Natalia Kordala, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek, Włodzimierz Bednarski

Transkrypt

1 Acta Sci. Pol., Biotechnologia 12 (3) 2013, ISSN X (print) ISSN (on-line) OCENA ZALEŻNOŚCI EFEKTÓW HYDROLIZY ENZYMATYCZNEJ POLISACHARYDÓW MISKANTA OLBRZYMIEGO I SŁOMY RZEPAKOWEJ OD WARUNKÓW ICH WSTĘPNEJ OBRÓBKI AMONIAKIEM 1 Natalia Kordala, Małgorzata Lewandowska, Magdalena Świątek, Włodzimierz Bednarski Uniwersytet Warmińsko-Mazurski w Olsztynie Streszczenie. Przedmiotem badań było określenie wpływu obróbki wstępnej miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej za pomocą 15-procentowego roztworu amoniaku na proces hydrolizy zawartych w nich polisacharydów. Efektywność jej działania oceniono na podstawie stężenia cukrów redukujących uwolnionych podczas hydrolizy enzymatycznej oraz jej wydajności obliczonej w odniesieniu do sumy polisacharydów dostępnych w materiałach. Przeprowadzenie obróbki wstępnej w warunkach 80ºC/6 godz. skutkowało wzrostem stężenia uwalnianych cukrów o 50% (miskant) i 18% (słoma rzepakowa) w odniesieniu do hydrolizy materiałów po obróbce w warunkach 20 C/24 godz., w tym samym czasie hydrolizy. Niezależnie od wariantu obróbki wyższy stopień delignifikacji odnotowano w miskancie niż w słomie rzepakowej. Słowa kluczowe: obróbka wstępna, amoniak, lignoceluloza, słoma rzepakowa, miskant olbrzymi WSTĘP Postępujące wyczerpywanie się nieodnawialnych zasobów surowców paliwowych oraz konieczność ochrony środowiska naturalnego skłaniają do upatrywania alternatywnych źródeł energii, między innymi w biomasie roślinnej [Prendecka i in. 2005]. Rocznie powstaje jej na Ziemi 200 mld ton, z czego 90% stanowią odpady lignocelulozowe. Jest to Praca naukowa finansowana ze środków na naukę w latach jako projekt badawczy. Copyright by Uniwersytet Przyrodniczy we Wrocławiu Adres do korespondencji Corresponding author: Natalia Kordala, Katedra Biotechnologii Żywności, Uniwersytet Warmińsko-Mazurski, ul. Heweliusza 1, Olsztyn, natalia.kordala@uwm.edu.pl

2 20 N. Kordala i in. w pewnym sensie, niedoceniana dotąd, strategiczna rezerwa energetyczna, eliminująca ryzyko niepewności dostaw paliw importowanych oraz niepodlegająca fluktuacjom cen na rynkach światowych [Piotrowski, Wiltowski 2004]. Ważnym kierunkiem biotechnologicznego wykorzystywania materiałów lignocelulozowych jest ich przerób na paliwa płynne, głównie na etanol. Produkcja etanolu z biomasy lignocelulozowej obejmuje cztery główne etapy: obróbkę wstępną, hydrolizę celulozy i hemicelulozy, fermentację oraz odzysk i oczyszczanie etanolu. Ze względu na cechy strukturalne kompleksu lignocelulozowego obróbka wstępna jest niezbędnym etapem przed hydrolizą generującą cukry proste, wykorzystywane następnie w procesie fermentacji. Skuteczna obróbka wstępna przynosi obniżenie krystaliczności i wzrost porowatości celulozy oraz usunięcie ligniny [Schacht 2008]. Jej efekty powinny usprawnić hydrolizę enzymatyczną, nie powodując strat polisacharydów ani powstawania produktów ubocznych, wpływających hamująco na proces fermentacji etanolowej [Keshwani, Cheng 2009]. Biorąc pod uwagę zróżnicowany skład chemiczny biomasy lignocelulozowej, trudno ustalić uniwersalny proces jej wstępnego przygotowania. Obecność ligniny i hemiceluloz ogranicza dostęp enzymów celulolitycznych do celulozy, zmniejszając skuteczność ich działania. Lignina, jako bariera fizyczna, utrudnia hydrolizę celulozy przez wiązanie enzymów celulolitycznych, wywołując ich inaktywację. Obróbka wstępna ma kluczowe znaczenie w zapewnieniu dobrej wydajności uwalniania cukrów prostych z polisacharydów zawartych w surowcu. Stopień hydrolizy polisacharydów z pominięciem etapu jego wstępnego przygotowania osiąga wartość niższą niż 20%, natomiast zastosowanie obróbki wstępnej zwiększa ją do 90% i wyższej [Balat 2011]. Znane są różne metody obróbki wstępnej materiałów lignocelulozowych. Ze względu na rodzaj zastosowanych czynników można je