Politechnika Śląska Wydział Chemiczny Katedra Chemii Analitycznej. Marta Koper

Transkrypt

1 Politechnika Śląska Wydział Chemiczny Katedra Chemii Analitycznej Marta Koper METDY WLTAMPERMETRYCZNE W ZNACZANIU WYBRANYCH LEKÓW I ICH METABLITÓW AUTREFERAT RZPRAWY DKTRSKIEJ Promotor pracy: Prof. dr hab. Irena Staneczko-Baranowska Gliwice 2012

2 I. WPRWADZENIE... 3 II. CEL PRACY... 4 III. CZĘŚĆ DŚWIADCZALNA... 4 III.1. PRACWANIE METD PRZYGTWANIA PRÓBEK D ANALIZ WLTAMPERMETRYCZNYCH... 5 III.2. WLTAMPERMETRYCZNE BADANIA PDSTAWWE LEKÓW... 6 III.3. PARAMETRY KRZYWYCH KALIBRACJI III.4. ZNACZANIE LEKÓW W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH III.5. BADANIA PDSTAWWE METABLITÓW LEKÓW III.6. ZNACZANIE LEKÓW I METABLITÓW W PRÓBKACH MCZU III.7. ZNACZANIE LEKÓW W PRÓBKACH WÓD IV. PDSUMWANIE I WNISKI V. LITERATURA VI. DRBEK NAUKWY VI.1. PUBLIKACJE VI.2. KMUNIKATY, REFERATY, PSTERY VI.3. GRANTY

3 I. WPRWADZENIE Przemysł farmaceutyczny nastawiony przede wszystkim na opracowywanie nowych preparatów oferuje ciągle lepsze, skuteczniejsze, często złożone produkty dla pacjentów. Badania opinii publicznej wskazują, iż obok deklarowanej przez społeczeństwo potrzeby nowych skutecznych leków, priorytetem jest ich bezpieczeństwo. W kwestii tej oczekiwania nastawione są przede wszystkim na trzy aspekty bezpieczeństwa preparatów farmaceutycznych: pewność co do ich składu, dawki substancji aktywnej oraz czystości preparatu. W związku z tym jednym z najbardziej restrykcyjnie traktowanych procesów w przemyśle farmaceutycznym jest kontrola jakości leków. Stąd też potrzeba opracowywania nowych, szybkich i dokładnych metod analitycznych, które mogłyby być wykorzystane zarówno jako alternatywne w stosunku do obecnie stosowanych, jak i jako metody odniesienia, pozwalające na potwierdzenie uzyskanych wyników. Istnieje także potrzeba analizowania próbek płynów biologicznych pobranych od pacjenta poddanego terapii. Dzięki temu, już na etapie testów, można uzyskać wiele informacji na temat biodostępności, metabolizmu oraz właściwości toksykologicznych, farmakodynamicznych i farmakokinetycznych leku. Szczególny wzrost znaczenia monitorowania leków w płynach ustrojowych pacjenta odnotowano w latach siedemdziesiątych XX wieku, kiedy to zaobserwowano u pacjentów cierpiących na epilepsję, lepsze efekty leczenia przy dawkowaniu leków w celu osiągnięcia określonego stężenia substancji aktywnej we krwi pacjenta, w porównaniu do dawek podawanych w przeliczeniu na masę ciała. Zmniejszenie się ilości ataków chorobowych oraz nasilenia bólu wywołały dyskusję na temat potrzeby indywidualizacji terapii, a co za tym idzie monitorowania dystrybucji i zmian stężenia leków w trakcie leczenia pacjentów. Z tego też względu powstał projekt monitorowania leków podczas terapii, zwany ogólnie Terapeutycznym Monitorowaniem Leków (Therapeutic Drug Monitoring TDM), opierający się na współpracy kilku dyscyplin naukowych, w szczególności farmakokinetyki, farmakodynamiki oraz chemii analitycznej [1]. TDM jest projektem polegającym na oznaczaniu stężenia leków w płynach ustrojowych w celu opracowania najbardziej efektywnego, ale też maksymalnie bezpiecznego schematu dawkowania leków dla indywidualnego pacjenta. Ustalenie parametrów farmakodynamicznych i farmakokinetycznych leków na etapie projektowania i badań przed dopuszczeniem preparatów do ogólnego stosowania, pozwala na przewidywanie ich dystrybucji i metabolizmu w organizmie. Jednakże cechy indywidualne pacjenta oraz coraz szersza potrzeba stosowania wielu leków równocześnie, a co za tym idzie ich ewentualne wzajemne oddziaływanie, wymusiły kontrolę stężeń w rzeczywistym czasie terapii. W tym celu właśnie odnotowano zainteresowanie opracowywaniem nowych metod analitycznych do oznaczania farmaceutyków oraz ich metabolitów w próbkach biologicznych. W dyskusji na temat leków nie sposób pominąć kwestii wpływu środowiska na organizm. Coraz szerzej stosowane leki oraz niefrasobliwość w ich utylizacji spowodowały występowanie tych 3

4 związków w ekosystemach wodnych. bserwowane anomalie wśród organizmów występujących w wodach powierzchniowych świadczą o zagrożeniach spowodowanych przez farmaceutyki obecne w środowisku przyrodniczym. Sytuacje te oraz potencjalna możliwość wpływu pozostałości farmaceutyków na człowieka wymusiły potrzebę oznaczania leków w wodach powierzchniowych i wodzie pitnej, a co za tym idzie postawiły przed chemią analityczną problem opracowania metod do ich oznaczania. II. CEL PRACY Celem naukowym pracy było opracowanie nowych, nieopisanych dotąd woltamperometrycznych metod oznaczania wybranych leków należących do różnych grup terapeutycznych (deksametazon, furosemid, ketoprofen, kwas acetylosalicylowy, nifedypina, paracetamol, prednizolon, propranolol, terbinafina). W ramach badań należało zatem przeprowadzić badania podstawowe leków metodą woltamperometrii cyklicznej na elektrodzie z węgla szklistego oraz modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrodzie z węgla szklistego oraz opracować parametry pomiarowe do wyznaczenia krzywych kalibracji metodą woltamperometrii pulsowej różnicowej. W kolejnym etapie zaplanowano objąć zakresem badań także metabolity leków, a opracowane metody zastosować do oznaczania analitów w próbkach moczu, po wcześniejszym opracowaniu metody przygotowania próbek w celu wzbogacenia analitów oraz wyeliminowania interferencji ze strony składników matrycy. Zaplanowano także opracowanie procedury przygotowania próbek wód powierzchniowych techniką ekstrakcji do fazy stałej i poddanie ich badaniu na zawartość oznaczanych w niniejszej rozprawie leków. III. CZĘŚĆ DŚWIADCZALNA Elektrochemiczne badania podstawowe wybranych leków z różnych grup terapeutycznych prowadzono metodą woltamperometrii cyklicznej i pulsowej woltamperometrii różnicowej. Badania prowadzono w układzie trójelektrodowym, gdzie elektrodę pracującą stanowiła elektroda z węgla szklistego (GCE), elektrodę odniesienia elektroda chlorosrebrowa, natomiast elektrodę pomocniczą elektroda platynowa. Ponadto w pomiarach stosowano elektrodę z węgla szklistego modyfikowaną wielościennymi nanorurkami węglowymi (MWCNT/GCE). 4

