Koniugaty substancji biologicznie czynnych z biodegradowalnymi oligomerami polihydroksyalkanianów jako systemy kontrolowanego uwalniania pestycydów

Transkrypt

1 Iwona Kwiecień Koniugaty substancji biologicznie czynnych z biodegradowalnymi oligomerami polihydroksyalkanianów jako systemy kontrolowanego uwalniania pestycydów Autoreferat rozprawy doktorskiej wykonanej pod kierunkiem dr hab. Grażyny Adamus, prof. nadzw. PAN w Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych Polskiej Akademii Nauk Zabrze 2015

2 Lista skrótów używanych w autoreferacie ESI-MS n wielostopniowa spektrometria mas z jonizacją metodą elektrorozpylania (ang. Electrospray Ionisation Mass Spectrometry) GPC chromatografia żelowa (ang. Gel Permeation Chromatography) NMR Spektroskopia magnetycznego rezonansu jądrowego (ang. Nuclear Magnetic Resonance) 2,4-D kwas (2,4-dichlorofenoksy)octowy MCPA kwas (4-chloro-2-metylofenoksy)octowy PHA polihydroksyalkaniany PHB, poli(3hb) poli(3-hydroksymaślan) poli(3hb-ko-4hb) poli(3-hydroksymaślan-ko-4-hydroksymaślan) poli(3hb-ko-3hv) poli(3-hydroksymaślan-ko-3-hydroksywalerian) poli(3hb-ko-3hh) poli(3-hydroksymaślan-ko-3-hydroksyheksanian) TSA H 2 monohydrat kwasu p-toluenosulfonowego 1. Wstęp Rosnąca liczba ludności oraz malejące obszary rolne, kosztem rozrastających się terenów miejskich i obszarów przemysłowych, wymuszają konieczność zwiększania efektywności produkcji rolnej. W celu ograniczenia strat w plonach oraz utrzymania wysokiej jakości produktów rolnych stosowane są pestycydy. 1 Pestycydy definiowane są jako substancje, a także mieszaniny substancji chemicznych lub biologicznych przeznaczone do odstraszania, niszczenia jak również kontrolowania szkodników lub regulowania wzrostu roślin. 2 Ze względu na zastosowanie, wśród pestycydów wyróżnia się m.in. herbicydy, czyli pestycydy chwastobójcze, fungicydy - grzybobójcze, bakteriocydy - bakteriobójcze, insektycydy - owadobójcze. 3 W przypadku konwencjonalnych form pestycydów, które są lotne i hydrofilowe, występują duże straty składników aktywnych spowodowane warunkami środowiskowymi; pestycydy są wymywane przez opady oraz odparowują, trafiając do gleby, wód powierzchniowych i gruntowych oraz do atmosfery. 4 Dlatego tez obecnie obserwuje się wzrost zainteresowania systemami kontrolowanego uwalniania pestycydów, których celem jest dostarczanie substancji czynnej do określonego miejsca w określonej ilości przez odpowiedni czas. 5 Systemy kontrolowanego uwalniania dzielą się na: (i) systemy zawierające fizycznie rozproszone składniki aktywne, np. pokrywany granulat czy matryce polimerowe; (ii) systemy zawierające pestycyd związany kowalencyjnie z polimerem. 6,7 Ze względu na zmniejszoną lotność oraz zwiększoną hydrofobowość pestycydów znajdujących się w systemach kontrolowanego uwalniania, w mniejszym stopniu trafiają one do atmosfery, gleby czy wód gruntowych niż konwencjonalne formy pestycydów, a także są bezpieczniejsze dla pracowników narażonych na kontakt z pestycydami. Dodatkowo ograniczenie strat substancji aktywnych do środowiska pozwala zmniejszyć ilość aplikacji w czasie danego sezonu. 8 Bardzo ważną rolę w opracowywaniu systemów kontrolowanego uwalniania stanowią polimery biodegradowalne, które w środowisku ulegają biodegradacji do produktów bezpiecznych dla przyrody ożywionej i nieożywionej. Przykładem biodegradowalnych polimerów stosowanych jako nośniki w systemach kontrolowanego uwalniania są poliestry alifatyczne polihydroksyalkaniany (PHA), 9 które są wytwarzane przez wiele gatunków mikroorganizmów jako materiał zapasowy, stanowiący nawet do 80% suchej masy komórki. 10,11 PHA mogą być również produkowane w procesach biotechnologicznych z wykorzystaniem jako źródła węgla surowców ze źródeł 2

3 odnawialnych, takich jak węglowodany, tłuszcze i alkohole lub z odpadów, takich jak glicerol z produkcji biodiesla, mączka mięsno-kostna czy melasa. 12,13 pracowanie technologii produkcji wybranych PHA na skalę przemysłową sprawia, że polimery te są stosunkowo łatwo dostępne na rynku światowym. 14 Naturalne PHA ulegają biodegradacji, a powstałe w jej wyniku produkty są bioasymilowane przez różne szczepy bakterii. 15,16 Syntetyczne analogi PHA można otrzymać na drodze polimeryzacji z otwarciem pierścienia odpowiednich β-laktonów. Poli([R,S]-3-hydroksymaślan) ([R,S]-PHB) można otrzymać na drodze polimeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β- butyrolaktonu. 17 Syntetyczny [R,S]-PHB ulega głównie degradacji hydrolitycznej, a powstałe niskocząsteczkowe oligomery są bioasymilowane przez różne szczepy bakterii. 18 Syntetyczny [R,S]- PHB degraduje również enzymatycznie pod wpływem niektórych enzymów zewnątrzkomórkowych. 19,20 W literaturze opisano wiele przykładów zastosowania otrzymanych na drodze biotechnologicznej polihydroksyalkanianów w systemach kontrolowanego uwalniania pestycydów takich jak: mikrosfery z poli([r]-3-hydroksymaślanu) 21,22 lub mikrosfery 23 i folie 24 z poli([r]-3- hydroksymaślanu-ko-[r]-3-hydroskywalerianu). W przypadku tego typu systemów, substancja biologicznie czynna jest rozproszona w matrycy PHA, jej uwalnianie zależy głównie od fizycznego rozpadu polimeru, co wiąże się ze słabą kontrolę szybkości uwalniania. Ponadto, uwalnianie pestycydu zachodzi w stosunkowo krótkim czasie (w ciągu dni) w porównaniu z długością sezonu wegetacji roślin (od wiosny do jesieni). Biorąc pod uwagę powyższe ograniczenia obiecujące wydaje się opracowanie systemów kontrolowanego uwalniania, w których pestycyd byłby związany kowalencyjnie z nośnikiem polimerowym poprzez ulegające hydrolizie wiązanie estrowe. Pestycyd chemicznie związany z polihydroksyalkanianami (zarówno biopoliestrami jak i ich syntetycznymi analogami) może zostać uwolniony na skutek degradacji hydrolitycznej lub biodegradacji enzymatycznej łańcucha poliestrowego. Dotychczas w literaturze opisano zastosowania syntetycznych oligomerów 3-hydroksymaślanu jako nośnika w systemach kontrolowanego uwalniania leków, tj. Penicylina G, 25 kwas acetylosalicylowy, 26 oraz substancji stosowanych w przemyśle kosmetycznym, tj. kwas liponowy Cel pracy Stosowanie konwencjonalnych form pestycydów, które są lotne i hydrofilowe, wiąże się z dużymi stratami składników aktywnych spowodowanymi warunkami środowiskowymi. Rozwiązaniem wydają się być systemy kontrolowanego uwalniania pestycydów, które zapewniają wydłużony czas uwalniania pestycydu, możliwość dostarczenia optymalnej jego ilości do miejsca działania oraz ograniczają jego niekorzystny wpływ na środowisko. Celem cyklu prac stanowiących niniejszą rozprawę doktorską było opracowanie biodegradowalnych polimerowych systemów dla uwalniania substancji biologicznie czynnych, wybranych z grupy pestycydów, dla potencjalnych zastosowań w rolnictwie. W szczególności badania koncentrowały się nad opracowaniem koniugatów pestycydów z biodegradowalnymi oligomerami polihydroksyalkanianów. Zasadniczą część pracy stanowiło opracowanie metod syntezy pozwalających na związanie cząsteczek substancji biologicznie czynnej z łańcuchami biodegradowalnych oligomerów poprzez ulegające hydrolizie wiązanie estrowe. W kolejnym etapie badań przeprowadzono pełną molekularną i strukturalną charakterystykę otrzymanych koniugatów. Istotnym elementem prowadzonych badań było potwierdzenie, że 3