podzielić na: biologiczne, fizyczne, chemiczne i fizykochemiczne. Do chemicznych metod obróbki wstępnej zaliczają się m.in. sposoby wykorzystujące katalizatory alkaliczne, takie jak tlenek wapnia, wodorotlenek wapnia, amoniak czy też wodorotlenek sodu. Większość z tych związków oddziałuje na acetylowe grupy hemiceluloz i estrowe wiązania pomiędzy ligniną a pozostałymi polimerami. Skutkuje to częściowym upłynnieniem kompleksu i usunięciem znacznej części ligniny [da Costa Sousa i in. 2009, Li, Kim 2011]. Konsekwencją tych zmian jest zwiększenie dostępności celulozy dla enzymów hydrolitycznych. Do głównych zalet metod opierających się na zastosowaniu alkaliów należą: możliwość przeprowadzenia procesu w temperaturze pokojowej, mniejsza degradacja sacharydów w porównaniu ze sposobami wykorzystującymi kwas siarkowy, a także brak powstawania furfuralu i hydroksymetylofurfuralu (HMF). Omawiane metody są przydatne głównie do obróbki pozostałości rolniczych (np. słomy) [Alvira i in. 2010]. Zastosowanie amoniaku na etapie wstępnego przygotowania materiałów lignocelulozowych skutkuje puchnięciem biomasy i wzrostem jej porowatości, obniżeniem stopnia polimeryzacji i krystaliczności celulozy oraz skuteczną delignifikacją [Gupta i in. 2009, Kim i in. 2008]. Spośród różnych sposobów wykorzystujących roztwory amoniaku można wyróżnić recyrkulacyjną perkolację w roztworze amoniaku ARP (z ang. ammonia recycled percolation), SAA (z ang. soaking in aqueous ammonia), czyli moczenie w wodnych roztworach amoniaku, oraz AFEX (z ang. ammonia fibre explosion). Proces ARP polega na wielokrotnym przemywaniu biomasy lignocelulozowej umieszczonej w reak- Acta Sci. Pol.

3 Ocena zależności efektów hydrolizy torze kolumnowym roztworem amoniaku o stężeniu 5 15% (w/w) pod zwiększonym ciśnieniem i w podwyższonej temperaturze ( ºC). W tych warunkach wodny roztwór amoniaku reaguje przede wszystkim z ligniną, powodując jej depolimeryzację i rozpad wiązań pomiędzy polisacharydami kompleksu [Binod i in. 2010, da Costa Sousa i in. 2009]. W metodzie SAA stopień delignifikacji i wydajność hydrolizy enzymatycznej kolejnego etapu zależne są od zastosowanych parametrów, tj. temperatury i czasu procesu oraz stężenia amoniaku. Zastosowanie metody SAA umożliwia przeprowadzenie procesu w niskiej temperaturze, co sprzyja zachowaniu hemicelulozy we frakcji stałej oraz wpływa na zwiększenie wydajności fermentacji i uproszczenie systemu biokonwersji [Kim i in. 2008]. Natomiast procedura AFEX polega na traktowaniu biomasy amoniakiem pod dużym ciśnieniem (1,12 1,36 MPa). W procesie stosuje się dodatek tego związku w stężeniach: od 0,6 2 g g -1 s.s. materiału poddawanego obróbce cieplnej w zakresie temperatury: od pokojowej (w czasie dni) do 120ºC (kilka minut). Obniżenie ciśnienia i rozprężenie amoniaku skutkują rozerwaniem wiązań między ligniną a polisacharydami kompleksu oraz częściową dekrystalizacją celulozy. W warunkach metody AFEX pentozany nie ulegają depolimeryzacji, dlatego w kolejnym etapie konieczne jest stosowanie zarówno celulaz, jak i hemicelulaz. Jednakże biomasa po tego typu obróbce może być poddana hydrolizie enzymatycznej z pominięciem detoksykacji [Alvira i in. 2010, da Costa Sousa i in. 2009, Sánchez, Cardona 2008]. W niniejszym opracowaniu przedstawiono wyniki badań zmierzających do oceny skuteczności metody delignifikacji opartej na obróbce amoniakiem we wstępnym traktowaniu miskanta olbrzymiego (Miscanthus giganteus) i słomy rzepakowej (Brassica napus L. var. napus). Głównym celem badań było zwiększenie podatności polisacharydów (celulozy i hemicelulozy) na proces hydrolizy enzymatycznej, której efekty oceniano na podstawie stężenia wydzielonych cukrów, możliwych do wykorzystania przez drożdże w procesie fermentacji alkoholowej. Ponadto, w surowcu natywnym oraz wstępnie traktowanym z udziałem amoniaku określono udział głównych frakcji lignocelulozy, w celu wykazania strat polisacharydów