Badania zostały przeprowadzone z użyciem nowoczesnych metod biologii molekularnej oraz zaawansowanych technik i narzędzi bioinformatycznych, a większo

Transkrypt

1 Prof. dr hab. Paweł Sowiński Zakład Ekofizjologii Molekularnej Roślin Instytut Biologii Eksperymentalnej i Biotechnologii Roślin Wydział Biologii Uniwersytetu Warszawskiego Warszawa, Miecznikowa 1 Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik pt. The role of short DOG1 mrna form and antisense RNA in seed dormancy regulation based on the analysis of Arabidopsis thaliana transgenic lines and accessions Tworzenie nasion umożliwia wyższym roślinom lądowym rozprzestrzenianie się w środowisku, a jednocześnie pozwala im przetrwać okresy zimy czy suszy, a więc niekorzystne warunki występujące cyklicznie. Taki mechanizm unikania stresu jest w tym przypadku wynikiem wchodzenia nasion w stan spoczynku bezpośrednio po ich wytworzeniu, co zapobiega kiełkowaniu przed nastaniem nowego sezonu wegetacyjnego. Zjawisko spoczynku nasion cieszy się od lat dużym zainteresowaniem badaczy, toteż mechanizmy fizjologiczne i biochemiczne leżące u jego podstaw są już dobrze poznane. Rozprawa doktorska mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik dotyczy aktualnie najintensywniej badanych aspektów spoczynku nasion, tzn. mechanizmów molekularnych. Praca była realizowana w grupie badawczej kierowanej przez dr. Szymona Świeżewskiego z Zakładu Biosyntezy Białka, IBB, który pełni rolę promotora pomocniczego. Promotorem rozprawy jest prof. dr hab. Grażyna Dobrowolska z Zakładu Biochemii Roślin, IBB. Recenzowana rozprawa doktorska dokumentuje bardzo interesujący mechanizm regulacji ekspresji genu DOG1 biorącego udział w kontroli czasu spoczynku nasion Arabidopsis thaliana. Autorka pokazała, że czas kiełkowania nasion koreluje z poziomem ekspresji krótszego z dwóch produktów DOG1 powstających w wyniku alternatywnej poliadenylacji. W mechanizmie ekspresji genu DOG1, jako jej negatywny regulator bierze udział niekodujący transkrypt asdog1 powstający na nici antysensownej genu. Doktorantka wykazała ponadto, że ekspresja genu DOG1 w populacjach pochodzących z różnych naturalnych lokalizacji może mieć związek z polimorfizmem sekwencji nukleotydowych w obrębie genu, poprzez możliwy wpływ na pozycjonowanie nukleosomów w obrębie locus DOG1. W mojej opinii, próba odniesienia przez Autorkę swoich wyników molekularnych do mechanizmu adaptacji materiałów A. thaliana w środowisku znacząco podnosi wartość ocenianej rozprawy doktorskiej. 1

