Agata Pleskaczyńska. OCENA PRZYDATNOŚCI OZNACZANIA PROHEPCYDYNY W PRZEBIEGU ZAKAśEŃ BAKTERYJNYCH U NOWORODKÓW

Transkrypt

1 Agata Pleskaczyńska OCENA PRZYDATNOŚCI OZNACZANIA PROHEPCYDYNY W PRZEBIEGU ZAKAśEŃ BAKTERYJNYCH U NOWORODKÓW Rozprawa na stopień doktora nauk medycznych Promotor: Prof.dr hab.n.med. Anna Dobrzańska Instytut Pomnik-Centrum Zdrowia Dziecka Klinika Neonatologii, Patologii i Intensywnej Terapii Noworodka Kierownik Kliniki: Prof.dr hab.n.med. Anna Dobrzańska Warszawa,

2 Składam serdeczne podziękowania Mojemu Promotorowi, Pani Profesor dr hab.n.med. Annie Dobrzańskiej, za pomoc, wsparcie, zaufanie i wiarę w powodzenie prowadzonego badania Pani Profesor dr hab.n.med. Urszuli Goduli-Stuglik i Panu Profesorowi dr hab.n.med. Józefowi RyŜko za cenne uwagi w recenzjach rozprawy doktorskiej Pani Doktor Hannie Gregorek i Jej Zespołowi z Pracowni Diagnostyki Immunologicznej Zakładu Mikrobiologii i Immunologii Klinicznej w Instytucie Pomnik- Centrum Zdrowia Dziecka za wszelkie uwagi, rady i wykonanie oznaczeń hematologicznych w ramach grantu promotorskiego KoleŜankom i Kolegom z Kliniki Neonatologii, Patologii i Intensywnej Terapii Noworodka Instytutu Pomnika-Centrum Zdrowia Dziecka oraz zespołowi pielęgniarskiemu Kliniki za pomoc w przeprowadzeniu badania Doktor Annie śochowskiej z Oddziału Noworodkowego szpitala w Otwocku za pomoc w rekrutacji dzieci do badania Doktor Joannie Janowskiej za wszelkie uwagi dotyczące tekstu rozprawy doktorskiej i wyrozumiałość Doktor Joannie śydak za nieocenioną wnikliwość i uwagi, za słowa otuchy i obecność w najtrudniejszych chwilach mijającego roku Mojej Rodzinie za cierpliwość, wsparcie i niezachwianą wiarę w moje moŝliwości KaŜdy z nas jest aniołem, który ma tylko jedno skrzydło. JeŜeli chcemy wzbić się ponad ziemię, musimy wziąć się w objęcia (Luciano de Crescenzo) 2

3 Spis treści: Spis rysunków.. Spis tabel. Zastosowane skróty. I.Wstęp. I.1.Wprowadzenie... I.2.Erytropoeza i metabolizm Ŝelaza w okresie prenatalnym i noworodkowym fizjologia i patologia I.3. Metabolizm Ŝelaza u człowieka... I.4. Białka metabolizmu Ŝelaza w diagnostyce homeostazy Ŝelaza I.5.NajwaŜniejsze odrębności dotyczące homeostazy Ŝelaza u noworodków I.6. Hepcydyna i jej rola w regulacji homeostazy Ŝelaza... I.7. ZakaŜenie, zaburzenia homeostazy Ŝelaza w przebiegu stanu zapalnego i metody diagnostyczne II. Cel pracy III. Zgoda Komisji Bioetyki... III.1. Załącznik 1. Formularz informacji dla rodziców pacjenta.... III.2. Załącznik 2. Formularz zgody rodziców pacjenta na badanie IV. Grant naukowy. V. Materiał i metody... V.1. Kryteria włączenia i wykluczenia... V.2. Charakterystyka grupy badanej i grupy odniesienia... V.3. Metody VI.Wyniki... VII.Omówienie wyników i dyskusja.. VIII.Wnioski IX.Streszczenie... X. Abstract.. XI.Piśmiennictwo... XII. Załącznik 3. Spis pacjentów (grupa badana i odniesienia)

4 Spis rysunków: Rysunek 1. Schemat wchłaniania Ŝelaza w jelicie. Rysunek 2. Schemat najwaŝniejszych szlaków w metabolizmie Ŝelaza u człowieka. Rysunek 3. Porównanie grupy badanej i grupy odniesienia pod względem liczby przetoczeń uzupełniających koncentratu krwinek czerwonych (KKCz) Rysunek 4. Porównanie grupy badanej i grupy odniesienia pod względem doby Ŝycia w dniu pierwszego badania.. Rysunek 5. Rozkład wartości kreatyniny w grupie badanej i grupie odniesienia. Rysunek 6. Rozkład liczby leukocytów (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 7. Rozkład liczby retikulocytów (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 8. Rozkład liczby granulocytów podzielonych (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 9. Rozkład liczby granulocytów pałeczkowatych (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 10. Rozkład liczby limfocytów (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 11. Rozkład wartości TIBC (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej). Rysunek 12. Rozkład wartości SIBC (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej).. Rysunek 13. Rozkład wartości wysycenia transferyny (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 14. Rozkład stęŝeń prohepcydyny (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 15. Rozkład stęŝeń CRP (grupa odniesienia i 1 oznaczenie w grupie badanej).. Rysunek 16. Rozkład liczby krwinek czerwonych (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej)

5 Rysunek 17. Rozkład wartości hemoglobiny (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 18. Rozkład wartości hematokrytu (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 19. Rozkład liczby płytek krwi (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej)... Rysunek 20. Rozkład liczby limfocytów atypowych (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej). Rysunek 21. Rozkład wartości TIBC (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej).. Rysunek 22. Rozkład wartości SIBC (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej).. Rysunek 23. Rozkład wartości wysycenia transferyny Ŝelazem (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej) Rysunek 24. Rozkład wartości prohepcydyny (grupa odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej)

6 Spis tabel: Tabela 1. Czynniki wpływające na status Ŝelaza w okresie perinatalnym Tabela 2. NajwaŜniejsze białka związane z metabolizmem Ŝelaza u człowieka.. Tabela 3. Przeliczanie transferyny i TIBC Tabela 4. Przeliczanie wysycenia transferyny Ŝelazem. Tabela 5. Prawidłowe średnie wartości hematologiczne u noworodków urodzonych o czasie w pierwszych 2 tygodniach Ŝycia. Tabela 6. Prawidłowe średnie wartości wskaźników krwinek czerwonych u niemowląt urodzonych o czasie w pierwszych 6 miesiącach Ŝycia Tabela 7. Czynniki wpływające na syntezę hepcydyny i ich wpływ na homeostazę Ŝelaza.. Tabela 8. Drobnoustroje wymagające Ŝelaza do rozwoju i o udowodnionej, zaleŝnej od Ŝelaza zjadliwości Tabela 9. NajwaŜniejsze odrębności układu immunologicznego noworodka... Tabela 10. Najczęstsze patogeny wywołujące zakaŝenia okresu noworodkowego. Tabela 11. Wskaźniki homeostazy Ŝelaza w organizmie w wybranych sytuacjach klinicznych Tabela 12. Charakterystyka grupy badanej i grupy odniesienia... Tabela 13. Wyniki morfologii krwi obwodowej ze wzorem odsetkowym krwinek białych w pierwszym oznaczeniu w grupie badanej i w grupie odniesienia.. Tabela 14. Wyniki parametrów biochemicznych w pierwszym oznaczeniu w grupie badanej i w grupie odniesienia Tabela 15. Wyniki morfologii krwi obwodowej ze wzorem odsetkowym krwinek białych (oznaczenie w grupie odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej).. Tabela 16. Wyniki parametrów biochemicznych (oznaczenie w grupie odniesienia i 2 oznaczenie w grupie badanej) Tabela 17. Zmiany wartości i analiza znamienności statystycznej zmian wartości parametrów w grupie badanej (pomiędzy 2 i 1 oznaczeniem) morfologia krwi z wzorem odsetkowych krwinek białych i retikulocytozą