4 substancja biologicznie czynna po uwolnieniu z koniugatu posiadała niezmienioną budowę oraz aktywność biologiczną w stosunku do swojej pierwotnej postaci. W ostatnim etapie badań dla otrzymanych koniugatów przeprowadzono wstępne testy umożliwiające określenie przydatności opracowanych systemów dla zastosowań w rolnictwie. 3. Zakres pracy becnie znane i stosowane są pestycydy, których cząsteczki zawierają karboksylowe lub hydroksylowe grupy funkcyjne. Konieczne było zatem opracowanie metod syntezy koniugatów, zarówno dla jednej jak i dla drugiej grupy substancji biologicznie czynnych. Na potrzeby prowadzonych badań wybrano pestycydy posiadające grupę karboksylową: t.j. kwas (4-chloro-2-metylofenoksy)octowy (MCPA), kwas (2,4-dichlorofenoksy)octowy (2,4-D), kwas 3,6-dichloro-2-metoksybenzoesowy (dikamba), oraz pestycydy posiadające grupę hydroksylową: t.j. 4-(2-hydroksyetylo)fenol (tyrosol) oraz 2-etyloheksano-1,3-diol (ethohexadiol). MCPA oraz 2,4-D należą do szeroko stosowanych herbicydów; 28,29 Związki te używane najczęściej w postaci soli sodowych, potasowych i amoniowych są stosunkowo nielotne, lecz dobrze rozpuszczalne w wodzie. 30 Dlatego też MCPA i 2,4-D są najczęściej spośród herbicydów występującymi zanieczyszczeniami wód powierzchniowych i gruntowych na terenach rolniczych w wielu krajach europejskich. 31,32,33,34 Estry MCPA i 2,4-D, np. estry izooktylowe są słabiej rozpuszczalne w wodzie niż herbicydy w postaci kwasów lub soli, ale ze względu na dużą lotność 35 łatwo przedostają się do atmosfery. W prowadzonych badaniach wykorzystano również bioaktywne związki zawierające grupy hydroksylowe: tyrosol, wykazujący działanie jako regulator wzrostu roślin 36,37 oraz ethohexadiol, stosowany do odstraszania insektów, między innymi komarów. 38,39 Do syntezy koniugatów, w których wybrany pestycyd posiadający grupę karboksylową jest związany z syntetycznymi analogami biopoliestrów PHA wykorzystano polimeryzację anionową. W szczególności, koniugaty te otrzymano na drodze: oligomeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowanej solami wybranych pestycydów; inicjowanej solami kwasów karboksylowych, w tym solami wybranych pestycydów, oligomeryzacji β-podstawionych β-laktonów zawierających cząsteczkę pestycydu inicjowanej solami kwasów karboksylowych, w tym solami wybranych pestycydów, kooligomeryzacji β-butyrolaktonu z β-podstawionymi β-laktonami zawierającymi cząsteczkę pestycydu. Koniugaty, w których wybrany pestycyd jest związany z oligomerami biopoliestrów PHA otrzymano: na drodze transestryfikacji dostępnych handlowo wysokocząsteczkowych PHA za pomocą wybranych pestycydów posiadających grupę karboksylową, prowadzonej w stopie w obecności monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego, synteza realizowana w wersji one pot, metodą dwuetapową, obejmującą otrzymanie cyklicznych oligomerów PHA i ich dalsze wykorzystanie w reakcji transestryfikacji za pomocą wybranych pestycydów posiadających w swojej strukturze grupę hydroksylową w obecności lipazy z Candida antarctic. W kolejnym etapie badań przeprowadzono pełną charakterystykę otrzymanych koniugatów z zastosowaniem technik GPC, FT-IR, 1 H NMR. Ponadto zastosowanie w badaniach struktury techniki 4

5 wielostopniowej spektrometrii mas z jonizacją metodą elektrorozpylania ESI-MS n umożliwiło określenie struktury na poziomie molekularnym otrzymanych produktów. W ostatnim etapie badań dla wybranych koniugatów przeprowadzono wstępne testy degradacji hydrolitycznej oraz skuteczności ich działania w warunkach szklarniowych oraz polowych, umożliwiające określenie przydatności opracowanych systemów dla zastosowań w rolnictwie. Prowadzone w ramach niniejszej pracy doktorskiej badania nad syntezą koniugatów substancji biologicznie czynnych z biodegradowalnymi oligomerami polihydroksyalkanianów, ich pełna charakterystyka na poziomie molekularnym oraz badania degradacji hydrolitycznej wybranych koniugatów w warunkach laboratoryjnych zostały wykonane w Centrum Materiałów Polimerowych i Węglowych PAN w ramach projektu badawczego dla młodych pracowników naukowych CMPW PAN: Dotacja dla młodych naukowców 2011 oraz projektu NCN, nr 2012/07/B/ST5/00627 Niskociśnieniowa katalityczna synteza nowych monomerów β-laktonowych oraz ich anionowa (ko)polimeryzacja prowadząca do syntetycznych analogów biopoliestrów alifatycznych. Wybrane koniugaty pestycydowo-oligomerowe poddano badaniom skuteczności działania w warunkach szklarniowych oraz polowych w Instytucie chrony Roślin w Sośnicowicach we współpracy z Akademią im. Jana Długosza w Częstochowie w ramach projektu badawczego MNiSW, nr NN pracowanie nowych formulacji herbicydów o kontrolowanym uwalnianiu zawierających koniugaty biologicznie czynnych kwasów karboksylowych z biodegradowalnymi oligoestrami i oznaczanie ich skuteczności. Ponadto Iwona Kwiecień była stypendystką Regionalnego Funduszu Stypendiów Doktoranckich realizowanego w ramach Programu peracyjnego Kapitał Ludzki oraz stypendystką w Projekcie SWIFT (Stypendia Wspomagające Innowacyjne Forum Technologii) PKL /10 współfinansowanym ze środków Unii Europejskiej w ramach Europejskiego Funduszu Społecznego. 4. mówienie wyników 4.1. ligomeryzacja anionowa β-butyrolaktonu inicjowana solami wybranych substancji biologicznie czynnych Koniugaty herbicydów z oligo([r,s]-3-hydroksymaślanem) Przeprowadzone badania anionowej polimeryzacji β-butyrolaktonu inicjowanej solami związków biologicznie czynnych (Schemat 1), wykazały, że możliwe jest otrzymanie na tej drodze oligomerów poli([r,s]-3-hydroksymaślanu) zawierających kowalencyjnie związaną substancję czynną będącą herbicydem. R K + i) n H 3 C ii) H + R n H CH 3 R = Cl Cl Cl CH 2 lub CH 2 lub CH 3 Cl Cl (a) (b) (c) CH 3 Schemat 1. ligomeryzacja anionowa z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu inicjowanej solami potasowymi związków biologicznie czynnych: MCPA (a), 2,4-D (b) lub dikamby (c). 5

