ul. Piotrowo 3, Poznań, tel , fax

Transkrypt

1 dr hab. Arkadiusz Ptak Instytut Fizyki Politechnika Poznańska tel Poznań, RECENZJA ROZPRAWY DOKTORSKIEJ mgr. Szymona Prauzner-Bechcickiego pt. The influence of chemical and physical properties of selected polymer thin films on adhesion of melanoma cell lines Niniejsza recenzja sporządzona została na prośbę Rady Naukowej Instytutu Fizyki Jądrowej im. H. Niewodniczańskiego PAN. Promotorem rozprawy doktorskiej jest dr hab. Małgorzata Lekka, prof. IFJ PAN. Rozprawa doktorska mgr. Szymona Prauzner-Bechcickiego poświęcona jest zjawisku adhezji występującemu pomiędzy komórką biologiczną a podłożem stałym. Na wypadkową siłę adhezji składają się nie tylko oddziaływania specyficzne występujące pomiędzy parami wybranych cząsteczek, ale również oddziaływania niespecyficzne, na które składają się m.in. oddziaływania van der Waalsa, w tym dyspersyjne, oddziaływania elektrostatyczne czy wiązania wodorowe. O ile odziaływania specyficzne skupiają uwagę naukowców od lat, o tyle rola oddziaływań niespecyficznych w adhezji międzykomórkowej oraz adhezji komórek do podłoży nie jest dobrze poznana. Zagadnienia te są szczególnie istotne w kontekście rozprzestrzeniania się komórek nowotworowych, co stanowi motywację badań opisanych w rozprawie doktorskiej Pana mgr. Prauzner-Bechcickiego. Temat rozprawy jest jasno sformułowany, prawidłowo wskazuje zawartość i cel rozprawy: wpływ chemicznych i fizycznych właściwości wybranych cienkich warstw polimerowych na adhezję komórek czerniaka. Struktura rozprawy jest dość nietypowa; praca nie dzieli się na klasyczne rozdziały opisujące kolejno materiał badawczy, metody, wyniki itd., natomiast każdy z rozdziałów poświęcony jest odrębnemu zagadnieniu tematycznemu. Rozdziały napisane są tak, by stanowiły samodzielną całość z wewnętrznym tu już tradycyjnym podziałem na wstęp, materiał badawczy, wyniki, ich dyskusję oraz wnioski. Każdy z rozdziałów ma również swój spis literatury. Rozwiązanie takie ma zarówno swoje zalety jak i wady. Niewątpliwą zaletą jest spójność opisu wyodrębnionych, istotnych zagadnień pracy, natomiast wadą częste powtórzenia treści, w tym opisy wykorzystywanych metod, definicje wielkości fizycznych (np. parametr N/C definiowany jest kilkukrotnie), wielokrotne wprowadzanie

2 tych samych skrótów i symboli (np. AFM, SCFS, WM115, WM266-4). Jednak z punktu widzenia czytelnika, taki oryginalny podział uznałbym za zaletę, ułatwia bowiem analizę treści, a Autorowi udało się utrzymać ciągłość opisu. Rozprawa liczy 124 strony łącznie z załącznikami, a poprzedzona jest streszczeniem w języku angielskim oraz obszerniejszym w języku polskim. Po spisie treści znajdują się spisy rysunków i tabel. W załącznikach natomiast znajdują się kolejno: A) wyniki opisowe testu t Welcha dla parametrów uzyskanych metodą spektroskopii siły dla dwóch rodzajów komórek, B) lista użytych w rozprawie skrótów, C) lista publikacji i doniesień konferencyjnych mgr. Sz. Prauzner-Bechcickiego. Pierwszy z siedmiu rozdziałów rozprawy stanowi wprowadzenie do tematyki adhezji komórek biologicznych. Autor opisuje oddziaływania specyficzne typu receptor-ligand oraz oddziaływania niespecyficzne, a następnie przedstawia aktualny stan wiedzy w tym zakresie. Przedstawia również podstawową metodę badań adhezji komórek jaką jest spektroskopia siły wykonywana za pomocą mikroskopu sił atomowych. W szczególności omawia tzw. krzywą siła przemieszczenie wskazując na jej istotne odcinki i punkty (rys. 1.1). Zastanawia jedynie umieszczenie punktu kontaktu (który zwykle w literaturze oznacza punkt, od którego rozpoczyna się kontakt pomiędzy ostrzem AFM a powierzchnią próbki) w części krzywej odpowiadającej wycofywaniu mikrobelki AFM, kiedy ostrze jest już w kontakcie na całym odcinku aż do momentu zerwania. Rozdział kończy się sformułowaniem celu rozprawy, po czym następuje wykaz 57 pozycji literaturowych. W drugim rozdziale Autor opisuje właściwości cienkich warstw polimerów stosowanych coraz częściej w roli biomateriałów. Do badań wybrane zostały następujące polimery: polistyren (PS), politlenek etylenu (PEO), poliizopren(1,4) (PI) oraz polidimetylosiloksan (PDMS), znacznie różniące się właściwościami fizyko-chemicznymi powierzchni. W tabeli 2.1 przedstawione zostały ich podstawowe parametry chemiczne takie jak masa cząsteczkowa, stężenie, parametr PDI czy rozpuszczalnik. Brakuje jednak danych dla PDMS. Metody zastosowane przez Doktoranta do scharakteryzowania warstw polimerowych to: pomiar kąta zwilżania w celu określenia hydrofilowości/hydrofobowości badanych warstw, a także wyznaczenia swobodnej energii powierzchniowej (SFE) i jej składowych (z wykorzystaniem czterech cieczy: wody, gliceryny, dijodometanu oraz formamidu; spektroskopia masowa jonów wtórnych (SIMS) w celu określenia składu chemicznego warstw polimerowych oraz mikroskopia sił atomowych (AFM) do obrazowania topografii powierzchni polimerowych oraz wyznaczenia ich chropowatości. W opisie trybów pracy AFM wkradł się błąd terminologiczny. Tryb przerywanego kontaktu po ang. intermittent contact nazwany został intermediate contact (str. 26, rys. 2.7). Tryb przerywanego kontaktu można nazywać trybem pośrednim (intermediate mode), ale nie trybem kontaktu pośredniego. Ponadto na rys. 2.7 niepoprawnie zaznaczony został zakres amplitudy drgań mikrobelki dla trybu przerywanego kontaktu; jest on znacznie większy i powinien obejmować zakres dla trybu bezkontaktowego. Zwykle amplituda drgań mikrobelki w trybie przerywanego kontaktu wynosi od kilkudziesięciu do kilkuset nm, gdy tymczasem w trybie

