Lista najczęściej używanych skrótów w pracy

Transkrypt

1 Michał Kwiecień Nowe biodegradowalne materiały polimerowe oparte o biopoliestry alifatyczne i ich syntetyczne analogi dla zastosowań w medycynie - synteza i charakterystyka Autoreferat rozprawy doktorskiej wykonanej pod kierunkiem dr hab. Grażyny Adamus, prof. nadzw. PAN w Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych Polskiej Akademii Nauk Zabrze 2015

2 Lista najczęściej używanych skrótów w pracy PHA - poli(hydroksyalkaniany) PHB - poli(3-hydroksymaślan), biopoliester [R,S]PHB poli([r,s]-3-hydroksymaślan), poliester syntetyczny P3HB4HB poli(3-hydroksymaślan-ko-4-hydroksymaślan), biopoliester PHBH poli(3-hydroksymaślan-ko-3-hydroksyheksanian), biopoliester 3HB jednostki konstytucyjne 3-hydroksymaślanowe 4HB jednostki konstytucyjne 4-hydroksymaślanowe 3HH jednostki konstytucyjne 3-hydroksyheksanianowe 1H NMR spektroskopia magnetycznego rezonansu protonowego 13C NMR spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego węgla 13 C GPC chromatografia żelowa ESI-MS spektrometria mas z jonizacją metodą elektrorozpylania TGA analiza termograwimetryczna DSC różnicowa kalorymetria skaningowa 2

3 1. Wprowadzenie Materiały polimerowe stanowią obecnie podstawowy budulec do produkcji urządzeń wykorzystywanych w bardzo wielu dziedzinach życia. Trudno wymienić jakiś obszar funkcjonowania człowieka w którym nie wykorzystuje się materiałów polimerowych. Pomimo, że historia materiałów polimerowych zapoczątkowana została ponad sto lat temu, nadal obserwujemy bardzo intensywny rozwój nauki o polimerach. Materiałom polimerowym wykorzystywanym do szeroko pojętych zastosowań biomedycznych stawiany jest szereg wymagań zarówno co do ich właściwości fizyko-chemicznych jak również biokompatybilności. Wykorzystanie materiałów polimerowych w medycynie wiąże się z wytwarzaniem urządzeń do zastosowań zewnętrznych (tj. do kontaktu z zewnętrznymi powłokami organizmu) bądź do zastosowań wewnętrznych (tj. w przypadku wszczepiania urządzenia do wnętrza organizmu). W zastosowaniach biomedycznych oprócz trwałych materiałów polimerowych coraz większym zainteresowaniem cieszą się biodegradowalne materiały polimerowe. Od dłuższego czasu w aplikacjach biomedycznych stosowane są charakteryzujące się dobrą biokompatybilnością syntetyczne poliestry i kopoliestry laktydu i glikolidu, zawierające jednostki konstytucyjne pochodzące od 2-hydroksykwasów. Duży potencjał w zakresie zastosowań biomedycznych, posiadają biodegradowalne i biokompatybilne poliestry alifatyczne należące do grupy poli(hydroksyalkanianów). PHA stanowią grupę biodegradowalnych i biokompatybilnych poliestrów alifatycznych, które mogą być produkowane przez wiele mikroorganizmów jako materiał zapasowy. 1-3 W zależności od budowy i zawartości jednostek konstytucyjnych właściwości PHA mogą się zmieniać od polimerów sztywnych i kruchych do materiałów elastycznych. 4 Budowa chemiczna jednostek konstytucyjnych, ich wzajemny udział oraz rozkład ich sekwencji wpływa na właściwości mechaniczne, fizyczne, przetwórcze jak również decyduje o szybkości biodegradacji PHA. 5 Struktura chemiczna poliestrów, jak również ich właściwości fizyko-chemiczne, mogą być kontrolowane na etapie biosyntezy. 6 Pomimo prowadzonych badań nad modyfikacjami procesów biotechnologicznych w kierunku otrzymywania PHA o zróżnicowanych właściwościach fizyko-chemicznych, nie zawsze możliwe jest otrzymanie materiału o pożądanych właściwościach. Dlatego też równocześnie prowadzone są intensywne badania nad modyfikacją właściwości fizyko-chemicznych otrzymywanych na skalę przemysłową PHA. 7 Obecnie badania nad modyfikacją PHA ukierunkowane są na opracowanie materiałów o kontrolowanych właściwościach termicznych, mechanicznych, hydrofilowości oraz szybkości degradacji, spełniających wymagania stawiane dla konkretnych zastosowań. Niniejsza rozprawa stanowi wycinek badań nad modyfikacją właściwości wybranych biopoliestrów PHA na drodze chemicznej. Badania stanowiące przedmiot niniejszej pracy 3

4 doktorskiej były finansowane w ramach projektów badawczych: ANIMPOL Biotechnological conversion of carbon containing wastes for eco-efficient production of high added value products, realizowany w ramach 7PR UE, Programu Polskie Sztuczne Serce oraz projektu Narodowego Centrum Nauki NR 2013/11/B/ST5/02222 "Zastosowanie nowej selektywnej metody redukcji polihydroksyalkanianów w syntezie biomateriałów polimerowych dla medycyny regeneracyjnej i kardiochirurgii". Ponadto autor niniejszej pracy doktorskiej był stypendystą programu stypendialnego na rzecz innowacyjnego Śląska DoktoRIS oraz programu stypendialnego w ramach Regionalnego Funduszu Stypendiów Doktoranckich Cel i zakres pracy Celem badań podjętych w niniejszej pracy doktorskiej było opracowanie nowych biokompatybilnych, w pełni biodegradowalnych materiałów polimerowych o kontrolowanej strukturze i założonych właściwościach fizyko-chemicznych, zawierających segmenty strukturalne pochodzące od biopoliestrów z grupy poli(hydroksyalkanianów). Kluczowym elementem dla realizacji założonego celu było opracowanie metod kontrolowanej częściowej degradacji wybranych biopoliestrów PHA, w kierunku syntezy oligomerów o kontrolowanej strukturze chemicznej grup końcowych. Uzyskane na drodze kontrolowanej degradacji oligomery PHA wykorzystano następnie w syntezie nowych materiałów polimerowych, odpowiednio jako makroinicjatory polimeryzacji anionowej β-butyrolaktonu oraz jako makromonomery w reakcji polikondensacji z pochodnymi kwasu sebacynowego. Zakres niniejszej pracy obejmował następujące zagadnienia: 1. Opracowanie metod kontrolowanej degradacji PHA na drodze: - selektywnej redukcji wybranych PHA z zastosowaniem borowodorku litu jako czynnika redukującego, - kontrolowanej degradacji termicznej indukowanej karboksylanami biopoliestru P3HB4HB. 2. Badania nad syntezą polimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB z wykorzystaniem makroinicjatorów PHA otrzymane na drodze kontrolowanej degradacji termicznej. 3. Badania nad wykorzystaniem otrzymanych oligoestrodioli wybranych PHA w reakcji polikondesacji z dichlorkiem kwasu sebacynowego. 4. Próby wykorzystania nowych materiałów polimerowych w obszarze zastosowań medycznych. 4

