por. mgr Monika Konior Wojskowy Instytut Medyczny Zakład Epidemiologii i Medycyny Tropikalnej młodszy asystent

Transkrypt

1 por. mgr Monika Konior Wojskowy Instytut Medyczny Zakład Epidemiologii i Medycyny Tropikalnej młodszy asystent monika.konior@wim.mil.pl Rozprawy doktorska Analiza nosicielstwa Neisseria meningitidis z identyfikacją sero- i genogrup oraz określeniem kompleksów klonalnych w środowisku wojskowym w Polsce STRESZCZENIE Inwazyjna choroba meningokokowa (IChM) jest jedną z najciężej przebiegających klinicznie chorób zakaźnych, pomimo możliwości wczesnego włączenia antybiotykoterapii i rozwoju intensywnej opieki medycznej nad pacjentem. Szerzenie zakażenia odbywa się najczęściej drogą kropelkową i przez kontakt z wydzielinami osób chorych oraz bezobjawowych nosicieli, którzy stanowią 5-10% populacji ogólnej. Ocenia się, że wyższe poziomy nosicielstwa Neisseria meningitidis występują w środowiskach zamkniętych, np. w wojsku. Badania przeprowadzone pod koniec XX wieku wśród żołnierzy służby zasadniczej wykazały poziom nosicielstwa meningokoków przekraczający 60%. Po zakończeniu w 2009 r. służby zasadniczej, środowisko wojskowe w Polsce jest reprezentowane przez żołnierzy zawodowych, których dane socjodemograficzne oraz charakter pracy różnią się od zamkniętego środowiska młodych rekrutów pełniących 24-godzinną służbę w systemie koszarowym. Polska należy do krajów o nieznanych poziomach nosicielstwa Neisseria meningitidis. Minister Obrony Narodowej na mocy rozporządzenia z r., wprowadził obowiązkowe szczepienia przeciw zakażeniom meningokokowym grup A,B,C,W135,Y dla wszystkich żołnierzy zawodowych w Wojsku Polskim. Rozprawa jest próbą oceny aktualnej sytuacji epidemiologicznej i charakterystyki mikrobiologicznej N. meningitidis w środowisku wojskowym, w kontekście wprowadzenia racjonalnej immunoprofilaktyki przeciwmeningokokowej. Na podstawie tak sformułowanych założeń, celami pracy są: 1. Ocena poziomu nosicielstwa Neisseria meningitidis w środowisku żołnierzy zawodowych w Polsce. 2. Analiza sero- i genogrup oraz kompleksów klonalnych u wykrytych nosicieli N. meningitidis.

