ZASTOSOWANIE MIKROSYSTEMÓW W MEDYCYNIE LABORATORIUM Ćwiczenie nr 5 INSTRUMENT LAB-ON-A-CHIP DO ELEKTROFORETYCZNEJ ANALIZY MATERIAŁU GENETYCZNEGO Cel ćwiczenia Celem ćwiczenia jest zapoznanie się z budową i właściwościami instrumentu lab-on-a-chip do elektroforetycznej analizy materiału genetycznego. W ramach ćwiczenia zostaną przeprowadzone testy dozowania i separacji próbek (np. barwników fluorescencyjnych, DNA), z uwzględnieniem różnych parametrów procesu elektroforezy. Wykorzystywany w ćwiczeniu instrument lab-on-a-chip został opracowany w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki Wydziału Elektroniki Mikrosystemów i Fotoniki Politechniki Wrocławskiej. Jest on rozwinięciem prac grupy MEMSLab nad nowej klasy urządzeniami do wysokowydajnej analizy materiału genetycznego, umożliwiającymi m.in. znaczące skrócenie czasu analizy, zwiększenie czułości detekcji, zmniejszenie zużycia próbek. Wprowadzenie Elektroforeza jest jedną najważniejszych metod analityczno-preparatywnych, znajdującą szerokie zastosowanie m.in. w chemii, biologii molekularnej, diagnostyce medycznej. W szczególności, elektroforeza jest narzędziem w badaniach genetycznych, takich jak: analizy kryminalistyczne, testy ojcostwa, genetyczny odcisk palca, wykrywanie mutacji genowych. Elektroforeza umożliwia rozdzielenie i/lub wydzielenie składników mieszaniny w polu elektrycznym. Podstawą tej metody jest rozdzielenie cząstek (jonów, związków, substancji) ze względu na różną ich ruchliwość w kolumnie separacyjnej, wypełnionej ciekłym elektrolitem (buforem), w wyniku oddziaływania pola elektrycznego (Rys. ). Kierunek i szybkość migracji rozdzielanych cząstek zależy m.in. od ich masy cząsteczkowej, kształtu, zgromadzonego ładunku elektrycznego. Na rozdzielenie wpływ mają również parametry procesu, takie jak: temperatura kolumny, natężenie pola elektrycznego, odczyn buforu, wypełnienie kolumny. Rys.. Schemat elektroforetycznego rozdzielenia cząstek w kolumnie separacyjnej Szczególnie dobre rozdzielnie uzyskuje się w kolumnach wypełnionych żelem, wykorzystując zjawisko sita molekularnego (Rys. 2). Elektroforeza żelowa jest podstawowym narzędziem stosowanym w badaniach genetycznych do analizy ilościowej i jakościowej oraz preparatyki materiału genetycznego. Rys. 2. Schemat rozdzielenia cząstek metodą elektroforezy żelowej
Powszechnie stosowana do tego celu aparatura płytowa, w której separację prowadzi się w warstwie żelu zamkniętej między dwiema szklanymi płytami, jest prosta w budowie, tania i dostępna (Rys. 3). Ograniczeniem tej aparatury jest długi czas analizy (kilka godzin), znaczne ryzyko błędów dla śladowych ilości materiału genetycznego, stosowanie toksycznych (potencjalnie rakotwórczych) odczynników oraz wymagane wysokie doświadczenie. Rys. 3. Schemat aparatury do elektroforezy żelowej płytowej Aparatura wykorzystująca technikę laboratoriów chipowych (lab-on-a-chip) stwarza nowe możliwości elektroforetycznej analizy materiału genetycznego. Przeprowadzenie analizy w chipach z mikroprzepływowymi kanałami transportującymi, dozownikami, separatorami i kolektorami rozdzielonych frakcji, wiąże się ze znaczącym (nawet 0 000 krotnym) zmniejszeniem zużycia próbki i odczynników, wzrostem stopnia automatyzacji analizy i niezawodności aparatury oraz ograniczeniem ryzyka błędu ludzkiego. Ponadto, wykorzystanie efektu mikroskali pozwala na skrócenie czasu analizy (do kilku minut) oraz znacznie zwiększa sprawności separacji. Pomimo