Prof. dr hab. n. med. Joanna Lewin-Kowalik Katowice Kierownik Katedry i Zakładu Fizjologii

Transkrypt

1 Prof. dr hab. n. med. Joanna Lewin-Kowalik Katowice Kierownik Katedry i Zakładu Fizjologii Śląskiego Uniwersytetu Medycznego Wydział Lekarski w Katowicach Recenzja rozprawy doktorskiej mgr Justyny Ulańskiej - Poutanen Modulowanie różnicowania prekursorów oligodendrocytów w procesie remielinizacji ośrodkowego układu nerwowego Choroby demielinizacyjne ośrodkowego układu nerwowego, a zwłaszcza stwardnienie rozsiane, od lat stanowią problem dla medycyny i to z wielu powodów. Niewątpliwie istotnym jest fakt, że dotykają one ludzi młodych, a ostatnio obserwuje się znaczący wzrost zachorowań w grupie dzieci i młodzieży a nawet niemowląt. Jeszcze niedawno tak młody wiek był powodem negatywnego wnioskowania diagnostycznego, co pokutuje w decyzjach płatników usług medycznych w krajach z niewydolnym systemem ochrony zdrowia jak np. Polska, odmawiających finansowania nowoczesnego leczenia najmłodszym pacjentom. Fakt, że schorzenie to jest leczone może u osób słabiej zorientowanych w temacie wywoływać wrażenie, że także całkowite wyleczenie jest możliwe. Niestety, mimo ogromnego postępu w terapii stwardnienia rozsianego ciągle jeszcze medycyna może, i to nie we wszystkich przypadkach, jedynie opóźniać rozwój kliniczny choroby. Poniekąd szczęściem w nieszczęściu jest, że schorzenie to znacznie częściej dotyka osoby zamieszkujące obszary oddalone od równika, czyli mieszkańców tzw. bogatej północy w krajach której możliwe jest prowadzenie intensywnych badań ukierunkowanych na znalezienie naprawdę skutecznej pomocy. Jest to tym trudniejsze, że etiologia stwardnienia prawdopodobnie jest złożona o czym świadczy wiele teorii sformułowanych w tym zakresie takich jak zapalna, genetyczna, toksyczna czy

2 najlepiej udokumentowana autoimmunologiczna. A zatem do leczenia przyczynowego ciągle daleka droga. Jednakże niezależnie od przyczyny w obrazie patologicznym choroby dochodzi do powstawania ognisk demielinizacji upośledzających funkcjonowanie neuronu aż do jego degeneracji. U niektórych chorych spontanicznie w okresie remisji lub na skutek zastosowanego leczenie dochodzi do remielinizacji aksonów manifestującej się kliniczne złagodzeniem objawów. Zatem strategie terapeutyczne ukierunkowane na ten etap rozwoju choroby wydają się szczególne racjonalne, bo niezależnie od czynnika etiologicznego dają szansę na znaczącą poprawę kliniczną. W ten właśnie sposób rozumowania badawczego wpisuje się niniejsza dysertacja doktorska. Przedstawiona mi do recenzji rozprawa doktorska Pani mgr Justyny Ulańskiej - Poutanen Modulowanie różnicowania prekursorów oligodendrocytów w procesie demielinizacji ośrodkowego układu nerwowego jest obszernym, ponad stupięćdziesięcio stronicowym opracowaniem zawierającym opis doskonale zaplanowanych badań wykonanych w zespole badawczym o ogromnym doświadczeniu i osiągnięciach w tej dziedzinie. Praca skonstruowana jest w sposób typowy dla tego rodzaju opracowań i składa się z następujących części: streszczenie w języku polskim i angielskim, wstęp, założenia i cel pracy, materiały i metody, wyniki, dyskusja i wnioski. Bibliografia to 272 pozycje w większości pochodzące z ostatnich 15 lat, choć znajdują się w niej również prace znacznie starsze jak choćby powszechnie uznana praca Bunge z 1961 roku. Nie wiem czy w uznaniu zasług autorów ich nazwiska jako jedyne w spisie piśmiennictwa zostały napisane dużymi literami. W spisie znalazł się również podręcznik autorstwa Myśliwskiego dość obficie cytowany w tekście pracy. Widocznie Autorka uznała to z niezbędne. Tekst pracy poprzedzony jest wykazem zastosowanych skrótów. Wstęp jest obszernym 34 stronicowym rozdziałam, który Autorka rozpoczyna od budowy mieliny, jej roli, komórek ją wytwarzających, chorób demielini-

