Recenzja rozprawy doktorskiej Pani mgr inż. Joanny Depciuch

Transkrypt

1 UNIWERSYTET MARII CURIE-SKŁODOWSKIEJ W LUBLINIE Wydział Biologii i Biotechnologii prof. dr hab. Mariusz Gagoś Kierownik Zakładu Biologii Komórki Lublin, dn r Recenzja rozprawy doktorskiej Pani mgr inż. Joanny Depciuch pt. Spektroskopowa identyfikacja zmian w równowadze fosfolipidowo-białkowej podczas depresji wykonanej pod kierunkiem Pani dr hab. inż. Magdaleny Parlińskiej-Wojtan, prof. IFJ PAN w Zakładzie Badań Materii Miękkiej Instytutu Fizyki Jądrowej im. Henryka Niewodniczańskiego PAN w Krakowie. Dobór, znaczenie tematu i cel pracy: Przedstawiona do recenzji rozprawa doktorska Pani mgr inż. Joanny Depciuch dotyczy badań materiału biologicznego metodami spektroskopii oscylacyjnej: FTIR i Ramana oraz spektroskopii absorpcji elektronowej z zakresu UV. Główna idea to spektroskopowa detekcja zaburzeń równowagi fosfolipidowo-białkowej w osoczu krwi w wybranych zwierzęcych modelach depresji. Depresja jest chorobą cywilizacyjną i jak dotychczas niestety oprócz wywiadu z lekarzem specjalistą nie da się potwierdzić jej metodami analitycznymi. Podjęty przez Doktorantkę temat ma ogromne znaczenie poznawcze oraz także aplikacyjne. Przełożenie informacji uzyskanych w oparciu o modele zwierzęce na badania ludzkiego osocza (Załącznik 1) jest pięknym uzupełnieniem całości dzieła. Gratuluję wyboru tematu. Należy dodać, że poszukiwanie tzw. spektroskopowych markerów neurodegeneracji metodami spektroskopii oscylacyjnej to ostatnio bardzo modny trend w biospektroskopii. Główny cel badań Doktorantka zrealizowała poprzez kilka celów szczegółowych w trzech modelach depresji u szczurów: usunięcie opuszek węchowych, niedobór cynku w diecie oraz działanie czynników stresogennych. W mojej opinii dobór tematu oraz cele pracy zostały ul. Akademicka 19, Lublin, tel: mariusz.gagos@poczta.umcs.lublin.pl

2 sformułowane prawidłowo, mimo oczywistej trudności związanej z określeniem poziomu depresji u szczurów i odniesieniu go do rzeczywistej depresji u ludzi. Pokonując tę trudność Doktorantka podjęła się zadania, którego efektem końcowym są prezentowane w rozprawie wyniki badań. Ocena formalna i merytoryczna pracy: Rozprawa doktorska Pani mgr inż. Joanny Depciuch ma układ typowy dla prac doświadczalnych. Praca liczy 165 stron, na które składa się 5 rozdziałów zakończonych wnioskami. W Bibliografii Autorka zacytowała 213 publikacji. W głównej części pracy zawarto 34 rysunki oraz 3 rysunki w materiałach dodatkowych, zamieszczono również 23 tabele plus 3 w Aneksie. Ponadto Autorka zamieściła wykaz 20-stu własnych publikacji. Na liście JCR w bazie Scopus aktualnie można odnaleźć 11 pozycji. Jest to liczba świadcząca o ponadprzeciętnej aktywności naukowej Doktorantki. Na zakończenie w załącznikach Autorka zamieściła kopie dwóch artykułów (jest pierwszym autorem i w jednej z prac autorem korespondencyjnym) z bazy JCR bezpośrednio związanych z tematem rozprawy. Stronę graficzną rozprawy oceniam wysoko. Rozprawa napisana jest starannie, ta ocena dotyczy zarówno rysunków, tabel jak i schematów zamieszczonych w opracowaniu pracy. Dyskusję wyników przeprowadzonych przez Autorkę oceniam także bardzo dobrze. We Wstępie do dysertacji uzasadniającym cel podjętych badań, Autorka zamieściła syntetyczny opis wprowadzający czytającego w problematykę znaczenia metod spektroskopowych w badaniach biologicznych. Przegląd literatury stanowi zwięzłą charakterystykę depresji oraz metod spektroskopowych używanych przez Doktorantkę. Rozdziały eksperymentalne dotyczące trzech modeli depresji zostały opisane w podobnym stylu. Autorka prezentuje wyniki badań rozpoczynając od analizy widm Ramana, następnie widm IR oraz na końcu wyniki badań osocza metodą spektroskopii absorpcyjnej w zakresie UV. Wyniki pozwalają na uzyskanie drugich pochodnych oraz wykonanie analizy gaussowskiej widm FTIR. Szczegółowa analiza pozwala porównać zmiany w komponentach drugorzędowej struktury białek. Badania w zakresie światłą widzialnego (powinno być w zakresie UV) umożliwiły zgrubne moim zdaniem porównanie frakcji białkowej i lipidowej. 2