5 Wyniki badań przeprowadzonych w ramach pracy doktorskiej stanowiły przedmiot nastpujących publikacji: 1. M. Kwiecień, G. Adamus, M. Kowalczuk,; Selective reduction of PHA biopolyesters and their synthetic analogues to corresponding PHA oligodiols proved by structural studies, Biomacromolecules 2013, 14, M. Kwiecień, M. Kawalec, P. Kurcok, M. Kowalczuk, G. Adamus; Selective carboxylate induced degradation of poly(3-hydroxybutyrate co-4 hydroxybutyrate) source of linear uniform 3HB4HB oligomers Polymer Degradation and Stability 2014, 110, G. Adamus, W. Sikorska, H. Janeczek, M. Kwiecień, M. Sobota, M. Kowalczuk "Novel block copolymers of atactic PHB with natural PHA for cardiovascular engineering: Synthesis and characterization, European Polymer Journal 2012, 48, M. Kowalczuk, G. Adamus, W. Sikorska, M. Sobota, M. Kwiecień, K. Mańczyk, Technologie inżynierii materiałowej i technologie metrologiczne dla potrzeb polskich protez serca współautorstwo rozdziału Inżynieria biomateriałów zawierających biopoliestry alifatyczne i ich syntetyczne analogi dla potrzeb programu Polskie Sztuczne Serce, ISBN , Grudzień Omówienie wyników badań 3.1 Metody kontrolowanej degradacji wybranych poliestrów alifatycznych Metoda kontrolowanej redukcji PHA z zastosowaniem LiBH 4 jako czynnika redukującego - synteza oligoestrodioli PHA Substancje chemiczne zawierające dwie grupy hydroksylowe (diole) w swojej strukturze są bardzo użytecznymi substratami w procesach polimeryzacji przebiegających na drodze polikondensacji i poliaddycji. Z dotychczasowych doniesień literaturowych wynika, że oligomery PHA z dwoma końcowymi grupami hydroksylowymi otrzymywano głównie na drodze transestryfikacji, najczęściej z wykorzystaniem glikolu etylenowego w obecności katalizatora o charakterze kwasowym. 8 W ostatnim czasie w literaturze zaproponowano alternatywną do transestryfikacji metodę otrzymywania takich oligodioli. Metoda ta wykorzystuje reakcję redukcji grup estrowych w łańcuchu poliestrowym, co w efekcie powinno prowadzić do otrzymania oligomerów PHA zakończonych dwoma grupami hydroksylowymi. Jednakże, przedstawione przez autorów wyniki badań struktury oligomerów otrzymanych w wyniku 5

6 redukcji PHA wykazały, że oligodiole nie były produktem dominującym a stanowiły jedynie jeden z kilku produktów tego procesu. 9 W ramach niniejszej pracy prowadzono badania nad opracowaniem selektywnej metody kontrolowanej degradacji, na drodze redukcji wybranych biopoliestrów PHA z wykorzystaniem borowodorku litu (LiBH 4) jako czynnika redukującego. Proces redukcji wybranych poliestrów PHAz zastosowaniem LiBH 4 prowadzono w łagodnych warunkach temperaturowychtj. T<20 C. Do badań wybrano syntetyczny ataktyczny poli[(r,s)-3-hydroksymaślan] ([R,S]PHB) oraz otrzymywane na skalę przemysłową biopoliestry P3HB4HB (przedstawiciel scl-pha)i PHBH (przedstawiciel mcl-pha). Schemat redukcji PHA z zastosowaniem LiBH 4 jako czynnika redukującego, przedstawiono na Schemacie 1. Schemat 1. Ogólny schemat reakcji redukcji PHA z zastosowaniem LiBH 4 jako czynnika redukującego. R = CH 3, x = 1 dla [R,S]PHB; R = H, x = 2 (4HB) lub R = CH 3, x = (3HB) dla P3HB4HB; R = CH 3, x = 1 (3HB) lub R = C 3H 7, x = 1(3HH) dla PHBH. W pierwszym etapie badań nad opracowaniem kontrolowanej metody częściowej redukcji wybranych poliestrów opracowano warunki korzystne dla realizacji tego procesu. Przeprowadzone badania wykazały, że proces redukcji PHA korzystnie jest prowadzić, stosując jako rozpuszczalnik tetrahydrofuran w temperaturze nie przekraczającej 20 C. W kolejnym etapie badań, stosując wcześniej ustalone warunki korzystne dla prowadzenia procesu, analizowano wpływ ilości stosowanego czynnika redukującego borowodorku litu (LiBH 4) na średnie masy molowe otrzymanych oligomerów. Średnie masy molowe wyjściowych poliestrów ([R,S]PHB, P3HB4HB i PHBH) oraz oligomerów otrzymanych w wyniku ich redukcji przy zastosowaniu zróżnicowanej ilości czynnika redukującego zebrano w Tabeli 1. Tabela 1. Średnie masy molowe oligomerów otrzymanych na drodze selektywnej redukcji wybranych poliestrów [R,S]PHB, P3HB4HB oraz PHBH. 6

7 Lp. Wyjściowe PHA Ilość Otrzymane diole PHA M n M w/m n Zawartość zastosowanego M n M w/m n Zawartość Wydajność [g/mol] * jednostek LiBH 4 [g/mol] * jednostek [%] 4HB lub [mol] 4HB lub 3HH 3HH [%mol] ** [%mol] ** a ,8 (4HB) (4HB) 95 2a ,8 (4HB) (4HB) ,5 (3HH) 0, ,8 (3HH) 97 3a ,5 (3HH) 0, ,3 (3HH) 98 *- wyznaczono metodą GPC, ** - wyznaczono metodą 1 H NMR Wyniki zestawione w Tabeli 1 jednoznacznie wskazują, że proces redukcji poliestrów zależy od ilości zastosowanego czynnika redukującego. Ponadto, ilość czynnika redukującego potrzebna do otrzymania oligomerów o założonej masie molowej zależy od średniej masy molowej wyjściowego poliestru. Uzyskane wyniki badań pokazują, iż poprzez zmianę ilość LiBH 4 możemy kontrolować średnie masy molowe oligomerów otrzymywanych w tym procesie. Możliwość kontroli średnich mas molowych otrzymywanych oligoestrodioli jest bardzo istotna dla ich potencjalnego wykorzystania w dalszej syntezie nowych materiałów polimerowych zawierających fragmenty strukturalne PHA. Charakterystykę struktury oligomerycznych produktów redukcji wybranych PHA z zastosowaniem LiBH 4 przeprowadzono z wykorzystaniem technik 1H NMR i spektrometrii mass ESI-MS. W ramach pracy doktorskiej badanie procesu redukcji przeprowadzono dla biopoliestrów P3HB4HB i PHBH oraz otrzymanego na drodze anionowej polimeryzacji ataktycznego [R,S]PHB. W niniejszym referacie przedstawiono przykładowo wyniki badania struktury oligomerów otrzymanych na drodze redukcji wybranych poliestrów. Rysunek 1 przedstawia widmo 1 H NMR oligomerów otrzymanych poprzez częściową redukcję biopoliestru P3HB4HB borowodorkiem litu (LiBH 4). Natomiast na Schemacie 2 pokazano struktury wszystkich teoretycznie możliwych oligomerów, które mogą zostać otrzymane na drodze zaproponowanej metody wraz z oznaczeniami poszczególnych protonów. Użyty w reakcji biopoliester P3HB4HB jest dostępnym handlowo, bezładnym kopolimerem kwasu 3-hydroksymasłowego oraz 4-hydroksymasłowego, zawierającym 8,8 % molowych jednostek 4-hydroksymaślanowych, otrzymywanym w procesie biotechnologicznym. W związku z powyższym na widmie 1 H NMR oligomerów otrzymanych w wyniku jego częściowej redukcji dominują sygnały charakterystyczne dla protonów powtarzających się jednostek 7