3 zacyjnych i remielinizacji. W części tej nie ustrzegła się jednak od pewnych niezręczności pisząc już na pierwszej stronie o zwojach mieliny a na drugiej twierdząc, że mielina składa się głównie z białek podczas gdy wiadomo, że stanowią one jedynie ok.30% jej masy. Ten pogląd o składzie mieliny uporczywie powtarza na stronie 22 pisząc o białku P0, że jest ono głównym składnikiem mieliny. Wydaje mi się, że doszło tu do pewnego niefortunnego skrótu myślowego, gdyż jak sądzę chodziło o stwierdzenie, że jest ono głównym białkiem wśród białek mieliny. Następne podrozdziały o modelach demielinizacji/remielinizcji, inhibitorach demielinizacji, mikrośrodowisku miejsca urazu i udziale różnych czynników i komórek w procesach demielinizacji czyta się, podobnie jak poprzednie z dużą satysfakcją. Ryciny opracowano bardzo starannie i są pomocne w zrozumieniu tekstu. Szczególnie interesujące są podrozdziały dotyczące jednostki oligodendrocytarnonaczyniowej i szlaków przekazywania sygnału w środowisku uszkodzenia. Przedostatni podrozdział dotyczący różnych strategii terapeutycznych w chorobach demielinizacyjnych zawiera informacje dotyczące najnowszych trendów zarówno eksperymentalnych jak i klinicznych i świadczy o doskonałej orientacji Autorki w literaturze problemu. Jednakże nie ustrzegła się w nim pewnego potknięcia pisząc na stronie 47 w wierszu 11 od dołu : Cząsteczki te mogłyby stać się celem terapeutycznym w chorobach regeneracyjnych ośrodkowego układu nerwowego.. Chciałabym zapytać jakie schorzenia ma autorka na myśli? Cel pracy przedstawiono w rozdziale 4. i dla jego osiągnięcia sformułowano 6 szczegółowych zadań badawczych. Uważna lektura tych zadań ukazuje precyzyjną mapę drogową realizacji bardzo rozległego projektu badawczego posługującego się dla realizacji swego celu wieloma złożonymi technikami Potwierdzenie rozległości i złożoności wykonanych badań znajdujemy w rozdziale Materiały i metody liczącym 18 stron i podzielonym na 4 podrozdziały z licznymi podpunktami opisujące : 1. doświadczenia z zastosowaniem modeli zwierzęcych 2. analizę różnic w globalnej ekspresji genów w niszy naczyniowej i niszy

4 bez naczyń 3. komórkowe modele analizy procesu różnicowania prekursorów oligocendrocytów 4. analizę poziomu transkryptów wybranych genów 5. identyfikację transkryptów genów i białek zaangażowanych w różnicowanie OPC w środowisku uszkodzenia Każdy z tych etapów realizacji projektu jest w zasadzie rozległym, spójnym zakresem badań posługującym się licznymi, często niezwykle złożonymi metodami. Potwierdzeniem tej obserwacji jest informacja dotycząca źródeł finansowania badań pochodzącego z kilku projektów. Aplikacje były zatem składane przez zespół i jego kierownictwo a Doktorantka była zapewne odpowiedzialna osobiście jedynie za pewną część wykonanych badań. Z podziękowań zamieszczonych na wstępie pracy wynika, że analizy bioinformatycznej danych z mikromacierzy ekspresyjnych dokonał dr Jakub Mieczkowski. Sądzę, że można było w sposób nie budzący wątpliwości przedstawić zakres badań wykonany osobiście przez Doktorantkę, co w niczym nie umniejszyłoby jej praw do posłużenie się uzyskanymi wynikami ( przy zgodzie pozostałych realizatorów projektu) dla przygotowania dysertacji doktorskiej. Nie znalazłam w tym rozdziale informacji na temat liczby zwierząt użytych w całym projekcie. Cząstkowe dane na ten temat można znaleźć w opisach rycin w wynikach lub np. przy opisie hybrydyzacji RNA do macierzy oligonukleotydowych. Wydaje mi się, że dokładna charakterystyka oraz liczebność zwierząt zarówno całościowo jak i w poszczególnych etapach i procedurach nie powinna budzić wątpliwości. W opisie doświadczenia z wykorzystaniem modeli zwierzęcych podano, że wykonano je na samicach szczepu (a nie rasy jak pisze Autorka) Wistar. Chciałaby zapytać, jaki był powód wybrania samic i czy pozostałe badania również przeprowadzono z użyciem zwierząt tej samej płci. U szczurzyc ze względu na krótki okres trwania cyklu rujowego (4-6 dni) dochodzi do nagłych dużych zmian

