Ziemniak Polski 2011 nr 1 1

Ziemniak Polski 2011 nr 1 1 Hodowla i genetyka OCENY CYTOLOGICZNE STOSOWANE W PRACACH HODOWLANO- -GENETYCZNYCH NAD ZIEMNIAKIEM mgr Iwona Wasilewicz-Flis IHAR PIB, Zakład Genetyki i Materiałów Wyjściowych Ziemniaka w Młochowie ul. Platanowa 19, 05-831 Młochów, e-mail: i.wasilewicz-flis@ihar.edu.pl O ceny cytologiczne wykorzystywane w pracach hodowlano-genetycznych nad ziemniakiem są technikami pomocniczymi. Należy do nich określanie płodności pyłku oraz poziomu ploidalności, a także w wypadku ziemniaków diploidalnych zdolności tworzenia gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów. Wymienione techniki usprawniają i ułatwiają skomplikowany cykl hodowlany ziemniaka. Zostały one opracowane głównie w latach 60. i 70. ubiegłego wieku i do dziś są stosowane z niewielkimi modyfikacjami. Ocena płodności pyłku Płodność pyłku można określać na podstawie kiełkowania jego ziaren na pożywce oraz na podstawie wybarwiania się ziaren na preparatach mikroskopowych. W pierwszej metodzie, bardziej bezpośredniej, obserwuje się kiełkowanie ziaren pyłku na pożywce. Pyłek kiełkujący przynajmniej w 2% jest uważany za funkcjonalny (Martenson i in. 1964), jednak procent kiełkujących ziaren w dużym stopniu zależy od składu pożywki (King, Johnston 1958). W pracach hodowlanych i genetycznych formy ojcowskie do programu krzyżowań są typowane na podstawie procentowego udziału wybarwionych ziaren pyłku na preparatach mikroskopowych. W tym celu, ze względu na duży wpływ czynników środowiska oraz genotypu na proces mejozy, pyłek zbiera się z kilku dojrzałych kwiatów z różnych roślin badanego klonu i ocenę powtarza w następnym sezonie. Preparat mikroskopowy powstaje przez zabarwienie pyłku kwaśną laktofuksyną. Przy powiększeniu 200x, w kilku polach widzenia, wśród 100- -200 ziaren określa się procentowy udział wybarwionych na kolor ciemnoróżowy, niezdeformowanych ziaren pyłku (fot. 1). Fot. 1. Ziarna pyłku ziemniaka diploidalnego; widoczne duże ziarna (2n), ziarna haploidalne (n) i pyłek niepłodny (niewybarwiony) Pyłek wybarwiony przynajmniej w 30% jest płodny i może być efektywnym zapylaczem w programie krzyżowań (Abdalla 1970; Janssen, Hermsen 1976). Jest to pośrednia, ale prosta i szybka metoda określania płodności pyłku genotypów wytypowanych do krzyżowań, która zapewnia zastosowanie płodnych form ojcowskich. Wynik krzyżowania zależy również od formy matecznej oraz barier między krzyżowanymi formami. W latach 70. i na początku lat 80. ubiegłego stulecia w oddziale Instytutu Ziemniaka w Młochowie (obecnie oddział

2 Ziemniak Polski 2011 nr 1 IHAR) oznaczano w celach badawczych zgodność między krzyżowanymi genotypami diploidalnymi na podstawie kiełkowania łagiewek na znamieniu słupka i przerastania ich przez szyjkę do zalążni. Obserwacje wykonywano w mikroskopie fluorescencyjnym na preparatach gniecionych barwionych błękitem anilinowym. W materiałach wywodzących się z Młochowa występują głównie dwa typy sterylności. Pierwszy, spotykany w genotypach diploidalnych (2x) i tetraploidalnych (4x), to niewybarwiające się nierozwinięte i nieżywotne ziarna pyłku. W ziemniaku tetraploidalnym występuje również sterylność tetradowa, polegająca na tym, że cztery ziarna pyłku, powstałe podczas mejozy, są ze sobą sklejone i mimo wybarwienia nie są zdolne do zapylenia. Ocena zdolności do tworzenia gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów w ziemniaku diploidalnym W ziemniaku diploidalnym męska płodność jest ważną cechą braną pod uwagę w czasie selekcjonowania klonów. Inną ważną cechą cytologiczną ziemniaka 2x jest zdolność do tworzenia męskich gamet o niezredukowanej liczbie chromosomów (gamety 2n). Gamety tego typu są wykorzystywane do przenoszenia na poziom tetraploidalny genetycznego potencjału diploidalnych