ANALIZA CZYNNIKÓW WIRULENCJI HELICOBACTER PYLORI

Transkrypt

1

2

3 POST. MIKROBIOL., 2003, 42, 2, ANALIZA CZYNNIKÓW WIRULENCJI HELICOBACTER PYLORI W ŒWIETLE GENOMIKI Renata Godlewska, El bieta Katarzyna Jagusztyn-Krynicka 1. Wstêp. 2. Ogólna charakterystyka H. pylori Charakterystyka genomu. 3. Zmiennoœæ szczepów H. pylori Mozaikowatoœæ genu vaca Bia³ko CagA i wyspa patogennoœci Zmiennoœæ fazowa genów H. pylori. 4. Ureaza g³ówny czynnik kolonizacji H. pylori. 5. Adhezja. 6. Systemy transportu bia³ek na powierzchniê komórki. 7. Regulacja ekspresji genów. 8. Podsumowanie Helicobacter pylori pathogenicity and bacterial genomics Abstract: Helicobacter pylori, one of the most common bacterial pathogens of humans, is a curved, microaerophilic, Gram-negative bacterium that persistently colonizes the gastric epithelium, causes gastritis, peptic ulcer disase, and is associated with certain types of gastric cancer. The analysis of the complete genomic sequence of two unrelated pathogenic H. pylori strains and other pathogens has extended our knowledge of bacterial genomic system, molecular mechanisms of genetic change and adaptive mutations, mechanisms of pathogenesis and evolutionary history of this organism. This review focuses on the contributions of published H. pylori sequences, as well as the contributions of recent findings from genetic studies, to understanding of determinants of pathogenicity. 1. Introduction. 2. Characteristic of H. pylori Characteristic of genome. 3. Genomic diversity of H. pylori strains vaca mosaicism CagA and pathogenicity islands 3.3. Phase-variation of the H. pylori genes. 4. Urease major colonization factor of H. pylori. 5. Adhesion. 6. Protein secretion. 7. Regulation of gene expression in H. pylori. 8. Summary 1. Wstêp Nowa era w genetyce mikroorganizmów rozpoczê³a siê w roku 1995 w momencie opublikowania pierwszej sekwencji nukleotydowej ca³ego genomu Haemophilus influenzae. Od tamtej pory znamy ju ca³kowity zapis genetyczny ponad 86 drobnoustrojów (70 gatunków bakterii i 16 archeonów, dane z wrzeœnia 2002 roku). Jest to ogromna iloœæ informacji, z których wiêkszoœci jeszcze nie rozumiemy albo nie umiemy wykorzystaæ. Prawd¹ wydaje siê byæ stwierdzenie, e kompletne sekwencje genomów stawiaj¹ przed nami wiêcej pytañ ni daj¹ odpowiedzi [20]. Genomika dostarcza nam coraz wiêcej informacji z zakresu fizjologii bakterii, genetyki, patogenezy jak równie taksonomii, ewolucji mikroorganizmów, ekologii, mikrobiologii medycznej, weterynaryjnej i rolniczej. Postêp w tej dziedzinie jest niewyobra alny, a dokona³ siê dziêki rozwojowi bioinformatyki pozwalaj¹cej na przeprowadzenie analiz in silico oraz opracowywaniu nowych technologii. Coraz doskonalsze metody mikromacierzy (mikropaneli) pozwalaj¹ porównywaæ ca³e genomy bakteryjne, analizowaæ procesy ekspresji wszystkich genów komórki 115

4 bakteryjnej oraz w przypadku bakterii patogennych poszukiwaæ genów bior¹cych udzia³ w oddzia³ywaniach pomiêdzy patogenem a organizmem ludzkim. Nasza wiedza na temat podstawowych procesów metabolizmu, przemian energetycznych, replikacji i ekspresji genów, zmiennoœci oraz czynników determinuj¹cych wirulencjê H. pylori tak e zosta³a znacznie wzbogacona po poznaniu pe³nych sekwencji genomów dwóch szczepów i J99. W dalszej czêœci pracy przedstawiono podstawowe informacje dotycz¹ce mechanizmów patogenezy tego mikroorganizmu uwzglêdniaj¹c dane pochodz¹ce z analiz genomów. 2. Ogólna charakterystyka H. pylori H. pylori, zaliczany do klasy g-proteobacteria (domena Bacteria), jest spiraln¹, Gram-ujemn¹ mikroaerofiln¹ pa³eczk¹, zdoln¹ do poruszania siê dziêki rzêskom umieszczonym na jednym z biegunów komórki. Kolonizuje œluzówkê o³¹dka, g³ównie czêœci przyodÿwiernikowej. Mikroorganizmem tym jest zaka one ponad 50% ludzkiej populacji, a w krajach rozwijaj¹cych siê odsetek osób zainfekowanych siêga 80 90%. Infekcja nabyta najczêœciej we wczesnym dzieciñstwie utrzymuje siê przez ca³y okres ycia cz³owieka wywo³uj¹c stany zapalne b³ony œluzowej i doprowadzaj¹c do choroby wrzodowej o³¹dka i dwunastnicy. Nie ma tak e w¹tpliwoœci, e zaka enie H. pylori zwiêksza ryzyko powstania raka o³¹dka (adenocarcinoma) i drobnokomórkowego ch³oniaka tkanki limfatycznej, powi¹zanej z b³on¹ œluzow¹ o³¹dka o niskim stopniu z³oœliwoœci (MALT-oma). Dlatego te w roku 1994 WHO zaliczy³a H. pylori do I klasy karcinogenów [53]. Ze wzglêdu na swoj¹ powszechnoœæ wystêpowania i chorobotwórczoœæ H. pylori, by³ jednym z najintensywniej badanych gatunków bakterii. W roku 1997 i 1999 opublikowano pe³ne sekwencje nukleotydowe dwóch szczepów [85] i J99 [3]. S¹ one dostêpne w Internecie pod adresami: i astrazeneca-boston.com/hpylori. Szczep wyizolowano w Wielkiej Brytanii od pacjenta z zapaleniem b³ony œluzowej o³¹dka, a szczep J99 otrzymano w 1994 r. od chorego z USA cierpi¹cego na wrzody dwunastnicy. Obydwa szczepy posiada³y geny caga i vaca, uznawane za istotne czynniki wirulencji Charakterystyka genomu Obydwa szczepy maj¹ genomy w postaci kolistych cz¹steczek. Porównanie najwa niejszych cech fizycznych genomów przedstawiono w Tabeli I. Wielkoœæ zsekwencjonowanych genomów mieœci siê w zakresie 1,6 1,73 Mb ustalonym na podstawie badañ wielu szczepów H. pylori metod¹ elektroforezy w zmiennym polu [83]. Wszystkie odnalezione otwarte ramki odczytu zajmuj¹ 91% ca³ego chromosomu szczepu i 90,8% chromosomu szczepu J99. Œrednia d³ugoœæ genu wynosi ok pz. Oko³o dwóch trzecich wszystkich genów wykazuje znacz¹ce podobieñstwo do genów z okreœlon¹ funkcj¹. Spoœród 1406 bia³ek wspólnych dla obydwu szczepów ok. 50% charakteryzuje siê identycznoœci¹ sekwencji aminokwasowej wiêksz¹ ni 96%. Oko³o 23% genów uznano za geny 116

5 Porównanie wybranych cech genomów dwóch szczepów H. pylori Tabela I H. pylori H. pylori J99 Wielkoœæ pz pz Zawartoœæ par GC 39% 39% Regiony o innej zawartoœci par GC 8 9 Otwarte ramki odczytu Geny o znanej funkcji Geny o nieznanej funkcji Geny koduj¹ce bia³ka posiadaj¹ce sekwencjê sygnaln¹ Geny specyficzne dla H. pylori Geny obecne w obydwóch szczepach Geny specyficzne dla szczepu specyficzne dla gatunku H. pylori, wiêkszoœæ z nich nie mia³o odpowiedników w bazach danych. Okaza³o siê jednak, po opublikowaniu w roku 2000 przez Sanger Center pe³nej sekwencji genomu C. jejuni, bakterii blisko spokrewnionej z H. pylori, e oko³o 90 genów uznanych za specyficzne dla H. pylori ma ortologi w materiale genetycznym C. jejuni. Tak wiêc liczba genów gatunkowo specyficznych uleg³a obni eniu i aktualnie jest oceniana na 17% wszystkich ORF [65]. Zawartoœæ par GC w obydwu chromosomach wynosi 39%, ale zarówno genom szczepu jak i J99 zawieraj¹ odpowiednio 8 i 9 obszarów o innej zawartoœci par GC. W obszarach o obni onej zawartoœci GC (35%) znajduj¹ siê m.in. geny koduj¹ce bia³ko CagA (tzw. wyspa patogennoœci, PAI pathogenicity island), VirB4 (homolog bia³ka Agrobacterium tumefaciens zaanga owanego w transfer T-DNA do komórek roœlinnych), bia³ka systemów restrykcji/modyfikacji. Jednym z takich obszarów jest tak e tzw. plasticity zone (PZ), w którym znajduje siê oko³o 50% genów specyficznych dla ka dego szczepu. W genomie szczepu J99 geny te zgrupowane s¹ w jednym bloku, zaœ w w dwóch, oddzielonych od siebie 600 kb fragmentem DNA. W obydwóch genomach istnieje tak e region o 43% zawartoœci par GC koduj¹cy podjednostki polimerazy RNA. Sugeruje siê, e zgrupowane obszary o odmiennej zawartoœci par GC ni reszta genomu zosta³y nabyte drog¹ horyzontalnego transferu od innych gatunków bakterii, zw³aszcza e w ich s¹siedztwie odnaleziono elementy insercyjne (IS605 i IS606). IS605 sk³ada siê z dwóch genów koduj¹cych najprawdopodobniej transpozazy o ró nym pochodzeniu filogenetycznym [1]. Obecnoœæ sekwencji insercyjnych œwiadczy o udziale procesu rekombinacji w rearan acji materia³u genetycznego. 3. Zmiennoœæ szczepów H. pylori Naukowców od dawna intrygowa³ fakt, e gatunek H. pylori kolonizuj¹cy b³onê œluzow¹ o³¹dka po³owy ludnoœci œwiata, wywo³uje tak szerokie spektrum objawów 117