oraz stopnia usunięcia ligniny w wyniku tego zabiegu. MATERIAŁ I METODY W badaniach wykorzystywano dwa surowce lignocelulozowe: miskanta olbrzymiego (Miscanthus giganteus) oraz słomę rzepakową (Brassica napus L. var. napus) w postaci wysuszonej. Surowce poddano mieleniu (młyn tnący Retsch SM100), do poziomu rozdrobnienia 1 2 mm. W surowcach określono zawartość poszczególnych frakcji włókna, stosując urządzenie Fibertec TM 1020 (FOSS): neutralno-detergentowego (NDF) według Van Soesta [Van Soest i in. 1991], kwaśno-detergentowego (ADF) oraz ligniny kwaśnodetergentowej (ADL) [PN-EN ISO 13906]. Zawartość celulozy wyznaczono z różnicy pomiędzy udziałem frakcji ADF i ADL, natomiast hemicelulozy z różnicy pomiędzy udziałem frakcji NDF i ADF. W celu przeprowadzenia obróbki wstępnej surowców odważono 10 g s.m. miskanta lub słomy rzepakowej, po czym łączono z 90 ml 15% roztworu amoniaku. Zastosowano dwa warianty procesu: I 20ºC/24 godz. lub II 80ºC/6 godz. Po wyznaczonym czasie próbki frakcjonowano metodą wirowania (RCF 4240/10 min/5ºc). Supernatant odrzucano, a osad uzupełniono wodą i ponownie wirowano. Czynności te powtarzano do Biotechnologia 12 (3) 2013

4 22 N. Kordala i in. momentu uzyskania odczynu obojętnego we frakcji płynnej. Frakcję stałą przenoszono następnie do kolb stożkowych o pojemności 300 ml, korygowano kwasowość środowiska do ph 5,0 (za pomocą 99% kwasu octowego), uzupełniono wodą destylowaną do 100 g i poddano hydrolizie enzymatycznej. Proces hydrolizy polisacharydów prowadzono metodą wstrząsaną (inkubator Innova 40, New Brunswick Scientific), przy obrotach 250 obr min -1 ; w temperaturze 40ºC z użyciem trzech preparatów enzymatycznych: celulazy z Trichoderma longibrachiatum (SIGMA), ksylanazy z T. longibrachiatum (SIGMA), celobiozy (Novozyme 188) w dawkach odpowiednio: 15 EGU 1, 15 U 2 oraz 30 CBU 3 g -1 s.s. materiału. Podczas hydrolizy zastosowano dodatek azydku sodu (0,1%) celem wyeliminowania potencjalnych zakażeń mikrobiologicznych. W czasie reakcji okresowo pobierano próbki do analizy, aby określić stężenia uwolnionych cukrów redukujących, przy użyciu metody z kwasem 3,5-dinitrosalicylowym [Miller 1959]. Wydajność hydrolizy obliczono w odniesieniu do ilości polisacharydów (celulozy i hemicelulozy) w biomasie surowców wstępnie traktowanych amoniakiem. Porównawczo przeprowadzono hydrolizę składników substratu natywnego (próba kontrolna). WYNIKI I DYSKUSJA Prowadzenie obróbki wstępnej surowców lignocelulozowych z wykorzystaniem metody delignifikacji opartej na obróbce amoniakiem ma na celu zachowanie hemiceluloz (głównie ksylanu) we frakcji stałej, które po hydrolizie enzymatycznej mogą być wykorzystane dzięki ko-fermentacji pentoz i heksoz, zwiększając wydajność etanolu [Kim i in. 2008]. Ten rodzaj wstępnego traktowania eliminuje powstawanie rozpuszczalnej frakcji cukrów, które przy wysokich temperaturach obróbki wstępnej mogą być substratem do powstawania związków będących inhibitorami fermentacji (m.in. furfuralu, HMF). Tabela 1. Skład chemiczny badanych surowców Table 1. Chemical composition of the tested native substrates Substrat Substrate Miskant olbrzymi Miscanthus giganteus Słoma rzepakowa Rape straw Celuloza Celullose Hemiceluloza Hemicelullose Lignina Lignin Suma polisacharydów Total polysaccharides 45,3 27,1 9,8 72,4 49,2 12,2 14,9 61,4 Analiza frakcji włókna substratów lignocelulozowych stosowanych w eksperymencie wykazała różnice dotyczące zawartości poszczególnych polisacharydów oraz ligniny (tab. 1). Biomasa miskanta zawierała ok. 45% celulozy w odniesieniu do suchej masy 1 1 EGU ilość enzymu uwalniająca 1 μmol glukozy z celulozy w czasie 1 godz. (ph 5,0, temperatura 37 C, czas inkubacji 2 godz.) 2 1 U ilość enzymu uwalniająca 1 μmol ksylozy z ksylanu w czasie 1 min (ph 4,5, temperatura 30 C) 3 1 CBU ilość enzymu przekształcająca 1 μmol celobiozy do 2 μmoli glukozy w czasie 1 min (ph 4,8, temperatura 50 C) Acta Sci. Pol.