7 Tabela 18. Zmiany wartości i analiza znamienności statystycznej zmian wartości parametrów w grupie badanej (pomiędzy 2 i 1 oznaczeniem) parametry biochemiczne. Tabela 19. Wyniki badań mikrobiologicznych i skrócona charakterystyka noworodków z grupy badanej z rozpoznaniem posocznicy i/ lub zapalenia opon mózgowo-rdzeniowych.. Tabela 20. Porównanie grupy z potwierdzeniem bakteriologicznym zakaŝenia uogólnionego (bakteriemia i/lub zapalenie opon mózgowo-rdzeniowych) z grupą z zakaŝeniem nie potwierdzonym bakteriologicznie lub bez bakteriemii podstawowe dane demograficzne... Tabela 21. Porównanie grupy badanej w zaleŝności od wyniku badania bakteriologicznego morfologia krwi z rozmazem leukocytów i retikulocytozą (1 oznaczenie). Tabela 22. Porównanie grupy badanej w zaleŝności od wyniku badania bakteriologicznego parametry biochemiczne (1 oznaczenie).. Tabela 23. Porównanie grupy badanej w zaleŝności od wyniku badania bakteriologicznego morfologia krwi z rozmazem leukocytów i retikulocytozą (2 oznaczenie). Tabela 24. Porównanie grupy badanej w zaleŝności od wyniku badania bakteriologicznego parametry biochemiczne (2 oznaczenie).. Tabela 25. Zmiany wartości ciągłych pomiędzy 2 i 1 oznaczeniem w grupie badanej morfologia krwi z rozmazem leukocytów i retikulocytozą. Tabela 26. Zmiany wartości ciągłych pomiędzy 2 i 1 oznaczeniem w grupie badanej parametry biochemiczne. Tabela 27. Porównanie grupy badanej i grupy odniesienie pod względem liczby przetoczeń uzupełniających koncentratu krwinek czerwonych (KKCz)

8 Zastosowane skróty: β2m - beta2- mikroglobulina DCT 1 (Divalent Cation Transporter 1) - transporter kationów dwuwartościowych 1 = DMT1 Dcytb (Duodenal cytochrome b) - cytochrom b dwunastnicy DMT 1 (Divalent Metal Transporter 1) - transporter metali dwuwartościowych 1= DCT1 Epo erytropoetyna Fe /Fe 2+ /Fe 3+ - Ŝelazo/ Ŝelazo dwuwartościowe / Ŝelazo trójwartościowe Gen HAMP gen kodujący hepcydynę HAMP (hepcidin antimicrobial peptide) peptyd przeciwbakteryjny - hepcydyna Hb hemoglobina (g/dl) Hbd tydzień Ŝycia płodowego HFE (hemochromatosis protein) gen/białko HFE Ht hematokryt (%) IL-1/IL-1α/ IL-1β interleukina 1/interleukina 1α/ interleukina 1β IL-6 interleukina 6 IPCZD Instytut Pomnik Centrum Zdrowia Dziecka KKCz koncentrat krwinek czerwonych LEAP-1 (liver-expressed antimicrobial peptide) peptyd przeciwbakteryjny wytwarzany przez wątrobę = hepcydyna LPS - lipopolisacharyd ściany bakteryjnej MCH (Mean Corpuscular Hemoglobin) - średnia masa hemoglobiny w krwince czerwonej (pg) MCHC (Mean Corpuscular Hemoglobin Concentration) - średnie stęŝenie Hb w krwince czerwonej (g/dl) MCV (Mean Corpuscular Volume) - średnia objętość krwinki czerwonej (fl) Plt liczba płytek krwi RDW (Red Cell Distribution Width) rozkład objętości krwinek czerwonych SIBC (Serum Iron Binding Capacity) zdolność wiązania Ŝelaza przez surowicę TfS - transferyna TfR 1 / TfR 2 (transferrin receptor 1/ transferrin receptor 2) - receptor transferyny 1 /2 stfr (soluble transferrin receptor) rozpuszczalny receptor transferyny = rozpuszczalny receptor transferynowy TIBC (Total Iron Binding Capacity) całkowita zdolność wiązania Ŝelaza TNF α / TNF β (tumor necrosis factor α/ β)- czynnik martwicy guza α / β TRF - transferyna 8

9 I.WSTĘP I.1. Wprowadzenie Niedokrwistość w przebiegu zakaŝeń i stanu zapalnego stwarza duŝy problem kliniczny u dzieci w kaŝdym wieku. Wyniki badań wskazują pozornie na niedobór tego pierwiastka, ale leczenie preparatami Ŝelaza jest nieskuteczne, a nawet moŝe pogorszyć przebieg choroby. Co więcej skutki stanu zapalnego trwają jeszcze po zakończeniu leczenia infekcji. Od wielu lat podejrzewano, Ŝe istnieją określone mediatory reakcji zachodzących w metabolizmie Ŝelaza podczas stanu zapalnego, szczególnie w zakaŝeniu bakteryjnym. Jednym z głównych mediatorów niedokrwistości stanu zapalnego jest hepcydyna. Pierwsze doniesienia na temat tego peptydu pochodzą z 2000 roku. Hepcydyna (HAMP, LEAP-1) została wyizolowana z ultrafiltratu krwi i z moczu ludzi (Park i wsp. oraz Krause i wsp.). [1,2] Początkowo podkreślano jej działanie przeciwbakteryjne i przeciwgrzybicze, wkrótce zauwaŝono związek hepcydyny z metabolizmem Ŝelaza. Pigeon i wsp. wykazali zwiększoną ekspresję mrna HAMP w wątrobach myszy nastrzykiwanych dekstranem Ŝelaza i u myszy karmionych dietą wzbogaconą Ŝelazem. To właśnie do nich naleŝy propozycja nowej nazwy dla LEAP-1, czyli hep-cidin (od głównego miejsca syntezy peptydu, hep-atocyte oraz pierwotnie odkrytej funkcji mikrobójczej =cidin ). [3] Stwierdzono, Ŝe działając na enterocyty i makrofagi, hepcydyna wpływa równieŝ na zahamowanie recyrkulacji Ŝelaza z komórek układu siateczkowo-śródbłonkowego. Zmniejsza wchłanianie Ŝelaza w enterocytach i odzyskiwanie Ŝelaza przez makrofagi. W konsekwencji obniŝa się poziom Ŝelaza w surowicy krwi. Silnym stymulatorem genu HAMP jest lipopolisacharyd (LPS) ze ściany komórkowej Escherichia coli oraz interleukina 6. Hepcydyna jako peptyd kationowy odznacza się stosunkowo szerokim zakresem aktywności przeciwgrzybiczej i bakteriobójczej. Funkcja hepcydyny jako peptydu powodującego lizę komórek bakteryjnych pozostaje spójna z jej wpływem na metabolizm Ŝelaza, poniewaŝ jest to dodatkowy mechanizm obronny powodujący sekwestrację Ŝelaza w układzie siateczkowo-śródbłonkowym. ObniŜenie stęŝenia jonów Ŝelaza w płynach biologicznych ma na celu ograniczyć ich dostępność dla mikroorganizmów chorobotwórczych, ale hamuje takŝe wykorzystanie Ŝelaza przez organizm gospodarza. Wzrost wydalania hepcydyny z moczem obserwowano w przypadku 9