3 Dalsze testy statystyczne umożliwiły wyłonienie najbardziej istotnych informacji z zastosowania w/w technik. W dyskusji w sposób syntetyczny Autorka omawia uzyskane wyniki. Wnioski zostały zebrane w sposób klarowny. Jako osiągnięcie Autorki należy wskazać wykazanie przez nią istotnej korelacji zmian w równowadze fosfolipidowo-białkowej we wszystkich analizowanych modelach depresji. Podobne zmiany zostały uchwycone w przypadku badań Autorki na osoczu ludzkim, od pacjentów ze zdiagnozowaną depresją w różnym stopniu zaawansowania oraz przedziale wiekowym. Uważam te badania za bardzo cenny wkład Autorki w rozwój związanej z zastosowaniem metod fizycznych, analityki medycznej. Podczas czytania rozprawy doktorskiej zauważyłem drobne uchybienia redakcyjne i stylistyczne o charakterze tzw. skrótów myślowych nie mające jednak wpływu na ostateczną ocenę pracy: 1. Rozdziału Wprowadzenie, str. 14 brak w spisie treści. Na tej samej stronie Autorka pisze: Z drugiej strony, w badaniach na zwierzętach, różne stężenia białek oraz poszczególnych frakcji lipidowych powodują objawy charakterystyczne dla depresji. Podczas czytania nie zauważyłem wzmianki na temat badań behawioralnych oraz informacji o tym jakie objawy specyficzne dla depresji były oceniane w związku z różnymi stężeniami białek i lipidów w surowicy szczurów? Jak w przypadku zwierząt odróżnić objawy depresji od zaburzeń w prawidłowym przyjmowaniu pokarmów? Idąc dalej, trochę niefortunne określenie: W pierwszych dwóch rozdziałach pracy przedstawiłam informacje teoretyczne dotyczące metod spektroskopowych oraz depresji. Należy w tym miejscu dodać, że problematyka badawcza jest związana z depresją, a spektroskopia jest tylko narzędziem pomiarowym. 2. Równanie 2 na str. 18 brakuje α. 3

4 3. Strona 20: Technika ta do wzbudzeń drgań cząstek wykorzystuje fale elektromagnetyczne o długości od 400 cm -1 do 4000 cm -1 (średnia podczerwień). Ten zakres podany jest w jednostkach liczb falowych a nie długości fali. 4. Na stronie 23 w tabeli Autorka używa raczej potocznych cech różniących spektroskopię Ramana i FTIR np.: losy padającej fali lub rodzaj wyczuwanych drgań. Jeżeli chodzi o widmo wody (należałoby to także uściślić jakiej), to woda destylowana posiada widmo Ramana ( lub 5. Na stronie 23: Spektroskopia w nadfiolecie oraz w świetle widzialnym UV-VIS (Ultraviolet- Visible Spectroscopy) jest jedną z najpopularniejszych metod stosowanych w określaniu struktury związków chemicznych, w szczególności organicznych. Spektroskopia absorpcji elektronowej UV-Vis wspiera nas w poznaniu struktury elektronowej molekuły oraz jej asocjatów w różnych środowiskach, o ile w cząsteczce istnieje chromofor. 6. Na stronie 25: Roztwór odnośnika podczas pomiaru nie absorbuje promieniowania, ponieważ nie zawiera on substancji oznaczanej. W zależności od tego, jaki rozpuszczalnik jest używany - część rozpuszczalników absorbuje zwłaszcza w obszarze UV, np. aceton 280 nm. 7. Strona 48: Doświadczenia prowadzono na samcach szczurów Sprague-Dawley (Charles River Laboratories, Germany) w wieku czterech tygodni. Jaka była ich masa oraz dlaczego do badań wzięto niedojrzałe płciowo osobniki? Zwierzęta były trzymane po 5 osobników w klatce W jaki sposób kontrolowano ilość spożytej paszy jeśli szczury przetrzymywano po 5 osobników w klatce? Dlatego też należy zadać kolejne pytanie skąd wiadomo jaką dawkę dobową cynku otrzymywał każdy szczur? 8. Strona 54: Do pomiarów FTIR Autorka używała spektrometru Vertex 70v. Należy pamiętać, że w tym spektrometrze zamiast typowego interferometru Michelsona, jak opisała to Autorka, pracuje interferometr nowej generacji RockSolid. 4