wielu zalet, instrumenty lab-on-a-chip do analizy elektroforetycznej nadal nie są ogólnodostępne, ich opracowanie jest długotrwałe i kosztowne, a istniejące (nieliczne) komercyjne rozwiązania są ukierunkowane jedynie na wybrane aplikacje. Postęp w dziedzinie analizy genetycznej wymaga dalszych badań nad tej klasy urządzeniami. Detekcja fluorymetryczna W instrumentach lab-on-a-chip chętnie stosuje się metody detekcji optycznej, z których największą czułością charakteryzuje się metoda fluorymetryczna ze wzbudzeniem fluorescencji światłem laserowym. W tej metodzie składniki próbki oznaczane są barwnikami fluorescencyjnymi, które w wyniku wzbudzenia światłem o długości fali λ ab emitują światło o długości fali λ em, przy czym zwykle λ ab < λ em. Rozdzielone elektroforetycznie składniki, migrując przez odcinek kanału separacyjnego oświetlony wiązką lasera (λ ab ), emitują błyski światła fluorescencji wzbudzonej (λ em ), które są rejestrowane przez detektor (kamerę CCD), a po przetworzeniu są przedstawiane w postaci charakterystyki czasowej (elektroferogramu). Elektroferogramy Elektroferogram jest zapisem czasowym sygnału detektora, umożliwiającym analizę ilościową i jakościową próbki. Piki elektroferogramu odpowiadają rozdzielonym składnikom, wykrywanym kolejno przez detektor w kolumnie separacyjnej. Do najważniejszych parametrów pików zaliczamy czas migracji t M, wysokość H i szerokość połówkową W H (Rys. 4a). Istotne jest, że czas migracji składnika liczony jest od momentu jego wprowadzenia do kolumny separacyjnej (dozowanie) do momentu wykrycia przez detektor. 2
Kształt i wzajemne położenie pików na elektroferogramie zależy od szeregu parametrów, m.in. przekroju kolumny separacyjnej, temperatury, czasu migracji (Rys. 4b). Optymalne parametry analizy pozwalają uzyskać piki smukłe i wyraźnie oddzielone od siebie. a) b) Rys. 4. Elektroferogram: a) parametry pików, b) wpływ czasu separacji na kształt pików W trakcie ćwiczenia studenci będą mogli zmieniać nastawy napięcia zasilającego chip (wpływając pośrednio na czas migracji) oraz temperatury chipa. Poprawność doboru tych parametrów mierzona jest sprawnością separacji N, wyrażoną ilością półek teoretycznych (pt). Sprawność separacji obliczana jest dla każdego piku ze wzoru: N = 5,545 (t M /w H ) 2 W ćwiczeniu uzyskiwany jest elektroferogram cyfrowy, który jest wyświetlany podczas analizy oraz zapisywany do wynikowego pliku tekstowego. W pliku tekstowym pierwsza kolumna danych pomiarowych odpowiada czasowi procesu wyrażonemu w sekundach (z dokładnością do ms), a kolumna druga jest zapisem wartości sygnału detektora. Po zakończeniu ćwiczenia studenci kopiują pliki wynikowe, przetwarzają dane w dowolnym arkuszu kalkulacyjnym (np. Excel, Calc, Origin) i obliczają parametry pików elektroferogramu: czas migracji, wysokość pików, szerokość połówkową i sprawność separacji. Obliczone parametry przedstawiają w sprawozdaniu w tabeli zbiorczej, z uwzględnieniem nastaw procesu analizy. Opis stanowiska W ćwiczeniu studenci zapoznają się z instrumentem lab-on-a-chip do elektroforetycznej analizy materiału genetycznego, opracowanym w Zakładzie Mikroinżynierii i Fotowoltaiki WEMiF PWr. Najważniejsze elementy stanowiska pomiarowego to: chip do elektroforezy, stacja dokująca oraz komputer z oprogramowaniem (Rys. 5). Rys. 5. Stanowisko pomiarowe 3