2 3. Określenie czynników ryzyka mogących mieć wpływ na występowanie zakażeń meningokokowych w środowisku wojskowym. 4. Ocena zasadności wprowadzenia obowiązkowych szczepień przeciw zakażeniom wywołanym przez N. meningitidis w Siłach Zbrojnych RP. Analizę nosicielstwa Neisseria meningitidis z identyfikacją sero- i genogrup oraz określeniem kompleksów klonalnych w środowisku wojskowym wykonano w oparciu o badania żołnierzy zawodowych pełniących służbę w 10. Brygadzie Kawalerii Pancernej w Świętoszowie. Materiał biologiczny (wymaz z jamy nosowo-gardłowej) został pobrany na terenie jednostki wojskowej od 1744 żołnierzy (861 osób badanie jednokrotne w 2015 lub 2016 r., 883 osoby badanie dwukrotne w latach ) w I kwartale 2015 r. oraz w I kwartale 2016 r. Uzyskany materiał opracowano tuż po pobraniu wykonując posiew redukcyjny na stałym podłożu mikrobiologicznym Columbia Agar z dodatkiem 5% krwi baraniej i na podłoże PoliVitex VCA3. Po przetransportowaniu posiewów do pracowni mikrobiologicznej Wojskowego Instytutu Medycznego, materiał biologiczny został oceniony makroskopowo i mikroskopowo. Szczepy o morfologii ziarenkowców Gram-ujemnych, wykazujących obecność katalazy i oksydazy cytochromowej, identyfikowano na podstawie cech biochemicznych wykorzystując kartę NH i aparat Vitek2. Szczepy, które zidentyfikowano jako Neisseria meningitidis zostały zamrożone w temp. -20 C, a następnie przetransportowane do Krajowego Ośrodka Referencyjnego ds. Diagnostyki Bakteryjnych Zakażeń Ośrodkowego Układu Nerwowego (KOROUN) celem dalszej diagnostyki. Wszystkie izolaty poddano typowaniu serologicznemu używając zestawu surowic do aglutynacji szkiełkowej. Test do typowania serologicznego jest oparty na wykrywaniu otoczkowych antygenów Neisseria meningitidis poszczególnych serogrup przy użyciu surowicy monowalentnej. Zakres badań obejmował serogrupy A,B,C,E29,W135,X,Y,Z. Typowanie wykonano z kolonii wyizolowanych na podłożu Meuller Hinton po identyfikacji gatunku. Przynależność genogrup ustalano na podstawie reakcji PCR, używając mieszaniny reakcyjnej oraz wykorzystując specyficzne startery oligonukleotydowe. Analizę produktów przeprowadzono na żelu agarozowym. Określono genogrupy izolatów A,B,C,E29,W135,Y. Fragmenty siedmiu genów wyizolowanego DNA badanych szczepów poddano sekwencjonowaniu na podstawie strony Nosicielstwo Neisseria meningitidis w latach stwierdzono przynajmniej jeden raz u 76 żołnierzy (8,6% grupy badanej). W 2015 r. wykryto 68 nosicieli (4,9% grupy badanej), natomiast w 2016 r. 65 nosicieli (5,2% grupy badanej). Nosicielstwo pojawiło się w dwóch kolejnych latach u 31 żołnierzy. W 2015 r. dla 58 izolatów zidentyfikowano 6 genogrup:

3 B (n=43, 63,2%), E29 (n=7, 10,3%), C (n=5, 7,4%), Y (n=2, 3,0%), A (n=1, 1,5%), W (n=1, 1,5%); dziewięć izolatów (NG, 13,2%) nie poddało się genogrupowaniu z zastosowanymi starterami. W 2016 r. dla 56 izolatów zidentyfikowano 5 genogrup: B (n=34, 52,3%), E29 (n=8, 12,3%), C (n=6, 9,2%),Y (n=6, 9,2%), W (n=2, 3,1%); dziewięć izolatów (NG, 13,8%) nie poddało się genogrupowaniu z zastosowanymi starterami. Na podstawie wyników analizy MLST w badanej grupie izolatów zidentyfikowano 38 różnych typów sekwencyjnych. Najwięcej, po dwóch przedstawicieli miały ST-162, ST-11439, ST-136 i ST Pozostałe ST wystąpiły pojedynczo. Wśród badanych izolatów N. meningitidis w latach znaleziono przedstawicieli 15 kompleksów klonalnych (cc), do których należały 62 izolaty. Najwięcej izolatów należało do kompleksów 41/44cc (n=8), 53cc (n=4), 162cc (n=3), 60cc i 254cc (n=2). W modelach regresji logistycznej jednoczynnikowej i wieloczynnikowej określono trzy istotne statystycznie czynniki ryzyka wystąpienia nosicielstwa: wiek, palenie papierosów i stopień wojskowy. Młodszy wiek, nikotynizm oraz posiadanie niższego stopnia wojskowego powodowało zwiększenie prawdopodobieństwa nosicielstwa Neisseria meningitidis. Przeprowadzone badania i analizy pozwoliły na wysunięcie następujących wniosków: 1. Poziom nosicielstwa Neisseria meningitidis wśród badanych żołnierzy zawodowych w latach wynosił odpowiednio 4,9%, 5,2% i 8,6%. Tym samym był porównywalny z wynikami szacowanymi w populacji ogólnej w Polsce. 2. Najczęściej izolowanymi szczepami były meningokoki grupy B (40,3%), E29 (11,7%), C (10,4%), Y (7,8%). Kompleksami klonalnymi charakterystycznymi dla szczepów wywołujących inwazyjną chorobę meningokokową w populacji polskiej, które wystąpiły u 15,8% nosicieli w środowisku wojskowym, były ST-213cc, ST- 32cc, ST-41/44cc, ST-103cc, ST-167cc, ST-92cc, ST-22cc. 3. Czynnikami socjodemograficznymi wpływającymi na wzrost ryzyka występowania nosicielstwa Neisseria meningitidis wśród żołnierzy zawodowych są, podobnie jak w środowisku rekrutów wojskowych, młody wiek, niski stopień wojskowy i palenie papierosów. 4. Obowiązkowe szczepienia przeciw zakażeniom Neisseria meningitidis w wojsku powinny być w pierwszej kolejności wykonywane u żołnierzy pełniących służbę w ciężkich warunkach środowiskowych. Wprowadzenie immunoprofilaktyki dla całego stanu osobowego Sił Zbrojnych RP powinno być poprzedzone badaniami przesiewowymi określającymi aktualną sytuację epidemiologiczną i charakterystykę mikrobiologiczną zakażeń meningokokowych w środowisku wojskowym.