3 bezkontaktowym poniżej 10 nm. Nawiasem mówiąc jest to błąd, który często powtarza się w różnego rodzaju opracowaniach. W punkcie omawianego rozdziału znajduje się dyskusja wyników dotyczących topografii warstw polimerowych i porównanie ich chropowatości (liczonych jako RMS) dla dwóch różnych obszarów skanowania: (10 x 10) μm 2 oraz (1 x 1) μm 2. Nie za bardzo rozumiem, co wnosi takie porównanie. Według mnie różnice uzyskane dla obu obszarów są zwykłą różnicą statystyczną wynikającą z małej próby pomiarowej, przy czym wyniki dla obszaru 100 μm 2 są statystycznie wiarygodniejsze niż dla obszaru 1 μm 2 ze względu na uśrednienie dla obszaru 100-krotnie większego. Myślę, że pomiar dla obszarów o różnych wielkościach miałby sens wtedy, gdyby jeden z nich był znacznie większy niż obiekty (nierówności, pofałdowania) na powierzchni próbki, a drugi znacznie mniejszy. Wtedy otrzymana byłaby informacja o pofałdowaniu powierzchni próbki oraz o chropowatości samych fałd. W tym jednak przypadku oba obszary są znacznie większe od obserwowanych obiektów. Niemniej jednak sam pomiar chropowatości dostarcza istotnych wyników, szczególnie w kontekście porównania podłoży polimerowych pomiędzy sobą. W kolejnym rozdziale Autor opisuje preparatykę i metody pomiaru wzrostu na powierzchniach polimerowych dwóch linii komórkowych czerniaka: WM115 z guza pierwotnego oraz WM266-4 z przerzutów do skóry. Pomiar wzrostu został przeprowadzony za pomocą mikroskopu fluorescencyjnego z wykorzystaniem pomysłowego sposobu zliczania komórek i określania zajętej przez nich powierzchni. Zdefiniowany został parametr N/C będący stosunkiem średniej powierzchni pojedynczego jądra komórkowego do średniej powierzchni całej komórki. Pomiary zostały wykonane w trzech punktach czasowych po osadzeniu komórek na podłożach polimerowych: po 24 h, 72 h i 120 h. W ten sposób Doktorant mógł określić ilościowo zmiany zachodzące w czasie, czyli szybkość rozprzestrzeniania się komórek na podłożach oraz różnice pomiędzy komórkami i wpływ różnych podłoży. Zrozumienie wyników skomplikowały trochę niejasności w opisie, począwszy od niefortunnego moim zdaniem wyboru symbolu N/C, gdzie N zostało zdefiniowane jako liczba jąder komórkowych, natomiast C pozostało bez opisu. Niemniej uzyskane w tej części pracy wyniki uważam za wartościowe, a wyciągnięte wnioski (np. że polistyren jest najgorszym z badanych materiałem na podłoże do wzrostu obu rodzajów komórek czerniaka) mają mocną podstawę statystyczną. W rozdziale czwartym opisane zostały badania z zastosowaniem spektroskopii siły pojedynczej komórki (SCFS). W metodzie tej rolę próbnika oddziaływania komórka-podłoże pełniła pojedyncza komórka czerniaka. Z zarejestrowanych krzywych siły analizowane były trzy parametry: maksymalna siła oderwania F max, praca oderwania komórki od podłoża W oraz długość oderwania L max. Wyniki przedstawione zostały w postaci histogramów oraz tzw. wykresów skrzynkowych (box graphs). Jest to bardzo wygodna dla czytelnika forma graficznej prezentacji rozkładu statystycznego. Moje wątpliwości budzi jedynie wykorzystanie modelu Hertza, który nie uwzględnia adhezji, do

