Własności fizyko-chemiczne w oddziaływaniach komórek z otoczeniem

Transkrypt

1 Własności fizyko-chemiczne w oddziaływaniach komórek z otoczeniem Małgorzata Lekka IFJ PAN

2 Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016) Tematyka badawcza Zakładu (realizowana do tej pory i dalej kontynuowana) Własności chemiczne powierzchni komórki w rozpoznawaniu zmian nowotworowych Oddziaływanie komórek z powierzchnią cienkich warstw polimerowych Oddziaływania receptorów integryn z macierzą zewnątrzkomórkową Oddziaływanie komórek z otaczającymi komórkami układy modelowe i tkanki Standaryzacja pomiarów AFM Ocena jakości powierzchni antybakteryjnych wykonanych na bazie miedzi (projekt NCBiR)

3 Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016) Charakterystyka własności fizyko-chemicznych pojedynczych komórek pozwoli na uzyskanie parametrów, które w sposób ilościowy opisywałyby zmiany zachodzące podczas progresji nowotworu.

4 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Własności chemiczne powierzchni komórki w rozpoznawaniu zmian nowotworowych Osoby realizujące: Justyna Bobrowska (z d.gostek) doktorantka (obrona planowana w 2016), stypendysta NCN Etiuda oraz OECD (Austria) M.Lekka - promotor, Joanna Pabijan (hodowle komórkowe). Projekt realizowany we współpracy z Zakładem Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ). Finansowanie: Projekt Preludium (IFJ PAN) , kierownik projektu mgr J.Bobrowska J.Gostek, J.Pabijan, K.Awsiuk, J.Rysz, A.Budkowski, M.Lekka Differentiation of human bladder cells using PCA analysis of ToF-SIMS mass spectra Analytical Chemistry 88(6) (2015) (IF = 5.825).

5 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Widma masowe Spektrometr masowy jonów wtórnych z analizatorem czasu przelotu ToF SIMS krzemowe podłoże komórka Trzy działa jonowe Bi + Bi 3 + C 60 + Wysoka próżnia ~ 10-8 mbar Transport w warunkach sterylnych ION TOF, Zakład Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ)

6 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Opracowanie metody preparatyki materiału komórkowego do pomiarów w próżni Utrwalanie Odsalanie Dehydratacja Suszenie Pomiar -> ToF SIMS Bobrowska et al. Ultramicroscopy w recenzji

7 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Opracowanie metody preparatyki materiału komórkowego do pomiarów w próżni Utrwalanie Odsalanie Dehydratacja Suszenie Pomiar -> ToF SIMS Bobrowska et al. Ultramicroscopy w recenzji

8 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Opracowanie metody preparatyki materiału komórkowego do pomiarów w próżni Utrwalanie we współpracy z Laboratorium Skaningowej Mikroskopii Elektronowej UJ (prof. Franciszek Krok) Odsalanie Dehydratacja Suszenie Pomiar -> ToF SIMS Bobrowska et al. Ultramicroscopy w recenzji

9 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Opracowanie protokołu analizy danych bez uprzedniej znajomości mas 2x10 4 x100 WM115 Intensity 1x10 4 2x10 4 1x10 4 2x10 4 1x x x100 WM Mass (u) Silicon praca doktorska J.Bobrowskiej

10 Własności chemiczne powierzchni komórek a zmiany nowotworowe Opracowanie protokołu analizy danych bez uprzedniej znajomości mas w oparciu o analizę składowych pierwotnych (PCA) Si podłoże krzemowe WM115 pierwotne ognisko czerniaka WM266-4 wtórne ognisko czerniaka PC3 (9.30%) PC2 (25.17%) praca doktorska J.Bobrowskiej

11 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi Własności chemiczne powierzchni komórek są silnie związane ze zmianami własności adhezyjnych komórek manifestujących się w odmiennych oddziaływaniach komórek z otoczeniem

12 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi Oddziaływanie komórek z powierzchnią cienkich warstw polimerowych Osoby realizujące: Szymon Prauzner-Bechcicki doktorat (2014), stypendysta NCN Etiuda oraz OECD (Austria) Joanna Pabijan (hodowle komórkowe). Projekt realizowany we współpracy z Zakładem Inżynierii Nowych Materiałów (IF UJ); Politechniką w Pradze (Czechy) oraz ACMIN (AGH). Magistrantki: Magda Woszczek, Ewelina Madej Finansowanie: Projekt Preludium (IFJ PAN) , kierownik projektu Sz.Prauzner-Bechcicki Projekt Sonata (IF UJ, IFJ PAN -> hodowle komórkowe); wykonawca Sz.Prauzner-Bechcicki Sz.Prauzner-Bechcicki, J.Raczkowska, E.Madej, J.Pabijan, J.Lukes, J.Sepitka, J.Rysz, K.Awsiuk, A.Bernasik, A.Budkowski, M.Lekka The effect of PDMS elastic properties on growth of melanoma and prostate cancer cells Journal of the Mechanical Behavior of Biomedical Materials (2015) (IF = 3.487).