8 3-hydroksymaślanowych (oznaczone jako 1, 2, 3) jak również obecne są sygnały, o niższej intensywności, charakterystyczne dla protonów powtarzających się jednostek 4-hydroksymaślanowych (oznaczone jako 4, 5, 6). Rysunek 1. Widmo 1 H NMR oligomerów otrzymanych w wyniku redukcji biopoliestru P3HB4HB z zastosowaniem borowodorku litu. Struktury oligomerów wraz z oznaczeniami poszczególnych protonów przedstawiono na Schemacie 2. 8

9 Schemat 2. Struktury chemiczne oligomerów otrzymanych na drodze redukcji naturalnego P3HB4HB z zastosowaniem borowodorku litu jako czynnika redukującego. Analiza grup końcowych otrzymanych oligomerów (3HB4HB), przeprowadzona w oparciu o uzyskane widmo 1H NMR, potwierdziła obecność 3-hydroksymasłowych i 1-metylo-3-hydroksypropylowych grup końcowych (Rysunek 1, sygnały a-g,). Grupy te powstały w wyniku redukcji jednostek 3HB zawartych w biopoliestrze. Dodatkowo, na widmie zidentyfikowano sygnały charakterystyczne dla protonów grup końcowych 4-hydroksymasłowej oraz 4-hydroksybutylowej (Rysunek 1, sygnały h-n). Grupy te powstały na skutek redukcji jednostek konstytucyjnych 4HB zawartych w biopoliestrze. Skład chemiczny oligomerów otrzymanych w wyniku redukcji, określony w oparciu o intensywności sygnałów protonów charakterystycznych dla jednostek konstytucyjnych 3HB (1,2,3) oraz 4HB (4,5,6), był zbliżony do składu wyjściowego biopoliestru P3HB4HB. Zawartość merów 4HB wynosiła odpowiednio 8,8 i 8,6 %. Obecność w produktach redukcji biopoliestru P3HB4HB oligomerów (3HB4HB) zakończonych 3-hydroksymasłowymi, 1-metylo-3-hydroksypropylowymi, 4-hydroksymasłowymi oraz 4-hydroksybutylowymi grupami końcowymi, przy zachowaniu składu chemicznego wyjściowego biopoliestru, wskazuje na statystyczny charakter przebiegu procesu redukcji. Strukturę chemiczną na poziomie molekularnym oligomerów otrzymanych na drodze redukcji wybranych poliestrów [R,S]PHB, P3HB4HB oraz PHBH borowodorkiem litu (LiBH 4) potwierdzono również z zastosowaniem spektrometrii mas ESI-MS. W autoreferacie analizę 9

10 struktury otrzymanych oligomerów przedstawiona została na przykładzie oligomerów otrzymanych z biopoliestru PHBH. Widmo masowe ESI-MS uzyskane dla oligomerów otrzymanych z PHBH oraz jego rozszerzenie w zakresie m/z , przedstawiono odpowiednio na Rysunku 2a i 2b. Rysunek 2. Widmo ESI-MS (jony dodatnie), oligomerów otrzymanych nad drodze częściowej redukcji PHBH z zastosowaniem LiBH 4 (a). Rozszerzenie widma podstawowego w zakresie m/z (b). Uzyskane widmo masowe jest dość skomplikowane ze względu na obecność w łańcuchach oligoestrodioli bezładnie rozłożonych dwóch jednostek konstytucyjnych 3-hydroksymaślanowej 3HB (masa molowa 86) i 3-hydroksyheksanianowej 3HH (masa molowa 114). Obecne na widmie jony reprezentujące indywidualne łańcuchy oligoestrodioli PHBH, ze względu na stopień oligomeryzacji oraz skład chemiczny, zgrupowane są w liczne klastry, w których sygnały występują co 28 Da (różnica mas molowych pomiędzy 3HH i 3HB). Występowanie po sobie stałych sekwencji oligomerów widoczne jest lepiej na rozszerzeniu widma Rysunek 2b. Sekwencja sygnałów występująca przy wartościach m/z 715, 743 i 771 reprezentuje addukty sodowe oligoestrodioli o tym samym stopniu oligomeryzacji ale różnym składzie chemicznym zawierające w swojej strukturze 0, 1 i 2 jednostki pochodzące od kwasu 3-hydroksyheksanowego, jako jednostki konstytucyjne w łańcuchu lub w formie grup końcowych. Kolejną sekwencję oligomerów tworzą sygnały o wartościach m/z 801, 829 i 857, które również spełniają wskazaną powyżej prawidłowość. W oparciu o wartości m/z obecnych 10

11 na widmie ESI-MS sygnałów, główną serię jonów przyporządkowano adduktom sodowym liniowych oligomerów PHBH, o różnym stopniu oligomeryzacji, zawierającym od 0 do 2 jednostek pochodzących od kwasu 3-hydroksyheksanowego, zakończonych grupami końcowymi powstałymi w procesie redukcji, Rysunek 2. Struktury chemiczne jonów obecnych na widmie masowym (Rysunek 2) przedstawiono na Schemacie 3. Przedstawione na Schemacie 3, cztery różne struktury chemiczne otrzymanych oligomerów wynikają ze statystycznego przebiegu procesu redukcji grup estrowych jednostek HB lub HH w łańcuchu bezładnego biopoliestru PHBH, któremu towarzyszy utworzenie oligomerów zakończonych, 3-hydroksymasłowymi 3-hydroksyheksanianowymi, 1-metylo-3-hydroksypropylowymi oraz 3-hydroksyheksylowymi grupami końcowymi. Sygnały o najwyższej intensywności występujące na widmie (Rysunek 2b) przy wartościach m/z 743, 829, i 915, reprezentują liniowe oligoestrodiole PHBH, o różnym stopniu oligomeryzacji zawierające jedną jednostkę pochodzącą od kwasu 3-hydroksyheksanowego bądź jako jednostkę konstytucyjną w łańcuchu oligomeru lub w formie grup końcowych. Schemat 3. Chemiczne struktury adduktów sodowych oligomerów otrzymanych na drodze częściowej redukcji naturalnego PHBH z wykorzystaniem LiBH 4. W celu potwierdzenia struktur zaproponowanych dla oligomerów otrzymanych w wyniku redukcji PHBH zastosowano technikę tandemowej spektrometrii mas ESI-MS/MS. Eksperymenty fragmentacyjne przeprowadzono dla wybranych jonów o wartości m/z 715, 743 oraz m/z 771 reprezentujących jedna z sekwencji uzyskanych w wyniku redukcji biopoliestru PHBH oligestrodioli PHBH o zróżnicowanym składzie molowym. Na Rysunku 3 przedstawiono widmo fragmentacyjne jonu o wartości m/z 743 reprezentującego addukty sodowe 11

12 oligoestrodioli PHBH, zawierających jedną jednostkę 3HH w łańcuchu oligomerowym bądź jako grupę końcową. Rysunek 3. Widmo fragmentacyjne ESI-MS/MS dla jonu o wartości m/z 743 odpowiadającemu adduktowi sodowemu oligoestrodiolu PHBH, zawierającemu jedną jednostkę 3HH. W przypadku tego jonu możliwe są cztery teoretyczne drogi fragmentacji, które pokazano na Rysunku 3. Obecność czterech różnych dróg fragmentacji wynika, z możliwości występowania czterech różnych struktur chemicznych otrzymanych oligomerów. Jeśli grupy końcowe oligoestrodiolu powstały w wyniku redukcji jednostek 3HB, to fragmentacja takiego oligoestrodiolu w pierwszym etapie zachodzi poprzez oderwanie od końców łańcucha kwasu 3-hydroksymasłowego (104 Da) lub alkoholu 2-butenylowego (72 Da) z utworzeniem dwóch serii jonów fragmentacyjnych. Jeśli, któraś z grup końcowych wytworzona jest poprzez zredukowanie jednostki 3HH, obserwujemy na widmie masowym kolejne dwie serie jonów 12