6 chorobowych. Wyst¹pienie okreœlonych chorób mo e zale eæ od w³aœciwoœci i cech genetycznych zaka onego organizmu, diety i warunków ycia, ale tak e od specyficznych cech genotypu bakterii. Przyk³adowo ryzyko rozwiniêcia wrzodów dwunastnicy u osób zaka onych szczepem caga +, s1a (vaca) i icea jest du o wy sze ni u osób zaka onych szczepami nios¹cymi inne allele wymienionych genów [12]. Pomimo wielu badañ genetycznych i epidemiologicznych nie uda³o siê zidentyfikowaæ i scharakteryzowaæ konkretnych genów determinuj¹cych okreœlone symptomy chorobowe. Istotn¹ rolê przypisywano postulowanej zmiennoœci genetycznej H. pylori. Wczesne badania genomów H. pylori wykazywa³y du e zró nicowanie pomiêdzy klinicznymi izolatami na poziomie sekwencji nukleotydowej genów (microdiverity). Obserwowano ponadto istnienie ró nic w organizacji materia³u genetycznego, kolejnoœci i u³o eniu genów na chromosomie (macrodiverity) [47]. Dane te uzyskiwano przy u yciu ró norodnych technik molekularnego genotypowania, badaj¹c m.in. polimorfizm d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych uzyskiwanych po trawieniu chromosomów enzymami czêsto tn¹cymi DNA H. pylori (RFLP polimorfizm d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych, restriction fragments length polimorphisms) [55], rozpoznaj¹cymi stosunkowo niewiele miejsc w chromosomie (PFGE elektroforeza w zmiennym polu) [83], oraz metod¹ RAPD-PCR (polimorfizm produktów niespecyficznej reakcji PCR) [2]. Po opublikowaniu dwóch pe³nych sekwencji genomów szczepów i J99 okaza³o siê, e ró nice pomiêdzy nimi s¹ zaskakuj¹co ma³e. Oko³o 85% genów mia³o takich samych s¹siadów po obu stronach, a 1,8% tylko jednego wspólnego s¹siada. Ponadto u³o enie genów w obrêbie wyspy patogennoœci oraz w innych obszarach jest prawdopodobnie konserwowane [3]. Wiêkszoœæ zmian w sekwencji DNA nale y do tzw. zmian cichych, nie wywo³uj¹cych efektów fenotypowych. Alm sugeruje, e to w³aœnie one s¹ odpowiedzialne za ró nice wykrywane podczas analizy liczby i d³ugoœci fragmentów restrykcyjnych, a obserwowana ró norodnoœæ genetyczna szczepów wynika ze zbyt ma³ej rozdzielczoœci stosowanych metod. Ró nice w u³o- eniu genów autorzy t³umacz¹ zaœ inwersj¹ lub transpozycj¹ ca³ych bloków genów, zachodz¹c¹ na drodze rekombinacji przy udziale ró nych elementów IS [3]. W celu rozwi¹zania zagadki ró norodnoœci genetycznej H. pylori Salama przeprowadzi³ analizê genomów 15 klinicznych izolatów wykorzystuj¹c technikê mikromacierzy DNA [69]. U yte w tym eksperymencie szczepy by³y izolowane w ró nych krajach, od pacjentów z ró nymi objawami chorobowymi, a tak e z przypadków asymptomatycznych. 78% (1281) genów by³o obecnych we wszystkich szczepach i uznano je za geny podstawowe, konieczne do funkcjonowania mikroorganizmu. Pozosta³e 22% genów kodowa³o bia³ka specyficzne dla gatunku H. pylori, zaanga owane w procesy restrykcji i modyfikacji DNA, transpozazy oraz bia³ka powierzchniowe komórki. Obserwowano tak e ró ne wzory rozmieszczenia genów na chromosomie. Oko³o 30% genów specyficznych dla poszczególnych szczepów odnaleziono w obszarze wyspy patogennoœci i plasticity zone. Autorzy udokumentowali, e PAI najczêœciej wystêpuje jako blok 27 genów, ale odnajdywano tak e szczepy posiadaj¹ce tylko 2 lub 7 genów PAI. W przeciwieñstwie do wyspy patogennoœci, PZ wykazuje mozaikowat¹ budowê, zawiera wiele genów koduj¹cych 118

7 transpozazy i endonukleazy, co sugeruje, e jest to miejsce czêstych rearan acji materia³u genetycznego. Podczas gdy w genomach szczepów i J99 wiêkszoœæ genów specyficznych dla szczepu odnaleziono w PZ, to w chromosomach badanych 15 szczepów dwie trzecie tej kategorii genów by³o rozrzucone po ca³ym genomie w 1 8 genowych blokach. 58% wszystkich genów specyficznych dla szczepu nie ma przypisanej funkcji ani znanych odpowiedników w bazach danych [3, 85]. Heterogennoœæ klinicznych izolatów H. pylori w badaniach epidemiologicznych analizowano na dwóch poziomach, badaj¹c ró nice genetyczne pomiêdzy szczepami pochodz¹cymi od ró nych pacjentów oraz porównuj¹c materia³ genetyczny szczepów izolowany od tej samej osoby w okresie kilku lat. Wyniki tych badañ s¹ niejednoznaczne. Rezultaty jednych z pierwszych badañ nie wykazywa³y ró norodnoœci genetycznej szczepów izolowanych na przestrzeni 2 lat od tych samych pacjentów [70]. Ponadto wykazano wystêpowanie tylko niewielkich ró nic w genomach szczepów izolowanych w obrêbie tej samej rodziny [87], choæ obserwowano ró ny poziom opornoœci na metronidazol szczepów identycznych genetycznie [28]. W 2000 roku ukaza³a siê praca dokumentuj¹ca ró norodnoœæ szczepów H. pylori izolowanych od 13 pacjentów na przestrzeni 7 10 lat [50]. Oceniano w nich allele genów caga, vaca, icea i IS605, oraz opornoœæ szczepów na metronidazol. Dodatkowo badano ró norodnoœæ ca³ego genomu metodami RAPD-PCR i AFLP (amplified fragment length polymorphism), metody ELISA u yto do oceny fenotypu szczepu pod k¹tem wystêpowanie antygenu Lewis a. U dwóch z poœród 13 pacjentów (15%) wykryto mieszan¹ infekcjê, czyli zaka enie wiêcej ni jednym szczepem H. pylori. Pozosta³e 11 szczepów, izolowanych na przestrzeni 7 lat, zawiera³o w genomie te same allele caga, vaca, icea i IS605. Ró nice ujawni³y siê dopiero przy badaniu pe³nych genomów metodami RAPD-PCR i RFLP, co jest wg autorów wynikiem tzw. dryfu genetycznego (genetic drift) maj¹cego miejsce w populacji H. pylori w trakcie d³ugoterminowej kolonizacji gospodarza. Zmianom genetycznym towarzyszy³y tak e zmiany fenotypowe, dotycz¹ce zw³aszcza poziomu ekspresji genów odpowiedzialnych za syntezê antygenu Lewis a, którego poziom spada w trakcie rozwoju infekcji. Fakt ten raczej nie dowodzi zmiennoœci genetycznej, a jest rezultatem regulacji poziomu ekspresji genów w odpowiedzi na zmieniaj¹ce siê w trakcie rozwoju infekcji warunki œrodowiska. Autorzy zgadzaj¹ siê tak e z hipotez¹ wysuniêt¹ kilka lat wczeœniej, e ci¹g³a presja selekcyjna generuj¹ca ci¹g³e zmiany (mikroewolucja) doprowadza do powstania mieszanej populacji bakterii blisko spokrewnionych, ale jednak innych i zachowuj¹cych siê jak quasi-gatunki [22]. Dodatkowo przeprowadzono analizê porównawcz¹ sekwencji 16S rrna, pochodz¹cych z 5 szczepów, która wykaza³a ró nice na poziomie 0,2 0,5%. Dla porównania ró nice w sekwencji 16S rrna pomiêdzy innymi gatunkami rodzaju Helicobacter wynosz¹ 2,7 8% [29], a ró nice w sekwencjach pomiêdzy dwoma szczepami E. coli K12 i O157:H7, wynosz¹ ~0,2%. Obserwowana ró norodnoœæ genetyczna klinicznych izolatów H. pylori mo e byæ wywo³ywana przez ró ne mechanizmy: g³ównie mutacje punktowe, rearan acje DNA zachodz¹ce na drodze rekombinacji oraz poziomy transfer genów. 119