13 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi Adhezja komórek do podłoża: Adhezja komórkowa to inaczej przyleganie, w którym uczestniczą różnorodne oddziaływania. Sackmann et al., ChemPhysChem (2002) Adhezja komórkowa do powierzchni o zadanych własnościach jest szczególnie ważna w urządzeniach typu lab-on-a-chip, które mogą być wykorzystywane do identyfikacji komórek zmienionych chorobowo. Adhezja komórkowa zależy od wielu czynników m.in. chropowatości powierzchni, hydrofobowości, elastyczności.

14 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi poli(dimetylosiloksan) (PDMS) możliwa zmiana elastyczności poprzez kontrolę czasu wygrzewania elastomeru lub stężenia czynnika sieciującego

15 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi poli(dimetylosiloksan) (PDMS) Własności otoczenia wpływają silnie na zachowanie i własności komórek WM115 WM266-4

16 Oddziaływanie komórek z powierzchniami polimerowymi poli(dimetylosiloksan) (PDMS) F max [nn] soft (0.75 MPa) PDMS WM266-4 WM115 stiff (2.92 MPa) Rate [h -1 ] MPa 2.92 MPa 0.75 MPa 2.92 MPa Fadh [nn] WM266-4 WM115

17 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Oddziaływanie komórek z otoczeniem jest także realizowane za pomocą pojedynczych kompleksów molekularnych charakteryzujących się wysokim stopniem selektywności

18 Receptory integrynowe na powierzchni komórki

19 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Oddziaływanie receptorów integrynowych z macierzą zewnątrzkomórkową Osoby realizujące (IFJ PAN): Joanna Danilkiewicz, Szymon Prauzner-Bechcicki, Justyna Bobrowska oraz - Katrin Mayr & Thu Kim Co (JKU Linz pomiary w IFJ PAN) - Katarzyna Herman (Politechnika Poznańska, PP) - Anna Sobiepanek (Politechnika Warszawska, PW) J.Pabijan (hodowle komórkowe, mikroskopia fluorescencyjna) M.Lekka (IFJ PAN) & L.A.Chtcheglova (JKU Linz) & A. Ptak (PP) & T. Kobiela (PW) Tematyka realizowana we współpracy z (i) Politechniką Poznańską, (ii) Instytutem Biofizyki JKU Linz, Austria, oraz (iii) Politechniką Warszawską Finansowanie: Projekt NCN OPUS 8 (IFJ PAN) , kierownik projektu M.Lekka J.Gostek, Sz. Prauzner-Bechcicki, B. Nimmervoll, K. Mayr, J. Pabijan, P. Hinterdorfer, L. A. Chtcheglova, M. Lekka Nano-characterization of two closely related melanoma cell lines with different metastatic potential European Biophysics Journal (2015) (IF = 2.747).

20 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Czerniak K.Mayr, praca magisterska

21 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Colognato et al. (2000). Developmental Dynamics

22 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Fragment lamininy zawierający sekwencję aminokwasów: YIGSR (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) Pentapeptide YIGSR (5AA) Nonapeptide - CDPGYIGSR (9AA) Pomiary wykonywane we współpracy z JKU Linz, Austria

23 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Pomiary wykonywane we współpracy z JKU Linz, Austria

24 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Model Bella-Evansa gdzie: F siła wiązania r prędkość obciążania (loading rate) k B - stała Boltzmanna T temperatura x β szerokość bariery potencjału k off stała szybkości dysocjacji: 1/ k off czas życia wiązania Evans & Ritchie et al. Biophys. J Pomiary wykonywane we współpracy z JKU Linz, Austria

25 Unbinding force [pn] Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe WM266-4 & YIGSR (9AA) WM266-4 & YIGSR (5AA) WM115 & YIGSR (9AA) WM115 & YIGSR (5AA) Loading rate [pn/s] Parametry kinetyczne k off (s -1 ) x β (Å) 5AA YIGSR WM ± ± 1.8 WM ± ± 1.3 9AA YIGSR WM ± ± 2.5 WM ± ± 2.1 Pomiary wykonywane we współpracy z JKU Linz, Austria x β szerokość bariery potencjału k off stała szybkości dysocjacji