13 fragmentacyjnych. Jony te tworzą się w wyniku oderwania od łańcucha oliestrodiolu cząsteczki kwasu 3-hydroksyheksanowego (132 Da) bądź alkoholu 2-heksenylowego (100 Da)(Patrz schemat fragmentacji, Rysunek 3). Bezładny rozkład jednostek 3HH w łańcuchach fragmentowanych jonów oligoestrodiolu sprawia, że w kolejnych etapach tworzą się dwa jony fragmentacyjne o tym samym stopniu oligomeryzacji z których jeden zawiera jednostkę 3HH a drugi jest oligo(3-hydroksymaślanem). Analiza widm fragmentacyjnych otrzymanych dla wybranych adduktów sodowych oligoestrodioli PHBH potwierdziła, że wszystkie teoretycznie przewidziane struktury jonów fragmentacyjnych (przy założeniu bezładnego rozkładu 3HB i 3HH jednostek komonomerycznych) występują na uzyskanych widmach ESI-MS/MS. Fragmentacja wybranych jonów molekularnych, potwierdziła zatem strukturę otrzymanych oligoestrodioli PHBH, w tym budowę chemiczną ich grup końcowych oraz pozwoliła na weryfikacje bezładnego rozkładu jednostek komonomerycznych w łańcuchu. Wyniki badań nad opracowaniem kontrolowanej metody redukcji biopoliestrów PHA były przedmiotem publikacji M. Kwiecień, G. Adamus, M. Kowalczuk,; Selective reduction of PHA biopolyesters and their synthetic analogues to corresponding PHA oligodiols proved by structural studies Biomacromolecules 2013, 14, Kontrolowana degradacja termiczna indukowana karboksylanami biopoliestru P3HB4HB W literaturze można znaleźć szereg prac na temat stabilności termicznej PHA w różnych warunkach temperaturowych, jak również wpływu obecności zasad Bronsteda-Lowryego na stabilność termiczną PHB oraz strukturę otrzymanych produktów degradacji. Dostępne informacje literaturowe odnoszą się jednak tylko do wpływu obecności zasad Bronsteda-Lowryego na obniżanie stabilności termicznej poli(3-hydroksyalkanianów). Natomiast brak jest doniesień na temat wpływu wyżej wspomnianych zasad na stabilność termiczną PHA zawierających w swej strukturze jednostki 4HB. Biorąc pod uwagę różny przebieg procesów degradacji termicznej biopoliestrów PHA zawierających jednostki 4HB w niniejszej pracy podjęto badania nad możliwością rozszerzenia opisywanej wcześniej metody degradacji termicznej PHB w obecności zasad Bronsteda-Lowryego na dostępny handlowo biopoliester P3HB4HB zawierający zarówno jednostki 3HB jak i 4HB. W szczególności podjęto badania nad określeniem wpływu obecności octanu potasu na stabilność termiczną biopoliestru P3HB4HB. Do badań wykorzystano dostępny handlowo 13

14 biopoliester P3HB4HB o liczbowo średniej masie molowej g/mol, zawierający 8,8 % molowych jednostek 4HB. W pierwszym etapie badań przeprowadzono serię degradacji kopolimeru P3HB4HB w warunkach typowych dla degradacji PHB w obecności octanu potasu, zgodnie z procedurami opisanymi w części literaturowej. Jako próbę odniesienia przeprowadzono eksperymenty degradacji termicznej w warunkach charakterystycznych dla typowej pirolizy tego typu kopoliestrów opisywanych w literaturze. 10,11 Liczbowo średnie masy molowe oligomerów otrzymanych na drodze pirolizy oraz degradacji termicznej indukowanej karboksylanami, wyznaczone z wykorzystaniem chromatografii żelowej zestawiono w Tabeli 2. Tabela 2. Średnie masy molowe oligomerów 3HB4HB otrzymanych na drodze pirolizy oraz degradacji indukowanej karboksylanami po odpowiednich czasach prowadzenia procesu. a proces prowadzony w 180 C, b proces prowadzony w 290 C. Degradacja indukowana karboksylanami a Lp. Czas trwania Degradacji [min] M n [g/mol] Lp. Piroliza b Czas trwania Degradacji [min] M n [g/mol] W celu porównania procesów pirolizy i indukowanej karboksylanami degradacji termicznej, czasy degradacji biopoliestru P3HB4HB wyznaczono doświadczalnie tak by średnie masy molowe oligomerów uzyskanych w obu procesach były zbliżone. Przedstawione w Tabeli 2 wyniki wskazują, na znaczne obniżenie stabilności termicznej dla biopoliestru P3HB4HB poddanego procesowi degradacji termicznej z dodatkiem karboksylanu. Otrzymane wyniki wykazały zatem, że wprowadzenie soli karboksylowej do środowiska reakcji, umożliwia prowadzenie procesu degradacji P3HB4HB w znacznie niższej temperaturze niż temperatura pirolizy tego kopoliestru. Ponadto, możliwa jest kontrola procesu degradacji P3HB4HB przez stosowanie różnych czasów prowadzenia procesu, co jest wysoce istotne w przypadku, kiedy chcemy wykorzystać proces degradacji polimeru jako metodę syntezy użytecznych oligomerów. Badania struktury oligomerycznych produktów uzyskanych z biopoliestru P3HB4HB w wyniku pirolizy oraz degradacji termicznej indukowanej karboksylanami przeprowadzono z wykorzystaniem spektroskopii 1 H NMR oraz spektrometrii mas ESI-MS. Dla zobrazowania różnic w strukturze otrzymanych oligomerów porównano, najbardziej istotne zakresy widm 14

15 1H NMR, uzyskanych dla oligomerów3hb4hb po określonych czasach prowadzenia procesów pirolizy i degradacji termicznej indukowanej karboksylanami, Rysunki 4 i 5. Na Rysunku 4 przedstawiono wybrane fragmenty widm 1 H NMR dla nielotnych produktów uzyskanych w procesie pirolizy P3HB4HB. Na wszystkich widmach obserwowane były sygnały charakterystyczne dla protonów jednostek konstytucyjnych 3HB oraz 4HB. Ponadto na widmach widoczne są również sygnały charakterystyczne dla protonów grup końcowych. w szczególności sygnały charakterystyczne dla protonów ugrupowania krotonianowego (δ=1.85, 5.8, 6,95 ppm), potwierdzające obecność liniowych oligomerów z krotonianową grupą końcową. Dodatkowo na widmach obserwowano deformacje sygnałów charakterystycznych dla protonów jednostek 4-hydroksymaślanowych (δ=1.95, 2.3, 4.3 ppm). Deformacja sygnałów, odpowiadających protonom grup metylenowych jednostek 4HB, postępowała wraz z obniżeniem średniej masy molowej otrzymanych oligomerów. Dla oligomeru o najniższej średniej masie molowej zaobserwowano sygnały charakterystyczne dla protonów ɣ-butyrolaktonu, Rysunk 4. Rysunek 4. Widmo 1 H NMR nielotnych produktów otrzymanych po określonych czasach pirolizy biopoliestru P3HB4HB Przeprowadzona z wykorzystaniem 1 H NMR analiza struktury nielotnych produktów pirolizy P3HB4HB uzyskanych po określonych czasach potwierdziła, że produktami jest mieszanina liniowych i cyklicznych oligomerów 3HB4HB, jak opisano to wcześniej w literaturze. Podobnie jak w przypadku oligomerów otrzymanych na drodze pirolizy technikę 1H NMR wykorzystano również do analizy nielotnych produktów uzyskanych w procesie 15

