Zjawisko topofizy w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy wielkokwiatowej

Transkrypt

1 PRACE EKSPERYMENTALNE Zjawisko topofizy w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy wielkokwiatowej Ma³gorzata Zalewska, Natalia Miler Pracownia Biotechnologii, Katedra Roœlin Ozdobnych i Warzywnych, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy im. J. i J. Œniadeckich, Bydgoszcz Topophysis in adventitious shoots regeneration in vitro in chrysanthemum Summary Adres do korespondencji Natalia Miler, Katedra Roœlin Ozdobnych i Warzywnych, Pracownia Biotechnologii, Uniwersytet Technologiczno-Przyrodniczy, ul. Bernardyñska 6, Bydgoszcz; nmiler@utp.edu.pl 2 (89) Success of breeding programmes using adventitious shoots technique often depends on the regeneration efficiency. The aim of this study was to investigate the influence of topophysical position of explants on the efficiency of adventitious shoots regeneratio. Uniform, single shoots of chrysanthemum Satinbleu propagated in vitro were divided equally into three topophysical zones: distal, central and proximal. Two leaves and two internodes were isolated from each zone. The explants were cultured for 12 weeks on MS medium supplemented with 0.6 mg l -1 BAP and 2.0 mg l -1 IAA. Due to the highest adventitious shoots regeneration capability and the earliest formation of the shoots, the most suitable explants for breeding programmes for chrysanthemum are internodes excised from distal part of in vitro plantlet. Key words: topophysis, explants, adventitious regeneration, chrysanthemum. 1. Wstêp Zjawisko topofizy po raz pierwszy zdefiniowa³ Molish w 1916 r. (1) jako zró nicowany wzrost i rozwój sadzonek w zale noœci od ich lokalizacji na roœlinie matecznej. Topofiza jest badana

2 Zjawisko topofizy w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy wielkokwiatowej przede wszystkim w aspekcie rozmna ania wegetatywnego roœlin drzewiastych, u których stwierdzono siln¹ zale noœæ miêdzy po³o eniem pêdu u ytego jako sadzonka a zdolnoœci¹ do jego ukorzeniania siê lub wzrostu generatywnego (2-4). Stwierdzono tak e wp³yw lokalizacji topofizycznej sadzonki wêz³owej na jej wzrost podczas rozmna ania chryzantem w warunkach in vivo (5). Eksplantat pierwotny, odpowiednik sadzonki, daj¹cy pocz¹tek kulturze in vitro, przenosi pamiêæ o swoim statusie w roœlinie matecznej ( inherent cellular state ) do warunków kultury in vitro (6) Dowodem na to jest m.in. obserwowany wp³yw po³o enia eksplantatu pierwotnego na roœlinie donorowej na jego dalszy wzrost i regeneracjê w kulturach in vitro, co stwierdzono m.in. u daglezji (7), winoroœli (8) oraz ró y (9). Topofizyczna lokalizacja eksplantatu pierwotnego ma tak e znaczenie w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro, wp³ywa na iloœæ oraz na jakoœæ pêdów (10). Stwierdzono zale noœæ liczby pêdów przybyszowych wytworzonych in vitro od topofizycznej lokalizacji miêdzywêÿli u chryzantemy in vivo (11), brakuje natomiast publikacji dokumentuj¹cych rolê zjawiska topofizy w izolowanym œrodowisku kultur in vitro. Technika regeneracji pêdów przybyszowych in vitro ma du e znaczenie w mikrorozmna aniu oraz hodowli wielu roœlin (12). U chryzantem technika pêdów przybyszowych wykorzystywana jest wy³¹cznie w celach hodowlanych, a nie w laboratoryjnej produkcji sadzonek. Poniewa pêd przybyszowy u chryzantemy powstaje z jednej komórki inicjalnej, ca³y zregenerowany pêd jest jednorodny genetycznie (13). Cecha ta sprawia, e metoda pêdów przybyszowych jest stosowana w hodowli mutacyjnej (14), separacji komponentów chimer (15) oraz transformacji genetycznej (16). Wydajnoœæ organogenezy przybyszowej ma wówczas podstawowe znaczenie dla sukcesu hodowlanego, dlatego poszukuje siê ci¹gle sposobów na zwiêkszenie efektywnoœci namna ania pêdów. Na regeneracjê pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy maj¹ wp³yw: sk³ad po ywki (17), rodzaj eksplantatu oraz genotyp (odmiana) (18), barwa œwiat³a stosowanego w pokoju wzrostowym (19), a nawet dawka promieniowania u ytego do mutagenezy (20). Celem doœwiadczenia by³o zbadanie wp³ywu topofizycznej lokalizacji eksplantatów liœciowych i miêdzywêÿli izolowanych z roœlin rozmna anych in vitro na regeneracjê pêdów przybyszowych u chryzantemy. 2. Materia³ i metody W doœwiadczeniu u yto popularnej odmiany chryzantemy wielkokwiatowej (Chrysanthemum x grandiflorum /Ramat./ Kitam.) Satinbleu otrzymanej w formie kultur pêdowych z firmy VITROFLORA z Trzêsacza k. Bydgoszczy. Roœliny namno ono in vitro metod¹ jednowêz³owych fragmentów pêdu na po ywce MS bez regulatorów wzrostu. Po namno eniu wybrano jednakowe pêdy maj¹ce po 12 wêz³ów, podzielono je na trzy równe czêœci: proksymaln¹, centraln¹ i dystaln¹. Z ka dego fragmentu pêdu pobierano poprzez odciêcie po dwa eksplantaty liœciowe oraz po dwa miêdzywêÿla (o d³ugoœci 90 PRACE EKSPERYMENTALNE