5 w stężeniu hormonów płciowych co nie pozostaje bez wpływu na OUN. Wiadomo, że estrogeny pobudzają neurogenezę, nie można zatem wykluczyć ich wpływu na różnicowanie w kierunku oligodendrocytów. Uważam również, że przeszczepy powinny być wykonywane w określonym, zawsze tym samym momencie cyklu rujowego. Jeżeli chodzi o technikę operacyjną użytą w uszkodzeniu nerwów kulszowych to sposób preparowania przedstawiony przez autorkę opisowo w chirurgii jest określany preparowaniem na tępo. Dokonywanie zmiażdżeniowego uszkodzenia nerwu obwodowego winno być wykonane narzędziem o powtarzalnej i określonej sile nacisku np. szczypczykami naczyniowymi lub klipsem naczyniowym stosowanym do zamykania tętniaków. Użycie w tym celu ściskanej ręcznie pęsety nie gwarantuje powtarzalności wykonanego uszkodzenia. W opisie procedury podania bromku etydyny jako cel zabiegu wskazano dolny konar móżdżku podczas gdy opis wyników odnosi się do konaru górnego. Poza technikami biologii molekularnej duże wrażenie robi użycie metody mikrodysekcji laserowej do pozyskiwania materiału do hybrydyzacji RNA do macierzy oligonukleotydowych. Po pobraniu materiał tkankowy z wyciętymi dziurami był potwierdzeniem pobrania materiału z określonego obszaru czyli niszy naczyniowej lub niszy bez naczyń. Rozdział Wyniki jest obszerną 42 stronicową częścią wzbogaconą w 24 ryciny i podzieloną na rozdziały i podrozdziały odpowiadające zakresowi wykonanych analiz. Jednakże czasami i tutaj wkradają się chochliki i tak np. przy opisie rozmieszczenia komórek Schwanna natknęłam się na zdanie dość trudne do zrozumienia: Maksymalna odległość komórek Schwanna od błony podstawnej naczynia zawierała się w przedziale od długością promienia światła naczynia dla naczyń o dużej średnicy (>30µm) do długości średnicy światła naczynia dla naczyń o małej średnicy (<30µm). Bardzo cenne i pomocne dla czytelnika jest zwięzłe podsumowanie opisywanych wyników zamieszczane na końcu każdego podrozdziału. Niektóre z tych podsumowań mają w mojej ocenie znaczenie wręcz funda-

6 mentalne, jak np. to zamieszczone na str. 110 dotyczące genów sygnałowych ze szlaków BMP i Wnt. Tutaj pozwolę sobie wspomnieć, że w całym tekście pracy natknęłam się na drobne błędy gramatyczne (wyglądające na efekt przenoszenia fragmentów tekstu) oraz interpunkcyjne. Pragnęłabym również zapytać jaką metodą dokonywano analizy obrazów immunoflurescencyjnych, jak rozumiem pochodzących od kilku osobników, aby sformułować stwierdzenie o występowaniu określonej prawidłowości. Np. ryc.9 pokazuje przykładowe obrazy z ekspresji białek zaangażowanych w proces mielinizacji. Na następnej stronie jest podsumowanie, że nisza naczyniowa jest preferencyjnym miejscem rezydowania komórek prekursorowych, które może wspierać ich zdolności do podziału i różnicowania na ścieżce alternatywnej. Czy analizowano również rozmieszczenie tych białek w niszy bez naczyń. Jeśli tak to na czym polegały różnice i jak je oceniano (mierzono, liczono?)? Jeśli nie to na jakiej podstawie dokonano tego wartościowania ( preferencyjne?). Podobny opis oceny, który stwarza wrażenie oceny na oko dotyczy np. obrazów przedstawionych na rycinie 14. Jeżeli chodzi o tę rycinę i kilka innych to dużą niedogodnością w ich analizie jest to, że opis ryciny znajduje się na następnej stronie. Zdaję sobie sprawę, że w przypadku bardzo dużych rycin, jak np. rycina ze str. 115, jest to nieuniknione, ale w przypadku str,14 i innych podobnych chyba można było tak rozmieścić tekst aby uniknąć tego przesunięcia. Prosiłabym również o rozwianie wątpliwości skąd pochodził materiał po uszkodzeniu demielinizacyjnym jeżeli na str. 97 w ostatnim zdaniu znalazłam stwierdzenie: a jego porównywalny poziom ekspresji w niszy bez naczyń może być spowodowany obecnością komórek Purkinjego.. w pobranym materiale izolowanym z obszarów granicznych uszkodzenia. Jak wynika z metodyki bromek etydyny został podany do konara móżdżku (najprawdopodobniej górnego) skąd zatem komórki Purkinjego występujące w korze móżdżku?