5 Ocena zależności efektów hydrolizy surowca, podczas gdy zawartość tego polimeru w biomasie słomy rzepakowej wynosiła 49% s.s. Zawartość procentowa hemiceluloz była ponad 2-krotnie wyższa w biomasie miskanta niż w słomie rzepakowej. Dodatkowo, miskant charakteryzował się niższą o ponad 50% zawartością ligniny w porównaniu ze słomą, co powinno sprzyjać jego podatności na hydrolizę. Tabela 2. Skład chemiczny oraz straty suchej masy surowców po obróbce amoniakiem Table 2. Chemical composition and dry matter losses of the substrates after pretreatment with ammonia Substrat Substrate Miskant olbrzymi Miscanthus giganteus Słoma rzepakowa Rape straw Parametry obróbki wstępnej Pretreatment parameters Celuloza Celullose Hemiceluloza Hemicelullose Lignina Lignin Suma polisacharydów Total polysaccharides Straty s.s. po obróbce Dry matter losses after pretreatment [%] 20 C/24 h 65,3 19,3 4,9 84,6 27,6 80 C/6 h 59,6 20,5 8,3 80,1 38,3 20 C/24 h 52,0 15,9 17,3 67,9 25,2 80 C/6 h 53,0 16,7 14,7 69,7 30,9 W wyniku obróbki wstępnej, z udziałem amoniaku, w badanych surowcach nastąpiły straty masy w zakresie 25 38%. Były one większe w surowcach traktowanych wyższą temperaturą (80 C) niż inkubowanych w temperaturze pokojowej i wyniosły 39 i 23%, odpowiednio dla miskanta i słomy rzepakowej. Mogło to być spowodowane większym stopniem degradacji składników na skutek działania podwyższonej temperatury. Udział poszczególnych komponentów w masie próby uległ zmianie w różnym stopniu i był uzależniony od wariantu obróbki (tab. 2). W miskancie traktowanym w warunkach wariantu I (20 C/24 godz.) udział procentowy ligniny uległ ponad 2-krotnemu obniżeniu w porównaniu z surowcem natywnym. Biorąc pod uwagę straty masy, odnotowano stopień delignifikacji na poziomie 63,9% (rys. 1). Słoma rzepakowa po obróbce w omawianych warunkach charakteryzowała się wyższym udziałem ligniny (17,3%) w porównaniu z surowcem natywnym, natomiast obliczony stopień jej usunięcia względem masy wyjściowej wyniósł 13,4%. W II wariancie obróbki (80 C/6 godz.) udział ligniny w biomasie miskanta uległ obniżeniu do 8,3%, a ubytek wagowy tej frakcji nie przekroczył 50%. W tych warunkach słoma uległa delignifikacji w stopniu około 2,5-krotnie wyższym w porównaniu z wariantem I (32,0% wobec 13,4%). Można zatem stwierdzić, że obróbka z udziałem amoniaku w 20 C/24 godz. pozwoliła na uzyskanie korzystniejszych efektów delignifikacji miskanta niż traktowanie omawianego materiału podwyższoną temperaturą w krótszym czasie, natomiast w odniesieniu do słomy rzepakowej odnotowano odwrotną zależność. Różnice w stopniu delignifikacji badanych surowców mogły być związane z ich różną strukturą oraz składem chemicznym, a przez to podatnością na działanie zastosowanych czynników fizykochemicznych. Biotechnologia 12 (3) 2013

6 24 N. Kordala i in Strata składnika [%] The loss of the component Słoma rzepakowa Rape straw Miskant olbrzymi Miscanthus giganteus celuloza cellulose Warianty obróbki wstępnej The variants of the pretreatment hemiceluloza hemicellulose lignina lignin Rys. 1. Straty głównych frakcji lignocelulozy w biomasie miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej po obróbce wstępnej amoniakiem (I 20 C/24 godz.; II 80 C/6 godz.) Fig. 1. The losses of the main lignocellulose fractions in biomass of Miscanthus giganteus and rape straw pretreated with ammonia (I 20 C/24 h; II 80 C/6 h) Wstępne traktowanie substratów amoniakiem przyczyniło się również do zmian w udziale frakcji polisacharydów celulozy i hemicelulozy. W słomie rzepakowej zaobserwowano straty celulozy w wysokości 21,0 i 