EKOLOGICZNE SKUTKI DZIAŁANIA FOSFORANU MOCZNIKA NA DIAZOTROFY GLEBOWE W OKRESIE JESIENNYM. CZĘŚĆ I

ECOLOGICAL CHEMISTRY AND ENGINEERING S Vol. 15, No. 4 2008 Katarzyna GRATA 1 i Teresa KRZYŚKO-ŁUPICKA 1 EKOLOGICZNE SKUTKI DZIAŁANIA FOSFORANU MOCZNIKA NA DIAZOTROFY GLEBOWE W OKRESIE JESIENNYM. CZĘŚĆ I ECOLOGICAL EFFECTS OF CARBAMIDE PHOSPHATE ON SOIL DIAZOTROPHS IN AUTUMN. PART I Streszczenie: Fosforan mocznika ma zastosowanie w przemyśle paszowym, nawozowym i ochronie środowiska. Wcześniejsze badania nad tym preparatem, jako środkiem dezynfekcyjnym obornika, wykazały, iŝ nie powodował on zmniejszania aktywności nitryfikatorów, denitryfikatorów i amonifikatorów. Celem prezentowanych badań była ocena wpływu fosforanu mocznika (FM) na liczebność diazotrofów i ich aktywność w wiązaniu azotu molekularnego w okresie jesiennym. Wyniki badań wykazały, iŝ fosforan mocznika, zastosowany jako środek dezynfekcyjny obornika, stymulował liczebność diazotrofów oraz intensywność wiązania azotu w glebie po 30 i 90 dniach. Natomiast w glebie z obornikiem nieznacznie ograniczał wzrost i aktywność tych drobnoustrojów. Badania biochemiczne wykazały, iŝ po zastosowaniu fosforanu mocznika zwiększyła się zawartość w glebie fosforu i magnezu. Słowa kluczowe: gleba, jesień, fosforan mocznika, diazotrofy, intensywność wiązania azotu Azot jest jednym z biogennych pierwiastków niezbędnych do wzrostu i rozwoju zarówno dla mikroorganizmów, jak i roślin wyŝszych [1]. W środowisku przyrodniczym występuje on w róŝnych formach, mianowicie: molekularnej (N 2 ), mineralnej ( NH, NO 2, NO 3 ) i organicznej (aminokwasy, peptony, białka, mocznik i inne) [2]. Mikroorganizmy glebowe odznaczają się duŝą aktywnością metaboliczną i są zdolne do transformacji azotowych połączeń mineralnych i organicznych w procesach amonifikacji, denitryfikacji, nitryfikacji czy wiązania N 2 [1]. Dla większości organizmów azot jest związkiem metabolicznie niedostępnym, poniewaŝ nie mają one mechanizmów przekształcania go w formy przyswajalne. Dlatego teŝ pomimo znacznej ilości azotu w atmosferze, jest on składnikiem, w który gleba jest uboga. W domenie Bacteria tylko przedstawiciele typów: Proteobacteria (α, β, γ), Actinobacteria i Cyanoprokaryota wykazują zdolność do biologicznego wiązania azotu + 4 1 Katedra Biotechnologii i Biologii Molekularnej, Uniwersytet Opolski, ul. kard. B. Kominka 4, 45-035 Opole, tel. +48 77 401 60 56, email: kgrata@uni.opole.pl

588 Katarzyna Grata i Teresa Krzyśko-Łupicka atmosferycznego (BWAA). Dzięki przeprowadzanej przez diazotrofy redukcji azotu molekularnego następuje zasilenie gleby w przyswajalne formy tego pierwiastka [3-6]. Ponadto, niektóre z nich, np. Azotobacter sp., odgrywają teŝ znaczącą rolę w ekologii rolnictwa ze względu na syntezę związków biologicznie czynnych, np. auksyn, cytokinin, giberelin oraz IAA [7]. Czynnikami regulującymi aktywność wiązania N 2 mogą być oprócz naturalnych fizykochemicznych właściwości gleb równieŝ inne czynniki, np. metale cięŝkie, pestycydy czy nawoŝenie, a zwłaszcza rodzaj zastosowanego nawozu. Szczególne korzystne oddziaływanie na wzrost diazotrofów i intensywność procesu redukcji N 2 wykazują nawozy organiczne, charakteryzujące się duŝym ilorazem C/N [8-10]. Z nawozami organicznymi wprowadza się do gleby, oprócz składników pokarmowych niezbędnych dla roślin i mikroorganizmów, równieŝ często drobnoustroje potencjalnie chorobotwórcze. W celu minimalizacji zagroŝenia skaŝenia środowiska stosowano róŝne preparaty dezynfekcyjne, m.in. fosforan mocznika [11, 12]. Wcześniejsze badania nad tym preparatem, jako środkiem dezynfekcyjnym, wykazały hamujące