3 α = +

4 Ma³gorzata Zalewska, Natalia Miler 3. Wyniki i dyskusja Wp³yw po³o enia eksplantatu na roœlinie in vivo na regeneracjê pêdów przybyszowych in vitro po raz pierwszy wykaza³a Tran Thanh van (10). Epiderma u yta jako eksplantat pierwotny u tytoniu, izolowana z ³odygi z dolnej czêœci roœliny matecznej, tworzy³a wegetatywne p¹ki przybyszowe, natomiast pobrana z s¹siedztwa p¹ka wierzcho³kowego tworzy³a organy generatywne. Lu i in. (11) wykazali, e u chryzantem wiêcej pêdów przybyszowych in vitro tworzy siê z segmentów ³odygi pobranych z górnej czêœci pêdu rosn¹cego w warunkach in vivo. W naszym doœwiadczeniu topofizyczna lokalizacja eksplantatu na pêdzie wyros³ym w kulturach in vitro mia³a wp³yw na zdolnoœæ do regeneracji pêdów przybyszowych. Na miêdzywêÿlach izolowanych ze strefy dystalnej i proksymalnej pêdu tworzy³o siê siedmiokrotnie wiêcej pêdów przybyszowych ni na eksplantatach ze strefy centralnej (tab. 1). Udzia³ eksplantatów ze strefy centralnej podejmuj¹cych regeneracjê by³ ni szy ni eksplantatów izolowanych ze strefy dystalnej i proksymalnej (tab. 2). U chryzantemy Royal Purple najwiêcej pêdów przybyszowych wytworzy³o siê na segmentach ³odygi pobranych z górnej czêœci roœliny, najmniej zaœ z eksplantatów najni ej po³o onych (11). Ró nice te mog¹ wynikaæ z genotypów odmian i/lub odmiennych œrodowisk wzrostu roœlin donorowych. Na eksplantatach liœciowych z czêœci proksymalnej w naszym doœwiadczeniu do regeneracji pêdów wcale nie dosz³o. Najwiêcej pêdów przybyszowych na liœciach wytworzy³o siê na eksplantatach izolowanych ze strefy dystalnej, przy czym by³a to liczba o po³owê mniejsza ni w przypadku analogicznie usytuowanych miêdzywêÿli. Specyficzny rozk³ad aktywnoœci regeneracyjnej pêdów przybyszowych na miêdzywêÿlach oraz na liœciach izolowanych z ró nych poziomów na roœlinie mo e wynikaæ m.in. z rozmieszczenia regulatorów wzrostu, przede wszystkim auksyn i cytokinin, w organach roœliny donorowej (21,22). Tabela 1 Œrednia liczba pêdów przybyszowych wytworzonych na liœciach i miêdzywêÿlach izolowanych z ró nych stref topofizycznych z mikrosadzonek chryzantemy wielkokwiatowej Satinbleu Pozycja topofizyczna eksplantatu (B) MiêdzywêŸle Eksplantat (A) Liœæ Œrednia dystalna 0,90 a 1 A 2 0,43 a B 0,66 a centralna 0,13 b A 0,05 b A 0,09 b proksymalna 0,78 a A 0,00 b B 0,39 a Œrednia 0,60 A 0,16 B 1 Dane w kolumnach oznaczone ró nymi ma³ymi literami ró ni¹ siê istotnie. 2 Dane w wierszach oznaczone ró nymi wielkimi literami ró ni¹ siê istotnie. 92 PRACE EKSPERYMENTALNE