25,6% (rys. 1), odpowiednio dla I i II wariantu obróbki, natomiast jej udział nieznacznie się zwiększył w porównaniu z surowcem natywnym (tab. 1, 2). W miskancie odnotowano ubytek celulozy jedynie po obróbce w warunkach wariantu II (18,9%), zaś jej bezwzględna zawartość w materiale zwiększyła się o 44% (wariant I) i 32% (wariant II). Różnice te mogły być wynikiem odmiennej struktury oraz stopnia krystaliczności frakcji celulozowej badanych surowców. Największe różnice w składzie substratów wynikające z obróbki odnotowano jednak w zakresie udziału hemiceluloz. W miskancie wyniosły one 48,5 i 53,5%, odpowiednio dla wariantu I i II, co skutkowało obniżeniem udziału hemicelulozy do około 20%. W słomie straty omawianej frakcji były niewielkie i wyniosły 2,5% (wariant I) i 5,3% (wariant II), a jej udział uległ zwiększeniu odpowiednio do 15,9 i 16,7%. Zróżnicowane straty frakcji hemicelulozowej obu badanych substratów mogły być skutkiem różnic w ilości i strukturze tej frakcji, a także podatności na depolimeryzację w następstwie obróbki wstępnej. Po przeprowadzeniu 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej substratów natywnych (próba kontrolna) uzyskano stężenie uwolnionych cukrów redukujących w medium poreakcyjnym na poziomie 21,46 i 16,39 g dm -3 hydrolizatu, odpowiednio dla miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej (rys. 2, 3). Uzyskane wartości stanowiły odpowiednio 26,7 i 24,0% teoretycznej wydajności (obliczonej w odniesieniu do polisacharydów zawartych w surowcach natywnych, tab. 1). Hydroliza enzymatyczna substratów poddanych obróbce amoniakiem w warunkach wariantu I pozwoliła uzyskać około 1,4-krotnie wyższą zawartość cukrów redukujących po 72 godz. procesu niż hydroliza polisacharydów Acta Sci. Pol.

7 Ocena zależności efektów hydrolizy w substratach natywnych. Wydajność hydrolizy substratów traktowanych amoniakiem w odniesieniu do polisacharydów dostępnych podczas procesu była około 1,7-krotnie wyższa od wydajności w przypadku substratów natywnych (rys. 4). Proces przebiegał najefektywniej przez 24 godziny, po upływie których stężenie glukozy wyniosło 24,8 g dm -3 w hydrolizacie miskanta i 17,2 g dm -3 w hydrolizacie słomy. Wielkości te stanowiły około 82% (miskant) i 76% (słoma) wartości uzyskanej po 72 godzinach procesu (rys. 2, 3). Badania przeprowadzone z udziałem surowców lignocelulozowych wstępnie traktowanych w warunkach wariantu II wykazały, że zastosowanie wyższej temperatury obróbki pozwala na uzyskanie korzystniejszych rezultatów prowadzonej sekwencyjnie hydrolizy enzymatycznej polisacharydów (rys. 2, 3). Tempo wzrostu stężenia uwolnionych cukrów redukujących było najszybsze podczas 24 godz. procesu, po czym następowało jego zwolnienie. Po 72 godz. hydrolizy stężenie uwolnionych cukrów wyniosło 45,73 g dm -3 z miskanta oraz 26,82 g dm -3 ze słomy. Zastosowanie warunków wariantu II obróbki wstępnej pozwoliło na wzrost stężenia uwalnianych cukrów o 50% (miskant) i 18% (słoma), w odniesieniu do hydrolizy materiałów po obróbce w warunkach wariantu I w tym samym czasie hydrolizy, tj. 72 godzin. Ponadto, ilość cukrów redukujących uwolnionych po 72 godz. hydrolizy substratów wstępnie traktowanych w warunkach wariantu II była ponad 2-krotnie (miskant) i 1,6-krotnie (słoma) większa w porównaniu z ilością uzyskaną w przypadku substratów natywnych. st enie glukozy [g dm 3 ] Stężenie -3 ] glucose concentration [g dm 3 ] Glucose concentration C/24h h C/6h h czas [h] Czas [h] Time substrat natywny substrat natywny time [h] native substrate [native substrate] Rys. 2. Postęp hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta olbrzymiego natywnego (symbole puste) oraz po obróbce wstępnej amoniakiem (20 C/24 godz. lub 80 C/6 godz.) (symbole pełne) w trakcie 72 godz. doświadczenia, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie Fig. 2. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and ammonia pretreated Miscanthus giganteus polysaccharides (20 C/24 h or 80 C/6 h) (filled symbols) during 72-hour experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate Biotechnologia 12 (3) 2013