10 zakaŝenia, ale takŝe w stanach przeładowania organizmu Ŝelazem, kiedy to stęŝenie hepcydyny koreluje ze stęŝeniem ferrytyny (poza szczególnymi przypadkami hemochromatozy). Natomiast niedokrwistość lub niedotlenienie powodują zahamowanie syntezy hepcydyny. [4] Dane z piśmiennictwa wskazują, Ŝe hepcydyna jest elementem nieswoistej odpowiedzi układu immunologicznego podczas zakaŝenia. [5] Pośrednio moŝna więc wnioskować, Ŝe takŝe w grupie noworodków podczas zakaŝenia działa powyŝej opisany mechanizm obronny, który zarazem wpływa na metabolizm Ŝelaza. Na podstawie dotychczas przeprowadzonych badań wiadomo było, Ŝe nie naleŝy włączać leczenia niedokrwistości preparatami Ŝelaza podczas zakaŝenia lub innej choroby przebiegającej ze stanem zapalnym, natomiast okres pomiędzy zakończeniem leczenia infekcji a rozpoczęciem leczenia niedokrwistości ustalany był z duŝą dowolnością. Ocena stęŝenia prohepcydyny jako prohormonu hepcydyny mogłaby być cennym badaniem uzupełniającym w diagnostyce zakaŝeń (jako dodatkowy wykładnik stanu zapalnego), a takŝe pomocnym w określeniu wpływu stanu zapalnego na wystąpienie niedokrwistości i w ustaleniu optymalnego okresu przerwy od wyleczenia zakaŝenia do leczenia preparatami Ŝelaza w przypadku niedokrwistości. Pozwoliłoby to uniknąć działań niepoŝądanych związanych z zaburzeniami redystrybucji Ŝelaza. W przypadku noworodków, u których obrona przed stresem oksydacyjnym związanym z nadmiarem Ŝelaza nie jest w pełni wykształcona, kwestia homeostazy metabolizmu Ŝelaza i precyzyjne ustalenie wskazań do leczenia preparatami Ŝelaza powinny być traktowane bardzo powaŝnie. Zjawiska fizjologiczne oraz zaburzenia okresu prenatalnego i adaptacyjnego w sposób istotny wpływają na metabolizm Ŝelaza u noworodka. Dla zrozumienia udziału hepcydyny w reakcji zapalnej i konsekwencji zakaŝenia w aspekcie przemian Ŝelaza w ustroju dziecka w pierwszych miesiącach Ŝycia konieczne jest odniesienie do fizjologii i patofizjologii erytropoezy, metabolizmu Ŝelaza ze szczególnym uwzględnieniem jego wchłaniania w jelicie oraz zmian związanych ze stanem zapalnym. 10

11 I.2. Erytropoeza i metabolizm Ŝelaza w okresie prenatalnym i noworodkowym fizjologia i patologia Hematopoeza rozpoczyna się w drugim tygodniu Ŝycia płodowego, kiedy to pojawiają się pierwsze komórki krwi pochodzenia mezenchymalnego (wywodzące się z embrionalnej tkanki łącznej). Biorą w niej udział kolejno pęcherzyk Ŝółtkowy (okres mezoblastyczny, czyli mezodermalny), wątroba (okres wątrobowy) i szpik (okres szpikowy). Pierwsze krwinki czerwone mają cechy megaloblastów, zawierają jądro i hemoglobiny płodowe. Głównym narządem hematopoezy pomiędzy trzecim a piątym miesiącem ciąŝy jest wątroba. Stanowi ona równieŝ główne źródło erytropoetyny w ciąŝy i w pierwszych tygodniach Ŝycia dziecka, zanim Epo zaczną wytwarzać nerki. Wątroba produkuje juŝ normoblastyczne komórki krwi. Erytropoeza szpikowa jest wykrywana od tygodnia Ŝycia płodowego, a od 28. Hbd szpik jest najwaŝniejszym ośrodkiem krwiotwórczym. Erytrocyty płodowe są bardzo duŝe MCV wynosi około 200 fl, zawierają więcej hemoglobiny (MCH 60 pg) i są w większości komórkami jądrzastymi. W miarę dojrzewania płodu krwinki czerwone stają się mniejsze, zmniejsza się zawartość Hb w erytrocytach i liczba niedojrzałych form jądrzastych (w 10. Hbd do 10% całej puli erytrocytów, w 20. Hbd około 1%, w terminie porodu - 0,01%). Zmienia się takŝe struktura hemoglobiny. Jak wiadomo, poszczególne typy hemoglobiny charakteryzują się inną budową łańcuchów globinowych (α, β, γ, δ). Trzy hemoglobiny embrionalne (Hb Gower 1 i 2 oraz Hb Portland), najprawdopodobniej związane z prymitywnymi krwinkami czerwonymi w woreczku Ŝółtkowym, znikają do tygodnia Ŝycia płodowego. Hemoglobina płodowa (HbF: α2 γ2) pojawia się w Hbd i jest głównym rodzajem hemoglobiny w całym okresie Ŝycia płodowego (stanowi 50% hemoglobiny płodu około 8. Hbd, a 90% w 10.Hbd). Niewielkie ilości (5%) hemoglobiny typu dorosłego (HbA: α2 β2) moŝna wykryć od Hbd, ale produkcja HbA znacząco wzrasta dopiero pomiędzy 32. a 36. tygodniem Ŝycia płodowego. Wtedy teŝ zmniejsza się stęŝenie HbF. Hemoglobina typu A2 (HbA2: α2 δ2) pojawia się w III trymestrze ciąŝy, a jej stęŝenie w szóstym miesiącu Ŝycia osiąga poziom 2,5%, czyli zbliŝony do właściwego osobom dorosłym. Produkcja określonego rodzaju hemoglobiny w okresie perinatalnym jest najprawdopodobniej ściśle związana z wiekiem ciąŝowym. [6,7,8] 11

12 Wymienia się dziewięć pierwiastków śladowych niezbędnych dla człowieka: Ŝelazo, cynk, miedź, selen, jod, mangan, molibden, chrom i kobalt. Ocenia się, Ŝe kaŝdy z tych pierwiastków stanowi < 0,01% masy ciała. śelazo jest najbardziej znaczącym przykładem pierwiastka, który w warunkach duŝej podaŝy dobrze przyswajalnej postaci Fe jest przez organizm gromadzony, a uwalniany, gdy podaŝ jest zbyt mała w stosunku do potrzeb. [9] Zapotrzebowanie na Ŝelazo jest większe w szybko rosnących i róŝnicujących się komórkach. Zarówno niedobór, jak i nadmiar tego pierwiastka moŝe powodować dysfunkcję wielu narządów i układów. [10,11] Około 75-80% Ŝelaza ustrojowego znajduje się w hemoglobinie w krwinkach czerwonych, w przybliŝeniu 10% Ŝelaza w białkach niehemowych (między innymi mioglobina i cytochromy), a pozostałe 10-15% w białkach zapasowych ferrytynie i hemosyderynie, które odkładają się przede wszystkim w szpiku (85%), wątrobie i śledzionie (tj. w układzie siateczkowo-śródbłonkowym). [10,12,13] PrzezłoŜyskowy transport Ŝelaza rozpoczyna się juŝ w pierwszym trymestrze ciąŝy, jednak 2/3 całkowitych zasobów tego pierwiastka płód gromadzi dopiero podczas trzeciego trymestru (głównie od 32. Hbd) i u donoszonego noworodka wynoszą one około 75 mg Fe/kg masy ciała. Ocenia się, Ŝe całkowita ilość Ŝelaza zawartego w tkankach płodu pod koniec ciąŝy wynosi średnio około 300 mg ( mg). ZaleŜy to od masy urodzeniowej dziecka, stęŝenia hemoglobiny i ilości krwi pozyskanej z łoŝyska przed podwiązaniem pępowiny. [6,14] Transport Ŝelaza przebiega jednokierunkowo od matki do płodu i zachodzi takŝe w przypadku niedoboru Ŝelaza u cięŝarnej. Wysoka koncentracja receptorów transferyny na powierzchni błony podstawnej i kosmków łoŝyskowych umoŝliwia aktywny, konkurencyjny wobec potrzeb kobiety (wbrew gradientowi stęŝeń), transport Ŝelaza do organizmu płodu. Zapotrzebowanie na Ŝelazo w czasie ciąŝy wzrasta z 1 mg/dobę do 7-8 mg/dobę w ostatnim miesiącu ciąŝy. W warunkach niedoboru Ŝelaza u matki zwiększa się znacząco ekspresja receptorów dla tego pierwiastka w łoŝysku i w efekcie końcowym nie obserwuje się obniŝenia stęŝenia hemoglobiny u noworodków matek z anemią. [10,15,16] StęŜenie ferrytyny we krwi pępowinowej u zdrowego noworodka urodzonego o czasie wynosi > 60 µg/l. [10,12] Niedobór Ŝelaza w ciąŝy, takŝe utajony, tj. w fazie przed ujawnieniem się niedokrwistości, niekorzystnie wpływa na rozwój płodu. Natomiast w przypadku, gdy stęŝenie Hb u matki obniŝy się do wartości < 8,5 g/dl, zmniejszają się zasoby Ŝelaza u płodu (stęŝenie ferrytyny we 12

