Grupa Białek Szoku Termicznego

Transkrypt

1 Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii Instytut im. Marii Skłodowskiej-Curie, Oddział w Gliwicach Grupa Białek Szoku Termicznego

2 Miejsce HSPA2 pośród rodziny białek opiekuńczych HSP70 (HSPA) dr Dorota Ścieglińska Centrum Badań Translacyjnych i Biologii Molekularnej Nowotworów Centrum Onkologii Instytut im. M. Skłodowskiej-Curie Oddział w Gliwicach

3 PROJEKTY 1. NCN / MNiSW - N N Rola białka HSPA2 należącego do rodziny białek opiekuńczych HSP70 w procesie proliferacji warstwy bazalnej naskórka ; ; kierownik prof. Zdzisław Krawczyk, zł; 2. PRELUDIUM /05/N/NZ1/00022 Badanie mechanizmu regulacji ludzkiego genu HSPA2 w wybranych komórkach somatycznych ; ; kierownik mgr Anna Habryka, zł; 3. OPUS /09/B/NZ5/01815 Wpływ białka HSPA2, należącego do rodziny białek szoku termicznego HSPA (HSP70), na modulowanie wrażliwości komórek niedrobnokomórkowego raka płuca na pochodne platyny ; ; kierownik prof. Zdzisław Krawczyk, zł;

4 Grupa Białek Stresu Komórkowego dr Dorota Ścieglińska dr Agnieszka Gogler-Pigłowska mgr Damian Sojka (zatrudniony na 25 m-cy z grantu) mgr Wojciech Pigłowski (etat cząstkowy) prof. Zdzisław Krawczyk Doktoranci mgr Anna Habryka (studium doktoranckie Politechniki Śląskiej) Wolontariuszka doktorantka mgr Katarzyna Klarzyńska (studium doktoranckie Śląskiego Uniwersytetu Medycznego; promotor prof. Aleksander Sieroń) Zakład Patologii Nowotworów dr Mykola Chekan Klinika Transplantacji Szpiku i Onkohematologii dr Magdalena Głowala-Kosińska Klinika Chirurgii Onkologiczne i Rekonstrukcyjnej dr Mariusz Kryj

5 Doktoranci dr Piotr Filipczak Magistranci L.p. Imię i nazwisko Uczelnia Termin 1 Kania Agnieszka Uniwersytet Śląski, Wydział BiOŚ Krzemień Katarzyna Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Klarzyńska Katarzyna Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Klockiewicz Agnieszka Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Kopaczka Katarzyna Uniwersytet Śląski, Wydział BiOŚ Herok Marcin Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Kuglarz Monika Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Zawadzka-Nowicka Anna Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Krygowska Agata Uniwersytet Śląski, Wydział BiOŚ Sojka Damian Uniwersytet Śląski; Wydział BiOŚ Skrzypczyk Barbara Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Pyclik Bernadeta Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Karolina Morawiec Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny Brzęczek Sonia Politechnika Śląska, Wydział Chemiczny

6 Wprowadzenie

7 Białka HSP (heat shock protein) białka opiekuńcze (molecular chaperones) Funkcje w czasie stresu zapobieganie powstawaniu agregatów dysocjacja agregatów zwijanie uszkodzonych białek kierowanie do degradacji Hsp Funkcje house-keeping zwijanie de novo białek transport przez błony łączenie i rozłączanie regulowanie aktywności i degradacji Rodziny HSP zewnątrzkomókowe HSPH HSPC HSPA DNAJ HSPB HSP100 HSP90 HSP70 HSP40 HSP25/27

8 Nazwa genu Nazwa białka Inne stosowane nazwy Locus Liczba eksonów Wielkość białka a-a (kda) Podobieństwo sekwencji (%) HSPA1A HSPA1A HSP70-1; HSP72; HSPA1 6p (70,0) 100 HSPA1B HSPA1B HSP70-2 6p (70,0) 99 HSPA1L HSPA1L hum70t; hum70t; Hsp-hom 6p (70,4) 88 HSPA2 HSPA2 Heat-shock 70kD protein-2 14q (70,0) 83 HSPA5 HSPA5 BIP; GRP78; MIF2 9q (71,0) 60 HSPA6 HSPA6 Heat shock 70kD protein 6 (HSP70B ) 1q (71,0) 81 HSPA7 HSPA7 1q23.3 ND ND HSPA8 HSPA8 HSC70; HSC71; HSP71; HSP73 11q (70,9) 85 HSPA9 HSPA9 GRP75; HSPA9B; MOT; MOT2; PBP74 5q (73,7) 45 HSPA12A HSPA12A FLJ13874; KIAA0417 HSPA12B HSPA12B RP23-32L15.1; N06Rik 10q (141,0) 14 20p (75,7) 18 HSPA13 HSPA13 Stch 21q (51.9) 20 HSPA14 HSPA14 HSP70-4; HSP70L1; MGC p (54,8) 27