5 III.1. PRACWANIE METD PRZYGTWANIA PRÓBEK D ANALIZ WLTAMPERMETRYCZNYCH III.1.1. Przygotowanie próbek preparatów farmaceutycznych Przygotowanie próbek do oznaczania leków w preparatach farmaceutycznych, polegało, w przypadku roztworów do iniekcji, na pobraniu odpowiedniej ilości preparatu, a następnie rozcieńczeniu jej mieszaniną woda : metanol (50:50; v/v). Ze względu na to, iż badane leki w formie iniekcji występują w postaci roztworów, próbki nie wymagały dodatkowej obróbki. W przypadku oznaczeń w tabletkach, próbki ucierano w moździerzu, a następnie odważano odpowiednią ilość próbki. Próbki rozpuszczano w metanolu bądź w mieszaninie woda : metanol (50:50; v/v), wspomagając proces rozpuszczania ultradźwiękami w łaźni ultradźwiękowej. Następnie nierozpuszczalną część masy tabletkowej odsączano, poddając badaniom tylko klarowny przesącz. W przypadku kapsułek postępowano podobnie, przy czym do moździerza wprowadzano tylko zawartość kapsułek (granulki), bez osłonek. III.1.2. Przygotowanie próbek moczu W celu opracowania metody przygotowania próbek, początkowo badania prowadzono na próbkach moczu pobranego od osób zdrowych oraz na próbkach moczu z dodatkami wzorców. Badania te, na podstawie wartości odzysków poszczególnych substancji, pozwoliły na określenie wpływów matrycy oraz dobranie optymalnych warunków przygotowania próbek. Mocz do dalszych analiz pobierano zarówno od osób zdrowych jak i pacjentów leczonych odpowiednimi lekami. Bezpośrednio po pobraniu próbki moczu filtrowano przez filtr nylonowy o wymiarach porów 0,45 μm Bakerbond. Następnie do 5 ml próbki moczu wprowadzano 2 ml buforu fosforanowego o ph=7,0 oraz 2 ml acetonitrylu w celu strącenia ewentualnie obecnych białek. Następnie próbki wirowano, a całość roztworu znad osadu poddawano dalszym badaniom. Zatężanie analitów oraz eliminowanie wpływów substancji wchodzących w skład matrycy osiągnięto przez zastosowanie metody ekstrakcji do fazy stałej (SPE). Spośród przebadanych kolumn wybrano te, na których poszczególne mieszaniny leków i metabolitów dawały najwyższe wartości odzysków. W przypadku ketoprofenu i kwasu acetylosalicylowego oraz ich metabolitów zastosowano kolumny ekstrakcyjne Bakerbond C18 (6 ml, 500 mg). W przypadku oznaczeń paracetamolu i jego metabolitów najlepsze odzyski otrzymywano przy zastosowaniu kolumn asis MCX (6 ml, 500 mg). Próbki moczu zawierające propranolol i jego metabolity zatężano na kolumnach asis HLB (6 ml, 500 mg) [2]. III.1.3. Przygotowanie próbek wód Początkowo badania w wodach prowadzono na próbkach wody destylowanej z dodatkiem wzorców. Kolejno przeprowadzono badania w wodach wodociągowych oraz wodach rzecznych. 5

6 Próbki o objętości 1000 cm 3 pobierano do szklanych butelek i wprowadzano roztwór wzorcowy leków (deksametazon, furosemid, ketoprofen, kwas acetylosalicylowy, nifedypina, prednizolon, propranolol, terbinafina). Następnie próbkę przesączano, doprowadzano do ph=2 kwasem solnym i poddawano procedurze SPE na dyskach ekstrakcyjnych Speedisk (C 18, 500 mg, Bakerbond). We wszystkich przypadkach uzyskiwano odzyski około 90 %, dlatego ze względu na możliwość zastosowania dysków ekstrakcyjnych, a tym samym możliwość zastosowania znacznie większych szybkości przepływu niż w przypadku tradycyjnych kolumn, metodę tę stosowano do przygotowywania próbek wód. Jedynie w przypadku paracetamolu zastosowano kolumny z wypełnieniem asis MCX (6 ml, 500 mg). Wyniki badań zweryfikowano metodą wysokosprawnej chromatografii cieczowej z detektorem z matrycą diodową DAD, na podstawie publikacji Using HPLC method with DAD detection for the simultaneous determination of 15 drugs in surface water and wastewater (I. Baranowska, B. Kowalski, Polish J. of Environ. Stud., 20, 2011, 21). III.2. WLTAMPERMETRYCZNE BADANIA PDSTAWWE LEKÓW W początkowym etapie badań zarejestrowano woltamperogramy cykliczne badanych leków: deksametazonu, furosemidu, ketoprofenu, kwasu acetylosalicylowego, nifedypiny, paracetamolu, prednizolonu, propranololu i terbinafiny. Jako elektrolit stosowano bufor Brittona-Robinsona o różnych wartościach ph. Na podstawie uzyskanych wyników określono czy badane substancje ulegają reakcji elektrochemicznego utleniania czy redukcji. Następnie wyznaczono dla kolejno badanych substancji zależność potencjału piku od ph elektrolitu podstawowego. Wyznaczono także zależność natężenia prądu dla badanych leków od ph elektrolitu i na podstawie uzyskanych krzywych wybrano optymalną wartość ph elektrolitu do dalszych badań analitycznych. W buforze Brittona-Robinsona wyznaczono zależność natężenia prądu piku badanych leków od szybkości zmian potencjału. Analiza zarejestrowanych kolejnych skanów metodą woltamperometrii cyklicznej oraz wyznaczonych zależności natężenia prądu i potencjału piku od ph elektrolitu i szybkości zmian potencjału pozwoliła na dobranie parametrów pomiarów. W dalszym ciągu badań, metodą woltamperometrii pulsowej różnicowej zarejestrowano woltamperogramy dla kolejnych dodatków badanych substancji i na ich podstawie wyznaczono krzywe kalibracji, zakres liniowości oraz granicę oznaczalności i granicę wykrywalności. III.2.1. Badania podstawowe deksametazonu Badania podstawowe w buforze Brittona-Robinsona o różnych wartościach ph wykazały, iż deksametazon ulega na elektrodzie z węgla szklistego tylko reakcji redukcji, dając jeden pik przy potencjale -1,4 V. Jednak dla stosunkowo wysokich stężeń deksametazonu obserwowane natężenia prądu są niewielkie. W celu poprawy symetrii piku oraz zwiększenia wartości natężenia prądu 6

7 I p [A] zastosowano modyfikowaną elektrodę. Woltamperogram cykliczny deksametazonu zarejestrowany na MWCNT/GCE przedstawiono na rysunku 1, gdzie można zauważyć dodatkowy szeroki sygnał po stronie redukcji przy potencjale -0,6 V. 2.00E E E E E E E E Rysunek 1. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=9,3 oraz 3,18x10-4 M deksametazonu zarejestrowany na MWCNT/GCE w buforze BR o ph=9,3. Wpływ ph elektrolitu na potencjał redukcji deksametazonu można opisać równaniem: E p [V] = -0,9074 0,0572 ph Współczynnik kierunkowy wyznaczonej prostej wskazuje na fakt, iż w procesie elektrochemicznej redukcji deksametazonu bierze udział taka sama ilość elektronów jak i protonów [3,4]. W buforze Brittona-Robinsona o ph=9,3 zarejestrowano następnie woltamperogramy cykliczne deksametazonu w celu wyznaczenia zależności natężenia prądu od szybkości polaryzacji elektrody. Zależność tę wyznaczono w zakresie od 0,005 V do 0,250 V. Badania wykazały, iż wzrost szybkości zmian potencjału powoduje wzrost obserwowanego natężenia prądu, a zależność ta ma charakter liniowy. I p [μa] = 0,467 ν [mv s -1 ] + 0,845 pisana powyższym równaniem zależność świadczy o tym, iż proces jest kontrolowany adsorpcją. Mechanizm redukcji deksametazonu przedstawiono na schemacie [5]. H H 3 C CH3 H + 2e - H 3 C CH3 H (1) F + 2H + F 7