8 3.1. Mozaikowatoœæ genu vaca Za jeden z g³ównych czynników wirulencji H. pylori uwa a siê cytotoksynê wakuolizuj¹c¹ VacA. W 1988 roku Leunk i wsp. [52] zaobserwowali, e 50% supernatantów otrzymanych po odwirowaniu komórek H. pylori z hodowli indukowa³o powstawanie wakuoli w komórkach linii HeLa. Dalsze badania wielu linii ssaczych komórek potwierdzi³y te spostrze enia. Gen koduj¹cy bia³ko VacA jest obecny w genomach wszystkich izolowanych szczepów H. pylori, choæ niektóre nie wywo³uj¹ opisanego efektu fenotypowego. Udokumentowano, e w szczepach Tox, które nie indukuj¹ wakuolizacji w komórkach eukariotycznych transkrypcja genu vaca zachodzi na du o ni szym poziomie, ni w szczepach fenotypowo Tox +. Ró nica ta nie jest zwi¹zana z u ywaniem innych punktów startu transkrypcji czy z si³¹ promotorów. Postulowano istnienie w szczepach Tox + aktywatora lub w Tox represora genu vaca [35], wci¹ jednak czynniki decyduj¹ce o poziomie transkrypcji vaca pozostaj¹ niezbadane. Gen koduj¹cy cytotoksynê, vaca ma d³ugoœæ 3933 pz, powstaj¹ce bia³ko powinno wiêc mieæ masê cz¹steczkow¹ oko³o 140 kda; podczas gdy izolowane w warunkach denaturuj¹cych ma masê cz¹steczkow¹ ~ 90 kda, zaœ w nie denaturuj¹cych od 600 do 1000 kda [25]. Bia³ko VacA ma oligomeryczn¹ budowê. Natywna proteina sk³ada siê z szeœciu lub siedmiu podjednostek, a jej struktura przypomina kszta³tem kwiat z szeœcioma lub siedmioma p³atkami [51]. Prekursor cytotoksyny VacA sk³ada siê z trzech domen: 33 aminokwasowej sekwencji sygnalnej, w³aœciwej cytotoksyny wydzielanej z komórki (90 kda) i C terminalnej domeny zwi¹zanej z komórk¹ (~47 kda). Wydzielana cytotoksyna jest poddawana specyficznemu procesowaniu (ciêciu proteolitycznemu), w wyniku którego powstaje 37 kda N terminalny fragment (P37) i 58 kda fragment C terminalny (P58). Jak dot¹d wci¹ nie wiadomo czy jest to autoproteolityczna aktywnoœæ VacA czy te do ciêcia wymagana jest jakaœ proteaza. Obydwa fragmenty VacA s¹ powi¹zane wi¹zaniami niekowalentnymi [84]. Analiza mutantów w C-terminalnej domenie bia³ka zwi¹zanej z komórk¹ dowiod³a, e jest ona konieczna do sekrecji cytotoksyny, tworzy kana³ w b³onie zewnêtrznej przez który bia³ko VacA wydostaje siê na zewn¹trz komórki [72]. Sekwencja aminokwasowa dojrza³ego bia³ka VacA nie wykazuje podobieñstwa do adnej znanej bakteryjnej cytotoksyny, ale strukturalna organizacja i sposób procesowania bia³ka pozwala zaliczyæ VacA do rodziny autotransporterów wytwarzanych przez komórki wielu gatunków bakterii. Nale ¹ do niej: proteazy IgA Neisseria gonorrhoeae i H. influenzae, adhezyna Hap H. influenzae, bia³ka SepA i IcsA S. flexneri, ponad 10 bia³ek B. pertussis [33, 42]. Mechanizmy powstawania wakuoli wci¹ pozostaj¹ niejasne. Poddanie cytotoksyny krótkiemu dzia³aniu kwaœnego ph powoduje dysocjacjê oligomeru VacA i powstanie monomerów. Podjednostka P58 rozpoznaje na powierzchni komórki eukariotycznej nieznany receptor, wraz z podjednostk¹ P37 wbudowuje siê w b³onê tej komórki i tworzy kana³ selektywnie przepuszczaj¹cy aniony. Nastêpnie cytotoksyna na drodze endocytozy dostaje siê do endosomu, co powoduje wzrost przepuszczalnoœci jego œcian i akumulacjê jonów. W wyniku tych zjawisk do wnêtrza endosomu nap³ywa woda, powiêkszaj¹c go i w efekcie powstaje wakuola [68]. 120

9 Gen koduj¹cy cytotoksynê wakuolizuj¹c¹ H. pylori charakteryzuje siê mozaikowatow¹ budow¹. Obszary o sekwencji silnie konserwowanej przeplataj¹ siê z fragmentami o bardzo zmiennej sekwencji. Po raz pierwszy zosta³o to zademonstrowane przez Aterthon a, który scharakteryzowa³ gen vaca 59 szczepów H. pylori [8]. Odcinek koduj¹cy C-terminalna domenê protoksyny oraz segment po³o ony w pobli u N koñca jest silnie konserwowany we wszystkich szczepach. Zmiennoœæ wykazuje natomiast region œrodkowy (tzw. region m, middle-region) oraz fragment koduj¹cy sekwencjê sygnaln¹ bia³ka (tzw. region s, signal sequence). Znane s¹ przynajmniej trzy typy sekwencji sygnalnej, oznaczone s1a, s1b i s2 oraz cztery allele regionu m m1, m2, m1* (m1-like), m1*-m2. Wci¹ odnajdywane s¹ nowe rodzaje alleli. We wschodniej Azji wyizolowano nowy podtyp vaca oznaczony s1c, posiadaj¹cy trzy allele regionu m: m1, m2a i m2b [89], w Niemczech zaœ odnaleziono kolejny wariant podtypu m1 i nazwano go m1a [80]. Istnienie kilku ró nych genotypów regionów s i m umo liwia stworzenie licznych kombinacji genotypu genu vaca. Zgromadzono wiele dowodów wskazuj¹cych na korelacjê pomiêdzy genotypem vaca szczepu H. pylori, poziomem produkcji cytotoksyny oraz rodzajem wywo³ywanej choroby. Atherton wykaza³, e szczepy posiadaj¹ce kombinacjê alleli s1/m1 charakteryzuj¹ siê produkcj¹ cytotoksyny na bardzo wysokim poziomie i co jest z tym zwi¹zane indukuj¹ powa niejsze uszkodzenia nab³onka o³¹dka, prowadz¹ce najczêœciej do choroby wrzodowej dwunastnicy i o³¹dka [9]. Ponadto szczepy o sekwencji sygnalnej typu s1 posiadaj¹ tak e kopiê genu caga i zaka enie nimi zwiêksza ryzyko choroby wrzodowej. W Niemczech 96% szczepów izolowanych od pacjentów z chorob¹ wrzodow¹ mia³o vaca-s1 genotyp, pozosta³e 4% stanowi³y szczepy o genotypie s2. Szczepy o genotypie s2 izolowano tak e od 31% pacjentów z dyspepsj¹ bezwrzodow¹ (non-ulcer dyspepsia) [80]. Wydaje siê, e sygnalny peptyd s2 jest defektywny co prowadzi do wydzielania z komórki bakteryjnej ma³ych iloœci cytotoksyny i w konsekwencji do ³agodniejszego przebiegu infekcji [68]. Wœród klinicznych izolatów otrzymanych od pacjentów w Japonii nie obserwuje siê zale noœci pomiêdzy genotypem vaca a iloœci¹ produkowanej cytotoksyny i rodzajem wywo³ywanej choroby. Izolowane tam szczepy wykazuj¹ du ¹ jednorodnoœæ, 96% posiada genotyp s1a/m1, choæ w populacji japoñskiej infekcja H. pylori te prowadzi do ró nych objawów chorobowych [46]. Mechanizmy powstawania ró nych genotypów genu vaca pozostaj¹ niewyjaœnione. W sekwencji szczepu wystepuj¹ trzy geny (HP289, HP610, HP922), koduj¹ce bia³ka wykazuj¹ce podobieñstwo, na poziomie 26 31%, do C-terminalnego fragmentu dojrza³ej cytotoksyny. Miêdzygenowa rekombinacja mo e byæ procesem, który zwiêksza liczbê powstaj¹cych wariantów cytotoksyny [85] Bia³ko CagA i wyspa patogennoœci Gen caga (cytotoxin-associated genea) koduje bia³ko, którego masa cz¹steczkowa waha siê od 128 do 146 kda, w zale noœci od szczepu [21]. Jest to g³ówny antygen H. pylori, zlokalizowany na powierzchni komórki, czêsto uznawany za marker wirulencji. W genach caga pochodz¹cych od ró nych szczepów wykazano obecnoœæ 121