9 Indukowalność genów HSPA w warunkach szoku termicznego HEK293 Gen kontrola 1 h 3 h HSPA1A 1,0 495,7 3121,0 HSPA1B 1,0 3,0 8,0 HSPA1L 1,0 13,5 112,0 HSPA2 1,0 1,0 1,1 HSPA5 1,0 2,7 10,2 HSPA6 1,0 832,2 4588,5 HSPA8 1,0 1,1 1,7 HSPA9 1,0 0,8 0,9 HSPA14 1,0 0,8 0,8 Hageman et al.., Biochem. J. (2011) 435;

10 Wiązanie HSF do promotora genów HSPA w komórkach poddanych działaniu szoku termicznego HSPA1A HSPA6 HSPA1L HSPA8 HSPA5 HSPA9 HSPA2 Poziom wiązania HSF1 do sekwencji HSE nie warunkuje stopnia indukcji ekspresji genów HSPA Trinklein et al.., Cell Stress Chaperones (2004) 9; 21-28

11 Czynniki transkrypcyjne oddziałujące z promotorem genu HSPA1A Sasi i wsp., (2014) J Mol Biol. 426: / / / /-97-73/-58

12 HSPA w jądrach (testes) SPERMATOCYTY SPERMATYDY Szczur Mysz Człowiek HSPA2 (Hst70) HSPA2 (Hsp70.2) HSPA2 HSPA2; HSPA1L HSPA2; HSPA1L HSPA2; HSPA1L

13 Funkcje HSPA2 w komórkach spermatogenicznych spermatocyty: Kluczowy dla dysocjacji kompleksu synaptonemalnego (Dix et al, 1997); Reguluje aktywność kinazy CDK1 (Zhu et al, 1997; Alekseev et al, 2009); spermatydy: Mysz Białko opiekuńcze dla białek biorących udział w rearanżacji chromatyny (Choi et al., 2008; Quenet et al., 2009; Govin et al, 2006 Obniżona ekspresja HSPA2 jest wiązana z zaburzeniami płodności mężczyzn (Huszar et al.., 2000; Cedenho et al., 2006; Terribas et al., 2010; Motiei et al., 2012). plemniki: Człowiek Udział w zapłodnieniu. W plemnikach HSPA2 jest składnikiem kompleksu białkowego rozpoznającego komórkę jajową (Redgroove et al.., 2012; 2013).

14 Białko HSPA2 w ludzkich narządach somatycznych Narząd HSPA2 HSPA1 Skóra Warstwa bazalna naskórka Naskórek Przełyk Warstwa bazalna naskórka Naskórek Szyjka macicy Warstwa bazalna naskórka częsci tarczowej n.d. Pierś Pęcherz moczowy Prostata Mózg Komórki gleju (oligodendrocyty i komórki ependymalne) Nabłonek gruczołowy Urotelium Nabłonek gruczołowy (komórki bazalne) Scieglinska i wsp., 2011; Histochem Cell Biol, 135:337-50

15 Gen HSPA2 ulega ekspresji w liniach komórek nowotworowych TRANSKRYPT BIAŁKO Pigłowski i wsp., 2007; Acta Biochem Pol, 54: Scieglinska i wsp., 2008; J Cell Biochem, 104: oraz w guzach nowotworowych Niedrobnokomórkowy rak płuca Scieglinska i wsp.,anticancer Res, 2014

16 Podstawowe funkcje HSPA2 Brak efektu Doxorubicyna Antymitotyki (winblastyna, paklitaksel) Cytoprotekcja Szok termiczny Inhibitory proteasomu (bortezomib, MG132) Filipczak i wsp., Biochem. Cell Biol., (2012) Właściwości antyapoptotyczne bortezomib Filipczak i wsp., Biochem. Cell Biol., (2012) Właściwości opiekuńcze Ułatwia renaturację zdenaturowanej lucyferazy Hamuje tworzenie agregatów zdenaturowanej lucyferazy Hageman et al.., Biochem. J. (2011) 435;

17 Funkcje HSPA2 w komórkach nowotworowych Komórki raka piersi (in vitro) Podtrzymuje wzrost i podziały Obniżenie poziomu ekspresji indukuje starzenie komórkowe śmierć niezależna od kaspaz Komórki raka urotelium (in vitro) Komórki raka szyjki macicy (in vitro) Podtrzymuje wzrost komórek in vitro i w modelu in vivo Obniżenie poziomu zmniejsza: migrację inwazję Rohde et al., (2005) GENES & DEV 19: , Garg et al., (2010) Eur J Cancer 46:207 15; Garg et al., (2010) Cancer. 116: Analiza ekspresji w raku płaskonabłonkowym przełyku Analiza ekspresji w raku niedrobnokomórkowym płuca HSPA2 jako negatywny czynnik prognostyczny (gorszy OS i DFS). HSPA2 jako negatywny czynnik prognostyczny (gorszy OS). Zhang et al.., (2013) World J Surg Oncol 11:141 Scieglinska et al.., (2014); Anticancer Res.