8 I p [A] H H 3 C CH3 H H 3 C CH3 H H + 2e - H 3 C H H F F + 2H + H H 3 C H 3 C (2) H III.2.2. Badania podstawowe furosemidu Na elektrodzie z węgla szklistego furosemid ulega reakcji utleniania. Na krzywej woltamperometrycznej zarejestrowanej dla furosemidu (rysunek 2) obserwowano dwa piki. Przy zmianie kierunku polaryzacji elektrody, po stronie redukcji, nie obserwowano pików, co świadczy o nieodwracalnym charakterze reakcji utleniania furosemidu. Badania furosemidu przeprowadzono także na modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrodzie z węgla szklistego, przy czym zauważono, iż obserwowane natężenia prądu są większe w stosunku do tych uzyskiwanych na elektrodzie niemodyfikowanej. Ma to związek ze zwiększeniem powierzchni elektrody pracującej. 6.00E E E E E E E E E E p [V] vs. Ag/AgCl/KCl (nas.) Rysunek 2. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=5,0 oraz 1,21x10-4 M furosemidu zarejestrowany na GCE w buforze BR o ph=5,0. Stwierdzono, iż wraz ze wzrostem ph elektrolitu pik furosemidu przesuwa się w kierunku wartości bardziej ujemnych: E p [V] = 1,2510 0,0581 ph. Reakcję utleniania furosemidu opisuje następujący mechanizm[6]: Cl NH -2H + Cl N H 2 N 2 S CH -2e - H 2 N 2 S CH 8

9 I [A] Dalsze badania prowadzono dla piku utleniania furosemidu obserwowanego przy niższej wartości potencjału. Badania zależności natężenia prądu od szybkości polaryzacji elektrody, jak w przypadku badań innych leków, przeprowadzono w zakresie od 5 mv/s do 300 mv/s. Przeprowadzone badania pozwoliły stwierdzić, iż natężenie prądu rośnie proporcjonalnie do wzrostu pierwiastka kwadratowego z szybkości zmian potencjału, czyli że reakcja jest kontrolowana szybkością dyfuzji. I p [μa] = 0,671 ν ½ [mv s -1 ] + 0,083 III.2.3. Badania podstawowe ketoprofenu [IV] Na krzywej woltamperometrycznej ketoprofenu zarejestrowanej na GCE zaobserwowano szeroki pik redukcji przy potencjale -1,4 V, natomiast po stronie utleniania nie zaobserwowano sygnałów, co świadczy o nieodwracalnym charakterze reakcji redukcji. Woltamperogram cykliczny ketoprofenu, zarejestrowany w buforze Brittona-Robinsona o ph 9,3 zaprezentowano na rysunku 3. Równolegle badania prowadzono na modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrodzie z węgla szklistego. Na krzywej woltamperometrycznej zarejestrowanej w buforze Brittona-Robinsona o ph=9,3 zaobserwowano pik redukcji przy potencjale -1,27 V. Badania te wykazały, iż zastosowanie modyfikacji elektrody prowadzi do uzyskiwania znacznie większych natężeń prądu obserwowanego piku redukcji. 5,00E-06 0,00E+00-5,00E-06-1,00E-05-1,50E-05-2,00E-05-2,50E-05-3,00E-05-1,6-1,1-0,6-0,1 0,4 Rysunek 3. Woltamperogramy cykliczne 1,97x10-4 M ketoprofenu zarejestrowany na modyfikowanej (linia zielona) i niemodyfikowanej (linia czerwona) GCE w buforze Brittona-Robinsona o ph=9,3. Badania przeprowadzone w buforze Brittona-Robinsona o różnych wartościach ph wykazały, iż sygnał redukcji ketoprofenu zależy od ph elektrolitu. Zależność potencjału piku od ph elektrolitu można opisać równaniem: E p [V] = -0,057 ph 0,747 Charakterystyczny współczynnik kierunkowy równania, o wartości bliskiej teoretycznej wynoszącej 59 mv, sugeruje, iż w procesie elektrochemicznej redukcji ketoprofenu ilość protonów i elektronów 9

10 I [A] wymienianych podczas reakcji jest taka sama. Badania te potwierdzają mechanizm redukcji ketoprofenu zaproponowany w literaturze [7]: H H CH +2H + +2e - CH Dodatkowo na podstawie uzyskanych wyników wyznaczono zależność natężenia prądu piku ketoprofenu od ph elektrolitu podstawowego. Wykazały one, iż wraz ze wzrostem ph rośnie natężenie prądu osiągając wartość maksymalną przy ph=8,7. Zależność natężenia prądu piku redukcji ketoprofenu od szybkości zmian potencjału, wyznaczona na modyfikowanej elektrodzie, ma następujący przebieg: I p [µa] = 0, ,9749 ν ½ [mv s -1 ] Współczynnik korelacji uzyskany dla omawianego zbioru wyników wynosi 0,9982, czyli proces jest kontrolowany szybkością dyfuzji. III.2.4. Badania podstawowe kwasu acetylosalicylowego Badania podstawowe kwasu acetylosalicylowego prowadzono początkowo na elektrodzie z węgla szklistego w buforze Brittona-Robinsona o różnych wartościach ph. W ramach badań zaobserwowano, iż na każdym kolejnym skanie zarejestrowanym metodą woltamperometrii cyklicznej natężenie prądu piku utleniania kwasu acetylosalicylowego zmniejsza się (rysunek 4), co ogranicza możliwość zastosowania tego sygnału do celów analitycznych. 4,50E-06 3,50E-06 2,50E-06 1,50E-06 5,00E-07-5,00E-07-1,50E-06-0,5 0 0,5 1 1,5 Rysunek 4. Woltamperogramy cykliczne 2,77x10-4 M kwasu acetylosalicylowego (kolejne skany) zarejestrowane w buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0 na GCE. Podobne badania przeprowadzono na modyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego. W przypadku utleniania kwasu acetylosalicylowego na modyfikowanej elektrodzie obserwowano, iż kolejne skany pokrywają się. Wraz ze wzrostem wartości ph elektrolitu podstawowego pik utleniania kwasu acetylosalicylowego stawał się szerszy i mniej wyraźny. Przy wartości ph powyżej 8,0 sygnał pochodzący od kwasu acetylosalicylowego był trudny do zidentyfikowania. W związku z tym 10

11 I p [A] woltamperogramy cykliczne zarejestrowano w elektrolicie podstawowym o ph<8,0 dla stężenia 2,77x10-4 M. Wpływ ph elektrolitu podstawowego na potencjał utleniania kwasu acetylosalicylowego opisano równaniem: E p [V] = 1,1547 0,0316 ph Współczynnik kierunkowy przedstawionej prostej, o wartości zbliżonej do teoretycznej wartości 29 mv, świadczy o udziale w elektrochemicznym procesie utleniania dwukrotnie większej ilości elektronów niż protonów. Badania zależności natężenia prądu od szybkości zmian potencjału dla kwasu acetylosalicylowego wykazały, iż proces utleniania kwasu acetylosalicylowego jest procesem kontrolowanym szybkością dyfuzji. I p [μa] = 1,569 ν ½ [mv s -1 ] + 3,045 III.2.5. Badania podstawowe nifedypiny Nifedypina ulega zarówno reakcji redukcji jak i utleniania, przy czym pik utleniania obserwowano przy potencjale około 0,85 V, natomiast pik redukcji przy potencjale -0,39 V. Sygnały te związane są z reakcjami nieodwracalnymi. Dalsze badania nifedypiny prowadzono w oparciu o zarejestrowany pik utleniania. Kolejnym etapem badań było zastosowanie w oznaczeniach modyfikowanej elektrody z węgla szklistego. Badania wykazały znaczny wzrost natężenia prądu piku utleniania nifedypiny, przy czym zaobserwowano także pojawienie się dodatkowych pików utleniania. Woltamperogram cykliczny nifedypiny zarejestrowany na elektrodzie MWCNT/GCE zaprezentowano na rysunku E E E E E E p [V] vs. Ag/AgCl/KCl (nas.) Rysunek 5. Woltamperogram cykliczny 1,01x10-4 M nifedypiny zarejestrowany w buforze BR o ph=4,0 na MWCNT/GCE. Wykazano, iż wraz ze wzrostem szybkości polaryzacji elektrody potencjał piku przesuwa się w kierunku wartości ujemnych. Zależność natężenia prądu od szybkości zmian potencjału ma charakter typowy dla procesów kontrolowanych szybkością dyfuzji: I p [μa] = 0,591 ν ½ [mv s -1 ] + 0,091 11