6 Tabela 1. Liczbowo średnie masy molowe produktów oligomeryzacji β-butyrolaktonu inicjowanej solami potasowymi związków biologicznie czynnych. Nr inicjator M NMR [g/mol] a M n [g/mol] b M w /M n b ,2 2 sól potasowa MCPA , , ,1 5 sól potasowa 2,4-D , , ,2 8 sól potasowa dikamby , ,2 a określono w oparciu o widma 1 H NMR; b określono za pomocą GPC. Wykorzystując powyższą metodę, poprzez dobór stosunku inicjatora do monomeru, dla trzech wybranych herbicydów otrzymano koniugaty z oligo([r,s]-3-hydroksymaślanem) o liczbowo średnich masach molowych, w zakresie g/mol (Tabela 1). Strukturę otrzymanych produktów określono stosując technikę 1 H NMR i wielostopniową spektrometrię mas ESI-MS n. Rysunek 1. Widmo 1 H NMR oligomerów MCPA-HB otrzymanych na drodze oligomeryzacji β- butyrolaktonu inicjowanej solą potasową MCPA (próbka 1, Tabela 1). Na Rysunku 1 przedstawiono widmo 1 H NMR oligomerów MCPA-HB (MCPA-oligo([R,S]-3- hydroksymaślan)) otrzymanych na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β- butyrolaktonu inicjowanej solą potasową MCPA (próbka nr 1, Tabela 1). W widmie widoczne są sygnały oznaczone jako a-f odpowiadające protonom jednostek 3-hydroksymaślanowych; sygnały oznaczone jako g-k odpowiadające protonom (4-chloro-2-metylofenoksy)octanowej (herbicydowej) grupy końcowej; sygnał oznaczone jako x-z odpowiadające protonom krotonianowej grupy końcowej. 6

7 Rysunek 2. Widmo ESI-MS (w trybie jonów dodatnich) oligomerów MCPA-HB otrzymanych na drodze oligomeryzacji β-butyrolaktonu inicjowanej solą potasową MCPA (próbka 1, Tabela 1). Strukturę otrzymanych koniugatów potwierdzono za pomocą ESI-MS n. Widmo masowe oligomerów MCPA-HB otrzymanych na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β- butyrolaktonu inicjowanej solą potasową MCPA (próbka 1, Tabela 1) przedstawiono na Rysunku 2. trzymane widmo masowe zawiera jedną główną serię jonów powtarzających się regularnie, co 86 Da (masa molowa meru 3-hydroksymaślanowego) oznaczoną jako A (Rysunek 2). W oparciu o wartości m/z rozdzielonych sygnałów zawartych w widmie wykazano, że seria A reprezentuje addukty sodowe makrocząsteczek oligo([r,s]-3-hydroksymaślanu) o różnym stopniu oligomeryzacji, zawierających chemicznie związany pestycyd MCPA. Dodatkowo w widmie, w zakresie niskich wartości m/z, zaobserwowano występowanie drugiej serii jonów, oznaczonej jako B, która reprezentuje addukty sodowe oligomerów 3-hydroksymaślanu zakończonych krotonianowymi i karboksylowymi grupami końcowymi. Powstawanie niewielkiej ilości oligomerów zakończonych krotonianowymi i karboksylowymi grupami końcowymi w procesie polimeryzacji β-butyrolaktonu inicjowanej karboksylanami jest wynikiem reakcji przeniesienia łańcucha na monomer 40 i/lub międzycząsteczkowej α-deprotonacji indukowanej zasadą. 41 W celu weryfikacji struktury chemicznej jonów należących do serii A, reprezentujących makrocząsteczki koniugatu MCPA-HB, wykonano eksperyment fragmentacyjny z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas ESI-MS/MS. Na Rysunku 3 przedstawiono widmo fragmentacyjne adduktu sodowego o wartości m/z 997 reprezentującego makrocząsteczki koniugatu, zawierające dziewięć jednostek 3-hydroksymaślanowych (HB), zakończone karboksylową oraz (4-chloro-2- metylofenoksy)octanową grupą końcową. Fragmentacja tego jonu zachodzi poprzez statystyczne rozerwanie wiązań estrowych w łańcuchu oligomeru, a w jej wyniku tworzą się dwie serie produktów jonowych. Pierwsza seria produktów przy wartościach m/z 797, 711, 625, 539, 453, 367 odpowiada adduktom sodowym oligo([r,s]-3-hydroksymaślanu) zakończonym krotonianowymi i karboksylowymi grupami końcowymi. Pierwszy jon w tej serii o wartości m/z 797 powstaje na skutek rozerwania wiązania estrowego między (4-chloro-2-metylofenoksy)octową grupą końcową a łańcuchem oligomeru, któremu towarzyszy oderwanie obojętnej cząsteczki herbicydu (kwasu (4-chloro-2-7

8 metylofenoksy)octowego, 200 Da). Druga seria produktów występująca przy wartościach m/z 911, 825, 739, 653, 567, odpowiada adduktom sodowym oligo([r,s]-3-hydroksymaślanu) z (4-chloro-2- metylofenoksy)octowymi i karboksylowymi grupami końcowymi. Pierwszy jon w tej serii o wartości m/z 911 powstaje w wyniku oderwania obojętnej cząsteczki kwasu krotonowego (86 Da). Rysunek 3. Widmo ESI-MS/MS (w trybie jonów dodatnich) adduktu sodowego koniugatu [MCPA- (HB) 9 + Na] + o wartości m/z 997, seria A Koniugaty substancji przeciwbakteryjnych z oligo([r,s]-3-hydroksymaślanem) Zgodnie z wytycznymi rganizacji Narodów Zjednoczonych do spraw Wyżywienia i Rolnictwa, rolą pestycydów jest również zapobieganie działaniu szkodników w trakcie produkcji, przetwarzania, magazynowania, transportu oraz wprowadzania do obrotu m.in. żywności oraz produktów rolnych. 42 By przedłużyć trwałość produktów spożywczych, w tym zapobiegać rozwijaniu się mikroorganizmów w produktach spożywczych, stosowane są konserwanty. Ze względu na swoje właściwości przeciwbakteryjne kwas benzoesowy, kwas sorbinowy i ich sole są popularnie stosowanymi konserwantami. 43 becnie konserwanty dodawane są do całej objętości produktu spożywczego, co może powodować reakcje alergiczne u znaczącej części populacji. Jednym ze sposobów ograniczenia spożywania konserwantów jest wprowadzanie substancji o działaniu przeciwbakteryjnym do opakowania (opakowania aktywne, aktywne systemy opakowaniowe) 44 zamiast do produktu spożywczego. Interesującym rozwiązaniem wydaje się zaproponowane w ramach tej pracy wprowadzenie substancji przeciwbakteryjnych do opakowań w formie koniugatów z oligomerami 3- hydroksymaślanu. Koniugat kwasu benzoesowego oraz koniugat kwasu sorbinowego z oligo(3- hydroksymaślanem) otrzymano na drodze oligomeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowanej benzoesanem sodu (Schemat 2 a) oraz sorbinianem sodu (Schemat 2 b). trzymane koniugaty substancji przeciwbakteryjnych z oligo([r,s]-3-hydroksymaślanem) scharakteryzowano za pomocą GPC, 1 H NMR oraz ESI-MS 2. Przeprowadzone analizy potwierdziły, iż otrzymane koniugaty zawierają kowalencyjnie związaną substancję przeciwbakteryjną. 8