26 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Receptory syndekanowe Uproszczenie -> białko liniowe, modularne To et al. (2011). Fibrogenesis & Tissue Repair

27 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe kontrola ścieżek sygnalizacyjnych w komórce Pierwsze wyniki (rozpoczęcie projektu wrzesień 2015) Fibronektyna HepII RGD RGD 500 HCV29 HT1376 k SD off? k INT off F unb [pn] Syndekan-1 Syndekan-4 integryny α5β1 & αvβ R L [pn/s] Każdy punkt to ok dobrych krzywych praca doktorska J.Danilkiewicz

28 Receptory integrynowe na powierzchni komórki Receptory integrynowe Zrekonstruowany potencjał oddziaływania Fibronektyna HepII RGD k SD off? k INT off Syndekan-1 Syndekan-4 integryny α5β1 & αvβ5 Rekonstrukcja potencjału oddziaływania będzie wymagała zastosowania większego zakresu szybkości zmiany siły w czasie powodującej dysocjację pojedynczego kompleksu (zadanie realizowane na PP).

29 Oddziaływanie typu komórka-komórka Oddziaływanie komórek z otoczeniem to nie tylko połączenia z macierzą zewnątrzkomórkową ale to także oddziaływanie z innymi różnego typu komórkami znajdującymi się w sąsiedztwie

30 Oddziaływanie typu komórka-komórka Oddziaływanie komórek z otaczającymi komórkami układy modelowe i tkanki Osoby realizujące: Barbara Orzechowska, Joanna Pabijan (hodowle komórkowe), Pomiar własności materiału tkankowego: Joanna Danilkiewicz, Justyna Bobrowska, Iuliana Moldoveanu (Uniwersytet w Bukareszcie), Jorge Ramos (Uniwersytet w Madrycie), M.Lekka Tematyka realizowana we współpracy (i) z Collegium Medicum UJ oraz (ii) z Uniwersytetem w Lozannie (Szwajcaria) Finansowanie: Projekt NCN Harmonia (IFJ PAN) , kierownik projektu M.Lekka Planowany projekt typu Preludium (B.Orzechowska 2016) Składany projekt typu OPUS (grudzień 2015, umowa konsorcyjna z IF UJ) J.R. Ramos, J. Pabijan, R. Garcia, M. Lekka The softening of human bladder cancer cells happens at an early stage of the malignancy process" Beilstein Journal of Nanotechnology (2014) (IF = 2.374).

31 Oddziaływanie typu komórka-komórka Geho et al. Physiology 20 (2005)

32 Oddziaływanie typu komórka-komórka Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących na własności pojedynczych komórek? W pierwszym przybliżeniu analizowana jest morfologia pojedynczych komórek tego samego rodzaju komórki nabłonka przewodu moczowego: niezłośliwy rak przejściowo komórkowy linia HCV29)

33 Oddziaływanie typu komórka-komórka Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących na własności pojedynczych komórek? Kolejne podejście pokazuje analizę własności elastycznych pojedynczych komórek tego samego rodzaju E [kpa] T24 HT1376 HCV29 Grupa A: pojedyncze komórki Grupa B: klastry komórek (5-10) Grupa C: monowarstwa 0 A B C

34 Oddziaływanie typu komórka-komórka Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących na własności pojedynczych komórek? Kolejne podejście pokazuje analizę własności elastycznych pojedynczych komórek tego samego rodzaju E [kpa] T24 HT1376 HCV29 HCV29 > HT1376 > T24 Grupa A: pojedyncze komórki Grupa B: klastry komórek (5-10) Grupa C: monowarstwa 0 A B C

35 Oddziaływanie typu komórka-komórka Geho et al. Physiology 20 (2005)

36 Oddziaływanie typu komórka-komórka Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących innego rodzaju na własności pojedynczych komórek? fibroblast keratynocyty 50 μm 50 μm F-actin praca doktorska B.Orzechowskiej

37 Oddziaływanie typu komórka-komórka Jaki jest wpływ komórek sąsiadujących innego rodzaju na własności pojedynczych komórek? Pojedyncze komórki Mono-culture FB:K 1:1 FB:K 5:1 Mono-culture FB:K 1:1 FB:K 5:1 E [kpa] culture time: 24h 72h 0 Fibroblasts Keratinocytes praca doktorska B.Orzechowskiej

38 Oddziaływanie typu komórka-komórka Tkanki układ złożony z wielu typów komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej Pomiary makroskopowe silnie zaawansowane nowotwory Indenter tkanka Andrews et al. Soft Matter 9 (2013) Lee et al., Yonsei Med. J. 52 (2011) Krouskop et al. Ultrasonic Imaging 20 (1998) Tkanka nowotworowa jest sztywniejsza!