12 I [A] Utlenianie nifedypiny na elektrodzie węglowej zachodzi zgodnie z mechanizmem [8]: H 3 C C N 2 C -H + H 3 C C N 2 C -e - H 3 C N H H 3 C N III.2.6. Badania podstawowe paracetamolu [I] Badania podstawowe paracetamolu prowadzono na elektrodzie z węgla szklistego jak i modyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego. Na krzywej woltamperometrycznej zarejestrowanej w elektrolicie podstawowym o ph=3,0 obserwowano pik utleniania paracetamolu przy potencjale 0,75 V na elektrodzie niemodyfikowanej oraz przy potencjale 0,63 V na elektrodzie modyfikowanej. Przykładowy woltamperogram cykliczny paracetamolu zaprezentowano na rysunku 6. 4,00E-05 3,00E-05 2,00E-05 1,00E-05 0,00E+00-1,00E-05-2,00E-05-0,5 0 0,5 1 1,5 Rysunek 6. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=3,0 oraz 1,65x10-4 M paracetamolu zarejestrowany w buforze BR o ph=3,0 na MWCNT/GCE Badania paracetamolu w elektrolicie podstawowym o różnych wartościach ph wykazały silną zależność potencjału piku od wartości ph elektrolitu: E p [V] = 0,7924 0,0609 ph Wartość współczynnika kierunkowego prezentowanego równania świadczy o udziale w procesie utleniania takiej samej ilości protonów i elektronów. Mechanizm utleniania paracetamolu przedstawiono poniżej [9]: NHC NC -2H + -2e - H 12

13 I p [A] Natężenie prądu odpowiadające sygnałowi utleniania paracetamolu maleje wraz ze wzrostem ph elektrolitu. Dodatkowo w środowisku obojętnym i zasadowym obserwuje się poszerzenie pików. Stąd też do dalszych badań oraz do celów analitycznych zastosowano bufor Brittona-Robinsona o ph=3,0. Na modyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego można zauważyć, iż wraz ze wzrostem szybkości zmian potencjału zmienia się potencjał piku przesuwając się w kierunku potencjałów bardziej ujemnych. Tendencja ta jest charakterystyczna dla reakcji nieodwracalnych. Badania wykazały również, iż zależność między natężeniem prądu piku utleniania a szybkością zmian potencjału ma przebieg charakterystyczny dla procesów kontrolowanych szybkością dyfuzji: I p [μa] = 0,0668 ν ½ [mv s -1 ] + 0,017 III.2.7. Badania podstawowe prednizolonu Zarejestrowany woltamperogram cykliczny (rysunek 7) w środowisku zasadowym wskazuje, iż prednizolon ulega reakcji redukcji. Zastosowanie w kolejnym etapie badań modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrody z węgla szklistego, spowodowały wzrost obserwowanego natężenia prądu dla danego stężenia prednizolonu, jednak nie wpłynęło to na polepszenie symetrii sygnału redukcji. 1.00E E E E E E Rysunek 7. Woltamperogram cykliczny 2,08x10-4 M prednizolonu zarejestrowany w buforze BR o ph=9,3 na MWCNT/GCE Wraz ze wzrostem ph elektrolitu sygnał redukcji przesuwa się w kierunku potencjałów bardziej ujemnych, a w procesie tym bierze udział taka sama ilość protonów co elektronów. Na podstawie zależności natężenia prądu od szybkości polaryzacji elektrody, widać iż proces ten kontrolowany jest adsorpcją. E p [V] = -1,1436 0,0604 ph I p [μa] = 0,381 ν [mv s -1 ] + 0,741 Uzyskane wyniki potwierdzają zaproponowany w literaturze mechanizm elektrochemicznej redukcji prednizolonu [10]: 13

14 I [A] H H H +2H + H H H H H +2e - H H H H III.2.8. Badania podstawowe propranololu [III] Propranolol utlenia się na elektrodzie z węgla szklistego dając jeden pik utleniania, co świadczy o nieodwracalnym charakterze procesu. Równolegle badania prowadzono na elektrodzie z węgla szklistego modyfikowanej nanorurkami węglowymi. 1,10E-06 9,00E-07 7,00E-07 5,00E-07 3,00E-07 1,00E-07-1,00E-07-3,00E-07-0,5 0 0,5 1 1,5 Rysunek 8. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=3,0 oraz 1,35x10-4 M propranololu zarejestrowany w buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0 na GCE. Metodą woltamperometrii cyklicznej określono także wpływ ph elektrolitu na potencjał piku utleniania. Wraz ze wzrostem ph elektrolitu potencjał piku przesuwał się w kierunku potencjałów o niższych wartościach: E p [V] = 1,3990 0,0551 ph Reakcja utleniania przebiega z wymianą takiej samej ilości protonów i elektronów, według mechanizmu [11]: -2H + -2e - H H 3 C NH H 3 C NH 14

15 I p [A] Modyfikacja elektrody nie miała znaczącego wpływu na obserwowane sygnały utleniania propranololu. Zależność natężenia prądu piku utleniania propranololu od szybkości zmian potencjału można przedstawić w postaci równania: I p [μa] = 0,689 ν ½ [mv s -1 ] + 0,028 III.2.9. Badania podstawowe terbinafiny Na podstawie zarejestrowanego woltamperogramu cyklicznego widać, iż terbinafina utlenia się, dając sygnał przy potencjale 1,1 V. W badaniach terbinafiny, na modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrodzie z węgla szklistego, nie obserwowano znaczących różnic w przebiegu krzywych oraz w wartościach rejestrowanych natężeń prądu. 4.00E E E E E E E E p [V] vs. Ag/AgCl/KCl (nas.) Rysunek 9. Woltamperogram cykliczny 1,20x10-4 M terbinafiny zarejestrowany w buforze BR o ph=5,0 na elektrodzie MWCNT/GCE Wraz ze wzrostem ph elektrolitu podstawowego pik utleniania terbinafiny przesuwa się w kierunku potencjałów bardziej ujemnych, a zależność tę przedstawiono w postaci równania: E p [V] = 1,3213 0,0542 ph Wraz ze wzrostem szybkości zmian potencjału (od 5,0 do 300 mv/s) pik przesuwa się w kierunku wartości bardziej ujemnych, tak jak w przypadku reakcji nieodwracalnych. Natężenie prądu wzrasta w sposób charakterystyczny dla reakcji kontrolowanych szybkością dyfuzji: I p [μa] = 0,619 ν ½ [mv s -1 ] + 0,108 III.3. PARAMETRY KRZYWYCH KALIBRACJI Badania podstawowe przeprowadzone metodą woltamperometrii cyklicznej pozwoliły na opracowanie odpowiednich parametrów pomiarowych dla wyznaczenia krzywych kalibracji metodą woltampeormetrii pulsowej różnicowej dla badanych leków. Podstawowe parametry zestawiono w tabeli 1. 15