10 powtórzeñ sekwencji nukleotydowych o d³ugoœci do 102 pz. Rekombinacja miêdzy nimi jest najprawdopodobniej odpowiedzialna za powstawanie bia³ek CagA o ró - nej masie cz¹steczkowej. Oko³o 45 60% szczepów H. pylori produkuje zarówno bia³ka CagA i VacA. Gen caga i wyspa patogennoœci PAI s¹ obecne w szczepach typu I, charakteryzuj¹cych siê wysok¹ wirulencj¹ i wywo³uj¹cych chorobê wrzodow¹ dwunastnicy oraz raka o³¹dka. Typ II szczepów o fenotypie CagA (brak wyspy patogennoœci), najczêœciej zwi¹zany jest z bezobjawowymi zaka eniami lub infekcjami o znacznie ³agodniejszym przebiegu (zapalenie b³ony œluzowej o³¹dka) [93]. Znane s¹ jednak przypadki wystêpowania choroby wrzodowej u chorych zaka- onych szczepami o fenotypie CagA [32]. Kontakt komórek gospodarza z komórkami bakteryjnymi posiadaj¹cymi wyspê patogennoœci indukuje w komórkach eukariotycznych uruchomienie systemu przekaÿnictwa sygna³u oraz transkrypcjê czynnika NF-6B co w konsekwencji prowadzi do produkcji interleukiny 8 (IL-8), która przyci¹ga neutrofile do miejsca reakcji zapalnej [74]. Ponadto w komórkach eukariotycznych powstaje tzw. piedesta³ adhezyjny, bêd¹cy wynikiem zachodz¹cych w ich cytoszkielecie zmian. Procesowi temu towarzyszy fosforylacja bia³ka o masie cz¹steczkowej 145 kda [7, 63, 73, 79]. Bia³ko CagA jest transportowane do komórki eukariotycznej, za pomoc¹ IV systemu sekrecji, gdzie ulega wbudowaniu w b³onê cytoplazmatyczn¹ i fosforylacji przez nieznan¹ kinazê gospodarza. Ufosforylowane CagA wi¹ e siê z eukariotycznymi bia³kami zawieraj¹cymi domenê (SH)2. Kompleks ten najprawdopodobniej aktywuje czynniki stymuluj¹ce polimeryzacjê aktyny (Arp2/3) i/lub bia³ka kontroluj¹ce organizacjê cytoszkieletu komórkowego (bia³ka rodziny Rho i wi¹ ¹ce GTP, np. Cdc42, Rac, Chp) powoduj¹c powstanie tzw. piedesta³u adhezyjnego [23]. Poniewa wykazano, e zarówno szczepy dzikie jak i ze zmutowanym CagA indukuj¹ produkcjê czynnika NF-6B i IL-8 na podobnym poziomie, te zjawiska nie s¹ zale ne od fosforylacji CagA [26]. Podobny cykl przemian indukuj¹ bia³ka IcsA/VirG bakterii rodzaju Shigella, co umo liwia patogenowi rozprzestrzenianie siê w komórkach [13]. Bia³ko CagA jest drugim (po Tir enteropatogennej EPEC E. coli) bia³kiem bakterii, które po przekazaniu do komórek nab³onkowych, ulega fosforylacji przez eukariotyczne kinazy i indukuje przekazanie sygna³u. Bia³ko Tir dodatkowo stanowi receptor dla intyminy produkowanej przez patogena [36] W 1996 zidentyfikowano w genomie szczepu nale ¹cego do typu I H. pylori 40 kb region uznany za wyspê patogennoœci [16]. Markerem obecnoœci PAI jest gen caga. W wiêkszoœci szczepów PAI wystêpuje jako jeden, ci¹g³y obszar, ale w niektórych szczepach jest podzielona przez sekwencjê IS605 na dwa regiony (tzw. cagi i cagii). W szczepach caga brak jest zarówno wyspy patogennoœci jak i sekwencji IS605. Wydaje siê wiêc, e pierwotnie w H. pylori PAI wystêpowa³a jako pojedyncza jednostka, a dopiero póÿniej nast¹pi³o przerwanie jej ci¹g³oœci poprzez wstawienie sekwencji IS605. Wyspa patogennoœci jest wbudowana do chromosomu pomiêdzy dwa geny: glr koduje racemazê glutaminianu a gen o nieznanej funkcji (w HP519) 1. Na jej koñcach znajduj¹ siê 31 nukleotydowe proste powtórze- 1 Wielkimi literami HP i numerami oznaczono geny szczepu H. pylori Konwencja ta zosta³a wprowadzona przez naukowców, którzy zsekwencjonowali genom tego szczepu [84]. 122

11 nia. W szczepach cag w tym miejscu znajduje siê tylko jedno takie powtórzenie, które mog³o pozostaæ po wyciêciu PAI [1]. W obszarze wyspy patogennoœci znajduje siê oko³o 40 otwartych ramek odczytu. PAI szczepu zawiera tylko 27 genów. Bia³ka przez nie kodowane zawieraj¹ motywy odnajdywane w ró nych bia³kach bakteryjnych: translokazach, permeazach, receptorach, bia³kach bior¹cych udzia³ w sk³adaniu struktury rzêsek i pili. Wiele genów nie ma odpowiedników w bazach danych. Trzynaœcie bia³ek posiada sekwencje sygnalne o œredniej d³ugoœci 25 aminokwasów, co sugeruje ich pochodzenie od Gram-ujemnych bakterii. Osiem bia³ek ma co najmniej dwie domeny transmembranowe, wskazuj¹ce na ich lokalizacjê w b³onie wewnêtrznej komórki. Cztery geny: virb11, virb10, virb9, vird4; koduj¹ bia³ka homologiczne do niektórych bia³ek Vir Agrobacterium tumefaciens zaanga owanych w przeniesienie bakteryjnego T DNA (tumor inducing) do komórki roœlinnej oraz do bia³ek Tra umo liwiaj¹cych przeniesienie bakteryjnego plazmidu z komórki do komórki na drodze koniugacji. Trzy z tych czterech genów (oprócz vird4) wykazuj¹ tak e homologiê do genów ptl Bordetella pertussis, które s¹ konieczne do przeniesienia toksyny bakteryjnej do komórek eukariotycznych [1]. Bia³ka te tworz¹ system sekrecji typu IV odpowiedzialny za transport bia³ka CagA i prawdopodobnie innych bia³ek efektorowych indukuj¹cych transkrypcjê genu koduj¹cego IL-8. System sekrecji typu IV w niektórych szczepach H. pylori jest nieaktywny. Porównanie sekwencji wyspy patogennoœci dwóch szczepów H. pylori i NCTC11638 wykaza³o wiele ró nic. PAI szczepu NCTC11638 zawiera element IS605 dziel¹cy j¹ na dwa regiony, zaœ w szczepie stanowi ona jeden obszar. Sekwencja DNA obu wysp wykazuje 97% identycznoœæ, chocia odkryto kilka ró - nic mog¹cych mieæ znacz¹cy wp³yw na fenotyp komórki. Cztery geny ró ni¹ siê d³ugoœci¹, w tym gen HP527 szczepu koduj¹cy bia³ko VirB10. W szczepie NCTC11638 VirB10 kodowany jest przez dwie otwarte ramki odczytu (ORF13 i 14). Ich sekwencja DNA ró ni siê od sekwencji genu HP527 delecj¹ dwóch nukleotydów, powoduj¹cych zmianê ramki odczytu. Ponadto bia³ko VirB10 szczepu ma w czêœci N terminalnej o 129 aminokwasów wiêcej ni jego odpowiednik ze szczepu NCTC Wyspa patogennoœci szczepu zawiera dwa dodatkowe geny nie posiadaj¹ce odpowiedników w bazach danych. PAI szczepu J99 tak e nie zawiera elementu IS605. Ponadto w genie koduj¹cym bia³ko VirB10 brak jest fragmentu DNA, co powoduje skrócenie bia³ka o 114 aminokwasów w porównaniu z bia³kiem szczepu Systematyczna mutageneza transpozonowa genów wyspy patogennoœci szczepu wykaza³a, e do translokacji bia³ka CagA do komórki eukariotycznej konieczna jest aktywnoœæ 17 genów (z 27), zaœ 14 bia³ek jest wymaganych do indukcji transkrypcji IL-8 [34] Zmiennoœæ fazowa genów H. pylori Zmiennoœæ jest adaptacyjnym procesem podczas którego komórki bakteryjne przechodz¹ czêste i odwracalne zmiany fenotypu. Ich konsekwencj¹ jest niejednolity 123