16 degradacji termicznej indukowanej karboksylanami biopoliestru P3HB4HB. Analiza widm 1H NMR, podobnie jak w przypadku oligomerów otrzymanych w procesie pirolizy potwierdziła obecność sygnałów charakterystycznych dla jednostek konstytucyjnych 3HB oraz 4HB. Dodatkowo obserwowano sygnały odpowiadające protonom grup końcowych i podobnie jak to miało miejsce w przypadku pirolizy na widmach widoczne były sygnały charakterystyczne dla krotonianowej grupy końcowej (δ=1.85, 5.8, 6,95 ppm). Nie obserwowano natomiast zmian w strukturze sygnałów pochodzących od jednostek 4-hydroksymaślanowych (δ=1.95, 2.3, 4.3 ppm), jak miało to miejsce w przypadku pirolizy. Wybrane zakresy widm 1 H NMR dla oligomerów otrzymanych na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami po różnych czasach prowadzenia procesu przedstawiono na Rysunku 5. Rysunek 5. Widmo 1H NMR nielotnych produktów degradacji termicznej indukowanej karboksylanami biopoliestru P3HB4HB. Przeprowadzona z wykorzystaniem 1 H NMR analiza struktury nielotnych produktów procesu indukowanej karboksylanami degradacji termicznej P3HB4HB wykazała, obecność liniowych oligomerów 3HB4HB zakończonych krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi. Nielotne produkty procesu pirolizy oraz indukowanej karboksylanami degradacji termicznej naturalnego P3HB4HB były również charakteryzowane z wykorzystaniem spektrometrii mas ESI-MS. Obecność w łańcuchach oligomerów 3HB4HB izomerycznych 3-hydroksymaślanowychi 4-hydroksymaślanowych jednostek konstytucyjnych o identycznych masach molowych, które są nierozróżnialne w spektrometrii mas, sprawia, że spektrometria 16

17 mas daje ograniczone możliwości w analizie mikrostruktury łańcucha oligomerów P3HB4HB, jednak jest ona użyteczną metodą w określaniu struktury chemicznej grup końcowych. Widma masowe uzyskane dla oligomerów 3HB4HB otrzymanych na drodze pirolizy oraz degradacji termicznej indukowanej karboksylanami były bardzo podobne. Na obu widmach obserwowano jedną serię jonów (występujących regularnie co 86 Da) przy takich samych wartościach m/z. Obecność w produktach degradacji liniowych oligomerów 3HB4HB zakończonych krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi oraz cyklicznych oligomerów 3HB4HB o identycznych masach molowych sprawia, że oligomery te są nierozróżnialne w spektrometrii mas. Problemu rozróżnienia cyklicznych i liniowych oligomerów nie rozwiązało również wykonanie eksperymentów fragmentacyjnych ESI-MS/MS dla wybranych jonów. Niezależnie czy jonem fragmentowany był jon wyizolowany z widma masowego produktów pirolizy czy produktów uzyskanych w wyniku indukowanej karboksylanami degradacji termicznej P3HB4HB, uzyskane widma ESI-MS/MS był również identyczne. W kolejnym etapie badań dla rozróżnienia liniowych i cyklicznych oligomerów wykorzystano metodę pośrednią, polegającą na przeprowadzeniu selektywnej reakcji chemicznej z liniowymi oligomerami zakończonymi krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi. Do tego celu wybrano reakcję estryfikacji grupy karboksylowej trimetylosillilodiazometanem. Reakcja ta przebiega w sposób ilościowy z grupą karboksylową liniowych oligomerów. Jednocześnie trimetylosillilodiazometanem nie reaguje z ugrupowaniem estrowym obecnym w oligomerach cyklicznych. Otrzymane produkty procesu derywatyzacji oligomerów otrzymanych na drodze pirolizy oraz degradacji termicznej indukowanej karboksylanami P3HB4HB analizowano ponownie techniką spektrometrii mas. Widmo masowe otrzymane dla oligomerów otrzymanych na drodze indukowanej karboksylanami degradacji termicznej P3HB4HB i poddanych następnie derywatyzacji zawierało jedna serią sygnałów B przesuniętą w stosunku do serii przed derywatyzacja o 14 Da. Seria ta reprezentuje oligomery 3HB4HB zakończone krotonianowymi i estrowymi grupami końcowymi. Natomiast widmo ESI-MS produktów derywatyzacji oligomerów otrzymanych na drodze pirolizy zawierało oprócz serii B, dodatkową serię sygnałów C występującą przy wartościach m/z identycznych jak seria główna w widmie produktów pirolizy przed derywatyzacją. Na Rysunku 6, przedstawiono rozszerzone zakresy widm ESI-MS uzyskanych dla produktów derywatyzacji (a) oligomerów 3HB4HB uzyskanych na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami (b) oligomerów 3HB4HB uzyskanych z pirolizy. 17

18 Rysunek 6. Rozszerzony zakres widma ESI-MS dla produktów procesu derywatyzacji (a) oligomerów 3HB4HB otrzymanych na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami (b) oligomerów 3HB4HB uzyskanych na drodze pirolizy W celu potwierdzenia struktury oligomerów uzyskanych po derywatyzacji, zarówno produktów pirolizy biopoliestru P3HB4HB jak i produktów jego degradacji termicznej indukowanej karboksylanami, wykonano eksperymenty fragmentacyjne ESI-MS/MS dla jonów należących do serii B i C. Uzyskane widma fragmentacyjne potwierdziły, że seria B na obu widmach uzyskanych dla oligomerów po derywatyzacji reprezentuje oligomery 3HB4HB zakończone krotonianowymi i estrowymi grupami końcowymi. Widmo fragmentacyjne wykonane dla jonu oznaczonego na Rysunku 6 jako C, było identyczne jak widmo fragmentacyjne dla jonów z widma przed derywatyzacją, co potwierdza obecności oligomerów cyklicznych, które w warunkach procesu derywatyzacji nie uległy reakcji estryfikacji. Przeprowadzony eksperyment wykorzystujący selektywność procesu derywatyzacji w stosunku do liniowych oligomerów oraz analiza widm masowych produktów po derywatyzacji wykazały, iż proces pirolizy biopoliestru P3HB4HB prowadzi do otrzymania mieszaniny oligomerów cyklicznych i liniowych, natomiast degradacja termiczna indukowana karboksylanami tego biopoliestru prowadzi do otrzymania jednorodnych oligomerów liniowych zakończonych krotonianowymi i karboksylowymi grupami końcowymi. Badania obejmujące metodę kontrolowanej degradacji termicznej indukowanej karboksylanami kopolimeru P3HB4HB były przedmiotem publikacji naukowej:. M. Kwiecień, M. Kawalec, P. Kurcok, M. Kowalczuk, G. Adamus; Selective carboxylate induced degradation of 18