16 Tabela 1. Parametry pomiarowe zastosowane przy rejestrowaniu krzywych kalibracji metodą DPV Szybkość ph elektrolitu Potencjał Potencjał końcowy Lek polaryzacji podstawowego początkowy [V] [V] elektrody [V] Deksametazon 9,3-1,0-1,6 0,025 Furosemid 5,0 0,0 1,6 0,025 Ketoprofen 8,7-1,0-1,6 0,025 Kwas acetylosalicylowy 3,0 0,5 1,5 0,025 Nifedypina 4,0 0,5 1,6 0,025 Paracetamol 3,0 0,1 1,1 0,025 Prednizolon 9,3-1,0-1,6 0,025 Propranolol 3,0 0,5 1,6 0,025 Terbinafina 5,0 0,6 1,3 0,025 Na podstawie zarejestrowanych woltamperogramów DP wyznaczono krzywe kalibracji dla poszczególnych leków. Współczynniki korelacji krzywych kalibracji mieściły się w zakresie od 0,9809 do 0,9994. Dla każdego leku wyznaczono zakres liniowości oraz wartości granicy wykrywalności (LD) i granicy oznaczalności (LQ). Wartości LD mieszczą się w zakresie od 1,37x10-6 do 5,55x10-6 M. Jedynie w przypadku deksametazonu, ketoprofenu i prednizolonu, oznaczanych na niemodyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego, otrzymano wartości LD z zakresu 1,39x10-5 2,35x10-5 M. III.4. ZNACZANIE LEKÓW W PREPARATACH FARMACEUTYCZNYCH Wszystkie wybrane do badań leki są elektroaktywne i ulegają reakcji utleniania bądź redukcji, a ich sygnały mogą być wykorzystane do celów analitycznych. W związku z tym opracowane metody oznaczania tych leków zastosowano do analizy próbek preparatów farmaceutycznych, w skład których wchodzą badane leki. Badania prowadzono na MWCNT/GCE. Wyjątek stanowiły badania dotyczące propranololu i furosemidu, których oznaczanie w farmaceutykach prowadzono na GCE. Wyniki oznaczeń zestawiono i porównano z zawartościami leków deklarowanymi przez producentów w tabeli 2. Zastosowana technika woltamperometrii pulsowej różnicowej pozwala na oznaczenie wszystkich wymienionych leków w preparatach farmaceutycznych, wymaga jedynie pomiarów przy różnych wartościach ph elektrolitu podstawowego. Charakteryzuje się ona szybkością oraz prostotą przeprowadzenia. Metody przygotowania próbek polegają jedynie na rozpuszczeniu i przesączeniu próbki, nie wymagają natomiast zastosowania metod ekstrakcyjnych, co znacznie wpływa na mały błąd pomiarów. 16

17 Tabela 2. znaczanie leków w preparatach farmaceutycznych. Lek Zawartość według Rodzaj danych próbki producenta[mg/tab] znaczono[mg/tab] Roztwór do Deksametazon iniekcji krople do oczu Furosemid Ketoprofen Kwas acetylosalicylowy Nifedypina Paracetamol Prednizolon Propranolol tabletki Roztwór do iniekcji S.D. [mg/tab] C.V. [%] S x [mg/tab] dzysk [%] 8 7,52 0,23 3,00 0,09 93,97 8 7,55 0,21 2,73 0,08 97,01 1 0,98 0,02 2,37 0,01 97, ,81 0,49 1,25 0,20 97, ,21 0,45 1,16 0,18 98, ,54 1,06 1,03 0,43 102, ,01 1,08 1,07 0,44 101,02 tabletki 50 50,32 1,00 1,99 0,41 100, ,92 4,42 1,54 1,78 95,31 tabletki ,25 4,34 1,50 1,81 96, ,97 3,95 1,35 1,61 97,66 tabletki tabletki tabletki tabletki 10 9,79 0,14 1,48 0,06 97, ,79 0,21 1,05 0,09 98, ,86 0,16 1,63 0,07 98, ,68 5,68 1,15 2,33 98, ,00 5,65 1,14 2,37 98, ,91 5,62 1,17 2,52 98,99 5 4,96 0,08 1,56 0,03 99,27 5 4,94 0,09 1,76 0,04 98, ,48 0,19 2,01 0,08 94, ,38 0,17 1,87 0,07 93, ,55 0,66 1,71 0,27 96, ,08 2,78 1,12 1,13 98,99 Terbinafina tabletki ,90 2,66 1,09 1,09 97,96 S.D.-odchylenie standardowe, C.V.-współczynnik zmienności, S x -średnie odchylenie standardowe Modyfikacja elektrody jest prosta do przeprowadzenia. Zastosowane metody nie wymagają również etapu zatężania analitu na elektrodzie, co również wpływa na czas przeprowadzenia pomiarów. pracowane metody woltamperometryczne można z powodzeniem zastosować w analizie próbek preparatów farmaceutycznych na zawartość leków. Ma to szczególne znaczenie ze względu na konieczność stosowania systemów kontroli jakości trafiających na rynek leków, a w związku z tym potrzebę opracowywania i dostarczania przemysłowi farmaceutycznemu szybkich i prostych metod ich oznaczania. III.5. BADANIA PDSTAWWE METABLITÓW LEKÓW Zagadnienie oznaczania leków nabiera szczególnego znaczenia w przypadku analizy materiału biologicznego. Pierwszym podstawowym problemem jest tutaj obecność złożonej matrycy, wpływ której należy zminimalizować na etapie przygotowania próbek. Drugim istotnym zagadnieniem jest kwestia metabolizowania leków, co sprawia iż w próbkach pobranych od pacjenta lek występuje 17

18 w formie metabolitów, a część przyjętej dawki jest w próbkach obecna w formie niezmienionej. W zależności od przyjętej przez pacjenta substancji, może ona zostać częściowo zmetabolizowana do jednej lub większej ilości substancji pochodnych, może zostać całkowicie metabolizowana bądź też może zostać wydalona przez organizm wyłącznie w postaci niezmienionej nie ulegając metabolizmowi. W przypadku oznaczanych leków, wszystkie ulegają metabolizmowi i są wydalane z moczem zarówno w postaci metabolitów jak i w formie niezmienionej. W przypadku próby zastosowania metod woltamperometrycznych do oznaczania leków w próbkach płynów ustrojowych, ze względu na niewielkie różnice w budowie cząsteczek metabolitów i leków, napotyka się na problem związany z interferencyjnym wpływem metabolitów na oznaczanie leków. znaczenie sumarycznej ilości metabolitów i leków w próbce nie jest wynikiem satysfakcjonującym, gdyż nie niesie informacji o stopniu metabolizowania leku, a co za tym idzie ewentualnych nieprawidłowości w ich przyswajaniu. W związku z tym obok leków przeprowadzono także badania podstawowe ich metabolitów. Parametry krzywych kalibracji poszczególnych metabolitów zestawiono w tabeli na końcu rozdziału. III.5.1. Badania podstawowe metabolitu ketoprofenu Badaniom poddano główny metabolit ketoprofenu, glukuronian ketoprofenu, ze względu na to, iż w jego postaci ketoprofen głównie usuwany jest z organizmu. Badania prowadzono na modyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego. Glukuronian ketoprofenu redukuje się, przy czym sygnał związany z redukcją metabolitu ma wartość potencjału identyczną jak w przypadku ketoprofenu. Dlatego też niemożliwe jest oznaczanie równocześnie ketoprofenu oraz jego metabolitu, a jedynie ich sumarycznej ilości, co ze względu na możliwość niepożądanego kumulowania się ketoprofenu w organizmie człowieka, również ma istotne znaczenie. Przykładowy woltamperogram cykliczny glukuronianu ketoprofenu przedstawiono na rysunku E E E-06 Ip [A] -8.00E E E E E E p [V] vs. Ag/AgCl/KCl (nas) Rysunek 10. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=8,7 oraz 1,74x10-4 M glukuronianu ketoprofenu zarejestrowany w buforze BR o ph=8,7 na MWCNT/GCE 18