7 Jeśli chodzi o jakość zdjęć użytych do przygotowania rycin to jest ona akceptowalna choć waga uzyskanych wyników zasługiwałaby na lepszą jakość zdjęć. Do rozprawy dołączona została płytka z zapisem rycin, którą przeglądałam ale powiększanie obrazów nie dało dobrego skutku co chyba może świadczyć o niezbyt dużej rozdzielczości systemu rejestrującego (i zapewne mojego komputera). Dyskusja jest tradycyjnie ostatnim przed wnioskami rozdziałem rozprawy doktorskiej. W przypadku niniejszej dysertacji nie jest to rozdział obszerny, jest wręcz najkrótszy ze wszystkich, lecz napisany w mistrzowski sposób. Autorka z dużą swobodą porusza się w złożonych zagadnieniach będących przedmiotem badań. Biorąc pod uwagę mnogość metod i mechanizmów analizowanych przy ich pomocy ta biegłość jest imponująca. Jest to tym cenniejsze, że badania, których wyniki zostały zaprezentowane w rozprawie Pani mgr Justyny Ulłańskiej - Poutanen są nowatorskie i stanowią niezwykle cenny wkład do neurobiologii. Nie sposób przecenić również możliwości badawczych stwarzających obiecujące perspektywy aplikacyjne jakie wynikają z wyników przedstawionych w niniejszej dysertacji. Niewiele spotyka się rozpraw doktorskich prezentujących tak wszechstronne i dogłębne przeanalizowanie postawionego problemu. Poza opisaniem zachowania komórek prekursorowych w różnych obszarach OUN po uszkodzeniu poznano mechanizmy leżące u podstaw wybierania przez nie takich lub innych ścieżek różnicowania. Ogromnie ważnym odkryciem jest opisanie współzależności naczyniowo-prekursorowych w tych procesach. Słowem odpowiedziano nie tylko na pytania co? i jak? ale również na pytanie dlaczego? Przedstawiony na ryc. 34 schemat proponowanego przebiegu alternatywnego różnicowania prekursorów oligodendrocytów w uszkodzeniu demielinizacyjnym ma, w moim głębokim przekonaniu, ogromne szanse na zrobienie kariery podręcznikowej. Rozprawę podsumowuje 7 wniosków będących odpowiedziami na pytania i problemy postawione w celu pracy i wynikających z uzyskanych wyników. Wszystkie

8 one mają bardzo duże znaczenie naukowe i powinny stać się inspiracją do dalszych badań w tym ukierunkowanych aplikacyjnie na poszukiwanie możliwości ingerencji terapeutycznych w procesy remielinizacji u człowieka. Podsumowując pragnę stwierdzić że nieliczne uwagi krytyczne zawarte w niniejszej recenzji w niczym nie umniejszają mojej bardzo wysokiej oceny rozprawy. Autorka wykazała się umiejętnością rozwiązywania złożonego i ciekawego problemu badawczego, precyzyjnego przeprowadzenia badań oraz dojrzałością do odpowiedniego opracowania uzyskanych wyników, czego dowodem jest recenzowana rozprawa. Stwierdzam zatem, że przedstawione mi do oceny rozprawa doktorska Modulowanie różnicowania prekursorów oligodendrocytów w procesie remielinizacji ośrodkowego układu nerwowego spełnia warunki określone w art.13 Ustawy z dnia 14marca 2003 r. o stopniach i tytule naukowym oraz stopniach i tytule w zakresie sztuki (Dz.U. nr65. poz. 595 z późn. Zm. i zwracam się do Wysokiej Rady Naukowej Instytutu Biologii Doświadczalnej im. Nenckiego w Warszawie z wnioskiem o dopuszczenie mgr Justyny Ulańskiej Poutanen do dalszych etapów przewodu doktorskiego. Poza tym mając na uwadze niezwykle wysoki poziom rozprawy oraz wyjątkowe znaczenie dla nauki uzyskanych wyników wnioskuję o wyróżnienie pracy. Prof. dr hab.n.med. Joanna Lewin-Kowalik