jego działanie na rozwój bakterii i grzybów [12, 13]. Ponadto, nie powodował on obniŝenia aktywności niektórych grup fizjologicznych mikroorganizmów, m.in. amonifikatorów, nitryfikatorów i denitryfikatorów [14]. Celem przedstawionych badań była ocena wpływu fosforanu mocznika (FM) zastosowanego jako środek dezynfekcyjny obornika na liczebność i aktywność wiązania azotu przez diazotrofy w okresie jesiennym. Materiał i metody Przedmiotem badań były próbki gleby brunatnej właściwej o ph KCl = 5,5 pobranej jesienią z warstwy gleby 0 25 cm. Doświadczenie prowadzono w warunkach laboratoryjnych w wazonach (po 1 kg powietrznie suchej masy gleby) w 3 powtórzeniach. Czynnikami badanymi były: - dawka obornika: 0 oraz 25,56 g kg 1 suchej masy gleby, - dawka fosforanu mocznika: 0 oraz 1,22 g kg 1 suchej masy gleby. Dawkę fosforanu mocznika ustalono doświadczalnie tak, aby po zastosowaniu do obornika obniŝyła jego ph do 4,0. Następnie glebę wymieszano z obornikiem lub fosforanem mocznika oraz ze zdezynfekowanym obornikiem. Próbki inkubowano w 20ºC przez 90 dni, utrzymując stałą wilgotność (ok. 60% poj. wodnej). Po 2, 7, 30 i 90 dniach pobierano próbki gleby do analiz mikrobiologicznych, które obejmowały oznaczenia [15]: - ogólnej liczby diazotrofów metodą hodowlano-płytkową, inkubując posiewy na bezazotowej poŝywce Fenglerowej w temp. 28ºC przez 7 dni, - potencjalnej aktywności procesu wiązania wolnego azotu w glebie (Dn) zmodyfikowaną metodą Pochona. W metodzie tej wykorzystano zjawisko pojawiania się amoniaku jako pierwszego produktu, powstającego w toku procesu wiązania azotu z atmosfery. Liczebność diazotrofów oznaczono w 4 powtórzeniach, a wynik podano jako wartości średnie z powtórzeń w przeliczeniu na 1 g s.m. gleby.

Ekologiczne skutki działania fosforanu mocznika na diazotrofy glebowe w okresie jesiennym 589 Analizy chemiczne wykonane z próbek uśrednionych dotyczyły oznaczeń ph metodą potencjometryczną, P - metodą kolorymetryczną Engela w modyfikacji Riehma [16], a pozostałych pierwiastków - K, Mg, Fe, Cu metodą AAS (po 7 i 90 dniach). Obliczenia statystyczne wykonano metodą analizy wariancji z zastosowaniem testu Duncana. Omówienie wyników Dodatek substancji organicznej w postaci obornika wpływa na wzrost niektórych grup fizjologicznych, na przykład moŝe stymulować amonifikatory lub ograniczać rozwój nitryfikatorów [17, 18]. Przeprowadzone badania mikrobiologiczne wykazały, iŝ zastosowany obornik sprzyjał rozwojowi diazatrofów w sposób statystycznie istotny zwłaszcza w 7 dniu badań, a ich liczebność wynosiła 1,63 10 7 jtk/g s.m. gleby (rys. 1). Podobnie Narula i wsp. [19] po nawoŝeniu obornikiem wyizolowali znaczne ilości bakterii wiąŝących azot atmosferyczny ok. 1,96 10 6 jtk/g gleby. 1,00E+08 b a a a b d c a b b a c b b a c 1,00E+07 1,00E+06 1,00E+05 1,00E+04 1,00E+03 1,00E+02 1,00E+01 2 dni 7 dni 30 dni 90 dni Gleba GO GOFM GFM małe litery - róŝnice istotne (p < 0,05) G gleba bez nawoŝenia GO gleba + obornik GOFM gleba + obornik +fosforan mocznika GFM gleba + fosforan mocznika Rys. 1. Liczebność diazotrofów w 1 g s.m. gleby w zaleŝności od nawoŝenia [jtk/g] RównieŜ po zastosowaniu fosforanu mocznika do gleby zaobserwowano znaczącą stymulację liczebności diazotrofów po 30 i 90 dniach. Liczebność ich była największa w porównaniu do pozostałych kombinacji i wynosiła odpowiednio 9,03 10 6 jtk/g s.m. gleby (30 dni) i 1,28 10 7 jtk/g s.m. gleby (90 dni). RóŜnice te były statystycznie istotne. Natomiast w glebie z obornikiem fosforan mocznika (w 30 i 90 dniu) nieznacznie ograniczał wzrost tych mikroorganizmów ok. 10-krotnie w porównaniu do gleby tylko z obornikiem (rys. 1).