19 poly(3-hydroxybutyrate co-4 hydroxybutyrate) source of linear uniform 3HB4HB oligomers Polymer Degradation and Stability 2014, 110, Synteza nowych materiałów polimerowych zawierających segmenty strukturalne pochodzące od biopoliestrów PHA Badania nad syntezą poliestrów alifatycznych na drodze kondensacji oligestrodioli PHA z dichlorkiem kwasu sebacynowego W ramach niniejszej pracy podjęto próby modyfikacji właściwości biopoliestrów PHA poprzez syntezę na drodze polikondensacji nowych kopoliestrów, zawierających segmenty strukturalne pochodzące od PHA, połączonych jednostkami konstytucyjnymi zawierającymi stosunkowo długi łańcuch alifatyczny. Zgodnie z obecnym stanem wiedzy uzyskanie tego typu poliesetrów nie jest możliwe na drodze biotechnologicznej. W syntezie poliestrów wykorzystano oligoestrodiole otrzymane na drodze kontrolowanego procesu redukcji wybranych biopoliestrów z grupy PHA. Do badań obejmujących syntezę nowych biodegradowalnych materiałów polimerowych na drodze polikondensacji wybrano oligoestrodiole otrzymane z biopoliestru PHBH o średnich masach molowych w zakresie od 1200 do 3500 g/mol oraz dichlorek kwasu sebacynowego, (Schemat 4). H R O R O R O O O n O H + Cl O O Cl H R O R O R O O O n O O O O x H Schemat 4. Reakcja polikondensacji oligoestrodioli PHBH z dichlorkiem kwasu sebacynowego. R = CH 3 dla jednostek 3HB oraz R = C 3H 7 dla jednostek 3HH. Proces polikondensacji prowadzono w masie, stosując równomolowy stosunek oligoestrodiolu do dichlorku kwasu sebacynowego. Wykorzystanie w reakcji polikondensacji oligoestrodioli o zróżnicowanych średnich masach molowych przy zachowaniu równomolowego stosunku obu substratów, w założeniu miało prowadzić do otrzymania nowych poliestrów o zróżnicowanej zawartości jednostek pochodzących od kwasu sebacynowego. W wyniku przeprowadzonych polikondensacji otrzymano terpoliestry zawierające trzy rodzaje jednostek 19

20 konstytucyjnych: jednostki 3-hydroksymaślanowe (3HB), jednostki 3-hydroksyheksanianowe (3HH) oraz jednostki konstytucyjne pochodzące od kwasu sebacynowego (SEB). Strukturę oraz skład chemiczny otrzymanych terpoliestrów określono z zastosowaniem techniki NMR. Ze względu na fakt, iż na widmie protonowym sygnały odpowiadające poszczególnym protonom jednostek konstytucyjnych nachodzą na siebie co uniemożliwia rzetelną analizę struktury w badaniach struktury wykorzystano technikę węglowego magnetycznego rezonansu jądrowego ( 13 C NMR). Średnie masy molowe otrzymanych terpoliestrów określono z zastosowaniem GPC i zestawiono w Tabeli 3. Właściwości termiczne otrzymanych na drodze polikondensacji poliestrów określono z wykorzystaniem technik TGA oraz DSC. Techniką DSC wyznaczono temperatury przejścia szklistego T g oraz temperatury topnienia T m. Wyniki analiz TGA (temperatura maksymalnej szybkości rozkładu T max) oraz DSC zestawione zostały w Tabeli 3. Dla porównania właściwości otrzymanych materiałów wykorzystano terpoliestry o zbliżonych średnich masach molowych. Dodatkowo właściwości nowo otrzymanych materiałów zestawiono z właściwościami wyjściowego biopoliestru PHBH, użytego do syntezy oligoestrodioli PHBH. Tabela 3. Zestawienie wartości średnich mas molowych, stopnia dyspersyjności oraz właściwości termicznych T g, T m oraz T max dla otrzymanych terpoliestrów. Lp. Poliester M w M w/m n T g T m T max [ C] [ C] [ C] 0. PHBH ,5 10,0 115, poli(86%3hb-ko-10%3hh-ko-4%seb) ,0-11,0 99, poli(82%3hb-ko-12%3hh-ko-6%seb) ,6-12,7 95, poli(80%3hb-ko-11%3hh-ko-9%seb) ,7-14,9 92,7 298 Analiza danych zawartych w Tabeli 3 wskazuje, że otrzymane terpoliestry charakteryzują się wyższą stabilnością termiczną niż wyjściowy biopoliester PHBH. Ponadto, zawartość jednostek konstytucyjnych pochodzących od kwasu sebacynowego ma bezpośredni wpływ na właściwości termiczne terpoliestrów. Wartość temperatury maksymalnej szybkości rozkładu T max, wzrasta wraz ze wzrostem zawartości jednostek konstytucyjnych SEB w łańcuchu poliestrowym. Wyniki badań otrzymanych terpoliestrów przeprowadzone metodą DSC wskazują, iż wraz ze wzrostem zawartości jednostek SEB w łańcuchu poliestrowym obniża się wartość temperatury przejścia szklistego T g osiągając najniższą wartość, dla analizowanych 20

21 materiałów, na poziomie -14,9 C dla terpoliestru o składzie poli(80%3hb-ko-11%3hh-ko-9%seb). Jednocześnie wraz ze wzrostem zawartości jednostek SEB w łańcuchu poliestrowym obserwuje się również spadek T m. Porównując wartości T g oraz T m otrzymanych terpoliestrów z wartościami tych wielkości dla wyjściowego biopoliestru PHBH widoczny jest zdecydowany spadek wartości T g, przy zachowaniu relatywnie wysokiej wartości T m, co ma duże znaczenie dla możliwości wykorzystania otrzymanych poliestrów jako materiałów konstrukcyjnych Badania nad syntezą kopolimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB na drodze ROP β-butyrolaktonu inicjowanej makroinicjatorami Kopoliestry blokowe PHA-blok-[R,S]PHB otrzymano na drodze polimeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowanej makroinicjatorami 3HB4HB zakończonymi krotonianowymii karboksylanowymi grupami końcowymi, które otrzymano z biopoliestru P3HB4HB metodą kontrolowanej degradacji termicznej indukowanej karboksylanami. Otrzymanie kopolimerów blokowych zawierających w swej strukturze bloki [R,S]PHB miało na celu modyfikację właściwości fizyko-chemicznych biopoliestrów PHA których głównymi wadami jest wysoka krystaliczność, sztywność i kruchość. Wprawdzie, biopoliestry zawierające w swojej strukturze jednostki pochodzące od kwasu 4-hydroksymasłowego (4HB), są mniej sztywne i kruche niż biopoliester PHB. Jednakże obecnie komercyjnie dostępne są tylko P3HB4HB z niską zawartością jednostek 4HB i w przypadku specjalnych zastosowań medycznych konieczna jest dalsza modyfikacja tych biopoliestrów metodami fizyko-chemicznymi. Otrzymane kopolimery blokowe P3HB4HB-blok-[R,S]PHB, charakteryzowano z wykorzystaniem technik: GPC, NMR oraz DSC. Otrzymano kopolimery blokowe P3HB4HB-blok-[R,S]PHB o zróżnicowanej średniej masie molowej M n w zakresie od 7100 do g/mol (Tabela 4). 21