12 sk³ad populacji, co umo liwia patogenom kolonizacjê ró norodnych nisz ekologicznych oraz ucieczkê przed mechanizmami obronnymi gospodarza. W przeciwieñstwie do mechanizmów podwy szaj¹cych czêstoœæ przypadkowych, spontanicznych mutacji (szczepy mutatorowe) dotyczy on konkretnych genów zaœ bêd¹c procesem odwracalnym nie doprowadza do nagromadzenia potencjalnie szkodliwych dla komórki zmian. Opisano trzy g³ówne mechanizmy odpowiedzialne za zjawisko zmiennoœci fazowej. S¹ to: metylacja sekwencji GATC (fimbrie typu pap E. coli) [88], specyficzna co do miejsca rekombinacja (fimbrie typu I-fim E. coli) [41] oraz pomy³ki w replikacji DNA [41]. Ten ostatni dotyczy genów zawieraj¹cych w rejonach promotorowych lub rejonach 5 genów homopolimeryczne sekwencje (polit lub polia) lub dwunukleotydowe powtórzenia (CT, AG). Zwane s¹ one nieprzewidywalnymi loci (contingency loci). Ich obecnoœæ doprowadza do poœlizgu polimerazy w trakcie replikacji (SSM-slipped strand misspairing), w rezultacie czego potomny ³añcuch nukleotydowy zawiera wiêksz¹ lub mniejsz¹ ni matryca liczbê powtórzeñ. Konsekwencj¹ tego typu zmian s¹ zaburzenia procesu transkrypcji i translacji, niejednokrotnie prowadz¹ce do braku funkcjonalnego bia³ka. W wyniku analizy komputerowej zidentyfikowano takie powtórzenia w potencjalnych obszarach promotorowych 27 genów H. pylori [71], koduj¹cych bia³ka zaanga owane w syntezê LPS, sk³adniki systemu restrykcji i modyfikacji, 8 bia³ek b³ony zewnêtrznej (OMP) oraz bia³ka o nie poznanej funkcji. Appelmelk [5] udokumentowa³ wystêpowanie zjawiska zmiennoœci fazowej w komórkach ró nych serotypów nie zawieraj¹cych i zawieraj¹cych antygen grup krwi Lewis a. Znanych jest kilka typów antygenu Lewis a: (Le x, Le y, typ H, i-antygen, Le a, Le b, grupy krwi A), wszystkie to wielocukry obecne na powierzchni komórek eukariotycznych, zw³aszcza erytrocytów. Wiêkszoœæ szczepów H. pylori produkuje antygen Le x lub Le y lub obydwa, rzadziej spotykane s¹ antygeny Le a i Le b. W komórce bakteryjnej te wielocukru wchodz¹ w sk³ad LPS-u [75, 92]. Poniewa ich budowa jest bardzo podobna do budowy eukariotycznych antygenów Le obecnych na powierzchni komórek nab³onkowych o³¹dka, taka molekularna mimikra mo e pomagaæ komórkom bakteryjnym w ucieczce przed uk³adem immunologicznym gospodarza, ale tak e mo e indukowaæ odpowiedÿ autoimmunologiczn¹ wywo³uj¹c¹ objawy chorobowe [5, 62]. Szlak biosyntezy bakteryjnego antygenu Le x jest identyczny jak ludzkiego. $ 1,4-galaktozylotransferaza katalizuje do³¹czenie galaktozy do N-acetyloglukozoaminy, a nastêpnie do powsta³ego zwi¹zku (Gal$ 1,4GlcNAc)"1,3-fukozylotransferaza przy³¹cza fukozê. W genomach wielu szczepów H. pylori istniej¹ dwa geny koduj¹ce "1,3-fukozylotransferazê i obydwa zawieraj¹ ci¹gi polic. Zmiana d³ugoœci powtórzeñ tych odcinków DNA powoduje odwracalne przesuniêcia ramki odczytu czego konsekwencj¹ jest brak aktywnego produktu genu. Bia³ka, bêd¹ce produktami tych dwóch genów ró ni¹ siê specyficznoœci¹ substratow¹. Appelmelk i wsp. [4] zaproponowa³, aby nazwaæ je futa i futb. S¹ one odpowiednikami genów HP0379 i HP0651 szczepu Oprócz dwóch opisanych genów zidentyfikowano przynajmniej trzy geny H. pylori bior¹ce udzia³ w syntezie LPS koduj¹ce bia³ka ulegaj¹ce zmiennoœci 124

13 fazowej. S¹ to: "2-fukozylotransferaza, $3-galaktozylotransferaza, $3-N-acetylo-D- -glukozoaminylotransferaza. Obecnoœæ wielu genów podlegaj¹cych zmiennoœci fazowej, których produkty bior¹ udzia³ w syntezie LPS powoduje, e w populacji bakterii mog¹ znajdowaæ siê komórki produkuj¹ce a 32 ró ne typy LPS-u [6]. Do produkcji antygenu Le x wymagana jest tylko "1,3-fukozylotransferaza, ale do syntezy antygenu Le y konieczna jest aktywnoœæ obydwóch enzymów: "1,3-fukozylotransferazy i "1,2-fukozylotransferazy. W chromosomie szczepu nie odnaleziono genu, który móg³by kodowaæ drugi enzym, chocia B e r g sugerowa³, e gen HP94 mo e kodowaæ "1,2-fukozylotransferazê [10]. Gen HP94 jest jednak krótszy od homologicznych genów pochodz¹cych z komórek innych bakterii. Wstawienie in silico w obszar jego sekwencji powtórzeñ GC i po³¹czenie z s¹siaduj¹cym genem HP93 odtworza pe³n¹ ramkê odczytu wykazuj¹c¹ siln¹ homologiê do innych "1,2-fukozylotransferaz. W szczepie H. pylori UA802 odnaleziono pe³ny gen koduj¹cy "1,2-fukozylotransferazê. Unieczynnienie obydwóch genów (HP94 i "1,2-fucT szczepu UA802) poprzez wklonowanie w ich obszar genu koduj¹cego opornoœæ na chloramfenikol hamuje syntezê antygenu Le y w szczepach i UA802. Obydwa geny "1,2-fucT zawieraj¹ obszary polic oraz powtórzenia TAA, które umo liwiaj¹ zmiennoœæ fazow¹ tych bia³ek. Zadziwiaj¹ce jest, e zarówno ramka odczytu o pe³nej d³ugoœci (szczep UA802) jak i skrócona (szczep 26695) mog¹ kodowaæ pe³nej d³ugoœci bia³ko. Poni- ej opisano mechanizm wyjaœniaj¹cy to zjawisko. W œrodkowym regionie genu "1,2-fucT odnaleziono trzy charakterystyczne obszary: odcinek polic podobny do obecnego w pobli u 5 koñca genu "1,3-fucT, powtórzenia sekwencji TAA, charakterystyczn¹ strukturê (kaseta) generuj¹c¹ translacyjne przesuniêcie o jedn¹ pozycjê ( 1 frameshift) podobn¹ do tej która jest obecna w genie E. coli dnax koduj¹cym podjednostki J i ( polimerazy III DNA. Kaseta ta sk³ada siê z siedmionukleotydowej sekwencji AAAAAAG, potencjalnego miejsca Shine-Delgarno i sekwencji tworz¹cej strukturê spinki do w³osów, w obrêbie której znajduje siê kodon stop. Obszar polic i powtórzenia TAA mog¹ zmieniaæ ramkê odczytu, w ten sposób e translacja koñczy siê na kodonie stop umieszczonym przy 3 koñcu genu HP94. Jednak e dziêki obecnoœci kasety, generuj¹cej translacyjne przesuniêcie, bezpoœrednio za odcinkiem polic mo liwe jest ponowne skorygowanie ramki odczytu dziêki poœlizgowi rybosomu, powoduj¹ce powstawanie bia³ka normalnej d³ugoœci. Czêstoœæ wystêpowania tego zjawiska oceniana jest na 50% [91]. Schemat budowy genu "1,2-fucT przedstawiono na rys. 1. Poniewa w syntezie antygenu Le y bior¹ udzia³ obydwie fukozylotransferazy wy³¹czenie któregokolwiek z genów powoduje powstanie fenotypu szczepu Le y. Jeœli obydwa geny s¹ w stanie w³¹czonym lub czêœciowo w³¹czonym to produkcja antygenów Le x i Le y zale y od wzajemnego stosunku iloœciowego obydwu enzymów. W szczepie UA802 poziom "1,3-fukozylotransferazy jest niski, wiêc produkowany antygen Le x jest zamieniany przez "1,2-fukozylotransferazê (której 125