19 Tak jak w przypadku podstawowej formy leku, reakcja redukcji glukuronianu ketoprofenu jest reakcją kontrolowaną szybkością dyfuzji, w której bierze udział taka sama ilość protonów jak i elektronów. E p [V] = -0,057 ph 0,720 I p [µa] = 0, ,014 ν ½ [mv s -1 ] III.5.2. Badania podstawowe metabolitów kwasu acetylosalicylowego Jako główny metabolit kwasu acetylosalicylowego badaniom poddano kwas salicylowy. Badania przeprowadzone metodą woltamperometrii cyklicznej na modyfikowanej elektrodzie z węgla szklistego wykazały, iż kwas salicylowy utlenia się, dając wyraźny sygnał przy potencjale około 1,2 V. Przy zmianie kierunku polaryzacji elektrody nie obserwowano sygnałów związanych z redukcją, stąd wniosek, iż proces utleniania kwasu salicylowego jest związany z reakcją nieodwracalną. W procesie utleniania bierze udział dwa razy więcej elektronów niż protonów, a proces ten kontrolowany jest szybkością dyfuzji, o czym świadczą poniższe zależności: E p [V] = 1,183 0,034 ph I p [μa] =0,829 (ν [mv s -1 ]) ½ + 1,231 Woltamperogram cykliczny kwasu salicylowego zarejestrowany w buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0 przedstawiono na rysunku E E-05 Ip [A] 1.00E E E E Rysunek 11. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=3,0 oraz 2,89x10-4 M kwasu salicylowego zarejestrowany na MWCNT/GCE w buforze BR o ph=3,0. Porównując woltamperogram cykliczny kwasu acetylosalicylowego oraz kwasu salicylowego można zauważyć, iż krzywe te są podobne. Ma to związek z reakcją hydrolizy jakiej ulega kwas acetylosalicylowy, przez co w roztworze wodnym występuje on w formie zhydrolizowanej jako kwas salicylowy, w związku z tym elektrochemiczna reakcja jest analogiczna. Istnieje jedynie możliwość oznaczenia sumarycznej ilości kwasu salicylowego i kwasu acetylosalicylowego, co nie przyniesie pożądanej informacji na temat przyswojonej przez organizm dawki czy ewentualnych nieprawidłowości w metabolizowaniu leku. Badaniom poddano zatem inny metabolit kwasu 19

20 I p [A] acetylosalicylowego, który w najwyższym stężeniu występuje w moczu pacjenta kwas gentyzynowy. Badania podstawowe kwasu gentyzynowego przeprowadzono techniką woltamperometrii cyklicznej na modyfikowanej wielościennymi nanorurkami węglowymi elektrodzie z węgla szklistego. Woltamperogramy rejestrowano w buforze Brittona-Robinsona o różnych wartościach ph. Przykładowy woltamperogram cykliczny kwasu gentyzynowego zaprezentowano na rysunku 12. Kwas gentyzynowy ulega reakcji utleniania, dając wyraźny sygnał przy potencjale około 0,55 V. Przy zmianie kierunku polaryzacji elektrody, po stronie redukcji obserwuje się dwa niewielkie sygnały przy potencjale odpowiednio 0,25 V i -0,25 V. Różnica w potencjałach pików świadczy jednak o tym, iż nie tworzą one wraz z sygnałem utleniania pary pików związanych z reakcją odwracalną. Biorąc pod uwagę symetrię oraz intensywność widocznych pików, do celów analitycznych wybrano sygnał związany z utlenianiem kwasu gentyzynowego. 5.00E E E E E E E E E Rysunek 12. Woltamperogram cykliczny buforu BR o ph=3,0 oraz 1,95x10-4 gentyzynowego zarejestrowany na MWCNT/GCE w buforze BR o ph=3,0. M kwasu W ramach badań wykazano, iż wraz ze wzrostem ph elektrolitu sygnał utleniania przesuwa się w kierunku potencjałów ujemnych. Zmiana elektrolitu wpływa także znacznie na symetrię obserwowanego sygnału. Do celów analitycznych zastosowano elektrolit o niskich wartościach ph. Ma to również uzasadnienie wynikające z warunków zastosowanych w przypadku oznaczania kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego, gdyż docelowo opracowana metoda ma służyć do oznaczania tych analitów równocześnie. Zależność potencjału od ph elektrolitu dla kwasu gentyzynowego można wyrazić równaniem: E p [V] = 0,653 0,059 ph W buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0 zarejestrowano woltamperogramy przy różnych wartościach szybkości zmian potencjału. Charakter wzrostu natężenia prądu przy wzroście szybkości polaryzacji elektrody ma charakter funkcji potęgowej, przy czym I p ~ ν ½. 20

21 I p [A] Potencjał utleniania kwasu gentyzynowego różni się znacznie od potencjału utleniania kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego, w związku z tym istnieje możliwość oznaczenia kwasu gentyzynowego w próbce zawierającej równocześnie także kwas salicylowy i kwas acetylosalicylowy. Dla poszczególnych metabolitów kwasu acetylosalicylowego zarejestrowano woltamperogramy DP, które posłużyły do wyznaczenia krzywych kalibracji. 2.50E E E E Rysunek 13. Woltamperogramy pulsowe różnicowe w buforze BR o ph=3,0 dla kwasu salicylowego na MWCNT/GCE w zakresie stężeń 2,18x10-5 8,72x10-5 M. 1.40E E E-06 Ip [A] 8.00E E E E E Rysunek 14. Woltamperogramy pulsowe różnicowe w buforze BR o ph=3,0 dla kwasu gentyzynowego na MWCNT/GCE zarejestrowane w zakresie stężeń 1,95x10-5 9,75x10-5 M. W opracowanych warunkach zarejestrowano woltamperogramy DP mieszaniny metabolitów kwasu acetylosalicylowego, które przedstawiono na rysunku

22 I p [A] 6.00E E-07 SA 4.00E E E-07 GA 1.00E E E p [V] vs. Ag/AgCl/KCl (nas.) Rysunek 15. Woltamperogramy pulsowe różnicowe zarejestrowane w buforze BR o ph=3,0 dla kwasu gentyzynowego (GA) i kwasu salicylowego (SA) na MWCNT/GCE. III.5.3. Badania podstawowe metabolitów paracetamolu [II] Przeprowadzono badania podstawowe głównych metabolitów paracetamolu: glukuronianu paracetamolu i siarczanu paracetamolu. Substancje te utleniają się na elektrodzie z węgla szklistego, przy czym reakcja utleniania glukuronianu paracetamolu przebiega w sposób nieodwracalny, dając w środowisku kwaśnym pik przy potencjale około 1,2 V. Podobny przebieg zależności natężenia prądu od przyłożonego napięcia wykazuje siarczan paracetamolu. Woltamperogramy cykliczne zaprezentowano na rysunku 16. 1,70E-06 1,20E-06 Ip [A] 7,00E-07 2,00E-07-3,00E-07-8,00E-07-0,5 0 0,5 1 1,5 Rysunek 16. Woltamperogramy cykliczne zarejestrowane w buforze BR o ph=3,0 dla 1,53x10-4 M glukuronianu paracetamolu (linia niebieska) oraz 1,52x10-4 M siarczanu paracetamolu (linia czerwona) na GCE. Wyznaczono zależność natężenia prądu od szybkości polaryzacji elektrody oraz zależność potencjału piku od ph elektrolitu podstawowego. Uzyskane zależności dla siarczanu paracetamolu można opisać za pomocą następujących równań: E p [V] = 1,3309 0,0301 ph I p [μa] = 0,0318 ν ½ [mv s -1 ] + 0,039 22