9 R Na + i) n ii) H + C H 3 R n H CH 3 R = CH (a) (b) Schemat 2. Reakcja oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu inicjowanej solami sodowymi związków przeciwbakteryjnych: kwasu benzoesowego (a) lub kwasu sorbinowego (b) Homo- i kooligomeryzacja anionowa z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu z β-podstawionym β-laktonem zawierającym związaną kowalencyjnie substancję biologicznie czynną W ramach współpracy z Instytutem Chemii rganicznej PAN w Warszawie, w zespole pod kierunkiem prof. dr hab. Janusza Jurczaka na drodze karbonylowania odpowiedniego estru glicydylowego przeprowadzono syntezę nowego β-podstawionego β-laktonu zawierającego związany kowalencyjnie pestycyd. 45 trzymany nowy β-podstawiony β-lakton zawierający kowalencyjnie związany pestycyd MCPA, (4-chloro-2-metylofenoksy)acetyloksymetylopropiolakton (MCPA-CH 2 -PL), w ramach niniejszej pracy doktorskiej wykorzystano do syntezy nowych biologicznie aktywnych homo- i kooligoestrów zawierających bioaktywne ugrupowanie pestycydowe jako kowalencyjnie związane grupy boczne wzdłuż łańcucha (ko)oligoestru i/lub grupy końcowe. Nowe biologicznie aktywne homooligoestry otrzymano na drodze anionowej polimeryzacji MCPA-CH 2 -PL (Schemat 3, Tabela 2). Biologicznie aktywne kooligoestry otrzymano natomiast na drodze kopolimeryzacji β-butyrolaktonu z MCPA-CH 2 - PL (Schemat 4, Tabela 2). Jako inicjatory (ko)oligomeryzacji MCPA-CH 2 -PL zastosowano octan tetrabutyloamoniowy (AcNBu 4 ) i/lub (4-chloro-2-metylofenoksy)octan potasu. C H 3 Cl C H 3 Cl m i) CH 3 C()NBu 4 ii) H + H 3 C H m Schemat 3. ligomeryzacja anionowa z otwarciem pierścienia MCPA-CH 2 -PL inicjowana AcNBu 4. 9

10 C H 3 xn + R xm i) Cl(CH 3 )PhCH 2 C()K ii) H + Cl CH 3 R CH 3 n H m x R = Cl(CH 3 )PhCH 2 C()- Schemat 4. Kooligomeryzacja anionowa MCPA-CH 2 -PL i β-butyrolaktonu inicjowana (4-chloro-2- metylofenoksy)octanem potasu. Tabela 2. Liczbowo średnie masy molowe oraz skład produktów (ko)oligomeryzacji MCPA-CH 2 -PL z β-butyrolaktonem inicjowanej solą potasową MCPA i octanem tetrabutyloamoniowym (AcNBu 4 ). Nr próbki 1 inicjator Skład wyjściowy [mol%] HB/MCPA-CH 2 -HP Skład [mol%] a HB/MCPA-CH 2 -HP M n [g/mol] b M w /M n b 95/5 97/ ,4 2 Sól potasowa 90/10 93/ ,3 3 MCPA 85/15 87/ ,2 4 50/50 57/ ,3 5 AcNBu 4 0/100 0/ ,2 a Skład kopolimerów określono w oparciu o widm 1 H NMR; b określono za pomocą GPC. Badania struktury otrzymanych bioaktywnych (ko)oligoestrów przeprowadzono za pomocą technik 1 H NMR oraz ESI-MS n. Na Rysunku 4 przedstawiono widmo ESI-MS (ko)oligoestru (Tabela 2, próbka nr 4). Widmo zawiera trzy serie jonów A, B i C, które reprezentują trzy serie adduktów sodowych łańcuchów kooligoestrowych. Główna seria jonów A (oznaczona również jako (MCPA-CH 2 - HP) 1 /HB n na rozszerzonym zakresie widma) reprezentuje oligomery zawierające dwie cząsteczki substancji czynnej MCPA w łańcuchu. Jedna cząsteczka pochodzi od wbudowanej w łańcuch jednostki komonomeru MCPA-CH 2 -PL, a druga pochodzi od inicjatora, który wbudowuje się w łańcuch jako grupa końcowa. Seria oznaczona jako B (oznaczona również jako HB n na rozszerzonym zakresie widma) zawiera jedną cząsteczkę pestycydu związanego z łańcuchem w formie grupy końcowej. Seria oznaczona jako C oraz (MCPA-CH 2 -HP) 2 /HB n zawiera trzy cząsteczki pestycydu w łańcuchu (jedną jako grupę końcową, a dwie następne pochodzą od jednostek wbudowanego w łańcuch komonomeru MCPA-CH 2 -PL). 10

11 Rysunek 4. Widmo ESI-MS (w trybie jonów dodatnich) biologicznie aktywnego kopoliestru (Tabela 2, próbka nr 4). W celu potwierdzenia struktury chemicznej jonów należących do serii A, B i C, reprezentujących łańcuchy (ko)oligoestru, wykonano eksperyment fragmentacyjny z wykorzystaniem tandemowej spektrometrii mas ESI-MS/MS. Na Rysunku 5 przedstawiono przykładowe widomo fragmentacyjne jonu o wartości m/z 963 reprezentującego serię jonów C ( Rysunek 4) i odpowiadającego adduktom sodowym oligomerów zakończonych (4-chloro-2- metylofenoksy)octanową grupą końcową i zawierających dwie jednostki konstytucyjne MCPA-CH 2 -HP oraz dwie jednostki konstytucyjne HB, bezładnie rozmieszczone w łańcuchu oligomeru. Fragmentacja tego jonu zachodzi zarówno poprzez statystyczne zrywanie wiązań estrowych w łańcuchu oligomeru jak również wiązań estrowych pomiędzy łańcuchem a pestycydem związanym w formie grupy 11

12 bocznej (Rysunek 5, Tabela 3). Porównanie widma fragmentacyjnego oraz teoretycznych dróg fragmentacji tego jonu (przy założeniu bezładnego rozkładu jednostek komonomerycznych) wykazało, że wszystkie teoretycznie przewidziane struktury jonów fragmentacyjnych występują na eksperymentalnym widmie fragmentacyjnym (Rysunek 5, Tabela 3). Przeprowadzając fragmentację wybranych jonów molekularnych (reprezentujących indywidualne oligomery należące do serii A, B i C) potwierdzono zatem strukturę indywidualnych makrocząsteczek wchodzących w skład otrzymanych bioaktywnych kopoliestrów. Dodatkowo analiza widm fragmentacyjnych uzyskanych dla jonów należących do serii A i C umożliwiła weryfikację bezładnego rozkładu jednostek komonomerycznych wzdłuż łańcuchów badanych makrocząsteczek. Rysunek 5. Widmo fragmentacyjne ESI-MS/MS adduktów sodowych [MCPA-(MCPA-CH 2 -HP) 2 /HB 2 + Na] + o wartości m/z 963, reprezentujących makrocząsteczki kooligoestru zakończone (4-chloro-2- metylofenoksy)octanową grupą końcową i zawierających dwie jednostki konstytucyjne MCPA-CH 2 -HP i dwie jednostki HB. pisane w rozdziale 4.1 koniugaty pestycydowo-oligomerowe, otrzymane na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu inicjowanej solami związków biologicznie czynnych zawierają tylko jedną cząsteczkę substancji biologicznie czynnej przypadającą na jeden łańcuch oligo(3-hydroksymaślanu). Natomiast opisane w tym rozdziale badania wykazały, że na drodze homo- lub kopolimeryzacji anionowej przy zastosowaniu jako monomerów lub komonomerów β-podstawionych β-laktonów zawierających związaną kowalencyjnie substancję biologicznie czynną, możliwe jest otrzymanie odpowiednich (ko)oligoestrów zawierających większą 12