22 R O R1 O R O - O x O O + M m 1. H 3 C O O (R,S) BL 2. H + R O R1 O R O R O O x O x O m O n H P3HB4HB-blok-[R,S]PHB Schemat 5. Synteza kopolimerów blokowych P3HB4HB-blok-[R,S]PHB, na drodze polimeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowana makroinicjatorami P3HB4HB, R CH 3; R1 = CH 3 i x = 1 jednostka 3HB : R1 = H i x =2 dla 4HB. M + - kation tetrabutyloamoniowy Własności termiczne otrzymanych polimerów blokowych P3HB4HB-blok-[R,S]PHB, określano z zastosowaniem techniki DSC. W oparciu o uzyskane krzywe DSC wyznaczono temperatury przejścia szklistego T g, temperatury topnienia T m oraz zmiany entalpi topnienia ΔH m. Dla zobrazowania różnic we właściwościach termicznych otrzymanych kopolimerów blokowych w Tabeli 4 zamieszczono również T g, T m i ΔH m wyznaczone dla [R,S]PHB jak również dla makroinicjatora P3HB4HB użytego do syntezy kopolimerów. Tabela 4. Porównanie właściwości termicznych otrzymanych kopolimerów blokowych P3HB4HB-blok-[R,S]PHB, makroinicjatora P3HB4HB użytego do ich syntezy oraz [R,S]PHB. Lp. Próbka % zawartość bloku [R,S]PHB T m [ C] ΔH m [J/g] T g [ C] w kopolimerze 1. [R,S]PHB ,6 (M n=10000 g/mol) 2. Makroinicjator P3HB4HB ,9-7,7 3. P3HB4HB-blok-[R,S]PHB ,4-0,6 4. P3HB4HB-blok-[R,S]PHB ,5 1,1 5. P3HB4HB-blok-[R,S]PHB ,4 3,1 22

23 Analiza DSC wykonana dla kopolimerów blokowych P3HB4HB-blok-aPHB wykazała, że obserwujemy tylko jedną temperaturę przejścia szklistego T g. Wartość temperatury przejścia szklistego T g dla kopolimerów blokowych o zmiennej zawartości bloków [R,S]PHB przyjmuje wartości pośrednie pomiędzy wartościami dla makroinicjatora i homopolimeru [R,S]PHB. Wartość T g kopolimeru jest bliższa wartości T g dla homopolimeru [R,S]PHB, im większa jest zawartość procentowa bloku [R,S]PHB. Ponadto analiza DSC wykazała, że obecność w kopolimerze bloków pochodzących od [R,S]PHB obniża w sposób znaczący krystaliczność materiału, na co wskazują różnice ΔH m obserwowane dla makroinicjatora oraz kopolimerów blokowych. Wartość ΔH m jest tym mniejsza im większa jest zawartość procentowa bloku [R,S]PHB. 3.3 Przykłady zastosowań kopolimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB oraz terpoliestrów poli(3hb-ko-3hh-ko-seb) w obszarze medycyny W ramach niniejszej pracy przeprowadzono wstępne badania nad wykorzystaniem otrzymanych terpoliestrów poli(3hb-ko-3hh-ko-seb) do wytwarzania trójwymiarowych porowatych materiałów z przeznaczeniem do wykorzystania jako rusztowania do hodowli komórkowych. Obecnie trójwymiarowe porowate podłoża o połączonej ale nieregularnej strukturze porów są wytwarzane wieloma metodami. W niniejszej pracy do wytworzenia tego typu podłoży zastosowano jeden z najprostszych sposobów wytwarzania podłoży technikę wymywania. Na Rysunku 7 przedstawiono mikrofotografie SEM otrzymanych w ten sposób trójwymiarowych podłoży z zastosowaniem terpoliestru poli(3hb-ko-3hh-ko-seb). Rysunek 7. Obrazy, podłoża wykonanego z terpoliestru poli(3hb-ko-3hh-ko-seb) metodą wymywania, wykonane z pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (SEM). 23

24 Zdjęcia SEM podłoża wykonanego z terpoliestru poli(3hb-ko-3hh-ko-seb), potwierdziły, że otrzymane podłoże ma trójwymiarową, rozwiniętą strukturę przestrzenną. Ponadto, otrzymane trójwymiarowe podłoża są stabilne, zachowują nadany im kształt umożliwiający ich swobodne użycie do hodowli komórkowych. Badania biologiczne potwierdzające ich przydatność do hodowli komórkowych prowadzone są obecnie we współpracy z Uniwersytetem w Wolverhampton. Opracowana w ramach niniejszej pracy metoda kontrolowanej degradacji biopoliestrów alifatycznych na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami lub znana wcześniej zasadowa hydroliza biopoliestrów, pozwalają na otrzymanie szerokiej gamy oligomerów PHA zakończonych krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi o kontrolowanych średnich masach molowych. We wcześniejszych badaniach wykazaliśmy, że otrzymane w tych procesach oligomery PHA zastosowane jako makroinicjatory anionowej polimeryzacji β-butyrolaktonu, prowadzą do otrzymania nowych kopolimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB zawierających bloki pochodzące od izotaktycznego biopoliestru PHA oraz ataktycznego[r,s]phb. Właściwości takich kopolimerów mogą być kontrolowane zarówno poprzez dobór odpowiedniego makroinicjatora, jak również poprzez długość bloków [R,S]PHB powstałych na drodze polimeryzacji β-butyrolaktonu. Wstępne próby wykorzystania otrzymanych kopolimerów blokowych z rodziny PHA-blok-[R,S]PHB prowadzone były we współpracy z Fundacją Rozwoju Kardiochirurgii. W pierwszym etapie badań podjęto próby wykorzystania kopolimerów blokowych do wytwarzania cienkich powłok na biomimetycznym poliuretanie dla zastosowań w protezie serca. Wyniki przeprowadzonych badań wskazują, że opracowane biodegradowalne materiały polimerowe charakteryzują się korzystnymi właściwościami dla ich potencjalnych zastosowań jako powłoki np. protezy serca. Jednak konieczne jest przeprowadzenie dalszych bardziej szczegółowych badań biologicznych oraz przeprowadzenia testów związanych z przyczepnością badanych powłok do protezy serca w warunkach stymulujących prace protezy serca. Kolejną próbą wykorzystania kopolimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB było zastosowanie tych materiałów do uszczelniania protez naczyń krwionośnych wykonywanych z włókien poliestrowych. W ramach prac nad możliwością wykorzystania kopolimerów blokowych PHA-blok-[R,S]PHB, protezy naczyniowe DALLON H pokryte zostały otrzymanymi kopolimerami blokowymi. Na Rysunku 7 przedstawiono zdjęcia mikroskopowe (SEM), protezy nieuszczelnionej oraz protezy pokrytej kopolimerem PHB-blok-[R,S]PHB. 24