5 Zjawisko topofizy w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy wielkokwiatowej Tabela 2 Udzia³ (%) eksplantatów regeneruj¹cych liœci i miêdzywêÿli izolowanych z ró nych stref topofizycznych z mikrosadzonek chryzantemy wielkokwiatowej Satinbleu Eksplantat (A) Pozycja topofizyczna eksplantatu (B) MiêdzywêŸle Liœæ Œrednia dystalna 27,5 a 1 A 2 12,5 a B 20,5 a centralna 10,0 b A 5,0 ab A 7,5 b proksymalna 27,5 a A 0,0 b B 13,8 ab Œrednia 21,6 A 5,8 B 1, 2 Patrz tabela 1. Eksplantaty liœciowe wykaza³y mniejsz¹ wydajnoœæ w tworzeniu pêdów przybyszowych ni miêdzywêÿla, mniejsza by³a tak e liczba liœci podejmuj¹cych regeneracjê. Podobnie Himsted i in. (18) u dziewiêtnastu badanych odmian chryzantem stwierdzili, wydajniejsz¹ organogenezê w obrêbie miêdzywêÿli ni liœci. W doœwiadczeniu uzyskano stosunkowo niskie wspó³czynniki namna ania, co mo na wyt³umaczyæ nisk¹ aktywnoœci¹ regeneracyjn¹ badanej odmiany (18). W eksperymencie Zalewskiej i in. (19) testowano odmiany pod k¹tem regeneracji pêdów przybyszowych (na po ywce o takim samym sk³adzie, jak w niniejszym doœwiadczeniu), uzyskuj¹c u odmiany Lady Salmon œredni¹ liczbê pêdów przybyszowych na poziomie 1,6, natomiast u Lady Amber 0,09, co wskazuje na zale noœæ efektywnoœci regeneracji od genotypu. Byæ mo e analizowana odmiana Satinbleu nie odznacza siê wysokim potencja³em regeneracyjnym. Tworzenie pêdów przybyszowych w doœwiadczeniu zachodzi³a w sposób poœredni. MiêdzywêŸla w pierwszym tygodniu zwiêkszy³y swoj¹ objêtoœæ, a nastêpnie zaczê³y proliferowaæ kalus w miejscu ciêcia. Pierwsze pêdy przybyszowe na eksplantatach izolowanych ze strefy dystalnej i centralnej pojawi³y siê w trzecim tygodniu kultury, natomiast na eksplantatach pobranych z czêœci proksymalnej rozwój pierwszych pêdów obserwowano dwa tygodnie póÿniej (rys. 2). Po zapocz¹tkowaniu regeneracji, w ci¹gu kolejnych 4 tygodni liczba pêdów przybyszowych sukcesywnie zwiêksza³a siê, by osi¹gn¹æ maksimum w siódmym oraz w dziewi¹tym tygodniu (odpowiednio dla miêdzywêÿli ze strefy dystalnej oraz proksymalnej). Potem obserwowano zamieranie pêdów. Na eksplantatach izolowanych ze strefy dystalnej w dwunastym tygodniu kultury pozosta³ ostatecznie tylko jeden ywy pêd. Natomiast na eksplantatach izolowanych ze strefy proksymalnej, podczas ostatnich dwóch tygodni kultury obumar³y dwadzieœcia dwa pêdy. Na eksplantatach liœciowych pobranych z czêœci dystalnej nowe pêdy przybyszowe tworzy³y siê miêdzy trzecim a siódmym tygodniem kultury, potem obserwowano zamieranie pêdów (rys. 3). Pêdy rozwija³y siê w obrêbie kalusa regeneruj¹cego wokó³ ogonka liœciowego. Po siódmym tygodniu kultury obserwowano br¹zowienie kalusa oraz po ywki. Podobnie Himsted i in. (18) BIOTECHNOLOGIA 2 (89)