form ojcowskich w krzyżowaniach interploidalnych typu 4x x 2x. Wstępną oceną zdolności do tworzenia męskich gamet 2n jest mikroskopowa obserwacja wielkości ziaren pyłku przy okazji określania płodności pyłku. Średnica typowych dla diploidów ziaren pyłku waha się od 18 do 23 µm, co wskazuje na prawidłowy przebieg mejozy i wytworzenie gamet haploidalnych (n) o zredukowanej liczbie chromosomów. Obecność dużych ziaren pyłku, o średnicy powyżej 25 µm, wskazuje, że badany klon może tworzyć męskie gamety 2n (Quinn i in. 1974) (fot. 1). Na preparacie barwionym kwaśną laktofuksyną określa się procentowy udział dużych ziaren pyłku wśród 200 płodnych ziaren. Jacobsen (1980) uważa, że klony diploidalne powinny wytwarzać minimum 1-5% dużych ziaren, aby być skutecznymi zapylaczami w krzyżowaniach interploidalnych. Zaburzenia obserwowane przed, w czasie oraz po mejozie, takie jak diady, triady, zlane lub równoległe wrzeciona kariokinetyczne, zaburzenia cytokinezy, potwierdzają wstępną ocenę zdolności do tworzenia gamet 2n oraz określają typ gamet (Veilleux 1985). Obserwacje przebiegu powstawania ziaren pyłku (mikrosporogenezy) prowadzi się na preparatach gniecionych pylników, barwionych karminem, pod powiększeniem 1000x. Przygotowanie materiału roślinnego do obserwacji nie jest skomplikowane. Z badanego genotypu zbiera się młode pączki kwiatowe, a wyizolowane z nich pylniki utrwala w utrwalaczu Carnoya. Po przemyciu pylników w 30-proc. alkoholu etylowym można je przechowywać w 70-proc. etanolu przez kilka miesięcy. Preparaty wykonuje się na bieżąco przed obserwacją mikroskopową. U ziemniaka występują głównie dwa typy gamet 2n FDR i SDR. Gamety typu FDR (First Division Restitution) powstają na skutek zlania lub równoległego ułożenia wrzecion kariokinetycznych w anafazie II, natomiast gamety typu SDR (Second Division Restitution) powstają przy zaburzeniach cytokinezy (Mok, Peloquin 1975). Najczęściej diploidalne klony wytwarzają równocześnie oba typy gamet (Wagenvoort, Zimnoch-Guzowska 1991). Szczególnie cenne dla hodowli są gamety typu FDR, ponieważ mogą posiadać rodzicielskie genomy w stanie niezmienionym. Funkcjonalność męskich gamet 2n testuje się w krzyżowaniach interploidalnych 4x x 2x, oceniając wiązanie nasion na jedną jagodę oraz procent tetraploidalnych form w potomstwie. Jako wyznacznik dobrego działania gamet 2n przyjmuje się minimum 10 nasion na jedną jagodę. W potomstwie z krzyżowań typu 4x x 2x, gdy zapylacz tworzy funkcjonalne gamety 2n, występuje ok. 85% form tetraploidalnych, ok. 10% diploidów oraz, dzięki silnie działającemu u ziemniaka blokowi triploidalnemu, zaledwie kilka procent triploidów. W diploidalnych klonach występuje również zdolność do tworzenia żeńskich gamet 2n. Jednak ocena tej cechy jest trudniejsza i bardziej pracochłonna w stosunku do określania zdolności formowania męskich gamet 2n. Powstawanie żeńskich gamet 2n wstępnie ocenia się na mikroskopowych preparatach półtrwałych, a ich funkcjonalność w

Ziemniak Polski 2011 nr 1 3 programach krzyżowań interploidalnych typu 2x x 4x (Jongedijk 1985). Zdolność do tworzenia gamet 2n jest zjawiskiem powszechnym w świecie roślin, również u ziemniaka. Liczne gatunki ziemniaka diploidalnego zostały opisane jako zdolne do tworzenia gamet 2n (Den Nijs, Peloquin 1977; Leue, Peloquin 1980; Narkiewicz 1986). W grupie męskopłodnych diploidalnych mieszańców otrzymanych w Młochowie ok. 49% klonów posiada zdolność do tworzenia męskich gamet 2n (Strzelczyk-Żyta i in. 1997). Natomiast zdolność do tworzenia żeńskich gamet 2n wykazują nieliczne formy z tej grupy. Ocenę cech związanych z procesem mejozy, na który duży wpływ mają warunki środowiskowe oraz cechy fizjologiczne rośliny, należy wykonywać przynajmniej dwukrotnie. Określanie poziomu ploidalności ziemniaka