2 Badania zostały przeprowadzone z użyciem nowoczesnych metod biologii molekularnej oraz zaawansowanych technik i narzędzi bioinformatycznych, a większość wyników została opublikowana w bardzo dobrych pismach naukowych (prace oryginalne - Plant Physiology, PNAS, Nucleic Acid Research, EMBO Reports, przeglądówka RNA Biology). Należy dodać, że wyniki zamieszczone w rozprawie stanowią wydzieloną część większego projektu. Trzeba podkreślić, że Doktorantka konsekwentnie wskazywała, które części projektu powstały przy jej bezpośrednim udziale. Nie mam wątpliwości, że wkład Doktorantki w projekt tworzy zwartą całość. Rozprawa doktorska mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik stanowi ważny wkład w naukę światową odnośnie biologii spoczynku nasion. Mimo jednak mojej pozytywnej oceny pracy, nie mogę w swojej recenzji pominąć kilku uwag krytycznych. Pogrupowałem je wg kolejności rozdziałów na koniec zostawiając uwagi bardziej ogólne. 1. Wstęp (rozdział 4), który w eksperymentalnych rozprawach doktorskich powinien stanowić kompendium wiedzy o temacie, jest napisany bardzo lakonicznie i pomija ważne informacje, a także nie dostarcza pełnego uzasadnienia dla podjęcia pewnych wątków badań. a. Podrozdział poświęcony Arabidopsis thaliana (4.1) niewiele mówi o biologii roślin tego gatunku. Takie informacje są często pomijane, jeśli rzodkiewnik jest używany wyłącznie, jako model badawczy, np. w badaniach mechanizmów molekularnych. Ale Autorka odnosi swoje wyniki do ewolucji i adaptacji rzodkiewnika w różnych środowiskach, więc stosowany przez nią materiał roślinny zasługuje na większą uwagę. Trochę informacji na ten temat Doktorantka zawarła w podrozdziale 4.2. Tu jednak większość tekstu odnosi się do projektów, które dostarczyły masowych danych o gatunku, a w dużo mniejszym, co z tych danych wynika. b. Podrozdział dotyczący regulacji spoczynku nasion (4.5), choć wspomina w jednym zdaniu o czynnikach biorących w tym udział, takich jak temperatura i światło, pomija jednak relacje między tymi czynnikami, a genem stanowiącym przedmiot rozprawy. Przede wszystkim nie wspomniano o relacji między czynnikami kompleksu CBF (C-REPEAT BINDING FACTORS) a DOG1 w kontekście indukcji spoczynku nasion u A. thaliana przez niską temperaturę (Kendall i in., Plant Cell, 23: , 2011). Czynniki transkrypcyjne z tego kompleksu są odpowiedzialne za reakcję wielu roślin na niskie temperatury oraz indukcję hartowania mrozowego. Donoszono ponadto (Jian i in., Nature Comm. 7: 12377, 2016), że 2

3 spoczynek nasion i kiełkowanie A. thaliana może znajdować się pod kontrolą receptora czerwonego światła, PHYB, za pośrednictwem czynników transkrypcyjnych RVE1 i RVE2 współdziałając z DOG1. Istnieją też dane, że PHYB może brać udział w precyzyjnej percepcji zmian temperatury (Jung i in., Science. 354: , 2016). Udział fitochromu w regulacji spoczynku i kiełkowania nasion rzodkiewnika jest o tyle ważny, że pod jego kontrolą znajdują procesy fotomorfogenetyczne inicjowane bezpośrednio po kiełkowaniu, a u rzodkiewnika, wrażliwość na światło może determinować występowanie A. thaliana w różnych środowiskach na drodze mechanizmu unikania zacienienia (shade avoidance, Aukerman i in. Plant Cell, 9: , 1997). Podczas publicznej obrony proszę wyjaśnić, dlaczego ścieżki sygnałowe, w których może brać udział DOG1 i wiążące temperaturę i światło ze spoczynkiem nasion i kiełkowaniem u rzodkiewnika nie zostały omówione w pracy. c. Podrozdziały o DOG1 i kolejne stanowią rozbudowany przegląd danych molekularnych o badanym genie, regulacji jego ekspresji, itd. Na tym tle dziwi brak opisu, jak wytypowano DOG1, oprócz wzmianki, że został wskazany, jako gen związany z QTL odpowiedzialnym za spoczynek nasion w A. thaliana. W oryginalnych badaniach cytowanych w rozprawie (Alonso-Blanco i in., 2003) znaleziono jednak sześć innych loci związanych ze spoczynkiem nasion, a niektóre z nich wykazywały podobne wartości LOD, co locus DOG1. Nie od rzeczy jest wspomnieć, że w regionie dwóch loci, DOG4 i DOG7, znajdujących się na tym samym chromozomie, co DOG1 (chromozom 5), ulokowane są wspomniane wyżej geny RVE1 i RVE2, być może związane z tymi QTL-ami. W mojej opinii, w rozprawie zabrakło wyjaśnienia, dlaczego właśnie DOG1 jest uważany za kluczowy dla spoczynku nasion A. thaliana. Proszę to wyjaśnić podczas publicznej obrony. 2. Rozdział 5 formułujący cele pracy powinien zawierać hipotezy, które mają być weryfikowane w badaniach. Omawiana rozprawa doktorskiej mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik nie zawiera żadnych hipotez, a rozdział Aims of the thesis przedstawia jedynie zadania do realizacji, bez uzasadnienia celu tych zadań. Proszę o sformułowanie hipotez podczas publicznej obrony. 3. Rozdział 6 zawiera szczegółowy opis podejść i metod molekularnych stosowanych w badaniach. Są podane nie tylko procedury, ale też odpowiednie cytowania. Natomiast opis prac z roślinami (podrozdziały ) jest niepełny, a ponadto nie podano referencji, 3