590 Katarzyna Grata i Teresa Krzyśko-Łupicka Analizując przebieg procesu wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy po 2 i 7 dniu, zaobserwowano, iŝ w prawie wszystkich wariantach (oprócz gleby) był na zbliŝonym poziomie, a róŝnice te były statystycznie nieistotne. Natomiast po 30 i 90 dniach stwierdzono istotnie większą aktywność wiązania azotu atmosferycznego w glebie z fosforanem mocznika (w porównaniu do gleby), a nieznacznie mniejszą w glebie z obornikiem i fosforanem mocznika (w porównaniu do gleby nawoŝonej obornikiem) (rys. 2). Matensson i Torstensson [9] zauwaŝyli, Ŝe rodzaj obornika miał wpływ na intensywność wiązania azotu. Zastosowany obornik bydlęcy nie wpływał na potencjalną aktywność wiązania azotu w przeciwieństwie do trzody chlewnej, u której dawki 10 i 50 Mg/ha całkowicie hamowały wiązanie tego pierwiastka. Biorąc pod uwagę czas trwania doświadczenia, zaobserwowano stopniowy wzrost intensywności wiązania azotu we wszystkich badanych wariantach, przy czym największe wartości odnotowano w 30 dniu badań (rys. 2). Podobnie Sawicka [8] wraz z upływem czasu obserwowała wzrost aktywności wiązania azotu, tłumacząc to stopniowym rozkładem organicznej materii glebowej i dostępnością powstających produktów dla bakterii wiąŝących azot atmosferyczny. Dn 8,00 7,00 a b b b b a a a a b a b a bc b c 6,00 5,00 4,00 3,00 2,00 1,00 0,00 2 dni 7 dni 30 dni 90 dni Gleba GO GOFM GFM Rys. 2. Intensywność wiązania azotu atmosferycznego przez diazotrofy w zaleŝności od nawoŝenia * - objaśnienia podano pod rysunkiem 1 Asymbiotyczne diazotrofy glebowe są grupą mikroorganizmów, dla których wiele pierwiastków ma duŝe znaczenie na ich występowanie i funkcje Ŝyciowe. NajwaŜniejszymi składnikami dla procesu wiązania azotu atmosferycznego są molibden i Ŝelazo, które wchodzą w skład kofaktora FeMo, oraz miedź, która reguluje zawartość tych metali [20, 21]. Badania Strzelec [22] wykazały, iŝ po nawoŝeniu gleby obornikiem wzrosła liczebność Azotobacter sp. i była ona statystycznie istotnie skorelowana z zawartością molibdenu w glebie. Nie mniej waŝne są równieŝ magnez, niezbędny podczas hydrolizy ATP, oraz fosfor, które wpływają na zintensyfikowanie metabolizmu tlenowego komórki. Zwłaszcza u tlenowych diazotrofów zwiększony poziom oddychania jest mechanizmem chroniącym

Ekologiczne skutki działania fosforanu mocznika na diazotrofy glebowe w okresie jesiennym 591 nitrogenazę przed tlenem. Reed i wsp. [23] dowiedli, Ŝe w obecności dostępnego fosforu intensywność wiązania azotu była ponad 2-krotnie większa niŝ w glebie nienawoŝonej fosforem. Dlatego teŝ niedostateczna ilość tych pierwiastków moŝe wpływać negatywnie na wzrost diazotrofów i wiązanie azotu atmosferycznego, poprzez zahamowanie syntezy funkcjonalnego enzymu nitrogenazy [20]. Wyniki przeprowadzonych badań dotyczące zawartości wybranych makroi mikroelementów w poszczególnych kombinacjach przedstawiono na rysunkach 3 i 4. 8 7 6 5 4 3 2 1 0 G GO GOFM GFM Fosfor Potas Magnez śelazo Miedź ph Rys. 3. Zawartość wybranych makro- i mikroelementów w glebie, ph w 7 dniu badań w zaleŝności od nawoŝenia (P, K, Mg i Fe [g/kg 1 s.m. gleby]; Cu [mg/kg 1 s.m. gleby]) * - objaśnienia podano pod rysunkiem 1 8 7 6 5 4 3 2 G GO GOFM GFM 1 0 Fosfor Potas Magnez śelazo Miedź ph Rys. 4. Zawartość wybranych makro- i mikroelementów w glebie, ph w 90 dniu badań w zaleŝności od nawoŝenia (P, K, Mg i Fe [g/kg 1 s.m. gleby]; Cu [mg/ kg 1 s.m. gleby]) * - objaśnienia podano pod rysunkiem 1 Fosforan mocznika nie powodował większych zmian w zawartości makroi mikroelementów. NaleŜy jednak zauwaŝyć, Ŝe pod wpływem jego działania zwiększyła