8 26 N. Kordala i in Stężenie glukozy [g dm -3 ] Glucose concentration Czas [h] Time 20 C/24 h 80 C/6 h substrat natywny native substrate Rys. 3. Postęp hydrolizy enzymatycznej polisacharydów słomy rzepakowej natywnej (symbole puste) oraz po obróbce wstępnej amoniakiem (20 C/24 godz. lub 80 C/6 godz.) (symbole pełne) w trakcie 72 godz. doświadczenia, wyrażony stężeniem cukrów redukujących w hydrolizacie Fig. 3. Enzymatic hydrolysis rate of untreated (empty symbols) and ammonia pretreated rape straw polysaccharides (20 C/24 h or 80 C/6 h) (filled symbols) during 72-hour experiment, expressed as reducing sugars concentration in hydrolysate ,4 70 Wydajność [%] Efficiency ,7 44,4 24,0 40,4 50, natywny native 20 C/24 h 80 C/6 h natywna 20 C/24 h 80 C/6 h native Miskant olbrzymi Miscanthus giganteus Słoma rzepakowa Rape straw Rys. 4. Porównanie wydajności 72-godzinnej hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej natywnych oraz po obróbce wstępnej amoniakiem (20 C/24 godz. lub 80 C/6 godz.) Fig. 4. The comparison of the efficiency of 72-hour enzymatic hydrolysis of polysaccharides of untreated and ammonia pretreated Miscanthus giganteus and rape straw (20 C/24 h or 80 C/6 h) Acta Sci. Pol.

9 Ocena zależności efektów hydrolizy Wydajność procesu hydrolizy polisacharydów z miskanta traktowanego w warunkach wariantu II (83,4%) była prawie 2-krotnie wyższa w porównaniu z substratem traktowanym amoniakiem w temperaturze pokojowej (wariant I) pomimo niższego stopnia delignifikacji, odpowiednio: 63,9 i 47,9% (wariant I i II). W wyniku 72-godzinnej hydrolizy polisacharydów ze słomy rzepakowej traktowanej amoniakiem uzyskano 1,7-krotnie (wariant I) oraz 2-krotnie (wariant II) wyższą wydajność procesu niż z udziałem substratu natywnego. Traktowanie słomy rzepakowej amoniakiem w wyższej temperaturze skutkowało wyższym stopniem delignifikacji (wariant I i II 13,4 i 32,0%), w przeciwieństwie do miskanta olbrzymiego (rys. 1). W rezultacie 72-godzinnej hydrolizy substratów wstępnie traktowanych amoniakiem w temperaturze 20 C osiągnięto zbliżoną wydajność procesu dla obu substratów, natomiast zastosowanie wyższej temperatury obróbki wstępnej skutkowało uzyskaniem prawie 2-krotnie wyższej wydajności hydrolizy miskanta niż słomy rzepakowej. Najkorzystniejsze rezultaty procesu hydrolizy składników miskanta olbrzymiego, traktowanego amoniakiem w warunkach wariantu II, świadczą o większym stopniu przemian w obrębie kompleksu lignocelulozowego oraz zwiększonej dostępności polisacharydów dla enzymów hydrolitycznych w wyniku obróbki w podwyższonej temperaturze. Ponadto, mogą być one spowodowane różnym składem obu substratów, a w szczególności niższą zawartością ligniny (której wysoka koncentracja obniża skuteczność hydrolizy w wyniku wiązania enzymów) oraz wyższej zawartości polisacharydów w miskancie w porównaniu ze słomą rzepakową. Kim i in. [2008] w przetwarzaniu plew jęczmiennych za optymalne warunki obróbki uznali: stężenie amoniaku 15% (w/w), temperaturę procesu 75 C, czas 48 godz., stosunek frakcji stałej do płynnej 1:12 (w/w). Zastosowanie