13 ilość substancji biologicznie czynnej związanej z łańcuchem polimerowym poprzez ulegające hydrolizie wiązanie estrowe. Tabela 3. Teoretyczne produkty fragmentacji jonu [MCPA-(MCPA-CH 2 -HP) 2 /HB 2 + Na] + o wartości m/z 963 uwzględniające bezładny rozkład jednostek komonomerycznych w łańcuchu. [MCPA-(MCPA-CH 2 -HP) 2 /HB 2 + Na] Jony fragmentacyjne [m/z] 877, 763, 677, 593, 393 M C P A M C P A M C P A H B H P H P H B + N a m /z m / z m /z m / z m / z M C P A M C P A + 763, 679, 677, 591, 395 M C P A H B H B H P H P + N a m /z m / z m /z m / z m / z , 791, 763, 479 M C P A M C P A M C P A H P H P H B H B + N a m /z m / z m /z m / z M C P A M C P A + 763, 679, 593, 479, 393 M C P A H P H B H B H P + N a m /z m /z m /z m /z m /z M C P A M C P A + 763, 679, 677, 593, 393 M C P A H B H P H B H P + N a m /z m /z m /z m /z m /z M C P A M C P A + 877, 763, 593, 479, 393 M C P A H P H B H P H B + N a m / z m / z m / z m / z m / z

14 4.3. Bezpośrednia transestryfikacja wysokocząsteczkowych biopoliestrów PHA z wybranymi pestycydami Koniugaty pestycyd-oligomery PHA otrzymano metodą bezpośredniej transestryfikacji wybranych PHA z wybranymi pestycydami prowadzonej w stopie, w obecności monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego (TSA H 2 ), w wersji one pot. W syntezie wykorzystano dostępne handlowo biopoliestry z rodziny polihydroksyalkanianów: poli([r]-3-hydroksymaślan) (poli(3hb)), poli([r]-3- hydroksymaślan-ko-[r]-4-hydroksymaślan) (poli(3hb-ko-4hb)), poli([r]-3-hydroksymaślan-ko-[r]-3- hydroksywalerian) (poli(3hb-ko-3hv)), poli([r]-3-hydroksymaślan-ko-[r]-3-hydroksyheksanian) (poli(3hb-ko-3hh)) oraz substancje biologicznie czynne posiadające grupę karboksylową takie jak MCPA oraz 2,4-D. Wyniki przeprowadzonych badań nad synteza koniugatów pestycydów z oligomerami PHA wykazały, że masa cząsteczkowa oligomerowego nośnika PHA może być kontrolowana poprzez warunki prowadzenia reakcji oraz skład mieszaniny reakcyjnej. Temperaturę i czas reakcji transestryfikacji wyznaczono eksperymentalnie i ustalono że najkorzystniej jest prowadzić proces transestryfikacji w temperaturze w zakresie C (zależnie od użytego biopoliestru) przez okres 2 minut (Schemat 5). Prowadzenie procesu transestryfikacji w takich warunkach, umożliwia całkowite stopienie biopoliestru PHA z minimalnym udziałem rozkładu termicznego PHA prowadzącego do wytworzenia oligomerów PHA z krotonianowymi grupami końcowymi. Schemat 5. Reakcja transestryfikacji PHA z MCPA lub 2,4-D w obecności TSA H 2 ; R 1 oznacza podstawnik metylowy, etylowy, propylowy, i/lub wodór; x wynosi 1 i/lub 2. Ponadto w wyniku przeprowadzonych badań stwierdzono, że istnieje zależność pomiędzy średnią masę molowa (M n ) syntezowanych koniugatów i ilością kwasu TSA H 2 stosowanego w tym procesie. Wzrost ilości wody, która została wprowadzona z TSA powoduje zmniejszenie masy cząsteczkowej uzyskanych oligomerów. Dlatego też kluczowym elementem syntezy koniugatów było dobranie, dla określonej temperatury i czasu procesu, odpowiedniego stosunku substratów i katalizatora PHA / MCPA / TSA H 2 aby zapewnić wysoki procent przyłączenia pestycydu do oligomerów PHA. W celu określenia korzystnego składu mieszaniny reakcyjnej przeprowadzono serię syntez (Tabela 4). 14

15 Tabela 4. Wynik reakcji transestryfikacji prowadzonych pomiędzy biopoliestrami a pestycydami w obecności monohydratu kwasu p-toluenosulfonowego. Nr próbki biopoliester pestycyd (% wag.) a TSA H 2 (% wag.) a M n [g/mol] b b M w /M n Ilość pestycydu przyłączona do oligomerów [% mol] c 1 MCPA (40) ,1 39±4 9 MCPA (60) ,5 58±2 2 MCPA (40) ,4 45±3 3 MCPA (40) ,8 73±2 4 5 poli(3hb-ko- 4HB) MCPA (40) MCPA (40) ,8 1,5 74±2 85±2 6 MCPA (60) ,3 18±3 7 MCPA (90) ,5 15±3 8 MCPA (60) ,8 69±2 10 poli(3hb-ko- MCPA (60) ,3 70±1 11 3HH) 2,4-D (60) ,6 64±2 12 poli(3hb) 2,4-D (60) ,5 55±2 a ilości reagentów względem biopoliestru; b określono za pomocą GPC; c procent molowy przyłączonego pestycydu określono na podstawie widm 1 H NMR. Każdy eksperyment powtarzano 3 razy, ilość przyłączonego pestycydu to średnia arytmetyczna. Na podstawie uzyskanych wyników (Tabela 4) wykazano, iż korzystnie jest prowadzić reakcję transestryfikacji biopoliestrów PHA za pomocą substancji biologicznie czynnych z grupy pestycydów, stosowanych w ilości 40 lub 60 % wag. w stosunku do ilości użytego biopoliestru, w obecności 20 % wag. TSA H 2. Dwukrotne zwiększenie ilości TSA H 2 tylko w nieznacznym stopniu wpłynęło na zwiększenie ilość pestycydu przyłączonego do oligomerów. Charakterystykę struktury produktów otrzymanych na drodze bezpośredniej transestryfikacji biopoliestrów przeprowadzono z wykorzystaniem technik 1 H NMR oraz ESI-MS n. Potwierdzono, że głównym produktem reakcji transestryfikacji były koniugaty, w których wybrany pestycyd jest kowalencyjnie związany z oligomerami PHA poprzez wiązanie estrowe. W produktach transestryfikacji obecna była również niewielka ilość oligomerów PHA zakończonych hydroksylowymi i karboksylowymi grupami końcowymi oraz wolnego pestycydu. W kolejnym etapie badań w reakcji transestryfikacji biopoliestrów poli(3hb), poli(3hb-ko- 4HB) oraz poli(3hb-ko-3hv) wykorzystano substancje biologicznie czynne posiadające grupę hydroksylową: 4-(2-hydroksyetylo)fenol (tyrosol) oraz 2-etyloheksano-1,3-diol (ethohexadiol). Reakcje prowadzono również w stopie w obecności TSA H 2 w wersji one pot. Zastosowanie 15

