Acta Biochim. Pol., (), Zadrąg-Tęcza R., Kowlek-Mirek M., Bartosz G., Biliński T., 9. Cell volume as a factor limiting the replicative lifespan of the yeast Saccharomyces cerevisiae. Biogerontology, 1, 1. PHYSIOLOGICAL STATE OF BREWING YEASTS DURING HG AND VHG FERMENTATION Abstract. During fermentation of classical (1%), HG (%) and VHG wort (1%) physiological state of brewing yeasts (Safale US-5 and Safbrew T-5) was observed. After innoculation and during selected moments of wort fermentation the following features were examined: biomass concentration, yeast cell size, contribution of budding cells, magnesium ion concentration. The Safale US-5 beter adapted to the high concentration of wort. These yeasts produced more biomass, budded for a longer time of fermentation and maintained the cell size on the constant level. The secretion of magnesium ions into the wort in the beginning of fermentation showed also the good condition of these yeasts. Key words: brewing process, yeast cell size, high gravity worts Zaakceptowano do druku Accepted for print: 3..1 Do cytowania For citation: Dziuba E., Foszczyńska B., Chmielewska J., Styczyńska M., Łoźna K., 1. Stan fizjologiczny drożdży piwowarskich podczas fermentacji brzeczek stężonych. Acta Sci. Pol. Biotechnol., (), 5 1. Acta Sci. Pol.