14 Rys 1. Schemat budowy genu "1,2-fucT jest du o w komórce) na antygen Le y i fenotyp szczepu jest Le x /Le y+. Natomiast w szczepie gen "1,2-fucT jest czêœciowo w³¹czony, enzym jest produkowany (chocia w niewielkiej iloœci) co powoduje fenotyp szczepu Le x+ /Le y+. 4. Ureaza g³ówny czynnik kolonizacji H. pylori Opublikowanie pe³nej sekwencji genomu H. pylori nie wnios³o wielu nowych informacji dotycz¹cych ureazy oraz mechanizmów regulacji jej aktywnoœci i syntezy. Bezsprzecznie ureaza jest jednym z g³ównych czynników wirulencji, mutanty nie wytwarzaj¹ce aktywnego enzymu nie s¹ zdolne do kolonizacji nab³onka œluzówki o³¹dka zwierz¹t doœwiadczalnych [86]. H. pylori kolonizuje nab³onek o³¹dka niektórych ssaków. Aby dotrzeæ do tej warstwy bakteria musi przetrwaæ w soku o³¹dkowym o ph <2 oraz spenetrowaæ warstwê œluzu wyœcie³aj¹c¹ œciany o³¹dka. Jednym z czynników umo liwiaj¹cych kolonizacjê jest produkcja ureazy, która stanowi 6 10% wszystkich bia³ek produkowanych przez H. pylori. Enzym katalizuje reakcjê rozk³adu mocznika do amoniaku i dwutlenku wêgla. Nagromadzony amoniak alkalizuj¹c œrodowisko powoduje neutralizacjê soku o³¹dkowego, co w konsekwencji pozwala komórkom H. pylori bezpiecznie sforsowaæ warstwê œluzu i dotrzeæ do nab³onka. H. pylori nie jest bakteri¹ acidofiln¹. Optymalne warunki do wzrostu komórek in vitro stwarza œrodowisko o ph 6 7. Nie obserwuje siê wzrostu bakterii w zakresie ph 4,5 5 ani powy ej ph 8. Dopiero w obecnoœci mocznika komórki mog¹ przetrwaæ in vitro w ph 3. Wyprodukowany podczas hydrolizy mocznika amoniak mo e równie s³u yæ jako Ÿród³o azotu. Syntetaza glutaminy, produkt genu glna katalizuje reakcjê: NH 3 + kwas glutaminowy + ATP glutamina + ADP + Pi (fosforan nieorganiczny). 126

15 Odkrywcy genu sugeruj¹, e pe³ni on g³ówn¹ rolê w asymilacji azotu przez bakteriê [38], choæ hipoteza ta jest kontrowersyjna i wymaga dalszych badañ [15]. Chocia, powstaj¹cy w reakcji hydrolizy mocznika przez ureazê, amoniak nie ma wp³ywu na metabolizm bakterii, to indukuje zarówno bezpoœrednio jak i poœrednio powstawanie uszkodzeñ komórek tkanki nab³onkowej. Amoniak w œrodowisku wodnym dysocjuje uwalniaj¹c jon amonowy i jony OH. Jony amonowe nie s¹ szkodliwe dla komórek eukariotycznych, ale jony wodorotlenowe maj¹ toksyczny wp³yw na komórki [77]. Aktywnoœæ ureazy mo e byæ tak e odpowiedzialna za uszkodzenia nab³onka o³¹dka poprzez interakcje z uk³adem immunologicznym gospodarza. Kontakt komórek bakteryjnych z komórkami uk³adu immunologicznego (np. z neutrofilami) powoduje uruchomienie tlenowych mechanizmów zabijania drobnoustrojów. Sugeruje siê, e nadtlenek wodoru utlenia jony chlorowe, które nastêpnie reaguj¹ z amoniakiem, uwalnianym po hydrolizie mocznika przez ureazê, i powstaje silnie cytotoksyczna monochloramina [82]. Monochloramina wywiera mutagenny efekt na DNA komórek eukariotycznych, tak wiêc mo e byæ istotnym czynnikiem doprowadzaj¹cym do powstawania nowotworów u osób z chroniczn¹ infekcj¹ H. pylori. Ponadto sama ureaza mo e powodowaæ aktywacjê monocytów, uruchamianie odpowiedzi przeciwzapalnej, której efektem jest uszkodzenie nab³onka œluzówki o³¹dka [54]. Wykazano tak e, e ureaza uczestniczy w procesach chemotaksji H. pylori. Bakterie nie produkuj¹ce ureazy nie wykazuj¹ ruchu w kierunku mocznika, wêglanu sodu i wêglanu potasu w œrodowisku naœladuj¹cym lepkoœæ œluzu w o³¹dku [60]. W produkcjê ureazy zaanga owanych jest co najmniej siedem genów, skupionych w dwóch obszarach. Geny ureab koduj¹ dwie podjednostki enzymu, a ureiefgh bia³ka pomocnicze konieczne do wbudowywania jonów niklu do centrum aktywnego (UreEFGH) i bia³ko zwi¹zane z transportem mocznika. Wiêkszoœæ ureaz to oligomery zbudowane z trzech podjednostek: ", $ i (, ale znane s¹ odstêpstwa od tej regu³y. Ureaza H. pylori sk³ada siê z dwóch strukturalnych podjednostek o masach cz¹steczkowych odpowiednio 26,5 kda i 61 kda, które tworz¹ aktywny enzym [19], ureaza Proteus mirabilis zbudowana jest z trzech podjednostek kodowanych przez geny ureabc, zaœ ureaza z roœliny Canavalia ensiformis (fasola jaœ ) z jednej podjednostki. Wszystkie enzymy wykazuj¹ strukturalne podobieñstwo [59]. Ureaza jest metaloenzymem, wymagaj¹cym do swojej aktywnoœci jonów niklu. Oprócz czterech wspomnianych genów operonu bior¹cych udzia³ we wbudowywaniu jonów metalu do dojrza³ej cz¹steczki bia³ka, w procesie powstawania aktywnego enzymu bierze udzia³ 32 kda bia³ko b³onowe, produkt genu nixa [58]. Dodatkowymi genami zwi¹zanymi z przenoszeniem jonów Ni 2+ i zaanga owanymi w prawid³owe funkcjonowanie ureazy s¹ geny abcabcd, stanowi¹ce operon koduj¹cy tzw. system transportu ABC, hspa, hpn i gen koduj¹cy ATPazê typu P [39, 43, 56, 57, 81]. Wyj¹tkowo interesuj¹ce s¹ zagadnienia zwi¹zane z mechanizmami reguluj¹cymi aktywnoœæ i lokalizacjê enzymu. Ureaza H. pylori, w przeciwieñstwie do innych ureaz bakteryjnych, jest bia³kiem zarówno cytoplazmatycznym, zwi¹zanym z os³onami komórkowymi, jak i wydzielanym do œrodowiska. Mechanizmy transportuj¹ce 127

16 ureazê na powierzchniê komórki pozostaj¹ niejasne. Niektórzy badacze uwa aj¹, e dzieje siê to za spraw¹ tzw. altruistycznej autolizy, czyli e dziêki œmierci czêœci komórek uwalniana jest nagromadzona ureaza, która jest absorbowana na powierzchni yj¹cych bakterii [49]. Inna grupa uwa a, e ureaza i bia³ka zwi¹zane z jej aktywnoœci¹ s¹ transportowane na powierzchniê komórki przez nieodkryte do tej pory mechanizmy transportu [90]. Maksymaln¹ aktywnoœæ enzymu obserwuje siê w œrodowisku o ph neutralnym, a wiêc w warunkach panuj¹cych w cytoplazmie [40]. Czynnikiem limituj¹cym aktywnoœæ wewn¹trzkomórkowej ureazy jest dostêpnoœæ substratu mocznika, który s³abo przenika przez b³ony komórki bakteryjnej [67]. Pocz¹tkowo uwa ano, e gen urei, wchodz¹cy w sk³ad operonu ureazowego, koduje bia³ko o nieznanej funkcji niezbêdne do prze ycia bakterii w organizmie gospodarza, ale którego brak nie wp³ywa na aktywnoœæ ureazy [76]. Ta 21,7 kda proteina, zawieraj¹ca szeœæ transmembranowych domen, jest integralnym sk³adnikiem b³ony wewnêtrznej wielu gatunków rodzaju Helicobacter, ale jej homologii odnaleziono w operonach ureazowych tylko dwóch innych gatunków bakterii: Streptococcus salivarius i Lactococcus fermentum [15]. Obydwa wymienione gatunki maj¹ zdolnoœæ do kolonizacji nisz ekologicznych o kwaœnym odczynie. Dodatkowo analiza genomów innych gatunków mikroorganizmów wykaza³a podobieñstwo UreI do b³onowego bia³ka AmiS (operony amidazowe P. aeruginosa, Rhodococcus sp., Mycobacterium smegmatis, B. pertussis), najprawdopodobniej zwi¹zanego z transportem zwi¹zków amidowych (R-CO-NH 2 ). Amidy maj¹ podobn¹ budowê chemiczn¹ do cz¹steczki mocznika (NH 2 -CO-NH 2 ) [15]. Przedstawione powy ej obserwacje zapocz¹tkowa³y okres intensywnych badañ genu urei. Funkcjonuje ono jako kana³ b³ony wewnêtrznej, transportuj¹cy mocznik do komórki, a jego aktywnoœæ stymulowana jest spadkiem ph œrodowiska zewnêtrznego. Kana³ zostaje otwarty gdy ph w otoczeniu bakterii spada poni ej 6,5. Powstaj¹cy w procesie hydrolizy amoniak uwalniany jest do œrodowiska. Tak wiêc czynnikiem limituj¹cym mo liwoœæ stworzenia sprzyjaj¹cych do ycia mikroorganizmu warunków jest import mocznika do wnêtrza komórki, a nie eksport amoniaku [15, 67]. 5. Adhezja Wiêkszoœæ bakterii H. pylori odnajdywana jest w warstwie œluzu jako wolno yj¹ce komórki, ale obserwuje siê tak e populacjê zwi¹zan¹ z eukariotycznymi komórkami nab³onkowymi. Zjawisko adhezji badano stosuj¹c ró norodne histochemiczne i immunohistochemiczne techniki oraz pierwotne jak i wtórne linie komórek eukariotycznych. Najczêœciej stosowanymi liniami by³y pochodne komórek nowotworowych o³¹dka AGS i Kato III [44]. H. pylori charakteryzuje siê silnie zaznaczonym tropizmem, kolonizuj¹c wy³¹cznie komórki nab³onkowe o³¹dka ludzi i ma³p naczelnych. Za receptory komórek nab³onkowych rozpoznawane przez ligandy bakteryjne uznawane s¹ cz¹steczki o ró norodnej budowie, np.: laminina (glikoproteina), fosfatydyloetanolamina 128