4 wyznaczenia powierzchni kontaktu komórek z podłożem. Czy nie lepszym byłoby zastosowanie np. modelu Johnsona-Kendalla-Robertsa? W rozdziale piątym Doktorant analizuje wpływ wybranych właściwości cienkich warstw polimerowych na adhezję komórek. Wybrane właściwości to: kąt zwilżania, swobodna energia powierzchniowa, polarny składnik swobodnej energii powierzchniowej, chropowatość oraz skład chemiczny. Analiza przeprowadzona jest w sposób skrupulatny, a wyciągnięte szczegółowe wnioski mają uzasadnienie w uzyskanych wynikach. W rozdziale 6 Autor zawarł analizę wpływu sztywności podłoża na morfologię i wzrost badanych komórek czerniaka. Przygotowane zostały dwa podłoża PDMS o różnej sztywności, ale zachowujące zgodność składu chemicznego, co zostało potwierdzone przez Doktoranta pomiarami ToF-SIMS. Sztywność próbek została obliczona z nachylenia części krzywej siły odpowiadającej naciskowi mikrobelki na podłoże. Jednak nachylenie to nie odzwierciedla tylko sztywności podłoża, ale efektywną sztywność układu mikrobelka-podłoże. Czy ten fakt został uwzględniony w obliczeniach? Brakuje również szerszego opisu pomiaru modułu Younga za pomocą nanoindentera. Informacja o tym jest bardzo zdawkowa. Wyniki uzyskane w tym rozdziale wskazujące na wyraźną zależność morfologii komórek czerniaka od sztywności podłoża są niezwykle ważne, nie tylko z poznawczego punktu widzenia, ale również w kontekście potencjalnych zastosowań, w szczególności w technologiach lab-on-a chip. Ostatni rozdział rozprawy zawiera podsumowanie i wnioski, z których chyba najważniejszym jest opisujący fakt, że adhezja komórki do podłoża nie zależy od jednej jego właściwości, ale od ich kombinacji. Pod względem gramatycznym i stylistycznym rozprawa została zredagowana starannie, pomimo dodatkowej trudności, którą mogło stanowić redagowanie pracy w języku angielskim. Rozprawę czyta się dobrze, a występujące błędy gramatyczne oraz literówki są nieliczne. Zdarzyło się kilka niezgrabnych bądź nieprecyzyjnych sformułowań, których przykłady z obowiązku pozwolę sobie wymienić: - primary ion beams is kept low (str. 25) pominąwszy błąd gramatyczny, należało sprecyzować, że mowa jest o energii jonów; - jest surface of average single cell zamiast average surface of single cell (kilkukrotnie w rozdziale 3); - w zdaniu The small N/C correlates with high cellular density what means that cells does not have a space to fully spread powinno być the high N/C (str. 48); - jest density of cells per area, a powinno być number of cells per area (str. 48); - skrótowe the cell nucleus (A N ) pojawia się zamiast the average surface of cell nucleus (A N ) (str. 57);

5 - używanie przymiotnika soft jako antonimu stiff powinno być raczej elastic, antonimem soft jest hard. Powyższe nieścisłości nie umniejszają jednak w sposób wyraźny wartości rozprawy, którą oceniam bardzo wysoko. Podsumowując: Doktorant precyzyjnie sformułował cel badawczy, który potrafił z sukcesem zrealizować. Poprawnie dobrał i zastosował metody eksperymentalne uzyskując obszerny zestaw wyników pomiarowych. Następnie starannie je przeanalizował stosując poprawnie metody analizy statystycznej, a także nowatorski pomysł ilościowego określania rozprzestrzeniania się komórek na podłożu. Ostatecznie, na podstawie wyników końcowych, poprawnie sformułował wnioski. W opisach poruszanych zagadnień oraz dyskusji wyników odnosił się do szeroko i trafnie wybranych źródeł literaturowych. Biorąc pod uwagę powyższą ocenę stwierdzam, że rozprawa spełnia wymogi stawiane pracom doktorskim przez Ustawę o stopniach naukowych i tytule naukowym i wnoszę o dopuszczenie mgr. Szymona Prauzner-Bechcickiego do dalszych etapów przewodu doktorskiego, w tym publicznej obrony rozprawy doktorskiej. Uwzględniając nowatorskie i kompleksowe podejście do rozwiązania postawionego problemu naukowego oraz wagę uzyskanych wyników wnioskuję o wyróżnienie rozprawy przez Radę Naukową.