4 SUMMARY Invasive meningococcal disease (IMD) is an acute infectious disease characterized by a severe clinical course even if antibiotics are administered at an early stage and intensive care is provided. The infection is transmitted from person to person via droplets or through a direct physical contact with infected patients or asymptomatic carriers, who account for 5-10% of the general population. It is estimated that carriage rates of Neisseria meningitidis in closed environments, such as the military, may be significantly higher than in the general population. A study which was conducted among Polish recruits in the last decade of the 20 th century demonstrated the prevalence of N. meningitidis carriage of over 60%. In 2009, Poland suspended compulsory conscription and transformed its national army into a fully professional organization. Recruits have been replaced by professional soldiers, whose sociodemographic profile as well as the character of work/service they perform is different from that of young conscripts who used to serve on a 24/7 basis and were permanently accommodated on military premises. Official data on the prevalence of Neisseria meningitidis carriage is unavailable in Poland. In accordance with the Regulation of the Minister of Defence of 12th February 2014, vaccination against meningococcal serogroups A, B, C, W- 135 and Y is compulsory for all professional soldiers in Poland. This dissertation aims to assess the current epidemiological situation with regard to the prevalence of Neisseria meningitidis and to study the microbiological characteristics of the bacterial strains isolated from the military personnel involved in the study, in the context of the introduction of rational meningococcal immunoprophylaxis. Based on the above assumptions, the objectives of this dissertation are: 1. To assess carriage rates of Neisseria meningitidis among professional soldiers serving in the Polish Armed Forces. 2. To identify serogroups, genogroups and clonal complexes of N. meningitidis isolated from study participants. 3. To determine risk factors associated with the prevalence of meningococcal infections in military personnel. 4. To assess the validity of introducing compulsory vaccination against infections caused by N. meningitidis in the Polish Armed Forces. The study, which was aimed to estimate Neisseria meningitidis carriage rates and to identify the serogroups, genogroups and clonal complexes of the isolates, involved professional soldiers from the 10 th Armoured Cavalry Brigade in Świętoszów, Poland.