39 Oddziaływanie typu komórka-komórka Tkanki układ złożony z wielu typów komórek i macierzy zewnątrzkomórkowej margins cancer 5, 10, 20 microns Pomiary mikroskopowe tkanek silnie zaawansowane nowotwory Indenter 20 um Andrews et al. Soft Matter 9 (2013) Lekka et al. Arch. Biochem. Biophys. 518 (2012) Plodinec et al., Nat. Nanotechnol. 7 (2012) Prabhune et al. Micron 43 (2014) Tkanka nowotworowa jest bardziej deformowalna!

40 Standaryzacja pomiarów elastyczności Pomiary własności elastycznych aby mogły być stosowane powszechnie w wielu laboratoriach muszą podlegać standaryzacji

41 Standaryzacja pomiarów elastyczności Osoby realizujące: M.Lekka, J. Bobrowska Projekt realizowany w ramach Akcji COST TD1002 we współpracy z 9 ośrodkami EU w: Niemczech (Brema i Muenster), Francji (Marcoule, Marsylia), Włoszech (Mediolan), Hiszpanii (Barcelona, Madryt), Grecji (Patra) Studenci wykonujący pomiary w IFJ PAN J.Ramos (Madryt), I.Moldoveanu (Bukareszt), K.Mayr & Thu Kim Co (Linz), K.Malohlava & J.Horakova (Ołomuniec) pobyt finansowany z funduszy poszczególnych uczestników Akcji COST

42 Standaryzacja pomiarów elastyczności European network on applications of Atomic Force Microscopy to NanoMedicine and Life Sciences (COST Action TD1002) The main objective of the COST Action TD1002 is to further develop and transfer the biophysical achievements of Atomic Force Microscopy to NanoMedicine and clinical research.

43 Ocena jakości powierzchni antybakteryjnych wykonanych na bazie miedzi (projekt NCBiR) Osoby realizujące: M.Lekka, Sz.Prauzner-Bechcicki Projekt NCBiR na lata realizowany we współpracy z Instytutem Metali Nieżelaznych w Gliwicach (koordynator) oraz z firmami Alveo, Certech i Lipopharm. Zadanie IFJ PAN badanie topografii powierzchni antybakteryjnych tworzonych na bazie miedzi. N55 CuTiO 2 Peak-to-peak [nm] Szorstkość (Ra) [nm] # # #

44 Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016) Podsumowanie Zmiany nowotworowe są akumulacją zmian różnego typu prowadzących do odmiennych własności komórki nowotworowej Charakterystyka własności fizyko-chemicznych pojedynczych komórek pozwoli na uzyskanie parametrów, które w sposób ilościowy opisywałyby zmiany zachodzące podczas progresji nowotworu

45 Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016) Skład grupy 1. Małgorzata Lekka 2. Szymon Prauzner-Bechcicki 3. Joanna Pabijan Doktoranci 1. Justyna Bobrowska 2. Barbara Orzechowska 3. Joanna Danilkiewicz 1. Joanna Wiltowska-Zuber 2. Katarzyna Pogoda 3. Agnieszka Dziekańska Aktualnie realizowane projekty - projekt NCN - Preludium ( ) - projekt NCN OPUS ( ) - Projekt NCBiR ( ) - kontynuacja badań wykonywanych w ramach Akcji COST TD1002, AFM4NanoBioMed (składany kolejny projekt COST (M.Lekka główny wnioskodawca, 18 krajów, deadline: )

46 Zakład Badań Mikroukładów Biofizycznych (od 1 stycznia 2016) Formalne i nieformalne współprace: 1. Collegium Medicum UJ 2. Uniwersytet w Linzu (Austria) 3. Instytut Fizyki UJ 4. Politechnika w Pradze (Czechy) 5. Politechnika Warszawska 6. Politechnika Poznańska 7. ACMIN (AGH) 8. Zespół instytucji należących do grupy pracującej nad standaryzacją pomiarów elastyczności Nie mówiłam o wynikach uzyskanych w ramach: 1. Uniwersytet w Lozannie badanie własności mechanicznych mięśni (dystrofie) 2. Uniwersytet Mikołaja Kopernika w Toruniu stabilność mechaniczna białek 3. Instytut Agrofizyki PAN pomiary sztywności ściany komórkowej

47 Dziękuję