Chip do elektroforezy Chip do elektroforezy jest szklaną strukturą o wymiarach 35 mm x 7 mm x 2 mm, zawierającą mikroprzepływowe układy dozowania i separacji próbki (Rys. 6). Chip jest wykonany w całości ze szkła borowo-krzemionkowego typu Pyrex, z wykorzystaniem metod mikroinżynierii. Układy mikrofluidyczne są wytworzone w jednym podłożu szklanym techniką trawienia mokrego; w drugim podłożu wykonane są otwory przelotowe. Podłoża są połączone bezpośrednio metodą bondingu termicznego. a) b) c) Rys. 6. Chip do elektroforezy: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok Chip umieszczony jest w dwuczęściowej, polimerowej obudowie, tzw. module (Rys. 7). Górna strona modułu, wykonana z PTFE (Teflon ), zawiera zbiorniki cieczowe na bufor, okno detekcji optycznej oraz otwory pozycjonujące chip w stacji dokującej. W dolnej części znajduje się apertura, umożliwiająca wprowadzenie wiązki światła laserowego do chipa. a) b) c) Rys. 7. Moduł chipa: a) schemat funkcjonalny, b) schemat przekroju, c) widok Przed analizą kanały chipa są wypełniane żelem, a do zbiorniczków cieczowych modułu wprowadzany jest bufor elektroforetyczny. Gotowy do pracy moduł umieszczany jest w stacji dokującej, gdzie wykonywane są dalsze etapy analizy. Po zakończeniu procesu, bufor i żel są usuwane, a kanały i zbiorniczki przepłukiwane kolejno alkoholem i wodą dejonizowaną. Po osuszeniu modułu chip jest zregenerowany i gotowy do ponownego użycia. Przygotowanie chipa do pracy oraz jego regeneracja wykonywane są z wykorzystaniem pipet laboratoryjnych, tipsów oraz pompki (Rys. 8a). Pipety umożliwiają pobranie i dozowanie precyzyjnie odmierzonej objętości cieczy. Na stanowisku dostępne są pipety przeznaczone na zakres -0 µl oraz 0-00 µl. Każda pipeta wyposażona jest w pokrętło nastawy dozy, wskaźnik nastawy, spust oraz tłoczek, pracujący na dwóch poziomach (Rys. 8b). 4
a) b) Rys. 8. Akcesoria do przygotowania chipa: a) stanowisko, b) pipety Procedura pobierania cieczy pipetą:. ostrożnie ustawić pokrętłem wymaganą objętość (nie przekraczać skrajnych wartości!), 2. założyć na pipetę odpowiednią końcówkę (tzw. tipsa), 3. wcisnąć tłoczek do poziomu, aby wypuścić powietrze, 4. zanurzyć tipsa pionowo w cieczy i pierwszego zwolnić tłoczek, 5. poczekać, aż poziom cieczy w tipsie przestanie podnosić się; wyjąć tipsa z cieczy. Procedura dozowania cieczy pipetą:. ustawić tipsa pionowo nad miejscem dozowania i wcisnąć tłoczek do drugiego poziomu, 2. po opróżnieniu tipsa, usunąć go do pojemnika na zużyte tipsy (użyć spustu na pipecie). Stacja dokująca i aplikacja sterująca Stacja dokująca jest urządzeniem mechatronicznym, zawierającym wszystkie mechaniczne, elektryczne i optyczne podzespoły instrumentu, niezbędne do przeprowadzenia analizy w chipie do elektroforezy (Rys. 9). Obsługa stacji dokującej ogranicza się do prawidłowego ustawienia głowicy pomiarowej, zawierającej detektor fluorymetryczny i elektrody drutowe do zasilania chipa. W pokrywie stacji umieszczony jest wyłącznik bezpieczeństwa. Rys. 9. Stacja dokująca Pracą stacji dokującej zarządza komputer z dedykowanym oprogramowaniem. Aplikacja sterująca jest wyposażona w graficzny interfejs użytkownika i zawiera opis wszystkich czynności niezbędnych do obsługi instrumentu i przygotowania chipa, w formie tekstowej oraz zdjęć i animacji. Po uruchomieniu aplikacji widoczny jest ekran startowy z Menu (Rys. 0a), a dalsza obsługa sprowadza się do wyboru odpowiednich poleceń zgodnie 5