5 9. Strona 55: Niewątpliwą zaletą pomiarów ATR jest fakt, że stan skupienia oraz ilość badanych substancji nie wpływa na wynik pomiaru. Substancje badane z wykorzystaniem ATR nie wymagają uprzedniego przygotowania. Do końca nie mogę się zgodzić z tym stwierdzeniem, gdyż nawet orientacja cząsteczek lub to, z jakiego rozpuszczalnika uzyskano fazę stałą ma wpływ na kształt widm ( 10. Strona 57: Czy Autorka odparowywała nakropione na ATR osocze z wody? 11. Strona 67, rys. 13 i inne: Zamiast skali jednostek absorbancji powinno być druga pochodna absorbancji po liczbie falowej (d 2 A( )/d 2 ). Ta sama kwestia dotyczy wszystkich podobnych rysunków w tekście. 12. Strona 69, rys. 14: W zaprezentowanej analizie gaussowskiej brakuje mi konkretnego przyporządkowania gausów zakresami do konkretnej struktury białek wraz ze szczegółowymi danymi odnośnie np. wysokości i szerokości połówkowej gausów. Czy Autorka używała gausów inicjacyjnych wyliczonych co do sztuki z dekonwolucji widma? Jak wyglądały residualsy dopasowań. 13. Strona 70, podrozdział : W wyniku pomiaru spektrum w zakresie światła widzialnego Autorka mierzyła widma w zakresie od nm, czyli max. 50 nm przed obszarem światła widzialnego. 14. Strona 71, rys. 15 i inne podobne w tekście: Zaprezentowane widma po właściwej ich obróbce wyglądałyby atrakcyjniej. Szkoda, że Autorka nie zmierzyła próbki metodą dichroizmu kołowego CD. Wówczas uzyskałaby więcej wiarygodnych informacji na temat struktury białek. Technika UV-Vis nie jest referencyjna dla pomiarów białek i lipidów. Przy 203 nm absorbuje w zasadzie wszystko. Ostatnie zdanie - w tym przypadku mówimy nie o przesunięciu wartości liczby falowej, ale przesunięciu się pasma w kierunku konkretnej długości fali. 5

6 15. Strona 88: Testy statystyczne w pracy: Mała liczebność w grupach obliguje do sprawdzenia czy rozkład w populacji jest normalny. Tylko wtedy możemy posłużyć się analizą wariancji. Czy Autorka uwzględnia te warunki? 16. Strona 110: Wątpliwości budzi stwierdzenie: Jeśli wzbudzimy drganie danej cząsteczki, na widmie, w miejscu tej długości falowej dostaniemy sygnał w postaci maksimum intensywności (Ramana) lub absorbancji (FTIR, UV-VIS). 17. Strona 121: w kilku miejscach: Zmiany struktury białek widoczne są na widmach drugiej pochodnej FTIR. Raczej wskazuje na to druga pochodna z widma FTIR. Wskazane powyżej uchybienia nie umniejszają jednak wartości pracy i jej wysokiej merytorycznej oceny. Wnioski końcowe: Podsumowując rozprawę doktorską Pani mgr inż. Joanny Depciuch oceniam ją bardzo dobrze. Rozprawa posiada elementy nowości naukowej i stanowi oryginalny wkład do nauki w zakresie fizyki a zwłaszcza fizyki medycznej. Na uwagę zasługuje także fakt, że część wyników uzyskanych przez Panią mgr inż. Joannę Depciuch została opublikowana w jedenastu współautorskich artykułach zamieszczonych w wysoko punktowanych czasopismach z bazy JCR (np. Scientific Reports, IF 5.2). Artykuły dotychczas cytowano 16 razy (baza Scopus), indeks h=3. Doktorantka uczestniczyła także w konferencjach zagranicznych. Wobec powyższego stwierdzam, że praca spełnia wymagania stawiane rozprawom doktorskim i wnoszę o dopuszczenie Pani mgr inż. Joanny Depciuch do dalszych etapów przewodu doktorskiego. prof. dr hab. Mariusz Gagoś 6