6 Ma³gorzata Zalewska, Natalia Miler Rys. 2. Dynamika regeneracji pêdów przybyszowych na miêdzywêÿlach izolowanych z ró nych stref topofizycznych mikrosadzonek chryzantemy wielkokwiatowej Satinbleu. Rys. 3. Dynamika regeneracji pêdów przybyszowych na eksplantatach liœciowych izolowanych z ró - nych stref topofizycznych mikrosadzonek chryzantemy wielkokwiatowej Satinbleu. 94 PRACE EKSPERYMENTALNE

7 Zjawisko topofizy w regeneracji pêdów przybyszowych in vitro u chryzantemy wielkokwiatowej obserwowali najwiêksz¹ dynamikê tworzenia siê pêdów przybyszowych u chryzantem miêdzy trzecim a siódmym tygodniem trwania kultury. Na podstawie wyników doœwiadczeñ sugeruje siê, e wykorzystuj¹c technikê regeneracji pêdów przybyszowych u chryzantemy, nale y wzi¹æ pod uwagê zale noœæ aktywnoœci regeneracyjnej eksplantatów od ich topofizycznej lokalizacji. Literatura 1. Molish H., (1916), Pflanzenphysiologie als Theorie der Gärtnerei, Verlag von Gustav Fisher, Jena. 2. Marcelis-van Acker, C. A. M., (1994), Ann. Bot., 74, Halim H., Edwards G. R., Coombe B. G., Aspinall D., (1988), Ann. Bot., 61, Hansen, J., (1986), Sci. Hort., 28, de Ruiter H. A., (1996), Ann. Bot., 77, Tran Than van K. M., (1981), Ann. Rev. Plant Physiol., 32, Evers, P. W., (1987), in: Bonga J. M., Durzan D. J., Eds. (1987), Cell and Tissue Culture in Forestry. Martinus Nijhoff Publishers, Dordrecht, Goldy S., Goldy R. G.,(1991), HortScience, 26, Marcelis van-acker C. A. M., Sholten H. J., (1995), Sci. Hortic., 63, Tran Than van K. M., (1973), Planta, 115, Lu C.-Y., Nugent G., Wardley T., (1990), Plant Cell Rep., 8, van Aartrijk J., van der Linde P. C. G., van Telgen H. J., (1990), Proceedings of Eucarpia Symposium Integration of in vitro techniques in ornamental plant breeding, Wageningen. 13. Broertjes C., Keen A., (1979), Euphytica, 29, Miler N., (2005), Biotechnologia, 2, Zalewska M., Lema-Rumiñska J., Miler N., (2007), Sci. Hortic., 113, Teixeira da Silva J. A., (2003), Biotech. Adv., 21, Annadana S., Rademaker W., Ramanna M., Udayakumar M., de Jong J., (2000), Plant Cell Tiss. Org. Cult., 62, Himstedt J.P., Jacobsen H.J., Fischer-Klüver G., (2001), Acta Hort., 560, Zalewska M., Miler N., D¹browska D., (2008), Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 525, Zalewska M., Lema-Rumiñska J., (2004), Biotechnologia, 2, Everat-Bourbouloux A., Bonnemain J. L., (1980), Physiol. Plant., 50, Zieslin N., Algom R., (2004), Sci. Hortic., 102, BIOTECHNOLOGIA 2 (89)