13 krwi pępowinowej < 60 µg/l). Niedokrwistość z Hb < 6,0 g/dl skutkuje stęŝeniem ferrytyny we krwi pępowinowej < 30 µg/l, co jest równoznaczne z cięŝkim niedoborem Ŝelaza zapasowego i potencjalnie niedoborem Ŝelaza w mózgu. [10] JeŜeli u matki stęŝenie ferrytyny obniŝy się do wartości < 12 µg/l, obserwuje się jeszcze znaczniejsze obniŝenie stęŝenia ferrytyny we krwi pępowinowej, zatem anemia lub niedobór Ŝelaza u cięŝarnych zmniejszają zgromadzone przez płód zasoby Ŝelaza. Priorytetem dla płodu jest utrzymanie stęŝenia hemoglobiny na prawidłowym poziomie. We krwi pępowinowej dzieci cięŝarnych z anemią stwierdzano wyŝsze stęŝenie erytropoetyny niŝ u dzieci cięŝarnych bez niedokrwistości, co przekładało się na pobudzenie erytropoezy płodu i miało zabezpieczać wbudowywanie dostępnego Ŝelaza w hemoglobinę dla zagwarantowania optymalnego poziomu utlenowania tkanek rozwijającego się płodu. Zasoby Ŝelaza u kobiety cięŝarnej są niezwykle istotne, poniewaŝ jak wynika z badań - 70% Ŝelaza zawartego w hemoglobinie dziecka w pierwszym roku Ŝycia i 40% tego Ŝelaza w drugim roku Ŝycia pochodzi od matki z okresu prenatalnego. [6,14] Wysokie stęŝenie hemoglobiny, jak równieŝ właściwości hemoglobiny płodowej (większe powinowactwo do tlenu ułatwiające transport tlenu do płodu) stanowią mechanizmy kompensacyjne związane ze środowiskiem wewnątrzmacicznym względnie ubogim w tlen. Po urodzeniu stęŝenie hemoglobiny obniŝa się o 30-50% wtórnie do zahamowania erytropoezy (zmniejszenie stęŝenia erytropoetyny), rozpadu płodowych krwinek czerwonych i zwiększonej objętości osocza. Stwierdzono, Ŝe średni czas przeŝycia erytrocytów noworodka jest krótszy niŝ u osoby dorosłej i wynosi dni dla urodzonego o czasie i dni dla urodzonego przedwcześnie (u dorosłych 120 dni). Wskutek powyŝszych zjawisk wartości hemoglobiny obniŝają się do około g/dl między szóstym a ósmym tygodniem Ŝycia. [6-8,10] Podczas pierwszych miesięcy Ŝycia dziecko zuŝywa zapasy Ŝelaza na intensywny wzrost organizmu i zwiększenie objętości krwi krąŝącej. StęŜenie ferrytyny na poziomie 5 percentyla wynosi 70 µg/l bezpośrednio po urodzeniu, a w wieku 9 miesięcy obniŝa się do 10 µg/l, co odzwierciedla zuŝycie zapasów Ŝelaza między innymi do produkcji hemoglobiny. Zasoby Ŝelaza oceniane za pomocą stęŝenia ferrytyny w surowicy krwi są mniejsze w przypadku ciąŝy patologicznych (u 50% noworodków z wewnątrzmacicznym zaburzeniem wzrastania, u 65% noworodków matek z cukrzycą), ale takŝe u około 5% noworodków z ciąŝy o prawidłowym 13

14 przebiegu. Prawdopodobnie za obniŝone stęŝenie ferrytyny odpowiada zmniejszony transport Ŝelaza przez łoŝysko i zwiększone zuŝycie Ŝelaza do nasilonej erytropoezy w warunkach przewlekłego niedotlenienia. Dowodem na pobudzenie erytropoezy u płodów matek z cukrzycą insulinozaleŝną jest oprócz obniŝonego stęŝenia ferrytyny takŝe podwyŝszone stęŝenie rozpuszczalnego receptora transferyny we krwi pępowinowej. Ponadto w przypadku zmian w naczyniach łoŝyska i związanych z nimi zaburzeń transportu przezłoŝyskowego organizm matki nie moŝe sprostać zwiększonemu zapotrzebowaniu płodu na Ŝelazo. [10,17,18] Gromadzone prenatalnie zapasy Ŝelaza wystarczają na 4-6 miesięcy u niemowląt urodzonych o czasie i na około 2-3 miesiące u urodzonych przedwcześnie. [8,10] W tabeli 1 przedstawiono najwaŝniejsze czynniki wpływające na status Ŝelaza w okresie perinatalnym. 14

15 Tabela 1. Czynniki wpływające na status Ŝelaza w okresie perinatalnym (według [10] w modyfikacji własnej) Czynniki zmniejszające zasoby Ŝelaza: 1. Niedobór Ŝelaza u matki podczas ciąŝy 2. Cukrzyca u matki 3. Palenie tytoniu przez cięŝarną (czynne lub bierne) 4. Wewnątrzmaciczne zahamowanie wzrastania płodu 5. CiąŜa mnoga (ryzyko niedoboru Ŝelaza u noworodków zwiększa się, gdy u matki stwierdzano niedobór Ŝelaza w ciąŝy) 6. Poród przedwczesny 7. Ostre lub przewlekłe krwawienie, np. przetoczenie bliźnię-bliźnię (dawca) 8. Zbyt szybkie zaklemowanie pępowiny po porodzie 9. Transfuzja wymienna 10. Restrykcyjne praktyki transfuzyjne 11. Niewyrównane straty związane z pobraniami krwi na badania 12. Leczenie preparatem erytropoetyny 13. Opóźniona lub niewystarczająca suplementacja Ŝelazem 14. Karmienie wyłącznie pokarmem kobiecym powyŝej miesiąca Ŝycia 15. Karmienie mlekiem krowim Czynniki zwiększające zasoby Ŝelaza: 1. Stosowanie suplementacji Ŝelazem w ciąŝy (pod warunkiem zdiagnozowanego niedoboru Ŝelaza lub niedokrwistości z niedoboru Ŝelaza) 2. Przetoczenie płodowo-płodowe (biorca) 3. Opóźnione zaklemowanie pępowiny 4. Liberalne praktyki transfuzyjne 5. Suplementacja Ŝelazem wczesna i w odpowiedniej dawce 6. Stosowanie mieszanek mlecznych wzbogaconych w Ŝelazo 15

16 I.3. Metabolizm Ŝelaza u człowieka W metabolizmie Ŝelaza moŝna wyróŝnić kilka istotnych zjawisk i etapów w krąŝeniu tego pierwiastka w niemal zamkniętym cyklu w organizmie. Są to: 1. Wchłanianie Ŝelaza 2. Transport Ŝelaza 3. Przechowywanie Ŝelaza (pula Ŝelaza zapasowego) 4. Dystrybucja Ŝelaza pomiędzy poszczególnymi kompartmentami Zachowanie równowagi pomiędzy poszczególnymi etapami metabolizmu Ŝelaza z uwzględnieniem aktualnego zapotrzebowania organizmu, podaŝy, strat i statusu Ŝelaza wymaga współdziałania szeregu komórek i białek. W tabeli 2. przedstawiono podstawowe białka związane z metabolizmem Ŝelaza u człowieka/lub geny je kodujące. 16

17 Tabela 2. NajwaŜniejsze białka związane z metabolizmem Ŝelaza u człowieka (według [19-22] w modyfikacji własnej) Gen u człowieka lub kodowane białko Rola u człowieka Cytochrom b dwunastnicy (Duodenal Błonowa ferroreduktaza w części szczytowej cytochrome b = Dcytb) enterocytów dwunastnicy Transporter metali dwuwartościowych Odpowiada za wchłanianie Ŝelaza w części (Divalent Metal Transporter 1) szczytowej enterocytów dwunastnicy i uwalnianie Ŝelaza z transferyny w endosomach Ferrytyna Multimerowe białko przechowujące Ŝelazo Ferroportyna (Fpn) Transportuje Ŝelazo na zewnątrz komórki z enterocytów dwunastnicy, makrofagów i róŝnych komórek w układzie nerwowym Hefajstyna (hefestyna) Ferrooksydaza zawierająca atomy miedzi, zaangaŝowana w transport Ŝelaza na zewnątrz enterocytów dwunastnicy (zlokalizowana w błonie boczno-podstawnej) Mitoferryna (MtFt) Transporter Ŝelazo w błonie mitochondrium Białko nośnikowe dla hemu (Haem carrier Transporter hemu w błonie szczytowej (apikalnej) protein 1 = HCP 1) enterocytów Białko HFE Białko regulatorowe - jego interakcja z receptorem transferyny 1 umoŝliwia transport Ŝelaza do komórki β2- mikroglobulina (β2m) Białko niezbędne do prezentacji błonowej HFE Transferyna Białko nośnikowe wiąŝące Ŝelazo trójwartościowe we krwi Receptor transferyny 1 (TfR 1) Receptor dla kompleksu transferyna-ŝelazo (Tf- Fe), niezbędny dla wychwytu Ŝelaza z krwi Receptor transferyny 2 (TfR 2) Receptor dla kompleksu transferyna-ŝelazo (Tf- Fe) działający w hepatocytach Hepcydyna (HAMP, LEAP-1) Peptyd łączący się z ferroportyną i regulujący wchłanianie Ŝelaza 17