23 Najlepsze piki uzyskuje się stosując elektrolit podstawowy o niskich wartościach ph. trzymany przebieg zależności natężenia prądu od szybkości zmian potencjału jest charakterystyczny dla procesów kontrolowanych dyfuzją. Podobny charakter przebiegu wykazują zależności otrzymane dla glukuronianiu paracetamolu: E p [V] = 1,3455 0,0516 ph I p [μa] = 0,0325 ν ½ [mv s -1 ] + 0,050 Próby oznaczania metabolitów w mieszaninie nie powiodły się, ze względu na zbliżone wartości potencjału piku utleniania. Zastosowanie parametrów pomiarowych, takich jak wcześniej dla paracetamolu, pozwoliło na wyznaczenie krzywych kalibracji techniką DPV na podstawie pomiarów natężenia prądu dla kolejnych stężeń metabolitów paracetamolu. Woltamperogramy siarczanu paracetamolu zarejestrowane techniką DPV przedstawiono na rysunku 17. 2,30E-07 1,90E-07 Ip [A] 1,50E-07 1,10E-07 7,00E-08 3,00E ,4 0,8 1,2 1,6 Rysunek 17. Woltamperogram pulsowy różnicowy zarejestrowany dla siarczanu paracetamolu w buforze BR o ph=3,0 na GCE w zakresie stężeń 4,34x10-5 1,52x10-4 M. W podobny sposób wyznaczono krzywe kalibracji dla glukuronianu paracetamolu, a woltamperogramy zarejestrowane techniką DPV dla kolejnych stężeń analitu zaprezentowano na rysunku 18. 3,00E-07 2,50E-07 2,00E-07 Ip [A] 1,50E-07 1,00E-07 5,00E-08 0,00E ,4 0,8 1,2 1,6 Rysunek 18. Woltamperogram pulsowy różnicowy zarejestrowany dla glukuronianu paracetamolu w buforze BR o ph=3,0 na GCE w zakresie stężeń 3,06x10-5 1,53x10-4 M. 23

24 Różnica w położeniu pików utleniania paracetamolu i poszczególnych jego metabolitów wynosi około 0,4 V co świadczy o tym, iż możliwe jest oznaczenie paracetamolu w mieszaninie z metabolitami. Nabiera to szczególnego znaczenia przy oznaczaniu leku w próbkach rzeczywistych płynów ustrojowych. Poniżej zaprezentowano woltamperogram cykliczny zarejestrowany dla mieszaniny paracetamolu z poszczególnymi jego metabolitami. 1,40E-06 9,00E-07 Ip [A] 4,00E-07-1,00E-07-6,00E-07-0,6-0,1 0,4 0,9 1,4 Rysunek 19. Woltamperogramy cykliczne mieszaniny 1,65x10-5 M paracetamolu i 1,52x10-4 M siarczanu paracetamolu (linia czerwona) i mieszaniny 9,93x10-5 M paracetamolu i 1,53x10-4 M glukuronianu paracetamolu (linia niebieska) zarejestrowane na GCE. III.5.4. Badania podstawowe metabolitów propranololu [III] Badania 4 -hydroksypropranololu i siarczanu 4 -hydroksypropranololu prowadzono w całym zakresie ph buforu Brittona-Robinsona, rejestrując woltamperogramy cykliczne w zakresie potencjałów od -0,5 V do 1,5 V. W przypadku woltamperogramów obu metabolitów obserwowano dwa piki po stronie utleniania i jeden po stronie redukcji. Charakterystyczny sygnał utleniania położony przy potencjale około 0,150 V i pik redukcji przy potencjale około 0,095 V tworzą układ odwracalny, który obserwuje się zarówno na krzywej woltamperometrycznej 4 -hydroksypropranololu jak i siarczanu 4 -hydroksypropranololu. Zmieniając potencjał w kierunku wyższych wartości na krzywej woltamperometrycznej obserwuje się drugi pik, który zarówno dla jednego jak i drugiego metabolitu nie ma odpowiadającego mu sygnału po stronie redukcji, czyli jest związany z reakcją nieodwracalną. W przypadku 4 -hydroksypropranololu pik ten obserwuje się przy potencjale około 0,4 V, natomiast dla siarczanu 4 -hydroksypropranololu sygnał ten położony jest przy potencjale 1,0 V. Na rysunku 20 przedstawiono woltamperogramy cykliczne zarejestrowane w buforze Brittona- Robinsona o ph=3,0 dla badanych metabolitów propranololu. 24

25 1,60E-06 1,20E-06 8,00E-07 Ip [A] 4,00E-07 0,00E+00-4,00E-07-8,00E-07-1,20E-06-0,6-0,1 0,4 0,9 1,4 Rysunek 20. Woltamperogramy cykliczne 4,81x10-5 M 4 -hydroksypropranololu (linia niebieska) i 4,22x10-5 M siarczanu 4 -hydroksypropranololu (linia czerwona) w buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0 (linia zielona) zarejestrowane na GCE. Techniką woltamperometrii cyklicznej wyznaczono zależności potencjału piku od ph elektrolitu oraz natężenia prądu od szybkości zmian potencjału dla obu metabolitów. Dla 4 -hydroksypropranololu zależności te można opisać za pomocą następujących równań: E p [V] = 0,541 0,053 ph I p [μa] = 0,035 (ν [mv s -1 ]) ½ + 0,011 Dla siarczanu 4 -hydroksypropranololu badane zależności mają postać: E p [V] = 1,292 0,056 ph I p [μa] = 0,062 (ν [mv s -1 ]) ½ + 0,080 Wyznaczone zależności wskazują na fakt, iż utlenianie obu badanych metabolitów propranololu jest związane z wymianą takiej samej ilości protonów jak i elektronów, na co wskazuje współczynnik kierunkowy zależności potencjału od ph elektrolitu. trzymane zależności natężenia prądu od szybkości polaryzacji elektrody wskazują na to, iż proces utleniania metabolitów propranololu jest kontrolowany dyfuzją. W elektrolicie o ph=3,0, który zastosowano w przypadku oznaczania propranololu, piki utleniania jego metabolitów są wyraźne i symetryczne. Na poniższych rysunkach przedstawiono woltamperogramy metabolitów propranololu, na podstawie których wyznaczono zależność pomiędzy wartością natężenia prądu a stężeniem. 25

26 6,00E-07 5,00E-07 Ip [A] 4,00E-07 3,00E-07 2,00E-07 1,00E-07-0,3-0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 Rysunek 21. Woltamperogramy pulsowe różnicowe zarejestrowane w buforze BR o ph=3,0 dla 4 - hydroksypropranololu na GCE w zakresie stężeń 4,00x10-6 4,81x10-5 M. 8,00E-07 6,00E-07 Ip [A] 4,00E-07 2,00E-07 0,00E+00-0,3 0 0,3 0,6 0,9 1,2 Rysunek 22. Woltamperogramy pulsowe różnicowe zarejestrowane w buforze BR o ph=3,0 dla siarczanu 4 -hydroksypropranololu na GCE w zakresie stężeń 3,52x10-6 4,22x10-5 M. 8,00E-07 7,00E-07 6,00E-07 Ip [A] 5,00E-07 4,00E-07 4 H PH 4 H PS PR 3,00E-07 2,00E-07 1,00E-07 0,00E+00-0,3-0,1 0,1 0,3 0,5 0,7 0,9 1,1 1,3 1,5 Rysunek 23. Woltamperogram pulsowy różnicowy mieszaniny propranololu, 4 -hydroksypropranololu i siarczanu 4 -hydroksypropranololu w buforze BR o ph=3,0 zarejestrowany na GCE. 26