25 Rysunek 7. Zdjęcia SEM protezy naczyniowej DALLON H; A) proteza nieuszczelniona B) proteza pokryta kopolimerem blokowym PHB-blok-[R,S]PHB. Uszczelnione protezy poddano następnie próbie mającej wykazać, czy zastosowany materiał zwiększy szczelność badanej protezy naczyniowej. Uszczelnioną protezę poddano badaniom przepuszczalności wody zgodnie z normą PN-79/P : Metody badań wyrobów włókienniczych. Dziane artykuły medyczne-protezy naczyń krwionośnych. Wyznaczanie przepuszczalności wody. Eksperyment ten wykazał, że zastosowanie kopolimerów blokowych jako czynnika uszczelniającego protezy naczyń krwionośnych jest zasadne. Badania dotyczące syntezy kopolimerów blokowych oraz wstępne próby ich wykorzystania były przedmiotem publikacji: G. Adamus, W. Sikorska, H. Janeczek, M. Kwiecień, M. Sobota, M. Kowalczuk "Novel block copolymers of atactic PHB with natural PHA for cardiovascular engineering: Synthesis and characterization, European Polymer Journal, 2012, 48, oraz rozdziału w monografii: M. Kowalczuk, G. Adamus, W. Sikorska, M. Sobota, M. Kwiecień, K. Mańczyk, Technologie inżynierii materiałowej i technologie metrologiczne dla potrzeb polskich protez serca współautorstwo rozdziału Inżynieria biomateriałów zawierających biopoliestry alifatyczne i ich syntetyczne analogi dla potrzeb programu Polskie Sztuczne Serce, ISBN , Grudzień Podsumowanie i wnioski Podjęte w ramach niniejszej rozprawy badania ukierunkowane były na opracowanie nowych biokompatybilnych, w pełni biodegradowalnych materiałów polimerowych o kontrolowanej strukturze molekularnej i założonych właściwościach fizyko-chemicznych, zawierających segmenty strukturalne pochodzące od biopoliestrów PHA. Kluczowym etapem w syntezie nowych materiałów polimerowych było opracowanie metod kontrolowanej degradacji biopoliestrów PHA pozwalających na otrzymanie reaktywnych makroinicjatorów i makromonomerów PHA. W ramach prowadzonych badań opracowano dwie 25

26 metody kontrolowanej degradacji PHA. Pierwsza z nich to metoda selektywnej redukcji PHA z wykorzystaniem borowodorku litu (LiBH 4) jako czynnika redukującego. Metoda ta umożliwiła otrzymanie jednorodnych oligomerów PHA zakończonych dwoma grupami hydroksylowymi oligoestrodioli. Na podstawie przeprowadzonych badań struktury otrzymanych oligoestrodioli PHA z wykorzystanie 1 H NMR i ESI-MS, wykazano, że opracowana metoda jest uniwersalna dla PHA, zróżnicowanych pod względem budowy chemicznej jednostek komonomerycznych jak i mikrostruktury łańcucha. Nieobecność w widmach 1H NMR dodatkowych sygnałów, pochodzących od innych grup końcowych wskazuje na wysoką selektywności opracowanej metody. Jest to wysoce istotne dla możliwości wykorzystania oligoestrodioli PHA w dalszej syntezie nowych materiałów polimerowych o założonej strukturze i właściwościach. Druga z opracowanych metod kontrolowanej degradacji PHA to degradacja termiczna indukowana karboksylanami. Wykazano, że w obecności soli karboksylowych proces degradacji termicznej biopoliestru P3HB4HB może być prowadzony w znacznie niższej temperaturze niż jego piroliza. W wyniku procesu degradacji termicznej P3HB4HB indukowanej karboksylanami otrzymano liniowe oligomery 3HB4HB, zakończone krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi. Uzyskane wyniki wskazują, że w obecności czynnika zdolnego do oderwania protonu od węgla C2 jednostki konstytucyjnej 3HB, degradacja biopoliestru P3HB4HB przebiega najprawdopodobniej zgodnie z mechanizmem α-deprotonacji. Wykazano, że możliwa jest kontrola procesu degradacji P3HB4HB co ma istotne znaczenie dla wykorzystania tego procesu jako metody syntezy użytecznych oligomerów. Oligoestrodiole PHA otrzymane na drodze selektywnej redukcji biopoliestrów wykorzystano w reakcji polikondensacji z dichlorkiem kwasu sebacynowego. Celem tak zaplanowanej syntezy było otrzymanie poliestrów, zawierających segmenty strukturalne pochodzące od PHA połączone alifatycznymi łącznikami pochodzącymi od wbudowanego kwasu sebacynowego. W wyniku przeprowadzonych syntez otrzymano terpoliestry poli(3hb-ko-3hh-ko-seb) zawierające segmenty strukturalne pochodzące od biopoliestru PHBH o zróżnicowanej masie molowej oraz zróżnicowanej zawartości jednostek konstytucyjnych pochodzących od kwasu sebacynowego. Oligomery otrzymane na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami biopoliestru P3HB4HB, posiadające krotonianowe i karboksylanowe grupy końcowe, wykorzystano jako makroinicjatory anionowej polimeryzacji z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu. Na tej drodze otrzymano kopolimery blokowe P3HB4HB-blok-[R,S]PHB zawierające segmenty strukturalne od izotaktycznego biopoliestru oraz bloki pochodzące od ataktycznego [R,S]PHB. Charakterystykę nowych materiałów polimerowych otrzymanych zarówno na drodze polikondensacji jak i polimeryzacji anionowej przeprowadzono z wykorzystaniem takich technik analitycznych jak: GPC, 1H i 13 C NMR, TGA oraz DSC. Przeprowadzone badania pozwoliły na określenie struktury chemicznej nowych 26

27 materiałów polimerowych oraz określenie zależności pomiędzy strukturą chemiczną a właściwościami fizyko-chemicznymi nowych materiałów. Ostatnim etapem badań realizowanych w ramach niniejszej pracy doktorskiej było podjęcie prób wykorzystania otrzymanych nowych materiałów polimerowych w obszarze medycyny. Uzyskane w ramach niniejszej pracy kopolimery blokowe PHA-blok-[R,S]PHB zostały wykorzystane do wytwarzania powłok na biomimetycznym poliuretanie dla zastosowań w protezie serca oraz uszczelniania protez naczyń krwionośnych. Badania w tym zakresie były prowadzone we współpracy z Fundacją Rozwoju Kardiochirurgii im. prof. Zbigniewa Religi w Zabrzu w ramach Programu Polskie Sztuczne Serce. Nowo otrzymane terpoliestry wykorzystano do wytworzenia trójwymiarowych podłoży dla hodowli komórkowych. Badania biologiczne mające wykazać ich użyteczność w hodowli komórek prowadzone są obecnie we współpracy z Uniwersytetem w Wolverhampton. Najważniejsze poznawcze wyniki badań 1. Opracowanie metody kontrolowanej degradacji wybranych PHA przebiegającej na drodze selektywnej redukcji z zastosowaniem borowodorku litu jako czynnika redukującego, prowadzącej do otrzymania oligoestrodioli o założonej strukturze i średnich masach molowych. 2. Opracowanie selektywnej metody kontrolowanej degradacji biopoliestru P3HB4HB przebiegającej na drodze degradacji termicznej indukowanej karboksylanami, pozwalającej na otrzymanie liniowych oligomerów z krotonianowymi i karboksylanowymi grupami końcowymi 3. Opracowanie warunków syntezy nowych materiałów polimerowych o kontrolowanej strukturze molekularnej i założonych właściwościach fizyko-chemicznych, zawierających segmenty strukturalne pochodzące od biopoliestrów dla przewidywanych zastosowań w medycynie, na drodze: polikondensacji oligoestrodioli PHBH z dichlorkiem kwasu sebacynowego prowadząca do otrzymania terpoliestrów poli(3hb-ko-3hh-ko-seb), anionowej polimeryzacji z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu z wykorzystaniem makroinicjatorów P3HB4HB, zawierających krotonianowe i karboksylanowe grupy końcowe, prowadzącej do otrzymania kopolimerów blokowych P3HB4HB-blok-[R,S]PHB. 4. Charakterystyka struktury otrzymanych materiałów polimerowych oraz określenie zależności pomiędzy budową chemiczną a ich właściwościami fizyko-chemicznymi 5. Wykazanie przydatności nowych materiałów polimerowych w obszarze zastosowań medycznych. 27