18 Wchłanianie jelitowe i transport Ŝelaza Wchłanianie Ŝelaza z przewodu pokarmowego (w początkowym odcinku dwunastnicy) podlega ścisłej regulacji w zaleŝności od aktualnych zasobów w organizmie i zapotrzebowania na Ŝelazo. Tą drogą uzupełniane są straty Ŝelaza zawartego w złuszczających się komórkach nabłonka jelitowego i naskórka. Absorpcja Ŝelaza róŝni się w poszczególnych grupach wiekowych (u dziecka w wieku 1 roku wynosi w przybliŝeniu 10 mg/dobę, w wieku dojrzewania mg/dobę, u kobiety cięŝarnej 20 mg/dobę). Zwiększa się, kiedy konieczne jest zaspokojenie potrzeb związanych z przyrostem masy ciała, rosnącą liczbą erytrocytów lub rozwojem płodu, a takŝe wtedy, gdy uzupełniane są zapasy Ŝelaza w hepatocytach. Pula Ŝelaza zapasowego w hepatocytach związana jest głównie z ferrytyną. W wyjątkowych sytuacjach takich, jak okresowy niedobór Ŝelaza w diecie, krwotoki, niewydolna reutylizacja Ŝelaza przez makrofagi, erytropoeza bazuje przede wszystkim na rezerwach Fe z wątroby. [4] W skrajnych sytuacjach niedoboru Ŝelaza jego wchłanianie odbywa się z całej powierzchni jelit. [12] Według innych autorów maksymalną ilość Fe, jaka moŝe być wchłonięta w ciągu doby, ocenia się na około 3-4 mg. [23] W poŝywieniu Ŝelazo występuje w trzech podstawowych postaciach: Ŝelaza nieorganicznego dwuwartościowego i trójwartościowego oraz hemu, który jest kompleksem Ŝelaza z protoporfiryną IX. Około 90% zapotrzebowania dobowego na Ŝelazo w przeciętnej diecie zapewnia Ŝelazo nieorganiczne, podczas gdy hem stanowi pozostałe 10%. Wchłanianie Ŝelaza znacząco zaleŝy od składu diety, statusu Ŝelaza w organizmie i co najistotniejsze od biodostępności róŝnych form Ŝelaza. Poszczególne składniki diety wpływają przede wszystkim na wchłanianie Ŝelaza niehemowego. Kwas cytrynowy, niektóre aminokwasy i kwas askorbinowy ułatwiają wchłanianie Ŝelaza, utrzymując Fe w postaci roztworu (chelatacja przez kwas cytrynowy) albo redukując Fe do lepiej rozpuszczalnego i wchłanialnego Ŝelaza dwuwartościowego (cysteina, kwas askorbinowy). Listę inhibitorów wchłaniania Ŝelaza niehemowego otwierają fityniany, fosforany, polifenole i kwas taninowy, które wiąŝą Fe w nierozpuszczalne kompleksy w świetle jelita, co uniemoŝliwia kontakt Ŝelaza z odpowiedzialnymi za wchłanianie białkami. [12,19,24] Źródłem Ŝelaza dla noworodków i młodszych niemowląt jest pokarm kobiecy lub mieszanki mleczne. Pokarm kobiecy zawiera Ŝelazo niehemowe połączone z białkami mleka lub innymi substancjami o małej masie cząsteczkowej. 18

19 śelazo znajdujące się w poŝywieniu jest w większości trójwartościowe (jon Ŝelazowy). Przed wchłonięciem musi być zredukowane do Ŝelaza dwuwartościowego (jon Ŝelazawy). [4,24-26] W górnej części kosmków jelitowych znajdują się enterocyty wierzchołkowe (dojrzałe enterocyty absorpcyjne), które na przeciwległych stronach błony komórkowej zawierają białka biorące udział w transporcie jonów Ŝelaza. Błona wierzchołkowa (apikalna) jest zwrócona w kierunku światła dwunastnicy i zawiera białko DMT 1 oraz ferroreduktazę cytochrom b dwunastnicy. Błona bocznopodstawna kontaktuje się ze ścianą naczyń krwionośnych i występują w niej ferroportyna oraz hefajstyna, która pełni rolę ferrooksydazy. Komórki prekursorowe enterocytów wierzchołkowych wyściełają krypty Lieberkühna pomiędzy kosmkami dwunastnicy. Enterocyty krypt na błonie skierowanej w stronę naczyń krwionośnych posiadają kompleks białek z receptorem transferyny typu 1, białkiem HFE i β2- mikroglobuliną, dzięki czemu odbierane są sygnały o metabolizmie Ŝelaza w wątrobie i erytropoezie w szpiku kostnym. [4,20,27-29] Ferroreduktaza na powierzchni szczytowej enterocytów redukuje Fe 3+ do Fe 2+, następnie Ŝelazo dwuwartościowe jest przenoszone do enterocytów przez DMT 1. Białko DMT 1 transportuje takŝe inne jony dwuwartościowe, między innymi jony miedzi (Cu 2+ ) i cynku (Zn 2+ ). DMT 1 wymaga obecności jonów wodorowych (H + ), co wyjaśnia, dlaczego nośnik ten przejawia największą aktywność w bliŝszym odcinku dwunastnicy. Przeniesione do wnętrza komórki Ŝelazo zasila tzw. pulę nietrwałą (labilną) Ŝelaza wewnątrzkomórkowego (10-20% Ŝelaza wewnątrzkomórkowego), a część Ŝelaza ostatecznie łączy się z ferrytyną i stanowi pulę Ŝelaza zapasowego. [30] Następnie Ŝelazo za pomocą innego białka nośnikowego ferroportyny przenoszone jest przez błonę boczno-podstawną enterocytu. Ferroportyna jest jedynym nośnikiem dla Fe 2+ przy transporcie na zewnątrz komórki do krwi i stanowi punkt uchwytu dla hepcydyny, co zostanie dokładniej omówione w aspekcie zaburzeń dystrybucji Ŝelaza podczas zakaŝenia. To przezbłonowe białko wykryto w komórkach Kupffera w wątrobie, w makrofagach układu siateczkowo-śródbłonkowego, w enterocytach kosmków jelitowych, w hepatocytach, i syncytiotrofoblaście łoŝyska. Mutacje uniemoŝliwiające wydostanie się ferroportyny na powierzchnię komórki i jej prawidłową lokalizację w błonie komórkowej skutkują retencją Ŝelaza w makrofagach odzyskujących Ŝelazo z erytrocytów. Jeśli mutacja powoduje oporność na wpływ hamujący hepcydyny, 19