wymienionych parametrów podczas wstępnego traktowania pozwoliło na zachowanie 67% ksylanu i usunięcie 61% ligniny oraz doprowadziło do hydrolizy w kolejnym etapie celulozy w 83% i ksylanu w 63%. W badaniach Ko i in. [2009] za najbardziej korzystne parametry obróbki wstępnej słomy ryżowej z wykorzystaniem metody SAA uznano: stężenie amoniaku 21% (w/w), temperaturę 69 C, czas 10 godz., stosunek frakcji stałej do płynnej 1:6 (w/w). W ustalonych warunkach uzyskano stopień delignifikacji równy około 60%, a wydajność hydrolizy enzymatycznej polisacharydów wyniosła 70% teoretycznej wydajności glukozy. Proces wstępnego traktowania biomasy pustych owocostanów palmy olejowej przez moczenie w roztworze amoniaku przeprowadzili Jung i in. [2011]. Po obróbce w warunkach: stężenie amoniaku 21% (w/w), temperatura 60 C, czas 12 godz., a następnie 96-godzinnej hydrolizie enzymatycznej uzyskano wydajność uwalniania glukozy na poziomie 19,5% oraz 41,4%, przy dawkach celulazy odpowiednio 15 oraz 60 FPU. W powyższych warunkach stwierdzono również zmniejszenie zawartości ligniny o 41,1% oraz zachowanie 78,3% glukanu we frakcji stałej. Zhu i in. [2006] wykazali, że wspieranie obróbki alkalicznej słomy pszennej promieniowaniem mikrofalowym skutkuje niższymi stratami cukrów oraz wyższym stopniem hydrolizy materiału. Ogrzewanie mikrofalowe, jako metodę pomocniczą dla obróbki wstępnej amoniakiem (28% w/w) wytłoczyn sorga w produkcji etanolu, wykorzystali również Chen i in. [2012]. Najlepsze wyniki, w odniesieniu do ilości uwolnionej glukozy (4,2 g/10 g s.s.) oraz wydajności etanolu (2,1 g/10 g s.s.) uzyskano po obróbce Biotechnologia 12 (3) 2013

10 28 N. Kordala i in. w warunkach 130 C przez 1 godz. We frakcji stałej pozostało około 90% celulozy i 73% hemicelulozy. Najkorzystniejszy stopień delignifikacji (46%) odnotowano w temperaturze 160 C. Stwierdzono ponadto, że stężenia furfuralu, kwasów organicznych i glicerolu były bardzo niskie, dzięki czemu nie wpływały hamująco na enzymy w czasie hydrolizy ani na aktywność drożdży podczas fermentacji etanolowej sacharydóaw pochodnych lignocelulozy prowadzonej w systemie sekwencyjnym [Chen i in. 2012]. PODSUMOWANIE Wyniki przeprowadzonych doświadczeń wskazują, że wstępne traktowanie miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej 15% roztworem amoniaku powoduje częściową delignifikację oraz podwyższenie procentowego udziału polisacharydów w surowcach i zwiększa ich podatność na hydrolizę enzymatyczną. Obróbka wstępna w temperaturze 80 C, w czasie 6 godz. pozwoliła na uzyskanie korzystniejszych rezultatów hydrolizy enzymatycznej polisacharydów obu surowców, w porównaniu z traktowaniem amoniakiem w temperaturze 20 C i w czasie 24 godz. Można zatem stwierdzić, że proces obróbki chemicznej w podwyższonej temperaturze skutkuje większym stopniem przemian w obrębie kompleksu lignocelulozowego, sprzyjając poprawie efektów hydrolizy enzymatycznej. PIŚMIENNICTWO Alvira P., Tomás-Pejó E., Ballesteros M., Negro M.J., Pretreatment technologies for an effi- Pretreatment technologies for an efficient bioethanol production process based on enzymatic hydrolysis: A review. Bioresour. Technol., 101, Balat M., Production of bioethanol from lignocellulosic materials via the biochemical pathway: A review. Ener. Conv. and Manag., 52, Binod P., Sindhu R., Singhania R.R., Vikram S., Devi L., Nagalakshmi S., Kurien N., Sukumaran R.K., Pandey A., Bioethanol production from rice straw: An overview. Bioresour. Technol., 101, Chen C., Boldor D., Aita G., Walker M., Ethanol production from sorghum by a microwaveassisted dilute ammonia pretreatment. Bioresour. Technol., 110, da Costa Sousa L., Chundawat S.P.S., Balan V., Dale B.E., Cradle-to-grave assessment of existing lignocellulose pretreatment technologies. Curr. Opin. Biotechnol., 20, Gupta R., Lee Y.Y., Pretreatment of hybrid poplar by aqueous ammonia. Biotechnol. Progr., 25, Jung Y.H., Kim I.J., Han J.