Poziom ploidalności jest określany dla genotypów tetraploidalnych pochodzących z programów hodowlanych w przypadkach wątpliwych. Natomiast w pracach z formami diploidalnymi jest to ocena rutynowa. Konieczne jest kontrolowanie poziomu ploidalności roślin genotypów otrzymywanych z krzyżowań interploidalnych mających na celu zarówno haploidyzację, jak i tetraploidyzację materiału. Ze względu na powszechne występowanie gamet 2n w ziemniaku diploidalnym w przypadkach wątpliwych należy sprawdzić poziom ploidalności genotypów uzyskiwanych z krzyżowań na poziomie diploidalnym. W krzyżowaniach interploidalnych (4x - 2x) i intraploidalnych (2x - 2x) powstaje potomstwo tetraploidalne, diploidalne oraz w niewielkim procencie triploidalne. Poziom ploidalności można określać metodami pośrednimi lub bezpośrednio. Do metod pośrednich należy liczenie chloroplastów w komórkach przyszparkowych aparatu szparkowego (Rothacker i in. 1966, Jakuczun i in. 1997) oraz oznaczanie zawartości jądrowego DNA za pomocą cytometru przepływowego (Arumuganathan, Earle 1991; Jakuczun i in. 1997). Metoda bezpośrednia polega na liczeniu chromosomów metafazowych w wierzchołkach wzrostu korzeni (Schreiter 1988). Określanie poziomu ploidalności przez liczenie chloroplastów w komórkach przyszparkowych jest metodą powszechnie stosowaną w pracach nad ziemniakiem, również w oddziale IHAR PIB w Młochowie. W celu policzenia chloroplastów wykonuje się preparat mikroskopowy ze skórki pobranej ze spodniej strony blaszki liściowej. Skrobia w chloroplastach jest barwiona płynem Lugola (jod w jodku potasu) na ciemnobrązowy kolor, a chloroplasty liczone pod powiększeniem 1000x. Średnią liczbę chloroplastów badanego genotypu określa się na podstawie liczby chloroplastów z 10 aparatów szparkowych (fot. 2). a b Fot. 2. Chloroplasty w komórkach przyszparkowych ziemniaka diploidalnego (a) i tetraploidalnego

4 Ziemniak Polski 2011 nr 1 Według Rothackera i innych (1966) średnia liczba chloroplastów w aparacie szparkowym w dihaploidach wynosiła 11,2 (zakres 7,5-14,0), w triploidach 14,4 (zakres 10,7- -19,0) i w tetraploidach 19,7 (zakres 16,0- -25,7). W badaniach Jakuczun i innych (1997) średnia liczba chloroplastów u międzygatunkowych mieszańców diploidalnych wynosiła 13,0 (zakres 10,7-15,1), u triploidalnych 17,5 (zakres 16,5-18,1) i u tetraploidów 21,0 (zakres 18,3-23,5). Metoda ta jest wystarczająca do masowych ocen, chociaż jest obarczona błędem wynikającym z wpływu różnych czynników na liczbę chloroplastów w obrębie poszczególnych poziomów ploidalności (Jakuczun i in. 1997). Poza tym zakresy poszczególnych poziomów ploidalności częściowo pokrywają się. Średnia liczba chloroplastów w aparacie szparkowym waha się w zależności od badanego materiału oraz środowiska, w jakim są prowadzone rośliny. W niektórych przypadkach trudno policzyć chloroplasty na preparacie, ponieważ skrobia jest słabo wybarwiona lub rozproszona w komórce. Cytometria przepływowa, druga metoda pośrednia, uważana jest za szybką i dokładną metodę oznaczania zawartości jądrowego DNA, która jest miernikiem poziomu ploidalności. Metoda ta wymaga jednak kosztownego sprzętu i odczynników oraz właściwego dobrania wzorców. Jest to metoda wykorzystywana głównie w badaniach naukowych. W wybranych przypadkach stosuje się bezpośrednią metodę określania poziomu ploidalności, czyli liczenie chromosomów w mitozie, w stadium metafazy w wierzchołkach wzrostu korzeni. Jest to metoda najpewniej określająca poziom ploidalności rośliny, jednak nie jest stosowana w masowych ocenach, ponieważ jest trudna i pracochłonna. Obserwacja mitozy u ziemniaka jest utrudniona ze względu na drobne chromosomy oraz krótko trwające stadium metafazy. Wierzchołki wzrostu korzonków pobiera się z 3-4-tygodniowych roślin. Chromosomy mitotyczne