20 wówczas dochodzi do nadmiernej absorpcji Ŝelaza z przewodu pokarmowego (defekty ferroportyny leŝą u podłoŝa hemochromatozy typu 4). [20] W warunkach fizjologicznych po wydostaniu się z enterocytów Ŝelazo dwuwartościowe zostaje utlenione przez ferrooksydazy hefajstynę i ceruloplazminę do jonu trójwartościowego, który moŝe połączyć się z krąŝącą we krwi transferyną. Za aktywność hefajstyny i ceruloplazminy odpowiadają jony miedzi.[25,26] Kompleks transferyny z Fe 3+ łączy się następnie z receptorem transferyny na komórkach docelowych. Największą ekspresją TfR typu 1 charakteryzują się retikulocyty w szpiku kostnym jako komórki prekursorowe erytrocytów, ale receptory transferyny 1 są wytwarzane przez wszystkie komórki poza dojrzałymi erytrocytami. Typ 2 TfR występuje głównie w hepatocytach, gdzie odpowiada za pobieranie Ŝelaza w zaleŝności od stopnia wysycenia transferyny we krwi. Sygnał przekazywany poprzez internalizację kompleksu TfR 2-Fe decyduje w następnej kolejności o ilości produkowanej hepcydyny. [4,20] W sytuacji przeciąŝenia ustroju Ŝelazem i zwiększonego wysycenia transferyny, Ŝelazo w sposób niespecyficzny wiąŝe się z innymi białkami transportowymi, w tym z albuminami. Nadmiar kompleksów Fe 2+ z hemem nie podlega utlenowaniu w komórkach błony śluzowej jelita, ale jest transportowany przez hemopeksynę lub haptoglobinę do wątroby. [25,26] śelazo związane z transferyną najpierw przechodzi przez układ wrotny wątroby głównego narządu magazynowania, dopiero później trafia do innych narządów i tkanek. Internalizacja kompleksu transferyna-fe połączonego z receptorem transferyny zapoczątkowuje transport Ŝelaza do wnętrza komórek. Powstaje endosom, w którym pod wpływem niskiego ph Ŝelazo jest odłączane od transferyny. Następnie Ŝelazo poprzez DMT 1 w błonie endosomu przedostaje się do cytoplazmy. W zaleŝności od rodzaju komórki Fe moŝe zostać wykorzystane do produkcji hemu (w prekursorach erytrocytów), białek niehemowych albo wbudowane w ferrytynę i hemosyderynę stanowi pulę zapasową. Po odłączeniu Ŝelaza od kompleksu TfR 1- transferyna apotransferyna związana z receptorem transferyny 1 wraca na błonę komórkową. Tutaj apotransferyna powraca do krąŝenia. Warunkiem prawidłowego pobierania Ŝelaza za pomocą receptora transferyny jest obecność białka HFE. Ekspresja tego białka zachodzi we wszystkich tkankach poza mózgiem, a najbardziej nasilona jest w wątrobie i jelicie cienkim. Białko HFE, homologiczne z cząsteczkami klasy I głównego układu zgodności tkankowej (MHC), 20

21 zbudowane jest z trzech domen zewnątrzkomórkowych (α1, α2 i α3), domeny wewnątrzbłonowej i części cytoplazmatycznej. Domena α1 pośredniczy w połączeniu z TfR 1, natomiast domena α3 łączy się z β2-mikroglobuliną, która ułatwia prezentację białka HFE na powierzchni komórki. Wykryto duŝe ilości kompleksów HFE-β2M- TfR 1 na powierzchni komórek wyściełających krypty dwunastnicy. Za pośrednictwem tych kompleksów Ŝelazo wchłaniane jest z osocza do wnętrza enterocytów krypt i daje sygnał do osłabienia lub wzmocnienia ekspresji białek wpływających na absorpcję i transport Ŝelaza. Po ustaleniu poziomu zapotrzebowania na Fe część multipotencjalnych komórek krypt wędruje do nabłonka kosmków jelitowych, przekształca się w enterocyty i odtąd zajmuje się absorpcją wymaganej przez organizm ilości Ŝelaza. Defekt w białku HFE powoduje hemochromatozę typu 1 z nadmiernym wchłanianiem Ŝelaza z przewodu pokarmowego. [4,20,31] Koncepcja programowania komórek krypt jelitowych tak, aby po osiągnięciu dojrzałości jako enterocyty szczytowe wchłaniały stosowną do potrzeb organizmu ilość Ŝelaza, opiera się na wykryciu zmian ekspresji genów dla poszczególnych białek błonowych, w tym DMT 1 i ferroportyny. Istotny z klinicznego punktu widzenia jest fakt, Ŝe pomiędzy zadziałaniem konkretnego bodźca (np. obniŝeniem stęŝenia Ŝelaza w surowicy) a zmianami absorpcji Ŝelaza w jelicie mija okres około 2-3 dni, potrzebny na przejście enterocytów z krypt do części szczytowej i osiągnięcie pełnej dojrzałości. [21] Dodatkowo krąŝący we krwi rozpuszczalny receptor transferyny reguluje wychwyt Ŝelaza. Jego ilość zwiększa się proporcjonalnie do nasilenia erytropoezy, dostosowując transport do aktualnego zapotrzebowania na Fe. [26] Rysunek 1. przedstawia schemat wchłaniania Ŝelaza w jelicie. 21

22 Rysunek 1. Schemat wchłaniania Ŝelaza w jelicie (według [26] - w modyfikacji własnej) niedojrzała komórka krypty krew dwunastnica jelita Fe 3+ Receptor transferyny transferyna Fe 3+ Fe 3+ DMT1 HFE+β2M Fe 3+ hefajstyna Redukcja ferroreduktaza Ceruloplazmina apotransferyna Fe 2+ DMT 1 Fe 2+ Fe 3+ ferroportyna ligandy apoferrytyna ferrytyna HFE transferyna Fe 3+ Fe 3+ Haptoglobina/ hemopeksyna Fe 2+ hem Fe 2+ hem dojrzały enterocyt absorpcyjny (kosmki jelitowe) 22

23 Przechowywanie Ŝelaza Jak juŝ wspomniano, szpik kostny, wątroba i śledziona są waŝnymi miejscami gromadzenia Ŝelaza zapasowego. Ferrytyna jest pulą Ŝelaza szybko uruchamianą, gdy zwiększa się zapotrzebowanie na Ŝelazo. Zawiera 24% Ŝelaza elementarnego. JeŜeli podaŝ Ŝelaza przekracza moŝliwości przechowywania w postaci ferrytyny, Ŝelazo jest wbudowywane w hemosyderynę. Hemosyderyna, nierozpuszczalna w wodzie forma ferrytyny, zawiera więcej Ŝelaza (do 35%), ale uruchomienie Ŝelaza z tej puli jest trudniejsze i przebiega bardzo powoli. Wątroba przechowuje > 60% Ŝelaza zapasowego organizmu, z czego około 95% w postaci ferrytyny w hepatocytach, a 5% stanowi hemosyderyna w komórkach Kupffera. Pozostałe 40% puli zapasowej Ŝelaza znajduje się w tkance mięśniowej i komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego (hemosyderyna głównie w komórkach układu siateczkowo-śródbłonkowego). [4,12,24,26,31,32] Dystrybucja Ŝelaza pomiędzy poszczególnymi kompartmentami Poza wchłanianiem z przewodu pokarmowego głównym źródłem Ŝelaza krąŝącego we krwi są makrofagi układu siateczkowo-śródbłonkowego i hepatocyty. Zmiany w błonie komórkowej starzejących się erytrocytów (utrata coraz większych ilości reszt kwasu neuraminowego z glikoprotein błonowych) powodują, Ŝe pod koniec swojego Ŝycia krwinki czerwone opłaszczone przeciwciałami IgG są rozpoznawane i poddawane fagocytozie przez makrofagi śledziony i komórki Kupffera. Odzyskiwane Ŝelazo w makrofagach zasila tzw. zmienną (labilną) pulę Ŝelaza (labile iron pool = LIP). Z tej puli Ŝelazo moŝe być bezpośrednio transportowane do krwi za pośrednictwem ferroportyny w błonie komórkowej makrofagów (tak, jak przebiega transport z enterocytów do krwi) lub jest odkładane w postaci ferrytyny. Około 85% Ŝelaza pochodzącego z degradacji hemoglobiny ponownie trafia do krwi w postaci związanej z transferyną lub ferrytyną. Szpik kostny wykazuje największe zapotrzebowanie na Ŝelazo i tam transportowane jest > 80% Ŝelaza z krwi. [4,24,26] 23

24 Rysunek 2. Schemat najwaŝniejszych szlaków w metabolizmie Ŝelaza u człowieka (według [11,26,32] w modyfikacji własnej) W nawiasach podano białko, z którym związane jest Ŝelazo. Grubość strzałek oznacza udział ilościowy danego etapu w całkowitej puli krąŝącego Ŝelaza. absorpcja/wydalanie Transferyna we krwi Tkanki: mięśnie (mioglobina), hepatocyty (ferrytyna i hemosyderyna) Szpik kostny (hem) Komórki układu siateczkowośrodbłonkowego: wątroba, śledziona, szpik kostny (ferrytyna i hemosyderyna) KrąŜące krwinki czerwone (hemoglobina) 24