18 Rola białka HSPA2 należącego do rodziny białek opiekuńczych HSP70 w procesie proliferacji warstwy bazalnej naskórka

19 HSPA2 w naskórku RÓŻNICOWANIE Involucrin HSPA2 Overlay SC PROLIFERACJA CK14 HSPA2 Overlay Białko HSPA2 jest obecne w komórkach bazalnych naskórka

20 1. Ustalenie w jakiej populacji komórek naskórka ulega ekspresji gen HSPA2. Komórki macierzyste, czy też komórki które rozpoczęły różnicowanie. 2. Zbadanie czy modulowanie poziomem ekspresji HSPA2 zmienia fenotyp keratynocytów. Ocena zdolności do proliferacji, migracji, adhezji oraz odtwarzania stratyfikacji nabłonka w hodowlach organotypowych. 3. Analiza ekspresji białka HSPA2 w zmianach patologicznych skóry związanych z nieprawidłowym wzrostem keratynocytów. Model naskórek NHEK - pierwotne keratynocyty ludzkiego naskórka HaCaT immortalizowana linia ludzkich keratynocytów prawidłowych

21 Dorota Scieglinska, Agnieszka Gogler-Piglowska, Dorota Butkiewicz, Mykola Chekan, Ewa Malusecka, Jolanta Harasim, Anna Habryka, Zdzislaw Krawczyk. HSPA2 chaperone protein is expressed in various human tumors and correlates with clinical features in non-small cell lung carcinoma patients. Anticancer Res 2014; 34: ; Dorota Scieglinska and Zdzislaw Krawczyk. Expression, function and regulation of the testisenriched heat shock HSPA2 gene in rodents and humans; wysłane do redakcji; Agnieszka Gogler-Piglowska, Anna Habryka, Katarzyna Klarzynska, Mariusz Kryj, Magdalena Glowala-Kosinska; Marcin Herok, Monika Byrska, Zdzislaw Krawczyk; Dorota Scieglinska. Expression and functional roles of testis-enriched HSPA2 protein in human epidermal keratinocytes; manuskrypt w przygotowaniu; Praca doktorska mgr Katarzyny Klarzyńskiej

22 Badanie mechanizmu regulacji ludzkiego genu HSPA2 w wybranych komórkach somatycznych

23 1. Brak wiedzy o mechanizmach regulacji ekspresji genu HSPA2 w komórkach somatycznych. 2. Nie wiadomo, czy gen jest aktywny konstytutywnie, czy też może być indukowany. 3. Wiadomo jedynie, że ekspresja genu nie jest indukowana poprzez HSF1 (np. szok termiczny). Potencjalne miejsca wiązania czynników transkrypcyjnych (analiza in silico) MTF1 DRE/XRE DRE/XRE HIF1 NFκB Założenie badawcze: gen HSPA2 znajduje się pod kontrolą transkrypcyjną czynników HIF-1 i NFκB

24 HIF1 w skórze HIF1α Rezvani et al., J Invest Dermatol (2011) 131, gojenie ran angiogeneza regulacja proliferacji/różnicowania ochrona przed infekcjami odpowiedź na promieniowanie UV melanocytarne i niemelanocytarne nowotwory skóry

25 Analiza wpływu hipoksji i HIF1 na poziom ekspresji genu HSPA2 W hipoksji HIF1 wiąże się do promotora HSPA2 ChIP fold enrichment (in relation to no-antibody control) 15,00 12,50 10,00 7,50 5,00 2,50 0,00 HSPA2 mrna (rel.expression) CaIX HSPA2 CaIXcoding 21% O % O(h) echinomycin W hipoksji poziom ekspresji genu HSPA2 spada Stabilizacji HIF1 towarzyszy spadek aktywności promotora HSPA2 Hipoksja DFO LUC activity (rel.activity) LUCactivity (rel.activity) 1,20 1, , ,60 0, ,20 0,00 0 HIF1α 1,20 1,00 0,80 0,60 0,40 0, Ambient Hy poxia 565 / / 5 444/ 5 565/ 5 466/ 5 444/ 5 DFO μ M HIF1α 0h 3h 6h 12h 24h 48h NT DFO DFO HSPA2 1% O(h) HIF1 jako negatywny regulator ekspresji HSPA2??? β actin Anna Habryka, w przygotowaniu