4 do których można by się odwołać w razie wątpliwości. Braki takie szczególnie utrudniają ocenę pracy w przypadku opisu testu kiełkowania oraz traktowania ABA. W pierwszym przypadku (podrozdział 6.1.5) nie wiadomo, po co płytki z kiełkującymi nasionami fotografowano codziennie przez 7 10 dni i liczono skiełkowane. Z opisu nie wynika, jaki wynik brano, jako końcowy. Na podstawie pracy Alonso-Blanco i in. (2003) można przypuścić, że był to ostatni dzień. Innym wyjaśnieniem może być informacja zawarta w pracy, w której opublikowano część wyników rozprawy (Cyrek i in., 2016), że dane testu kiełkowania dla nasion kontrolnych pochodzą z dnia pełnego kiełkowania mutanta dog1-3. Drugi problem związany z opisem testu kiełkowania wynika ze stwierdzenia, że nasiona roślin kontrolnych były stratyfikowane przez trzy dni w 4 C. Oznacza to, że ich spoczynek powinien być przełamany. Jednak wg danych pokazanych na Fig. 8A (str. 39) nasiona kontrolne praktycznie nie kiełkowały, natomiast wg Fig. 26B test wykazał 60% skiełkowanych nasion kontrolnych. Proszę określić, jak był wykonywany test kiełkowania i z czego wynikały wskazane przeze mnie różnice w wynikach. W przypadku testów z użyciem ABA nie uzasadniono sposobu traktowania nasion kwasem abscyzynowym i zastosowanego stężenia hormonu (np. opierając się na badaniach wstępnych), ani nie podano odpowiednich cytowań. Dane te znalazłem w pracy zawierającej część wyników rozprawy (Yatusevich i in., 2017), niemniej powinny one być podane w rozprawie. 4. Wyniki (rozdział 7) oraz dyskusja (rozdział 8) w zasadzie nie budzą moich zastrzeżeń (z wyjątkiem wcześniej podanych sprzeczności w danych odnośnie testu kiełkowania), tym bardziej, że znaczna ich część została już opublikowana w pismach o najwyższej renomie dla dziedziny, a więc była poddana rygorystycznym recenzjom. Jako drobną uwagę odnośnie testu kiełkowania proszę potraktować pytanie, czy dane procentowe były poddane transformacji (np. Blissa), tak jak w pracy Alonso-Blanco i in. (2003). Wartości procentowe nie mają rozkładu normalnego, a to oznacza, że nie można dla nich stosować standardowych analiz statystycznych. W łagodniejszej formie zastrzeżenie to dotyczy wartości poniżej 30% i powyżej 70%. Wyniki przedstawione w recenzowanej pracy często mieszczą się w tych zakresach, więc takie dane powinny być poddane transformacji, która wartościom względnym nadaje bardziej linowy charakter. Inne drobne uwagi dotyczą Spisu literatury (rozdz.14), gdzie zabrakło kilku pozycji przywoływanych w tekście (Laibach 1940, str. 11; Casa et al., 2000, str. 14; Gupta and Rustagi, 2004, str. 14; Vignal et al., 2002, str. 14; Reiter et al., 1992, 4