16 spektrometrii ESI-MS w badaniach struktury produktów transestryfikacji umożliwiło identyfikacje indywidualnych makrocząsteczek występujących w badanych produktach Dwuetapowa transestryfikacja wysokocząsteczkowych biopoliestrów PHA Kolejna metoda otrzymywania koniugatów pestycyd-oligomer bazująca na reakcji transestryfikacji, opracowana w ramach rozprawy doktorskiej, obejmuje dwa etapy. W pierwszym etapie otrzymano cykliczne oligomery z biopoliestru PHB, które następnie wykorzystano, jako substrat w reakcji transestryfikacji z substancją biologicznie czynną (np. tyrosolem) do otrzymania koniugatów pestycyd-oligo([r]-3-hydroksymaślan). Reakcje prowadzono w obecności lipazy z Candida antarctica (Schemat 6). W ramach niniejszej pracy doktorskiej prowadzono badania nad wykorzystaniem lipazy jako katalizatora reakcji transestryfikacji cyklicznych oligomerów PHB w obecności substancji biologicznie czynnej, tyrosolu. Schemat 6. Dwuetapowa synteza koniugatów pestycyd-oligo([r]-3-hydroksymaślan. Na Rysunku 6a przedstawiono widmo cyklicznych oligomerów otrzymanych z biopoliestru PHB. trzymano cykliczne oligomery PHB zawierające od 3 do 12 jednostek 3-HB (Seria A), sygnały przy wartościach m/z Na Rysunku 6b przedstawiono widmo masowe produktów katalizowanej lipazą transestryfikacji cyklicznych oligomerów PHB tyrosolem. Przeprowadzona analiza widma potwierdziła obecność dwóch serii sygnałów A i B. Seria A reprezentuje cykliczne oligomery PHB, które nie uległy transestryfikacji. Natomiast seria B, reprezentuje liniowe koniugaty, w których tyrosol związany jest z łańcuchem oligo([r]-3-hydroksymaślanu). Rysunek 6. Widmo ESI-MS (w trybie jonów dodatnich) (a) cyklicznych oligomerów PHB (b) produktów katalizowanej lipazą transestryfikacji cyklicznych oligomerów PHB z tyrosolem. 16

17 Na podstawie przeprowadzonych badań, można zauważyć że opracowana dwuetapowa metoda syntezy koniugatów polimer-pestycyd jest zdecydowanie bardziej skomplikowana i czasochłonna niż metoda transestryfikacji w wersji one pot. Zaletą tej metody jest jednak możliwość otrzymania populacji bioaktywnych koniugatów o zdefiniowanych długościach łańcuchów polimerowego nośnika Wstępne testy potwierdzające przydatność opracowanych koniugatów pestycydowooligomerowych dla ochrony roślin W celu potwierdzenia, że opracowane w ramach rozprawy doktorskiej koniugaty umożliwiają uwalnianie z łańcucha oligomerowego związków biologicznie czynnych, dla wybranych spośród otrzymanych koniugatów, przeprowadzono wstępne testy degradacji hydrolitycznej oraz testy skuteczności chwastobójczego działania wobec populacji wybranych chwastów. W szczególności badania te obejmowały: przeprowadzenie degradacji hydrolitycznej wybranych koniugatów w warunkach laboratoryjnych; celem potwierdzenia uwalniania pestycydu oraz zbadania struktury uwalnianych niskocząsteczkowych produktów degradacji nośnika; testy skuteczności chwastobójczego działania wybranych koniugatów wobec populacji wybranych chwastów w warunkach szklarniowych; testy skuteczności chwastobójczego działania wybranych koniugatów wobec populacji wybranych chwastów w warunkach polowych; testy fitotoksyczności wybranych koniugatów w stosunku do wybranego zboża. Badania degradacji hydrolitycznej koniugatów pestycydowo-oligomerowych w warunkach laboratoryjnych przeprowadzono w CMPW PAN w Zabrzu. Badania w warunkach szklarniowych oraz polowych przeprowadzono w Instytucie chrony Roślin w Sośnicowicach we współpracy z Akademią im. Jana Długosza w Częstochowie. Degradacja hydrolityczna wybranych koniugatów w warunkach laboratoryjnych oraz badania struktury uwalnianych niskocząsteczkowych produktów degradacji Badania degradacji hydrolitycznej w warunkach laboratoryjnych opracowanych koniugatów prowadzono w wodzie dejonizowanej w cieplarkach laboratoryjnych w temperaturze 25 C przez 20 tygodni. Po określonych czasach inkubacji koniugatu w wodzie (1, 3, 6, 9, 12, 16 i 20 tygodniach) fiolki zawierające próbki koniugatu były kolejno wycofywane. Proces degradacji monitorowano stosując spektrometrię mas. Analiza koniugatu po określonych czasach degradacji hydrolitycznej oraz analiza roztworów wodnych znad koniugatu prowadzona za pomocą ESI-MS w trybie jonów ujemnych, umożliwiła monitorowanie uwalnianego pestycydu w formie kwasu, oraz określenie struktury tworzących się produktów degradacji hydrolitycznej oligomerowego nośnika. Na Rysunku 7 przedstawiono przykładowo widma masowe koniugatu MCPA-oligo([R]-3- hydroksymaślanu-ko-[r]-4-hydroksymaślanu) (Tabela 4, próbka nr 3) przed degradacją (a), po 6 (b) i po 20 (c) tygodniach degradacji hydrolitycznej. Wraz z postępem hydrolizy na widmach masowych obserwowano przesunięcie głównej serii jonów A reprezentującej indywidualne makrocząsteczki koniugatu w kierunku niższych wartości m/z (Rysunek 7, linia ciągła). Jednocześnie obserwowano wzrost intensywności sygnałów serii B, która powstaje w wyniku hydrolizy oligomerowego nośnika i 17

18 odpowiada oligomerom 3-hydroksymaślanu-ko-4-hydroksymaślanu zakończonym hydroksylowymi i karboksylowymi grupami końcowymi (Rysunek 7, linia przerywana). Ponadto, wraz z postępem procesu degradacji hydrolitycznej, obserwowano wzrost intensywności sygnału pochodzącego od uwolnionego pestycydu w formie kwasu MCPA (anion przy m/z 199). Przeprowadzone badania degradacji hydrolitycznej potwierdziły zatem uwalnianie kwasu MCPA z łańcuchów badanego koniugatu. Rysunek 7. Widmo ESI-MS (w trybie jonów dodatnich) koniugatu MCPA oligo(3hb-ko-4hb) przed inkubacją (a) oraz po 6 (b) i po 20 (c) tygodniach inkubacji w dejonizowanej wodzie w temperaturze 25 C. 18

19 W analogicznych warunkach jak dla koniugatu MCPA-oligo([R]-3-hydroksymaślanu-ko-[R]-4- hydroksymaślanu) przeprowadzono również badania degradacji hydrolitycznej w warunkach laboratoryjnych koniugatu 2,4-D-oligo([R,S]-3-hydroksymaślanu) (Tabela 1, próbka nr 4), otrzymanego na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu. Testy prowadzono przez 6 tygodni, próbki wycofywano po 1, 3, 7, 14, 21 i 42 dniach, w tym czasie obserwowano uwalnianie z koniugatu pestycydu 2,4-D w formie kwasu oraz powstawanie produktów hydrolizy łańcucha oligo([r,s]-3-hydroksymaślanu), czyli oligomerów z hydroksylowymi i karboksylowymi grupami końcowymi. Ponadto, w widmach masowych otrzymywanych po kolejnych czasach inkubacji obserwowano przesuwanie się serii jonów reprezentującej makrocząsteczki koniugatu w kierunki niższych wartości m/z w stosunku do próbki wyjściowej wskazujące na stopniowe obniżanie średnich masach molowych koniugatu wraz z postępem reakcji hydrolizy. Degradacja hydrolityczna w warunkach laboratoryjnych koniugatu zawierającego oligomery oligo([r]-3-hydroksymaślanu-ko-[r]-4-hydroksymaślanu) oraz uwalnianie pestycydu zachodziło wolniej niż degradacja hydrolityczna koniugatu zawierającego oligomery oligo([r,s]-3- hydroksymaślanu). Jednakże warunki laboratoryjne nie odzwierciedlają warunków środowiska naturalnego. Należy podkreślić, że enzymy, takie jak depolimerazy, odpowiedzialne za biodegradację PHA, są wydzielane przez szeroko rozpowszechnione w środowisku mikroorganizmy. 15,16 Depolimerazy te mogą znacznie przyspieszyć w warunkach polowych uwalnianie pestycydu z koniugatów zawierających oligomery biopoliestrów PHA. Testy skuteczności chwastobójczego działania wybranych koniugatów wobec populacji wybranych chwastów w warunkach szklarniowych Przeprowadzono porównawcze badania skuteczności chwastobójczego działania koniugatu (2,4-D-HB), otrzymanego w ramach niniejszej pracy i preparatu dostępnego na rynku pod nazwą handlową Pielik 85 SP. Z koniugatu 2,4-D-HB (otrzymanego na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu) oraz z preparatu Pielik 85 SP sporządzono formulacje zawierające równoważne ilości składnika aktywnego (0,75 kg/ha), odpowiednio kwasu 2,4-D oraz soli dimetyloamoniowej 2,4-D (2,4-D-DMA). Testy prowadzono w warunkach szklarniowych, przez okres 3 tygodni, w czasie których obserwowano procentowy postęp w niszczeniu populacji chwastu, gorczycy białej Sinapis alba var. Nakielska, aż do jej całkowitego zniszczenia. Na Wykresie 1 przedstawiono porównawczo zależność skuteczności działania obu formulacji w funkcji czasu. Wykres 1. Skuteczność chwastobójczego działania wobec gorczycy białej. 19