27 Różnica potencjałów pików, na podstawie których wyznaczono krzywe kalibracyjne, w przypadku metabolitów propranololu wynosi około 0,6 V, co świadczy o tym iż możliwe jest ich oznaczenie obok siebie bez wystąpienia interferencji. Na rysunku 23 przedstawiono woltamperogram mieszaniny propranololu, 4 -hydroksypropranololu i siarczanu 4 -hydroksypropranololu. Zaprezentowany woltamperogram pokazuje, iż w przypadku występowania w próbce zarówno propranololu jak i siarczanu 4 -hydroksypropranololu, pomiar natężenia prądu odpowiednich pików może być obarczony błędem wynikającym z małej różnicy potencjałów pików. W związku z tym otrzymane wyniki zaprezentowano w postaci drugiej pochodnej natężenia prądu po potencjale. Takie przedstawienie wyników pozwala na dogodne rozdzielenie sygnałów i ich pomiar. W tabeli 3 zaprezentowano parametry krzywych kalibracji wszystkich badanych metabolitów. Tabela 3. Parametry krzywych kalibracji oraz LD i LQ wyznaczone dla badanych metabolitów leków Współczynnik Wyraz Zakres Współczynnik LD LQ Metabolit kierunkowy wolny liniowości korelacji [µm] [μm] [μa/μm] [μa] [μm] KET-G 0,0411 1,878 0, ,23 174,26 6,18 18,59 SA 0,0023 0,052 0, ,86 289,60 2,40 7,25 GA 0,0047 0,066 0,9953 9,73 194,6 2,16 6,49 PG 0,0014 0,04 0, ,30 153,0 3,27 10,86 PS 0,0008 0,03 0, ,70 152,0 3,90 13,03 4 H PS 0,0050 0,21 0,9937 3,52 42,2 1,10 3,31 4 H PH 0,0031 0,05 0,9944 4,00 48,1 1,29 3,90 KET-G glukuronian ketoprofenu, SA kwas salicylowy, GA kwas gentyzynowy, PG glukuronian paracetamolu, PS siarczan paracetamolu, 4 H PS siarczan 4 -hydroksypropranololu, 4 H PH hydroksypropranolol III.6. ZNACZANIE LEKÓW I METABLITÓW W PRÓBKACH MCZU znaczanie leków i metabolitów w próbkach moczu wymagało wcześniejszego etapu przygotowania próbek metodą SPE. Badania prowadzono zarówno w próbkach moczu z dodatkiem wzorców jak i w próbkach moczu pobranego od pacjentów leczonych danymi lekami. Przykładowy woltamperogram próbki moczu po ekstrakcji typu SPE, pobranej od osoby zdrowej, nie przyjmującej leków, przedstawiono na rysunku

28 Ip [A] 7.00E E E E E E E E E E E E [V] vs. Ag/AgCl.KCl (nas.) Rysunek 24. Woltamperogram pulsowy różnicowy zarejestrowany dla ekstraktu próbki moczu pobranej od osoby nie leczonej farmakologicznie. znaczanie ketoprofenu oraz paracetamolu i metabolitów prowadzono w moczu z dodatkiem wzorców, natomiast oznaczenie propranololu i metabolitów oraz kwasu acetylosalicylowego i metabolitów prowadzono w próbkach moczu pobranych od osób leczonych tymi lekami. W poniższych tabelach zaprezentowano otrzymane wyniki. Tabela 4. znaczanie ketoprofenu w próbkach moczu z dodatkiem wzorców Wprowadzono znaczono C.V. S Próbka S.D. [M] x [M] [M] [%] [M] dzysk [%] 1 1,97x10-4 1,86x10-4 3,01x10-6 1,61 1,23x ,41 2 2,98x10-4 2,82x10-4 3,21x10-6 1,14 1,31x ,63 3 3,94x10-4 3,71x10-4 3,89x10-6 1,05 1,59x ,16 S.D.-odchylenie standardowe, C.V.-współczynnik zmienności, S x -średnie odchylenie standardowe, W próbkach moczu oznaczano sumaryczną ilość kwasu acetylosalicylowego i kwasu salicylowego w przeliczeniu na kwas salicylowy (SA). W próbkach tych oznaczano także kwas gentyzynowy (GA), wyniki zamieszczono w tabeli 5. Przykładowy woltamperogram zarejestrowany w próbce moczu przedstawiono na rysunku 25. Badania prowadzono w próbkach moczu pobranych od pacjentów, którzy przyjęli dawkę 300 mg leku. 28

29 I [A] Tabela 5. znaczanie kwasu acetylosalicylowego i kwasu gentyzynowego w próbkach moczu Czas od podania leku do znaczono znaczono S.D. poboru próbki moczu SA [M] SA [M] GA [M] S.D. GA [M] Próbka 1 2 h 2,13x10-6 1,53x10-7 2,56x10-6 1,17x h 2,72x10-6 1,61x10-7 2,31x10-6 1,24x10-7 Próbka 2 2 h 2,56x10-6 1,34x10-7 2,62x10-6 1,31x h 2,85x10-6 1,45x10-7 2,36x10-6 1,42x10-7 Próbka 3 2 h 3,52x10-6 1,66x10-7 2,98x10-6 1,23x h 3,41x10-6 1,42x10-7 2,79x10-6 1,30x E E-06 ASA+SA 1.10E E-07 GA 7.00E E Rysunek 25. Woltamperogramy pulsowe różnicowe próbki moczu zawierającej kwas acetylosalicylowy (ASA) i jego metabolity (po ekstrakcji typu SPE) zarejestrowane na MWCNT/GCE w buforze Brittona-Robinsona o ph=3,0. znaczanie propranololu i jego metabolitów prowadzono w próbkach pobranych od pacjentów leczonych propranololem. Pacjentów leczono podając im 40 mg propranololu na dobę. Mocz pobierano w różnych odstępach czasu po podaniu leku. Próbki przygotowano metodą ekstrakcji do fazy stałej. Przebadane próbki moczu zawierały jedynie propranolol oraz siarczan 4 - hydroksypropranololu. Wynika to z faktu, iż 4 -hydroksypropranolol jest aktywnym metabolitem propranololu, który wykazuje również właściwości β-adrenolityczne i obecny jest jedynie we krwi, gdzie ulega dalszemu metabolizmowi. 29

30 I [A] Tabela 6. znaczanie propranololu i siarczanu 4 -hydroksypropranololu w próbkach moczu Czas od podania leku do znaczono znaczono S.D. poboru próbki moczu PR [M] PR [M] 4 H PS [M] S.D. 4 H PS [M] Próbka 1 2 h 3,34x10-6 1,31x10-7 5,76x10-6 1,33x h 2,52x10-6 1,17x10-7 4,37x10-6 1,27x h - - 2,20x10-6 1,26x10-7 Próbka 2 2 h 3,16x10-6 1,21x10-7 5,52x10-6 1,24x h 2,15x10-6 1,27x10-7 4,16x10-6 1,29x h - - 2,04x10-6 1,34x10-7 Próbka 3 2 h 4,52x10-6 1,15x10-7 4,73x10-6 1,01x h 3,11x10-6 1,20x10-7 3,89x10-6 1,11x h - - 2,11x10-6 1,23x10-7 Na rysunku 26 przedstawiono woltamperogram próbki moczu pobranego od pacjenta leczonego propranololem. 7.00E-07 PR 6.00E-07 4 H PS 5.00E E E E E E [V] vs. Ag/AgCl/KCl(nas.) Rysunek 26. Woltamperogramy pulsowe różnicowe zarejestrowane na GCE w buforze BR o ph=3,0 dla próbki moczu pacjenta leczonego propranololem i kolejnych dodatków propranololu (PR) i siarczanu 4 -hydroksypropranololu (4 H PS) w zakresie stężeń odpowiednio 8,44x10-6 1,01x10-4 M i 3,52x10-6 4,22x10-5 M. Wyniki uzyskane dla próbek moczu pobranych od pacjentów leczonych propranololem zweryfikowano metodą ultrawysokosprawnej chromatografii cieczowej (Ultra-HPLC), według procedury opisanej w publikacji A RAPID UHPLC METHD FR THE SIMULTANEUS DETERMINATIN F SELECTED B-BLCKERS, NSAIDS, AND THEIR METABLITES IN HUMAN URINE AND WATER SAMPLES (I. Baranowska, A. Wilczek, J. Liq. Chromatogr. R.T., 33, 2010, 1776). Badania potwierdziły obecność w próbce moczu jedynie propranololu i siarczanu 4 - hydroksypropranololu. 30