592 Katarzyna Grata i Teresa Krzyśko-Łupicka się jedynie zawartość w glebie fosforu i magnezu w obu terminach badań oraz Ŝelaza w 7 dniu. Zawartość fosforu w kombinacjach z fosforanem mocznika była większa o ok. 50,00 58,97% w 7 dniu oraz o 34,37 48,64% w 90 dniu, natomiast zawartość magnezu o ok. 14,28 44,44% w 7 dniu i 12,50 30,76% w 90 dniu w porównaniu do gleby i gleby nawoŝonej tylko obornikiem (rys. rys. 3 i 4). Zaobserwowano równieŝ wzrost zawartości potasu o 26,92% w glebie z obornikiem i fosforanem mocznika w 7 dniu oraz o 20,93% w glebie z tylko z fosforanem mocznika w 90 dniu badań (rys. rys. 3 i 4). Wyniki pomiaru ph KCl badanych gleb wykazały, iŝ w 7 dniu badań odczyn gleb z dodatkiem fosforanu mocznika był większy, a w 90 dniu mniejszy w porównaniu do gleby oraz gleby z obornikiem (rys. rys. 3 i 4). Wnioski 1. Fosforan mocznika zastosowany jako środek dezynfekcyjny obornika nie ograniczał liczebności i aktywności wolno Ŝyjących asymilatorów azotu w badanej glebie w okresie jesiennym. 2. Stwierdzono stopniowy wzrost intensywności wiązania azotu we wszystkich badanych wariantach, przy czym największe wartości odnotowano w 30 dniu badań. 3. Zastosowanie fosforanu mocznika przyczyniło się do zwiększenia zawartości w glebie zwłaszcza fosforu i magnezu. Literatura [1] Barabasz W.: Mikrobiologiczne przemiany azotu glebowego. I. Biogeochemia azotu glebowego. Post. Mikrobiol., 1991, XXX(4), 395-409. [2] Górska E.B., Ragus B. i Russel S.: Wytwarzanie nitrogenazy przez bakterie z rodzaju Bacillus wyizolowane z gleby. Drobnoustroje środowiska glebowego. Aspekty fizjologiczne, biochemiczne, genetyczne. Wyd. Adam Marszałek, Toruń 2001, 141-146. [3] Rudnick P., Meletzus D., Greek A., He L. i Kennedy C.: Regulation of nitrogen fixation by ammonium in diazotrophic species of Proteobacteria. Soil Biol. Biochem., 1997, 29(5/6), 831-841. [4] Kneip C., Lockhart P., Voß C. i Maier U.: Nitrogen fixation in eukaryotes- New models for symbiosis. EMC Evolut. Biol., 2007, 7, 55 (http://www.biomedcentral.com/1471-2148/7/55). [5] Martyniuk S.: Systemy biologicznego wiązania azotu. Nawozy i NawoŜenie, 2002, 1(10), 264-277. [6] Postage J.: Nitrogen Fixation. University Press, Cambridge 1998. [7] Mrkovacki N. i Milic V.: Use of Azotobacter chroococcum as potentially useful in agricultural application. Ann. Microbiol., 2001, 51, 145-158. [8] Sawicka A.: Wiązanie azotu atmosferycznego w róŝnych glebach regionu Wielkopolski. Rocz. Akad. Rol. w Poznaniu, 1982, CXXXVIII, 103-114. [9] Matensson A.M. i Torstensson L.: Monitoring sewage sludge using heterotrophic nitrogen fixing microorganisms. Soil Biol. Biochem., 1996, 28(12), 1621-1630. [10] Kobus J.: Biologiczne procesy a kształtowanie Ŝyzności gleby. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 1996, (421), 209-219.