25 I.4. Białka metabolizmu Ŝelaza w diagnostyce homeostazy Ŝelaza Z uwagi na zastosowanie niektórych wymienionych powyŝej białek i parametrów w diagnostyce zostaną one szerzej omówione. Ferrytyna Podstawową funkcją tego czerwonobrązowego białka jest magazynowanie Ŝelaza w organizmie. Obecność ferrytyny potwierdzono potwierdzono w wątrobie, śledzionie, szpiku kostnym, w płucach, sercu, nerkach, mózgu i łoŝysku. Jej ilość w komórce zaleŝy od ilości Ŝelaza w organizmie i w sytuacji niedoboru Ŝelaza zmniejsza się, poniewaŝ uruchamiane są pule zapasowe tego pierwiastka. Tkankowa ferrytyna to kulisty 24-jednostkowy polimer zawierający dwa rodzaje podjednostek: cięŝką (H= heavy) i lekką (L= light). Główną podjednostką jest podjednostka lekka. W tkankach i narządach magazynujących Ŝelazo w ferrytynie przewaŝa podjednostka L (wątroba, śledziona), co wpływa na wysoką zawartość metalu w cząsteczce białka (> 1500 Fe/cząsteczkę). W mięśniach, mózgu i sercu występują ferrytyny bogate w podjednostkę H i zawierające mniej Ŝelaza (< 1000 Fe/cząsteczkę). Wokół rdzenia z atomami Ŝelaza w postaci micelarnej zbudowana jest otoczka białkowa (apoferrytyna). Podjednostka H zawiera centrum ferrooksydazowe utleniające Fe 2+ do Fe 3+, które jest odkładane wewnątrz struktury sferycznej. W ferrytynie występuje kompleks wodnego roztworu tlenku Ŝelazowego (Fe 3+ ) i fosforanów. Jedna cząsteczka moŝe zawierać od 2500 do 4000 atomów Ŝelaza. Ferrytyna zajmuje drugie miejsce (za hemoglobiną) pod względem ilości zgromadzonego Ŝelaza ustrojowego. [26,33-35] Z jednej strony ferrytyna zapewnia podaŝ Ŝelaza w kluczowych dla komórki procesach, z drugiej jej struktura i funkcja chronią lipidy, DNA i białka przed potencjalnie toksycznym działaniem Fe (szczególnie w aktywniejszej postaci dwuwartościowej). Zmiana proporcji syntetyzowanych podjednostek ferrytyny jest uwarunkowana aktualnymi potrzebami organizmu. Jeśli zachodzi potrzeba zwiększenia magazynów Ŝelaza, wzrasta synteza podjednostki L. W sytuacji zapotrzebowania na Ŝelazo do metabolizmu komórki, wzrasta zawartość podjednostki H. [34-36] Ferrytyna jest białkiem ostrej fazy, jej stęŝenie w surowicy podwyŝsza się podczas zakaŝenia, przewlekłego stanu zapalnego, chorób nowotworowych itd. [9,26,33,35,36,37,38] Ocenia się, Ŝe na 1 µg/l ferrytyny we krwi pępowinowej przypada u noworodka tylko 2,7 mg Ŝelaza, podczas gdy u starszych dzieci i dorosłych wynosi 8-10 mg Ŝelaza. 25

26 Oznacza to, Ŝe przy takich samych stęŝeniach ferrytyny rezerwy Ŝelaza u noworodka stanowią w przybliŝeniu 1/3 zasobów matki. [14] Transferyna Transferyna powstaje w wątrobie, jej okres półtrwania we krwi wynosi 8-12 dni. Produkcja tej glikoproteiny o masie cząsteczkowej 80 kd moŝe być zwiększona w odpowiedzi na wzrost zapotrzebowania na Ŝelazo. [26] Poza wieloma izoformami (w tym β1, β2, γ) występuje w trzech postaciach, które róŝnią się ilością związanych jonów Fe 3+. Apotransferyna nie jest związana z Ŝelazem (to forma powracająca z komórek do krwi po zakończonym cyklu wewnątrzkomórkowego transportu Fe), transferyna monoferryczna i dwuferryczna związane są odpowiednio z jednym lub dwoma jonami Ŝelaza trójwartościowego. KaŜda cząsteczka transferyny moŝe związać maksymalnie dwa jony Fe 3+, co odpowiada około 1,5 µg Ŝelaza na 1 mg transferyny. Transferyna związana z dwoma jonami Ŝelaza wykazuje 4-krotnie wyŝsze powinowactwo do receptora transferyny 1 niŝ transferyna z jednym jonem Ŝelaza, a 24- krotnie wyŝsze powinowactwo niŝ apotransferyna. [20,21] W diagnostyce laboratoryjnej oznaczenie stęŝenia transferyny jest mało rozpowszechnione, częściej natomiast wykonuje się badanie TIBC, czyli całkowitej zdolności wiązania Ŝelaza. [26,32] Tabela 3. Przeliczanie transferyny i TIBC (według [26]) Transferyna (µmol/l) x 2 TIBC (µmol/l) Transferyna (mg/dl) x 1,41 TIBC (µg/dl) 1 mol transferyny wiąŝe 2 atomy Ŝelaza TIBC dla 1 g transferyny wynosi 1,41 mg Ŝelaza Ściśle biorąc, TIBC odzwierciedla potencjalną zdolność wiązania Ŝelaza przez transferynę, natomiast rzeczywistą całkowitą zdolność wiązania przez surowicę określa SIBC, które moŝna obliczyć (SIBC = TIBC x 1,27). Obecnie rzadko uŝywa się wartości SIBC. Saturacja (wysycenie) transferyny W warunkach fizjologicznych około 2/3 miejsc wiązania jonów Fe 3+ nie jest zajęta. Frakcja wolnych dla Ŝelaza miejsc na transferynie jest określana jako utajona zdolność wiązania Ŝelaza (LIBC = latent iron-binding capacity) i moŝna ją obliczyć z róŝnicy 26

27 pomiędzy TIBC i stęŝeniem Ŝelaza w surowicy. Częściej uŝywa się jednak pojęcia procentowego wysycenia (saturacji) transferyny (TfS). Jak wspomniano powyŝej transferyna zwykle wysycona jest Ŝelazem w około 30%. Przy tych samych, dość stałych w czasie stęŝeniach transferyny, jej wysycenie moŝe się szybko zmieniać w zaleŝności od zapotrzebowania organizmu i podaŝy Ŝelaza w diecie. Wysycenie transferyny < 16% wskazuje na niedobór Ŝelaza, podwyŝszone wysycenie transferyny stwierdza się w przeładowaniu Ŝelazem (np. hemochromatoza, nadmiar Ŝelaza po przetoczeniu krwinek czerwonych). [26,32] Tabela 4. Przeliczanie wysycenia transferyny Ŝelazem (według [26]) Wysycenie transferyny (%) = [stęŝenie Ŝelaza (µmol/l) x 100] : transferyna (µmol/l) Wysycenie transferyny (%) = [stęŝenie Ŝelaza (µg/dl) x 100] : [transferyna (mg/dl) x 1,41] Wysycenie transferyny (%)= [stęŝenie Ŝelaza (µg/dl) : SIBC (µg/dl)] x 100 Wysycenie transferyny w 10% oznacza, Ŝe z 1 g transferyny związane jest 0,141 mg Ŝelaza Wysycenie transferyny w 50% oznacza, Ŝe z 1 g transferyny związane jest 0,705 mg Ŝelaza Receptor transferyny i rozpuszczalny receptor transferyny Za pośrednictwem receptora transferyny (TfR) na powierzchni komórek zachodzi regulacja wychwytu Ŝelaza przez komórki. PrzewaŜająca część Ŝelaza w ustroju jest potrzebna do syntezy hemoglobiny, dlatego teŝ około 80% wszystkich receptorów transferyny znajduje się na komórkach prekursorowych erytropoezy w szpiku kostnym. Receptor transferyny ma strukturę dimeru, którego kaŝda podjednostka o masie cząsteczkowej daltonów wiąŝe jedną cząsteczkę transferyny. Podjednostki TfR są połączone dwoma wiązaniami dwusiarczkowymi. Powinowactwo przezbłonowej glikoproteiny TfR do kompleksu transferyna-fe w słabo zasadowym środowisku krwi, jak juŝ wspomniano, zaleŝy od wysycenia transferyny Ŝelazem. NajniŜsze powinowactwo receptor wykazuje wtedy, kiedy wysycenie transferyny wynosi < 15%. [26] KaŜda komórka zmienia ekspresję receptorów transferyny stosownie do aktualnego zapotrzebowania na Ŝelazo. Znacząca część receptorów transferyny jest uwalniana do krwi jako rozpuszczalny receptor transferyny w mechanizmie proteolizy zewnątrzbłonowego monomeru o masie cząsteczkowej daltonów (krótszy o 100 aminokwasów od receptora zakotwiczonego w błonie komórkowej). W sytuacji 27