17 (receptor fosfolipidowy), polisacharydy zawieraj¹ce kwasy sialowe, sulfomucyna oraz antygeny grupy krwi: H-1 i Le b. Pierwsz¹ opisan¹ potencjaln¹ adhezyn¹, rozpoznaj¹c¹ N-acetyloneuraminylolaktozê, by³o bia³ko HpaA [31]. Jednak rola tego bia³ka w adhezji, przynajmniej do komórek AGS, nie zosta³a potwierdzona. Bia³ko HpaA jest najprawdopodobniej bia³kiem buduj¹cym pochewkê rzêski [48]. Analiza genomu H. pylori szczepu przeprowadzona przez Tomb i wsp. [85] ujawni³a istnienie w nim 19 innych lipoprotein, potencjalnych adhezyn tego mikroorganizmu. Ich udzia³ w procesie adhezji wymaga eksperymentalnej weryfikacji. W genomie H. pylori odnaleziono 32 przedstawicieli rodziny bia³ek b³ony zewnêtrznej, charakteryzuj¹cych siê wysok¹ homologi¹ sekwencji aminokwasowej N i C koñca i zmiennym rejonem œrodkowym bia³ka. Do tej grupy bia³ek nale ¹ produkty genów bab (blood group antigen binding), z których bia³ko BabA2 ma zdolnoœæ do rozpoznawania, zlokalizowanych na powierzchni komórek nab³onkowych o³¹dka, fukozylowanych polisacharydów (antygenów grupy krwi typu Le b i H-1). Ponad 50% przebadanych pod tym k¹tem klinicznych izolatów wykazuje tê w³aœciwoœæ w eksperymentach in vitro [45]. W genomach szczepów H. pylori odnaleziono ró n¹ liczbê kopii genów tej grupy. Gen koduj¹cy adhezynê, baba2, odkryto w szczepie CCUG Jego produktem jest bia³ko zbudowane z 721 aminokwasów, zwi¹zane z b³on¹ komórkow¹ bakterii. Odnaleziono tak e drugi gen, baba1, identyczny jak baba2, z wyj¹tkiem braku 10 nukleotydowego fragmentu z rejonu sekwencji sygnalnej. Nieobecnoœæ tego odcinka w genie baba1 prowadzi do powstania skróconej formy bia³ka BabA, która nie wykazuje zdolnoœci do wi¹zania z antygenem Le b. W genomie szczepu ortologami genów baba1 i babb, odkrytych w szczepach pochodz¹cych z Australii i Szwecji, s¹ odpowiednio otwarte ramki odczytu HP1243 i HP896 [45]. Nie odnaleziono odpowiednika genu baba2, co wyjaœnia brak zdolnoœci tego szczepu do adhezji do komórek nab³onkowych wyra aj¹cych na swojej powierzchni antygenu Le b. Sk³ad sekwencji nukleotydowej genu baba1 (46%) odbiega od sk³adu charakterystycznego dla ca³ego genomu H. pylori jak i od zawartoœci par GC w obrêbie wyspy patogennoœci. Sugeruje to, e geny bab zosta³y nabyte w drodze poziomego transferu genów, ale ich pochodzenie jest prawdopodobnie odmienne ni genów PAI [45]. Znaczenie adhezji, w której poœrednicz¹ ligandy Bab w wywo³ywaniu objawów chorobowych potwierdzaj¹ badania epidemiologiczne. Wiadomo, e osoby posiadaj¹ce grupê krwi 0, zainfekowane H. pylori, nara one s¹ na statystycznie wy sze ryzyko rozwiniêcia choroby wrzodowej, w porównaniu z ludÿmi z grup¹ krwi A i B, u których poziom receptorów rozpoznawanych przez bakteriê na powierzchni komórek nab³onkowych jest znacznie ni szy. Wykazano, e tak e dwa inne bia³ka AlpA i AlpB, nale ¹ce do tej samej rodziny OMP mog¹ rozpoznawaæ ró ne receptory na powierzchni komórek nab³onkowych [64]. Ponadto Namavar zidentyfikowa³ 16 kda bakteryjne bia³ko powierzchniowe, które jest aktywowane przez pojawienie siê neutrofili i wi¹ e siê z wêglowodorami obecnymi w œluzie, a tak e do antygenu Le x, co mo e wskazywaæ na jego rolê w adhezji. Sekwencja aminokwasowa wykaza³a identycznoœæ z N-terminaln¹ domen¹ bia³ka aktywuj¹cego neutrofile [61]. 129

18 Wysoki stopieñ homologii sekwencji nukleotydowych genów koduj¹cych OMP H. pylori umo liwia prawdopodobnie generowanie na drodze rekombinacji olbrzymiej iloœci wariantów sekwencji aminokwasowej kodowanych przez nie bia³ek (zjawisko zmiennoœci antygenowej). Wiele z tych genów prawdopodobnie podlega tak e zjawisku zmiennoœci fazowej. Umo liwia to powstanie zró nicowanej populacji, która ³atwiej doprowadza do chronicznej infekcji i unika mechanizmów obronnych gospodarza. 6. Systemy transportu bia³ek na powierzchniê komórki Oko³o 20% wszystkich bia³ek komórki bakteryjnej jest lokowana czêœciowo lub ca³kowicie poza cytoplazm¹. Wiêkszoœæ z nich osi¹ga swoje miejsce przeznaczenia przy u yciu g³ównej drogi sekrecji (GSP-general secretory pathway), inaczej zwanej systemem II transportu. Pierwszym etapem jest wstawienie bia³ka w b³onê cytoplazmatyczn¹ lub jego przeniesienie przez tê b³onê. U bakterii Gram-ujemnych bia³ka s¹ uwalniane do peryplazmy, wbudowywane w b³onê zewnêtrzn¹ lub transportowane na zewn¹trz komórki [66]. O ich koñcowej lokalizacji decyduje sekwencja aminokwasowa, dzia³alnoœæ peryplazmatycznych bia³ek opiekuñczych oraz obecnoœæ bia³ek odpowiadaj¹cych za transport przez b³onê. Potencjalnie 4% kodowanych przez H. pylori posiada sekwencje sygna³owe. Podobnie jak u innych gatunków bakterii Gram-ujemnych s¹ one transportowane przez b³onê wewnêtrzn¹ prawdopodobnie przez uk³ad bia³ek Sec. W komórkach E. coli znanych jest kilka tego typu bia³ek. Szeœæ z nich (SecDEFGY) tworzy kompleks sekrecyjny zlokalizowany w b³onie wewnêtrznej. Z wewnêtrzn¹ powierzchni¹ tej b³ony zwi¹zane jest ATPaza SecA, a bia³ko Sec B bêd¹ce bia³kiem opiekuñczym zlokalizowane jest w cytoplazmie. SecB posiada zdolnoœæ rozpoznawania jednoczeœnie dwóch ligandów odpowiedniej preproteiny oraz podjednostki bia³ka SecA [30, 78]. W chromosomie H. pylori nie odnaleziono tylko genów koduj¹cych SecB i SecG, uwa a siê wiêc e system dzia³a podobnie jak u E. coli, z t¹ ró nic¹ e bia³ko SecB jest najprawdopodobniej zastêpowane przez inne cytoplazmatyczne bia³ko opiekuñcze, które wspó³dzia³a z SecA [27]. W genomie H. pylori odnaleziono dwa geny koduj¹ce sygnalne peptydazy, enzymy konieczne do sekrecji bia³ek. Peptydaza typu I, LepB, jest odpowiedzialna za odcinanie peptydu sygnalnego od wiêkszoœci bia³ek peryplazmatycznych i b³ony zewnêtrznej. Gen lspa koduje peptydazê typu II, odcinaj¹c¹ sekwencje sygnalne prekursorów lipoprotein. W komórkach E. coli obecny jest tak e system sekrecji niezale ny od bia³ek Sec, tzw. system Tat (twin-arginine translocation), którego elementy odnaleziono tak e w genomie H. pylori. Uk³ad ten transportuje bia³ka w natywnej formie (kompletnie zwiniête). Posiadaj¹ one d³u sz¹ sekwencjê sygnaln¹ (ok. 38 aminokwasów), zawieraj¹c¹ charakterystyczny motyw (S/T)-R-R-X-F-L-K. Kompleks transportuj¹cy buduj¹ produkty 5 genów tatabcde. W komórkach H. pylori odnaleziono homologi tata/e (HP320), tatb (HP1060), rodziny tata/b/e (HP1061) i tatc (HP1573) [11]. 130