20 Przeprowadzone badania wykazały, że obie formulacje wykazują dobrą skuteczność w zwalczaniu gorczycy białej i powodują całkowite zniszczenie tego chwastu w okresie około 3 tygodni. Ponadto zaobserwowano, że w początkowym okresie po aplikacji, skuteczność działania koniugatu 2,4-D-HB była nieznacznie niższa w porównaniu z preparatem Pielik 85 SP, jednakże po ponad 2 tygodniach skuteczność działania obu formulacji osiągnęła podobny poziom. Testy skuteczności chwastobójczego działania wybranych koniugatów wobec populacji wybranych chwastów w warunkach polowych Badania skuteczności chwastobójczego działania koniugatu oligo([r,s]-3-hydroksymaślanu) z 2,4-D (2,4-D-HB) oraz z dikambą (otrzymanych na drodze oligomeryzacji anionowej z otwarciem pierścienia β-butyrolaktonu) w warunkach polowych prowadzono dla szerszego spektrum gatunkowego chwastów dwuliściennych niż badania w warunkach szklarniowych. Badania prowadzono przez 6 tygodni na poletkach eksperymentalnych o powierzchni 20 m 2 przygotowanych zgodnie ze standardami Europejskiej i Śródziemnomorskiej rganizacji chrony Roślin. Wykres 2. Skuteczność chwastobójczego działania wobec rdestu różnolistnego (PLAV). Skuteczność chwastobójczego działania koniugatów oraz formulacji handlowych zawierających te same substancje czynne obserwowano wobec wybranych chwastów: samosiewów rzepaku (Brassica napus var. leifera; BRSNV), rdestu różnolistnego (Polygonum aviculare; PLAV) oraz rumianu polnego (Matricaria inodora; MATIN). Wyniki badań porównawczych koniugatu 2,4-D-HB oraz formulacji zawierającej sól dimetyloamoniową 2,4-D wobec rdestu różnolistnego (PLAV) przedstawiono na Wykresie 2. Przeprowadzone badania w warunkach polowych wykazały, że opracowane w ramach pracy doktorskiej koniugaty po 6 tygodniach wykazują zbliżoną skuteczność działania chwastobójczego do formulacji handlowych. Z przeprowadzonego przeglądu literatury wynika, że w przypadku systemów uwalniania substancji biologicznie czynnych, masa molowa oligomerowego nośnika wpływa na profil uwalniania substancji biologicznie czynnej. W związku z powyższym masa molowa nośnika powinna być tak dobrana, aby umożliwić uwalnianie substancji biologicznie czynnej w ilości zapewniającej skuteczności działania w oczekiwanym okresie eksploatacji systemu dostarczania. 20

21 Przeprowadzone badania skuteczności działania wybranych koniugatów pestycydów z oligo([r,s]- 3-hydroksymaślanem), opracowanych w ramach niniejszej pracy, w warunkach szklarniowych i polowych wykazały, że najlepszą skuteczność działania wykazywały koniugaty w których pestycyd związany był z oligomerami 3-hydroksymaślanu o liczbowo średniej masie molowej M n około 1000 g/mol. Testy fitotoksyczności wybranych koniugatów w stosunku do wybranego zboża Do wstępnej oceny skutków narażenia upraw rolnych na kontakt z koniugatami pestycydoligo([r,s]-3-hydroksymaślan) wykorzystano metodę polegającą na obserwowaniu faz rozwojowych wybranego zboża. Przeprowadzone badania w warunkach polowych wykazały, że otrzymane koniugaty oraz formulacja handlowa nie wykazały fitotoksyczności wobec pszenicy ozimej; pszenica w kolejnych fazach rozwojowych rozwijała się prawidłowo zgodnie ze skalą BBCH (ujednoliconą skalą wykorzystywaną w Unii Europejskiej do identyfikacji faz rozwoju roślin uprawnych). 5. Podsumowanie i wnioski W ramach prowadzonych badań nad biodegradowalnymi polimerowymi systemami kontrolowanego uwalniania pestycydów opracowano 4 metody umożliwiające chemiczne związanie substancji biologicznie czynnych, będących pestycydami, z biodegradowalnymi oligomerami polihydroksyalkanianów. Pierwsze dwie metody oparte są na anionowej (ko)oligomeryzacji β- podstawionych β-laktonów inicjowanej solami kwasów karboksylowych i/lub solami wybranych pestycydów. Na drodze oligomeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowanej solami związków biologicznie czynnych (wybranych herbicydów lub substancji przeciwbakteryjnych) otrzymano koniugaty pestycyd oligo([r,s]-3-hydroksymaślan), w których każdy łańcuch oligomeru zawiera kowalencyjnie związaną, poprzez wiązanie estrowe, jedną cząsteczkę herbicydu lub substancji przeciwbakteryjnej jako grupy końcowe. Ta część badań została opisana w publikacjach I. Kwiecień, G. Adamus, M. Kowalczuk, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2012, 26 (23), oraz I. Kwiecień, G. Adamus, A. Bartkowiak, M. Kowalczuk, Designed Monomers and Polymers, 2014, 17 (4), Natomiast na drodze homo- lub kopolimeryzacji anionowej przy zastosowaniu jako monomerów lub komonomerów β-podstawionych β-laktonów zawierających związaną kowalencyjnie substancję biologicznie czynną, otrzymano odpowiednie bioaktywne (ko)oligoestry zawierające większą ilość substancji biologicznie czynnej, związanej z łańcuchem polimerowym poprzez ulegające hydrolizie wiązania estrowe. Ilość cząsteczek pestycydu związanego z łańcuchem bioaktywnych kooligoestrów można kontrolować poprzez zmianę składu β-laktonowych monomerów użytych w procesie kooligomeryzacji (I. Kwiecień, T. Bałakier, J. Jurczak, M. Kowalczuk, G. Adamus, Rapid Communications in Mass Spectrometry, 2015, 29 (6), ). W wyniku zastosowania powyższych metod otrzymano koniugaty pestycydowo-oligomerowe o założonej budowie chemicznej grup końcowych, zdefiniowanej strukturze łańcucha oraz stosunkowo wąskim rozrzucie mas molowych. Dalsze badania w ramach niniejszej rozprawy doprowadziły do opracowania dwóch kolejnych metod syntezy koniugatów bazujących na reakcji transestryfikacji wysokocząsteczkowych biopoliestrów alifatycznych z rodziny polihydroksyalkanianów z wybranymi pestycydami (I. Kwiecień, I. Radecka, M. Kowalczuk, G. Adamus, PLoS NE, DI /journal.pone ). pracowana metoda bezpośredniej transestryfikacji wysokocząsteczkowych biopoliestrów PHA z wybranymi pestycydami prowadzona w stopie, w wersji one pot, wydaje się perspektywiczna zarówno z 21