-I., Choi I.-G., Kim K.H., Aqueous ammonia pretreatment of oil palm empty fruit bunches for ethanol production. Bioresour. Technol.,102, Keshwani D.R., Cheng J.J., Switchgrass for bioethanol and Rother value-added applications: A review. Bior. Tech., 100, Kim T.H., Taylor F., Hicks K.B., Bioethanol production from barley hull using SAA (soaking in aqueous ammonia) pretreatment. Bioresour. Technol., 99, Ko J.K., Bak J.S., Jung M.W., Lee H.J., Choi I.-G., Kim T.H., Kim K.H., Ethanol production from rice straw using optimized aqueous-ammonia soaking pretreatment and simultaneous saccharification and fermentation processes. Bioresour. Technol., 100, Li X., Kim T.H., Low-liquid pretreatment of corn stover with aqueous ammonia. Bioresour. Technol., 102, Acta Sci. Pol.

11 Ocena zależności efektów hydrolizy Miller G.L., Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem., 31 (3), Piotrowski K., Wiltowski T., Biomasa kłopotliwe pozostałości czy strategiczne rezerwy czystej energii? Czysta Energia, 12, Polska Norma PN_EN ISO Pasze. Oznaczanie zawartości włókna kwaśnodetergentowego (ADF) i ligniny kwaśnodetergentowej (ADL). Prendecka M., Rogalski J., Szczodrak J., Enzymatyczna hydroliza mannanów roślinnych. Biotechnol., 68, Sánchez Ó.J., Cardona C.A., Trends in biotechnological production of fuel ethanol from different feedstocks. Bioresour. Technol., 99, Schacht C., Zetzl C., Brunner G., From plant materials to ethanol by means of supercritical fluid technology. J. of Supercrit. Fluids, 46, Van Soest P.J., Robertson J.B., Lewis B.A., Methods for dietary fiber, neutral detergent fiber and nonstarch polysaccharides in relation to animal nutrition. J. of Dairy Sci., 74, Zhu S., Wu Y., Yu Z., Chen Q., Wu G., Yu F., Wang C., Jin S., Microwaveassisted alkali pretreatment of wheat straw and its enzymatic hydrolysis. Biosyst. Eng., 94, THE EVALUATION OF THE DEPENDENCE OF THE EFFECTS OF ENZYMATIC HYDROLYSIS OF MISCANTHUS GIGANTEUS AND RAPE STRAW POLYSACCHARIDES ON THE CONDITIONS OF AMMONIA PRETREATMENT Abstract. The object of the study was to determine the effect of the pretreatment of Miscanthus giganteus and straw rape with a 15% solution of ammonia on the availability of polysaccharides in substrates for hydrolysis. Its effectiveness was assessed on the basis of the concentration of reducing sugars released during enzymatic hydrolysis and its efficiency calculated in relation to the total polysaccharides available in materials. Carrying out the pretreatment under conditions of 80 C/6 h resulted in an increase in released sugars concentration by 50% (Miscanthus) and 18% (straw), with regard to the hydrolysis of the materials pretreated under conditions of 20 C/24 h, at the same hydrolysis time. Regardless of the pretreatment variant a higher degree of delignification was reported for Miscanthus than rape straw. Key words: pretreatment, ammonia, lignocellulose, rape straw, Miscanthus giganteus Zaakceptowano do druku Accepted for print: Do cytowania For citation: Kordala N., Lewandowska M., Świątek M., Bednarski W., Ocena zależności efektów hydrolizy enzymatycznej polisacharydów miskanta olbrzymiego i słomy rzepakowej od warunków ich wstępnej obróbki amoniakiem. Acta Sci. Pol. Biotechnol., 12 (3), Biotechnologia 12 (3) 2013