19 W komórkach wielu gatunków bakterii zidentyfikowano dwa systemy transportu (typ III i IV), umo liwiaj¹ce mikroorganizmom przekazywanie cz¹steczek efektorowych bezpoœrednio do cytoplazmy komórek docelowych. Aktywnoœæ obydwóch indukowana jest bezpoœrednim kontaktem patogena z komórk¹ eukariotyczn¹. Doprowadza on do otwarcia kana³u w os³onach komórkowych i budowy na powierzchni komórki bakterii specyficznej, podobnej do ig³y, struktury. Jak wykazano, analizuj¹c sekwencje bia³ek buduj¹cych te struktury, ró ni¹ siê one swoim pochodzeniem. System III powsta³ na drodze duplikacji genów buduj¹cych rzêski, podczas gdy system IV poprzez duplikacjê genów zwi¹zanych z budow¹ pili koniugacyjnych. Obydwa systemy ró ni¹ siê tak e rodzajem transportowanych cz¹steczek. System III przekazuje na teren cytoplazmy komórek eukariotycznych wy³¹cznie monomeryczne bia³ka, podczas gdy system IV przenosi zarówno nukleoproteiny (proces koniugacji) jak i bia³ka monomeryczne i oligomeryczne. Geny koduj¹ce bia³ka buduj¹ce aparaty transportu obydwóch typów czêsto zgrupowane w obrêbie wysp patogennoœci ró ni¹ siê sk³adem nukleotydowym (% GC) od reszt chromosomu. Prawdopodobnie zosta³y wiêc nabyte drog¹ horyzontalnego transferu [14, 18, 33, 37]. W genomie H. pylori nie odnaleziono genów koduj¹cych bia³ka systemu III sekrecji. Odnaleziono za to geny homologiczne do genów koduj¹cych bia³ka tzw. IV systemu sekrecji. Wiêkszoœæ jest zlokalizowana na terenie wyspy patogennoœci (rozdz. 3.2). Produkty tych genów tworz¹ wielobia³kowy kompleks umo liwiaj¹cy transport cz¹steczek efektorowych (np. CagA H. pylori) do wnêtrza komórek docelowych. W sk³ad kompleksu wchodz¹ m.in. ATPazy (homologi VirB11, VirB4 i VirD4) dostarczaj¹ce energiê potrzebn¹ do utrzymania kompleksu; transglikozydazy (VirB1), zmieniaj¹ce strukturê i kszta³t mureiny buduj¹cej œcianê bakteryjn¹; bia³ka peryplazmatyczne oddzia³ywuj¹ce z lipoproteinami (VirB7); peryplazmatyczne bia³ka opiekuñcze (CagM), cykliczne peptydazy (TraF) [17]. W komórkach H. pylori funkcjonuje tak e typ V sekrecji. Tworzy go du a grupa bia³ek tzw. autotransporterów, np. proteaza IgA H. influenzae, proteaza serynowa Serratia marcescens, bia³ko SepA S. flexneri i cytotoksyna wakuolizuj¹ca H. pylori [33]. Bia³ko VacA jest transportowane przez b³onê wewnêtrzn¹ komórki najprawdopodobniej za poœrednictwem systemu II (bia³ka Sec). Nastêpnie fragment znajduj¹cy siê na C koñcu jest odcinany i wbudowany b³onê zewnêtrzn¹ w celu utworzenia kana³u dla dojrza³ej cytotoksyny [24]. 7. Regulacja ekspresji genów Wszystkie organizmy ywe maj¹ zdolnoœæ do regulacji ekspresji swoich genów w odpowiedzi na warunki œrodowiska. Poszukiwania genów koduj¹cych bia³ka regulacyjne w genomie H. pylori ujawni³y ich niewielk¹ liczbê w porównaniu z genomem E. coli. Mo e to byæ skutkiem wysokiego stopnia przystosowania bakterii do ycia w œrodowisku œluzówki o³¹dka cz³owieka i braku konkurencji ze strony innych mikroorganizmów. Wiêkszoœæ informacji na temat regulacji ekspresji genów pochodzi z teoretycznych przewidywañ i porównañ sekwencji 131

20 nukleotydowych genów H. pylori z genami innych bakterii, wymagaj¹ one wiêc potwierdzenia eksperymentalnego. W genomie H. pylori odnaleziono tylko trzy geny koduj¹ce bia³ka zawieraj¹ce motyw helisa-skrêt-helisa, wystêpuj¹cy w wielu prokariotycznych i eukariotycznych bia³kach wi¹ ¹cych DNA. S¹ to geny HP1124 i HP1349, nie wykazuj¹ce homologii do adnych znanych genów i HP1025 koduj¹cy bia³ko szoku cieplnego homologiczne do HspR, oddzia³uj¹cym z regionem promotorowym dnak w komórkach Streptomyces coelicolor [85]. Zaskakuj¹cym odkryciem jest brak w genomie H. pylori genów koduj¹cych bia³ka homologiczne do czynników reguluj¹cych transkrypcjê F 32 i F S, odpowiedzialnych za ekspresjê genów szoku cieplnego oraz fazy stacjonarnej i stresu. Ekspresja obecnych w genomie genów koduj¹cych bia³ka szoku cieplnego jest regulowana przez czynnik F 82, homologiczny do g³ównego czynnika F 70 E. coli [3, 85]. W chromosomie H. pylori odkryto natomiast geny koduj¹ce bia³ka uczestnicz¹ce w dwusk³adnikowym systemie przekazywania sygna³u. System ten sk³ada siê z odbieraj¹cej sygna³ kinazy histydynowej i bia³ka reguluj¹cego odpowiedÿ. Odebranie bodÿca powoduje autofosforylacjê kinazy i jej zmiany konformacyjne, które s¹ odbierane przez drugi z elementów systemu. Zidentyfikowano cztery ortologi kinaz histydynowych odbieraj¹cych sygna³ i siedem ortologów bia³ek wi¹ ¹cych DNA regulatorów odpowiedzi. Kilka z nich wykazuje podobieñstwo do dobrze znanych bia³ek E. coli CheA (kinaza) i CheY (regulator odpowiedzi), bior¹cych udzia³ w chemotaksji [85]. Otwarta ramka odczytu HP703 jest natomiast odpowiednikiem genu koduj¹cego bia³ko FleR, bêd¹cego transkrypcyjnym aktywatorem syntezy rzêski u P. aeruginosa. FleR jest homologiczne do wielu bia³ek regulatorowych, wi¹ ¹cych siê do DNA i wzmacniaj¹cych ekspresjê genów, których transkrypcja zale na jest od czynnika F 54. W przeciwieñstwie do innych gatunków bakterii, rzêska H. pylori zbudowana jest z dwóch rodzajów bia³ek: g³ównej flagelliny FlaA i FlaB. Transkrypcja genu flaa jest zale na od czynnika F 28 (inaczej F F ), zaœ flab od F 54. Tomb sugeruje, e obecnoœæ tych dwóch rodzajów promotorów przed genami koduj¹cymi bia³ka zaanga owane w syntezê aparatu ruch H. pylori mo e œwiadczyæ o istnieniu kompleksowej regulacji transkrypcji w tym regulonie [56, 85]. Gen HP244 przypuszczalnie koduje kinazê histydynow¹ odbieraj¹c¹ sygna³, homologiczn¹ do bia³ka AtoS E. coli, które fosforyluje transkrypcyjny aktywator F 54 polimerazy RNA bia³ko AtoC, reguluj¹ce metabolizm krótko³añcuchowych kwasów t³uszczowych [56]. 8. Podsumowanie Analiza sekwencji nukleotydowej genomu H. pylori dostarczy³a wielu informacji na temat fizjologii i metabolizmu bakterii. Ciekawe s¹ zw³aszcza mechanizmy pozwalaj¹ce bakterii prze yæ w kwaœnym œrodowisku œluzówki o³¹dka do których nale ¹ m.in. produkcja ureazy czy procesy indukuj¹ce niezwyk³¹ zmiennoœæ antygenow¹ i fazow¹ H. pylori. OdpowiedŸ na pytanie czy i w jaki sposób zmiennoœæ 132