należy poddać procesowi skrócenia, stosując 8-hydroksychinolinę, kolchicynę lub niską temperaturę (ok. 3-5 o C). Korzonki utrwala się w utrwalaczu Carnoya, przemywa w alkoholu etylowym i przechowuje w 70-proc. etanolu. W celu wybarwienia chromosomów korzonki umieszcza się w acetokarminie i sporządza preparat gnieciony. Chromosomy są liczone na płytce metafazowej widzianej z góry, przy dobrym rozproszeniu chromosomów. Odczytu dokonuje się z pięciu komórek ocenianego genotypu, pod powiększeniem ok. 1000x. Materiał do badań cytologicznych należy zbierać z roślin ziemniaka ok. godz. 10, ponieważ wtedy następują intensywne podziały mejotyczne i mitotyczne, a skrobia jest skoncentrowana w chloroplastach. Rośliny powinny być dobrze podlane i naświetlone. Literatura 1. Abdalla M. M. F. 1970. Inbreeding, heterosis, fertility, plasmon differentiation and Phytophthora resistance in Solanum verrucosum Schlechtd. and some interspecific crosses in Solanum. Agr. Res. Rep. Wageningen 748: 213; 2. Arumuganathan K., Earle E. D. 1991. Estimation of nuclear DNA content of plants by flow cytometry. Mol. Biol. Rep. 9: 229-241; 3. Den Nijs T. P. M., Peloquin S. J. 1977. 2n gametes in potato species and their function in sexual polyploidization. Euphytica 26: 585-600; 4. Jacobsen E. 1980. Increase of diplandroid formation and seed set in 4x x 2x-crosses in potatoes by genetical manipulation of dihaploids and some theoretical consequences. Z. Pflanzenzüchtg 85: 110-121; 5. Jakuczun H., Strzelczyk-Żyta D., Narkiewicz M. 1997. Zastosowanie pośrednich metod oznaczania poziomu ploidalności ziemniaka. Biul. Inst. Ziemn. 48/I: 91-98; 6. Janssen A. W. B., Hermsen J. G. T. 1976. Estimating pollen fertility in Solanum species and haploids. Euphytica 25: 577-586; 7. Jongedijk E. 1985. The pattern of megasporogenesis and megagametogenesis in diploid Solanum species hybrids: its relevance to the origin of 2n eggs and the induction of apomixis. Euphytica 34: 599-611; 8. King J. R., Johnston T. M. 1958. Factors affecting Irish potato pollen germination in an artificial environment. Am. Potato J. 35: 689-700; 9. Leue E. F., Peloquin S. J. 1980. Selection for 2n gametes and tuberization in Solanum chacoense. Am. Potato J. 57: 189-195; 10. Mok D. W. S., Peloquin S. J. 1975. Three mechanisms of 2n pollen formation in dihaploid potatoes. Can. J. Genet. 17: 217-225; 11. Mortenson L. R., Peloquin S. J., Hougas R. W. 1964. Germination of Solanum pollen on artificial media. Am. Potato J. 41: 322-328; 12. Narkiewicz M. 1986. Ocena wybranych diploidalnych klonów ziemniaka pod względem zdolności wytwarzania męskich gamet niezredukowanych. Hod. Rośl. 30(5/6): 1-9; 13. Quinn A. A., Mok D. W. S., Peloquin S. J. 1974. Distribution and significance of diploandroids among the diploid Sola-

Ziemniak Polski 2011 nr 1 5 nums. Am. Potato J. 51: 16-21; 14. Rothacker D., Schreiter J., Junges W. 1966. Untersuchungen zur Erzeugung und Auslese dihaploider Sämlinge bei Solanum tuberosum L. Eur. Potato J. 9: 99-110; 15. Schreiter J. 1988. Variabilität der Chromosomenzahl in den sproßbürtigenwurzeln der Kartoffel Solanum tuberosum L. 2n = 4x = 48. Arch. Züchtungsforsch. 18: 169-174; 16. Strzelczyk-Żyta D., Jakuczun H., Zimnoch-Guzowska E. 1997. Zdolność do tworzenia męskich gamet 2n w diploidalnych klonach ziemniaka z programu syntezy diploidalnych form rodzicielskich. Biul. Inst. Ziemn. 48/I: 99-105; 17. Veilleux R. E. 1985. Diploid and polyploid gametes in crop plants: mechanisms of formation and utilization in plant breeding. Plant Breed. Rev. 3: 253-288; 18. Wagenvoort M., Zimnoch-Guzowska E. 1991. Gene centromere mapping in potato by half-tetrad analysis: map distances of H1, Rx and Ry and their possible use for ascertaining the mode of 2n-pollen formation. Genome 35: 1-7