5 The biological samples (nasopharyngeal swab) were taken from 1,744 soldiers (861 subjects a single swab collected in 2015 or in 2016, 883 subjects two swabs taken between 2015 and 2016) on the premises of the abovementioned military base in the first quarter of 2015 or the first quarter of Immediately after sampling the swabs were streaked onto a solid medium - Columbia Agar with 5% sheep blood and PolyVitex VCA3 plates. Thus prepared cultures were transported to a microbiological laboratory in the Military Institute of Medicine, where they were macroscopically and microscopically evaluated. The strains morphologically similar to Gram-negative cocci which were positive for catalase and cytochrome oxidase were then identified with biochemical tests by means of the NH card and the VITEK2 system. The strains identified as Neisseria meningitidis were stored frozen in a temperature of -20 o C and then transported to the National Reference Center for the Diagnostics of Bacterial Infections of the Central Nervous System (KOROUN) in Warsaw for further testing. Serogroups of the isolates were identified with a slide agglutination test. Serological typing of Neisseria meningitidis is based on the detection of the serotype-specific capsular antigens using monovalent serum. We have identified serogroups A,B,C,E29,W-135,X,Y,Z. Serogrouping was performed on colonies isolated from Meuller Hinton plates, after identification of the strain. Genogroups were identified with the PCR assay using the reaction mixture and genogroup-specific oligonucleotide primers. The analysis of the products was performed in agarose gel. We have identified genogroups A, B, C, E29, W135, Y. Seven gene fragments isolated from the analyzed strains were sequenced on the bases of primshtmlers website. The biological material for testing was obtained from 1,381 soldiers in 2015 and from 1,246 soldiers in Between 2015 and 2016, nasopharyngeal swabs were taken twice from 883 soldiers; 76 of the soldiers tested within the given period were found to be carriers (8.6% of the study group). In 2015, 68 soldiers were found to be carriers of Neisseria meningitidis (4.9% of the study group), and in 2016 r. 65 carriers were identified (5.2% of the study group). In the next 2 years another 31 soldiers were found to be carriers. In 2015, 58 isolates were identified as belonging to 6 different genogroups including: genogroup B (n=43, 63.2%), E29 (n=7, 10.3%), C (n=5, 7,.4%), Y (n=2, 3.0%), A (n=1, 1.5%), W (n=1, 1.5%). It was impossible to determine the genogroup of 9 isolates (NG, 13.2%) with the primers used. In 2016, 56 isolates were identified as belonging to five genogroups, including genogroup B (n=34, 52.3%), E29 (n=8, 12.3%), C (n=6, 9.2%),Y (n=6, 9.2%), W (n=2, 3.1%); 9 isolates were found to be non-groupable (NG, 13.8%) with the primers used. Based on the MLST analysis, 38 different sequence types were identified among the analyzed isolates.

6 The following sequence types: ST-162, ST-11439, ST-136 i ST-1136 had double representation. All other STs occurred singly. In both years, 15 clonal complexes (cc) were identified among the analyzed N. meningitidis strains, which included 62 isolates. Most isolates belonged to the following clonal complexes: 41/44cc (n=8), 53cc (n=4), 162cc (n=3), 60cc and 254cc (n=2). Only five isolates which were identified in both years and 1 strain isolated in 2016 have not been assigned to any of the known clonal complexes. The logistic regression analysis (univariate and multivariate) identified three risk factors as statistically significant, i.e. age, tobacco smoking and military rank. Young age, cigarette smoking and a low military rank were associated with an increased risk of N. meningitidis carriage. The conducted research and analyses have led to the following conclusions: 1. The carriage rate of Neisseria meningitidis in the subjects studied was found to be 8.6%, similar carriage rates are reported in the general population. 2. Meningococcal strains which were isolated from carriers mainly belonged to serogroup B (40.3%), E29 (11.7%), C (10.4%) and Y (7.8%). The clonal complexes most commonly associated with invasive meningococcal disease in Poland, which were found in 15.8% of the carriers, included ST-213cc, ST-32cc, ST-41/44cc, ST- 103cc, ST-167cc, ST-92cc, ST-22cc. 3. The socio-demographic risk factors for Neisseria meningitidis carriage include: young age, low military rank and tobacco smoking; professional soldiers and recruits were found to share the same risk factors. 4. Compulsory vaccination against infections caused by N. meningitidis should primarily be considered in soldiers serving in harsh environmental conditions. Before initiating mass immunization of all military personnel serving in the Polish Armed Forces, it is recommended to carry out screening tests to assess the current epidemiological situation with regard to N. meningitidis carriage among soldiers and to study the microbiological characteristics of meningococcal infections found in the military environment.