28 zwiększonego zapotrzebowania na Ŝelazo i zbyt małego stęŝenia Ŝelaza wewnątrzkomórkowego wzrasta ekspresja receptora transferyny na powierzchni komórek i jego frakcji rozpuszczalnej krąŝącej we krwi. StęŜenie stfr odzwierciedla całkowitą ilość związanych z błoną komórkową receptorów transferyny, a co za tym idzie stanowi informację o zapotrzebowaniu na Ŝelazo w korelacji z aktywnością erytropoetyczną organizmu. W związku z powyŝszym stęŝenie TfR i stfr jest najwyŝsze u osób z niedoborem Ŝelaza i pobudzeniem erytropoezy. StęŜenie stfr wzrasta znacząco po rozpoczęciu leczenia niedokrwistości niedoborowej preparatami Ŝelaza, co koreluje ze zwiększoną liczbą uwalnianych retikulocytów. [26,32,39] Wykazano, Ŝe leczenie wysokimi dawkami rekombinowanej Epo spowodowało około 2,5-krotny wzrost liczby receptorów transferyny, niezaleŝnie od stanu czynnościowego niedoboru Ŝelaza lub przeładowania Ŝelazem. Jest to dowód na zwiększenie ekspresji receptora transferyny na powierzchni komórek linii erytroidalnej pod wpływem erytropoetyny. Ze względu na duŝą liczbę receptorów transferyny retikulocyty uwalniane do krwioobiegu sprawniej wychwytują Ŝelazo. W przypadku znacznego wzrostu liczby retikulocytów moŝe to przejściowo nasilić względny niedobór Ŝelaza dla erytroblastów w szpiku kostnym. [40] PodwyŜszone stęŝenie rozpuszczalnego receptora transferyny (stfr) lub wskaźnika stfr/log stęŝenie ferrytyny (wskaźnik TfR-F) odzwierciedla tkankowe niedobory Ŝelaza u dzieci i osób dorosłych. [23] Nie ustalono jednak zakresu wartości fizjologicznych tego wskaźnika u noworodków. StęŜenie Ŝelaza w surowicy Ocena stęŝenia Ŝelaza w surowicy krwi ma ograniczoną przydatność w diagnostyce jako pojedynczy parametr. Poziom Ŝelaza odznacza się duŝą zmiennością dobową, a nawet godzinową. RóŜnice pomiędzy wartościami oznaczanymi rano i wieczorem mogą sięgać nawet 50 µg/dl. [26,32] Wskaźniki czerwonokrwinkowe Wszystkie wartości wskaźników krwinek czerwonych naleŝy oceniać w odniesieniu do norm dla wieku, a niekiedy takŝe dla płci dziecka. Liczba erytrocytów oceniana w 1 litrze krwi i stęŝenie hemoglobiny (g/dl = mmol/l x 1,61; mmol/l = g/dl x 0,6205) są podstawowymi parametrami ocenianymi w morfologii krwi obwodowej. Niedokrwistość rozpoznaje się, gdy stęŝenie hemoglobiny lub/i liczba erytrocytów jest obniŝona w stosunku do norm dla wieku. Hematokryt określa procentowy udział 28

29 krwinek czerwonych we krwi obwodowej. Pozostałe wskaźniki są pochodnymi wyŝej wymienionych wartości. Średnia objętość krwinki czerwonej (fl lub µm 3 ) odnosi się do wielkości krwinki. MCV= [Hematokryt : (liczba krwinek czerwonych x 10 6 /µl)] x 10 [26,41] PowyŜszy parametr jest uzupełniany przez rozkład objętości krwinek czerwonych (RDW), współczynnik wariancji wielkości krwinek czerwonych. Współczynnik ten jest mniejszy, gdy wymiary krwinek są bardziej jednorodne, natomiast zwiększa się, gdy istnieją większe róŝnice objętości krwinek (koreluje ze stopniem anizocytozy). U zdrowego dziecka erytrocyty są zwykle jednorodną grupą pod względem objętości i wtedy RDW wynosi 11,5-14,5% (0,115-0,145). Obliczanie RDW odbywa się bezpośrednio z histogramu krwinek czerwonych. Mimo Ŝe RDW jest wysoce czułym wskaźnikiem, jego niska specyficzność ogranicza zastosowanie jako niezaleŝnego markera. Natomiast w połączeniu z MCV moŝe być przydatny w diagnostyce mikrocytozy. PodwyŜszony RDW wydaje się być najwcześniejszym laboratoryjnym wykładnikiem niedoboru Ŝelaza. Jest bardziej czuły niŝ poziom Ŝelaza w surowicy, stopień wysycenia transferyny czy poziom ferrytyny w surowicy. W przebiegu niedokrwistości z niedoboru Ŝelaza powstają małe krwinki czerwone (małe MCV). RDW jest jednak podwyŝszony ze względu na róŝnice w kształcie (poikilocytoza) i wielkości erytrocytów (anizocytoza). We wczesnym okresie niedoboru Ŝelaza tylko niewielka liczba erytrocytów jest mikrocytarna. To spowoduje wzrost odchylenia standardowego i RDW, ale MCV pozostanie bez zmian, poniewaŝ zbyt mało jest mikrocytów, aby zmieniła się średnia objętość krwinki czerwonej. [38,42] Do obliczenia średniej masy hemoglobiny w krwince czerwonej słuŝy wzór: MCH = Hemoglobina (g/l) : (liczba krwinek czerwonych x 10 6 /µl) Podawana jest w pikogramach (pg) lub femtomolach (fmol). fmol = pg x 0,062 pg = fmol x 16,11 Średnie stęŝenie hemoglobiny w krwince czerwonej oblicza się w sposób następujący: MCHC = Hemoglobina (g/dl) : Hematokryt (%) Podawane jest w g/dl lub mmol/l. mmol/l = g/dl x 0,62 g/dl = mmol/l x 1,61 29

30 MCHC określa, czy stęŝenie hemoglobiny w krwince czerwonej w stosunku do jej wielkości jest prawidłowe, zwiększone czy zmniejszone. Liczba retikulocytów jako prekursorów dojrzałych erytrocytów koreluje z aktywnością erytropoetyczną szpiku. Jest to forma przejściowa pomiędzy jądrzastym erytroblastem a bezjądrzastym erytrocytem, uwalniana ze szpiku kostnego około godzin przed ostatecznym zakończeniem dojrzewania komórki. W wynikach badań podaje się bezwzględną liczbę retikulocytów w µl lub wyraŝa ją jako odsetek krwinek czerwonych (w % lub ). [26,41] W tabeli 5 i 6 podano średnie wartości wskaźników czerwonokrwinkowych u zdrowych urodzonych o czasie noworodków i małych niemowląt. Tabela 5. Prawidłowe średnie wartości hematologiczne u noworodków urodzonych o czasie w pierwszych 2 tygodniach Ŝycia. Na podstawie [43] W ciągu pierwszych 2 tygodni Ŝycia Hb z krwi Ŝylnej < 13 g/dl lub z krwi włośniczkowej < 14,5 g/dl uwaŝana jest za niedokrwistość. Wskaźnik Krew Doba 1 Doba 3 Doba 7 Doba 14 pępowinowa Hemoglobina (g/dl) 16,8 18,4 17, ,8 Hematokryt (%) 53,0 58,0 55,0 54,0 52,0 Liczba erytrocytów 5,25 5,8 5,6 5,2 5,1 (10 6 /mm 3 ) MCV (fl) ,0 98,0 96,0 MCH (pg) ,5 31,5 MCHC (g/dl) 31,7 32, Retikulocyty (%) Jądrzaste krwinki czerwone (w mm 3 ) Płytki krwi (10 3 /mm 3 )