5 str 15; Bazakos et al., 2017, str. 15). Ponadto kilkanaście pozycji Spisu literatury nie zawiera pełnych danych bibliograficznych - nie podano tam stron, a niekiedy również tomu pisma. Uwagi ogólne Jak wspomniałem wcześniej, dane przedstawione w rozprawie stanowią istotny wkład w wiedzę o biologii molekularnej spoczynku nasion A. thaliana, natomiast opisany mechanizm regulacji ekspresji genu DOG1 u rzodkiewnika ma znaczenie bardziej ogólne. Bardzo też doceniam starania Autorki, aby umieścić swojej wyniki molekularne w szerszym kontekście biologii rzodkiewnika. Chciałbym się tu odnieść do opinii przewijającej się w rozprawie doktorskiej mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik, że wyniki jej pracy dotyczącej mechanizmów molekularnych kontrolujących spoczynek i kiełkowanie mogą mieć znaczenie dla zrozumienia podobnych mechanizmów u roślin uprawnych. M.in. w podrozdziale poświęconym DOG1 (4.6) oraz w podrozdziale podsumowującym (8.5) Autorka stwierdziła, że homologi genu z innych gatunków biorą udział regulacji spoczynku nasion. Jednak zacytowana literatura potwierdza taki pogląd jedynie dla przywołanych w tekście roślin dwuliściennych Lepidum sativum i Lactuca sativa. Natomiast w przypadku zbóż sprawa jest bardziej dyskusyjna. W pszenicy i jęczmieniu, w kontroli spoczynku ziarniaków mogą brać udział geny DOG1-like (cytowani w rozprawie Ashikawa i in., 2014). Natomiast u ryżu, Sugimoto i in (cytowani w rozprawie), stwierdzili, że kluczowym QTL dla spoczynku ziarniaków jest Sdr4. Może on kontrolować geny OsDOG1-like, które jednak zdaniem autorów (ibid.) - trudno uznać za homologi z A. thaliana ze względu na duże różnice w sekwencji. Generalnie, przenoszenie informacji uzyskanych z A. thaliana na zboża, szczególnie tzw. ciepłolubne (ryż, kukurydza, sorgo) jest niekiedy bardzo trudne lub niemożliwe. Może to też dotyczyć procesów związanych ze spoczynkiem nasion i ich kiełkowaniem. U zbóż zaadaptowanych do klimatu umiarkowanego, procesy te są powiązane z hartowaniem mrozowym, a także z jarowizacją i zapewne znajdują się pod kontrolą czynników transkrypcyjnych kompleksu CBF, podobnie jak u A. thaliana. Natomiast u zbóż ciepłolubnych, choć elementy kompleksu CBF występują, nie odgrywają znaczącej roli w reakcji na niskie temperatury (Tondelli i in., Plant Sci., 180: 39-45, 2011). Inny problem, jaki widzę w przenoszeniu wyników uzyskanych z użyciem A. thaliana na rośliny uprawne jest związany z różnicami biologii roślin bytujących w warunkach naturalnych oraz zbóż. W pierwszym przypadku, szczególnie w silnie zmiennych warunkach 5

6 klimatu umiarkowanego, dla populacji może być korzystne, jeśli część nasion kiełkuje wcześniej, a inna później. W takich środowiskach zróżnicowane ekspresji genów kontrolujących proces fizjologiczny taki jak kiełkowanie (np. w wyniku modyfikacji genetycznych typu SNP wpływających na ekspresję genu DOG1) może być promowane. Natomiast u roślin uprawnych, szczególnie zbóż, sztuczna selekcja była i jest ukierunkowana na skrócenie okresu kiełkowania, a w szczególności na eliminację lub ograniczenie zjawiska porastania zbóż. Podsumowanie Mimo podniesionych przeze mnie niedociągnięć pracy oceniam ją bardzo wysoko względu na nowatorskie osiągnięcia odnośnie mechanizmów regulacji ekspresji genu DOG1. Na uwagę zasługuje oryginalne i wieloaspektowe podejście Autorki recenzowanej pracy do problemu. Doktorantka wykazała się wysokim poziomem wiedzy teoretycznej, zdolnością opanowania zaawansowanych technik molekularnych i bioinformatycznych, zmysłem analitycznym potrzebnym do opanowania dużej liczby danych empirycznych oraz umiejętnością syntezy naukowej. Szczególnie ważnym osiągnięciem Autorki jest wykazanie, że w mechanizmie ekspresji genu DOG1, jako jej negatywny regulator bierze udział niekodujący transkrypt asdog1 powstający na nici antysensownej genu. Przedstawiona do oceny rozprawa spełnia też wszystkie kryteria formalne wymagane dla dysertacji doktorskiej. Wnioskuję więc o dopuszczenie mgr Katarzyny Ewy Krzyczmonik do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Ze względu na inwencję badawczą Autorki, wartość merytoryczną pracy, a w szczególności opublikowanie wyników rozprawy w bardzo dobrych pismach naukowych wnoszę o jej wyróżnienie. Warszawa, prof. dr hab. Paweł Sowiński 6