Ekologiczne skutki działania fosforanu mocznika na diazotrofy glebowe w okresie jesiennym 593 [11] Latała A., Zydroń K., Krzyśko-Łupicka T. i Namysło P.: Badanie wpływu wybranych preparatów chemicznych na mikroflorę kurzeńca. Pr. Nauk. Inst. Technol. Nieorg. i Nawozów Miner. Politechniki Wrocławskiej, 1996, 45, Konferencje 26, 346-349. [12] Krzyśko-Łupicka T., Latała A., Zydroń K. i Namysło P.: Badanie wpływu fosforanu mocznika na wybrane szczepy bakterii. Pr. Nauk. Inst. Technol. Nieorg. i Nawozów Miner. Politechniki Wrocławskiej, 1996, 45, Konferencje 26, 340-345. [13] Krzyśko-Łupicka T. i Grata K.: Ocena wraŝliwości wybranych grzybów środowiskowych na fosforan mocznika. Rocz. PZH, 2003, 55(3), 243-248. [14] Grata K. i Krzyśko-Łupicka T.: Wpływ fosforanu mocznika jako środka dezynfekcyjnego obornika na biologiczne i biochemiczne właściwości gleby. Rocz. Glebozn., 2005, LVI(3/4), 13-20. [15] Pfeiffer-Maliszewska W.: Metoda oznaczania potencjalnej aktywności procesu wiązania wolnego azotu w glebie. Prace z dziedziny mikrobiologii gleby. PTG, Warszawa 1974, 33-38. [16] Lityński T., Jurkowska H. i Gorlach E.: Analiza chemiczno-rolnicza. Gleby i Nawozy, WN PWN, Warszawa 1992. [17] Mazur T.: NawoŜenie organiczne a zawartość azotanów. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 1996, (440), 239-247. [18] Mazur T.: Rolnicze i ekologiczne znaczenie nawoŝenia organicznego i mineralnego. Zesz. Probl. Post. Nauk Rol., 1999, (467), 151-157. [19] Narula N., Deubel A., Gransee A. Behl R.K. i Merbach W.: Impact of fertilizers on total microbiological flora in planted and unplanted soils of long-term fertilization experiment. Arch. Acker-Pfl. Boden., 2002, 48, 171-180. [20] Kargi F. i Özmięci S.: Performance of azotobacter supplemented activated sludge in biological treatment of nitrogen deficient wastewater. Proc. Biochem., 2002, 38, 57-64. [21] Lorkiewicz Z. i Skorupska A.: Biologiczne wiązanie azotu. Post. Mikrobiol., 1982, XXI(1/2), 7-31. [22] Strzelec A.: ZaleŜności pomiędzy właściwościami fizykochemicznymi gleb a ich aktywnością biologiczną. Drobnoustroje środowiska glebowego. Aspekty fizjologiczne, biochemiczne, genetyczne. Wyd. Adam Marszałek, Toruń 2001, 639-645. [23] Reed S., Seastedt T.R., Mann C.M., Suding K.N., Townsend A.R. i Czerwin K.L.: Phosphorus fertilization stimulates nitrogen fixation and increases inorganic nitrogen concentrations in a restored prairie. Appl. Soil Ecol., 2007, 36, 238-242. ECOLOGICAL EFFECTS OF CARBAMIDE PHOSPHATE ON SOIL DIAZOTROPHS IN AUTUMN. PART I Summary: The carbamide phosphate has a practical application in the fodder production, fertilizer industry and environment protection as well. Earlier investigations proved that this compound used as the farmyard disinfectant, did not reduce the activity of ammonificators, denitrificators and nitrificators in the soil. The main objective of the examination was to assess the influence carbamide phosphate (FM) on the number and intensity of nitrogen fixing by diazotrophs in autumn. The study results evidenced that carbamide phosphate used as the farmyard disinfectant, stimulated the total number of diazotrophs and N-fixing activity in the soil both after 30 and 90 days. However, the growth and activity of these microorganisms in soil with farmyard was decreased (about ten times). Biochemical examinations proved that carbamide phosphate application increased particularly phosphorus and magnesium content in the soil solution. Keywords: soil, autumn, carbamide phosphate, diazotrophs, N-fixing activity