z instrukcjami na ekranie. Aplikacja steruje pracą chipa (zasilaniem, temperaturą) zgodnie z wybranymi przez użytkownika programami, przetwarza sygnały pomiarowe oraz prezentuje i zapisuje w plikach wynikowych sygnały wyjściowe. Ekran analizy przedstawia m.in. schemat chipa i nastawy napięcia zasilającego, podgląd obszaru detekcji oraz charakterystyki pomiarowe temperatury i sygnału fluorescencji (Rys. 0b). a) b) Rys. 0. Aplikacja sterująca: a) ekran startowy z Menu, b) ekran analizy Przebieg ćwiczenia Przed wykonaniem ćwiczenia: proszę dobrze zapoznać się z instrukcją (wprowadzenie, opis stanowiska), przed użyciem pipet proszę zapoznać się z ich obsługą, pracę z odczynnikami należy wykonywać zawsze w rękawiczkach ochronnych, pliki wynikowe, potrzebne do realizacji sprawozdania, będzie można przesłać na adres mailowy po zakończeniu ćwiczenia; zaleca się jednak przyniesienie na zajęcia nośnika pamięci USB (np. pendrive) z ok. 20 MB wolnego miejsca i skopiowanie tych plików. W razie wątpliwości należy zawsze poprosić o pomoc Prowadzącego. Wykonanie ćwiczenia:. Włączyć komputer i zalogować się na konto Student. 2. Uruchomić aplikację Elektroforeza (ikona na pulpicie) i poczekać aż pojawi się Menu. 3. Wybrać Przygotowanie instrumentu, zapoznać się z Wprowadzeniem, a następnie przeprowadzić Uruchomienie instrumentu. Wrócić do Menu. 4. Wybrać Przygotowanie chipa i wykonać kolejno czynności: Wprowadzenie żelu, Wprowadzenie buforu, Umieszczenie chipa w stacji dokującej. Wrócić do Menu 5. Wybrać Analiza i kolejno: program sterowania zasilaniem i program nastaw temperatury. Wybór programów uzgodnić z Prowadzącym i zanotować ich parametry. 6. Wprowadzić próbkę do chipa i opuścić głowicę pomiarową, zgodnie z instrukcjami na ekranie, a następnie przejść do ekranu analizy. 7. Wcisnąć START i poczekać na zakończenie analizy. Wrócić do Menu. 8. Przeprowadzić Regenerację chipa. Upewnić się czy żel został usunięty z kanałów. 9. Jeśli wykonywana będzie kolejna analiza, wrócić do pkt. 4. W przeciwnym razie wybrać Wyłączenie instrumentu i postępować zgodnie z instrukcjami. 0. Skopiować pliki wynikowe z folderu WYNIKI na pulpicie. Wyłączyć komputer. 6
Po wykonaniu ćwiczenia: przetworzyć pliki wynikowe w arkuszu kalkulacyjnym i przygotować czytelne elektroferogramy przeprowadzonych analiz (opisać i wyskalować osie), wyznaczyć dla każdego piku: czas migracji t M, wysokość H, szerokość połówkową W H i sprawność separacji N. w sprawozdaniu przedstawić elektroferogramy wykonanych analiz oraz tabelę zbiorczą parametrów wg schematu: Nr analizy Program sterowania zasilaniem Nr dozowanie: czas, U d, U z separacja: czas, U d, U s Program nastaw temperatury Nr dozowanie: 25 C separacja: 25 C 2 Nr piku 2 U d napięcie w kanale dozowania, U z napięcie zaciskające, U s napięcie w kanale separacji Przykładowe pytania Co to jest elektroforeza i gdzie znajduje zastosowanie? Na czym polega analiza materiału genetycznego metodą elektroforezy żelowej? Porównaj urządzenia do elektroforezy płytowej i lab-on-a-chip. Narysuj schemat funkcjonalny i opisz zasadę działania chipa do elektroforezy. Literatura. Jan A. Dziuban, Technologia i zastosowanie mikromechanicznych struktur krzemowych i krzemowo-szklanych w technice mikrosystemów, Oficyna Wydawnicza Politechniki Wrocławskiej, Wrocław 2004 2. W. Kubicki, R. Walczak, J. Dziuban, Injection, separation and fluorimetric detection of DNA in glass lab-on-a-chip for capillary electrophoresis, Optica Applicata (20) 4:409-46 3. Publikacje na temat elektroforetycznej analizy lab-on-a-chip n n t M [s] H [-] W H [s] N [pt] 7