22 ekonomicznego punktu widzenia, jak również ze względu na możliwość powiększenia skali syntezy. W metodzie tej wykorzystuje się dostępne handlowo, produkowane na dużą skalę polihydroksyalkaniany oraz pestycydy wykorzystywane jako substancje biologicznie czynne w preparatach dostępnych na rynku i obecnie stosowanych w rolnictwie. Ponadto, metoda ta jest uniwersalna i może być stosowana do syntezy koniugatów zarówno z pestycydami zawierającymi grupę karboksylową, jak również substancjami biologicznie czynnymi zawierającymi grupy hydroksylowe. pracowana w ramach niniejszej pracy dwuetapowa metoda syntezy koniugatów polimerpestycyd obejmującą otrzymanie cyklicznych oligomerów PHA i ich dalsze wykorzystanie w katalizowanej lipazą reakcji transestryfikacji z wybranymi pestycydami, jest zdecydowanie bardziej skomplikowana i czasochłonna niż metoda one pot. Jednak niewątpliwą zaletą tej metody jest możliwość otrzymania populacji bioaktywnych koniugatów o zdefiniowanych długościach łańcuchów polimerowego nośnika (I. Kwiecień, I. Radecka, M. Kowalczuk, G. Adamus, PLoS NE, DI /journal.pone ). Charakterystykę otrzymanych koniugatów przeprowadzono z zastosowaniem technik GPC, FT- IR, 1 H NMR. Zastosowanie w badaniach struktury techniki wielostopniowej spektrometrii mas z jonizacją metodą elektrorozpylania ESI-MS n umożliwiło identyfikację indywidualnych makrocząsteczek występujących w badanych koniugatach. Przeprowadzone badania fragmentacji wybranych jonów pseudomolekularnych koniugatów pestycydowo-oligomerowych potwierdziły, że otrzymane koniugaty posiadały kowalencyjnie związany substancję biologicznie czynną jako grupę końcową, bądź w przypadku bioaktywnych kopoliestrów zawierały bioaktywne ugrupowania pestycydowe jako kowalencyjnie związane grupy boczne wzdłuż łańcucha (ko)oligoestru i/lub grupy końcowe. Przeprowadzone wstępne badania degradacji hydrolitycznej koniugatów pestycydowooligomerowych potwierdziły, że wiązanie estrowe pomiędzy substancją biologicznie czynną a łańcuchem oligomerowym ulega hydrolizie, umożliwiając stopniowe uwalnianie z łańcucha oligomerowego związków biologicznie czynnych w pierwotnej postaci z zachowaniem ich biologicznej aktywności (I. Kwiecień, I. Radecka, M. Kowalczuk, G. Adamus, PLoS NE, DI /journal.pone ). Przeprowadzone testy w warunkach szklarniowych i polowych wykazały, że skuteczność chwastobójczego działania formulacji zawierającej koniugat 2,4-D-oligo([R,S]-3-hydroksymaślanu) wobec wybranych chwastów dwuliściennych jest porównywalna do skuteczności działania formulacji dostępnej handlowo zawierającej tę samą substancję czynną. Ponadto nie zaobserwowano fitotoksycznego działania otrzymanych koniugatów pestycydowo-oligomerowych na pszenice ozimą (W. J. Kowalski, M. Głazek, A. Siłowiecki, M. Kowalczuk, I. Romanowska*, D. Włóka, Pesticide Formulation and Delivery Systems: 32nd Volume, Innovating Legacy Products for New Uses. Ed. Mark L. Bernards). Najważniejsze poznawcze wyniki badań uzyskane w ramach niniejszej rozprawy doktorskiej 1. pracowanie metody syntezy koniugatów pestycydowo-oligomerowych na drodze oligomeryzacji anionowej β-butyrolaktonu inicjowanej solami wybranych pestycydów. 22

23 2. pracowanie metody syntezy bioaktywnych (ko)oligoestrów na drodze homo- lub kooligomeryzacji anionowej β-podstawionych β-laktonów zawierających związaną kowalencyjnie substancję biologicznie czynną. 3. pracowanie metod syntezy koniugatów, w których wybrany pestycyd jest związany z oligomerami PHA, bazujących na reakcji transestryfikacji wysokocząsteczkowych biopoliestrów z rodziny polihydroksyalkanianów z wybranymi pestycydami; metoda bezpośredniej transestryfikacji wysokocząsteczkowych biopoliestrów PHA z wybranymi pestycydami prowadzona w stopie w obecności monohydratu kwasu p- toluenosulfonowego, w wersji one pot ; metoda dwuetapowa, obejmującą otrzymanie cyklicznych oligomerów z biopoliestrów PHA i ich dalsze wykorzystanie w katalizowanej lipazą reakcji transestryfikacji z wybranymi pestycydami posiadającymi w swojej strukturze grupę hydroksylową. 4. Zbadanie struktury otrzymanych koniugatów. Zastosowanie spektrometrii mas w badaniach struktury wspomagane spektroskopią NMR umożliwiło identyfikację indywidualnych makrocząsteczek występujących w badanych koniugatach oraz określenie struktury chemicznej grup końcowych. Przeprowadzenie eksperymentów fragmentacyjnych oraz zbadanie procesu fragmentacji wybranych jonów reprezentujących indywidualne łańcuchy koniugatów, potwierdziło, że otrzymane koniugaty pestycydowo-oligomerowe posiadały związaną poprzez wiązanie estrowe substancje biologicznie czynną jako grupę końcową i/lub bioaktywne ugrupowania kowalencyjnie związane jako grupy boczne wzdłuż łańcucha (ko)oligoestru. 5. Zbadanie procesu degradacji hydrolitycznej wybranych koniugatów pestycyd-oligoester z wykorzystaniem techniki spektrometrii mas umożliwiło określenie struktury uwalnianych niskocząsteczkowych produktów degradacji koniugatu oraz potwierdziło uwalnianie z oligoestrowego nośnika substancji biologicznie czynnej w jej pierwotnej postaci. 6. Potwierdzenie przydatności opracowanych systemów dla zastosowań w rolnictwie obejmujące: potwierdzenie skuteczności chwastobójczego działania wybranych koniugatów pestycydowo-oligomerowych wobec populacji wybranych chwastów w warunkach szklarniowych i polowych oraz przeprowadzenie wstępnej oceny skutków narażenia upraw rolnych na kontakt z koniugatami pestycyd-oligomer. Badania przeprowadzone we współpracy z Instytutem chrony Roślin w Sośnicowicach oraz Akademią im. Jana Długosza w Częstochowie. 7. Literatura 1 C. A. Damals, I. G. Eleftherohorinos, Int. J. Environ.Res. Public Health 2011, 8, The International Code of Conduct on Pesticide Management, World Health rganization and Food and Agriculture rganization of the United Nations, Rome 2014, ISBN A. L. Mourad, L. Coltro, P. A. P. L. V. liveira, R. M. Kletecke, J. P.. A. Baddini, Int. J. LCA 2007, 12, R. G. Bowles, J. P. G. Webster, Crop Prot. 1995, 14, D. H. Lewis, D. R. Cowsar, Principles of Controlled Release Pesticides [in] ACS Symposium Series; American Chemical Society, Ed. H. B. Scher, Washington, DC,