TOM XXXI ROŚLINY OLEISTE OILSEED CROPS 2010 Alina Liersch, Krystyna Krótka, Iwona Bartkowiak-Broda Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin PIB, Oddział w Poznaniu Możliwości zastosowania markerów molekularnych w badaniu dystansu genetycznego linii hodowlanych rzepaku ozimego * Possibility of application of molecular markers for the assessment of genetic diversity of oilseed rape breeding lines Słowa kluczowe: rzepak ozimy (Brassica napus L.), markery molekularne, RAPD, AFLP, dystans genetyczny Znajomość ogólnej i specyficznej zdolności kombinacyjnej, pochodzenia, jak również dystansu genetycznego pomaga w wyborze komponentów rodzicielskich mieszańców F 1. Liczne badania wskazują na związek dystansu genetycznego (DG) ocenionego na podstawie markerów molekularnych z efektem heterozji i plonowaniem mieszańców różnych gatunków roślin uprawnych. Celem przeprowadzonych badań było oszacowanie DG za pomocą markerów RAPD i AFLP, porównanie obu systemów markerowych oraz określenie zależności pomiędzy DG obliczonym na podstawie 178 markerów RAPD, 259 markerów AFLP oraz przy niższej liczbie markerów. DG siedmiu linii hodowlanych rzepaku ozimego (linie rodzicielskie mieszańców CMS ogura) otrzymano za pomocą 23 kombinacji starterów AFLP, uzyskując 1026 zamplifikowanych fragmentów, z których polimorficznych było 25,2%. 64 startery RAPD wygenerowały 361 markerów, w tym 49,3% polimorficznych. Dendrogramy utworzono metodą UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Mean analiza skupień metodą średnich połączeń) w oparciu o współczynnik dystansu genetycznego Nei i Li (1979). Dystans genetyczny obliczono dla markerów RAPD, markerów AFLP, dwóch typów markerów łącznie oraz przy niższej liczebności markerów. DG pomiędzy badanymi liniami CMS ogura i liniami restorującymi oceniony na podstawie obu typów markerów łącznie wyniósł od 0,76 do 0,88 oraz od 0,22 do 0,29 dla linii CMS ogura i ich linii dopełniających. Uzyskane wyniki wykazały statystycznie istotną korelację pomiędzy DG otrzymanym na podstawie 178 markerów (64 starterów) RAPD i 259 markerów (23 kombinacje starterów) AFLP, jak również przy niższej liczbie markerów. Dendrogramy utworzone na podstawie różnej liczby markerów RAPD, AFLP oraz łącznie RAPD + AFLP umieszczają badane genotypy w podobnym układzie. Key words: oilseed rape (Brassica napus L.), molecular markers, RAPD, AFLP, genetic distance The knowledge of general and specific combining ability, information about pedigree as well as genetic distance help in selection of parental forms for F 1 hybrids. The relationship of molecular markers diversity of parental lines of F 1 hybrids with heterosis effect and yielding ability of hybrids * Badania molekularne genotypów pochodzących z HR Strzelce Sp. z o.o., Oddział w Borowie zostały sfinansowane przez Ministerstwo Rolnictwa i Rozwoju Wsi w ramach realizacji programu Postęp biologiczny w produkcji roślinnej, 4-2-01-4-01
212 Alina Liersch... has been examined in numerous studies for different crop plants. The aim of this study was: to assess genetic distance (GD) based on RAPD and AFLP markers, to compare and to evaluate the relationship of GD estimated by two molecular techniques using 178 RAPD and 259 AFLP markers and also using the lower number of molecular markers. Genetic distance of 7 oilseed rape breeding lines (parental lines of CMS ogura hybrids) was estimated using 23 AFLP primer combinations and 64 RAPD primers. AFLP primer combinations generated 1026 bands, of which 25.2% were polymorphic and RAPD primers generated 361 bands, of which 49.3% were polymorphic. The UPGMA (Unweighted Pair Group Method of Arithmetic Mean) method was used to construct dendrograms based on the Nei and Li (1979) diversity coefficient. Genetic distance was computed separately for RAPD, for AFLP markers and for two marker types together and also for different numbers of markers. The genetic distance between investigated CMS ogura and restorer lines ranged from 0.76 to 0.88 and from 0.22 to 0.29 for CMS ogura and maintainers lines. The obtained results revealed statistically significant correlation between GD estimated by 178 RAPD markers (64 primers) and 259 AFLP markers (23 primer combinations) but also for lower number of the RAPD and AFLP markers. Dendrograms based on GD values evaluated on the basis of RAPD markers, AFLP markers, the both types of markers as well as using different number of the markers placed the investigated genotypes in similar arrangement. Wstęp Markery DNA znalazły szerokie zastosowanie w wielu obszarach nauk przyrodniczych, zarówno w badaniach podstawowych jak również w programach hodowlanych. Ze względu na wysoki poziom polimorfizmu markerów DNA takich jak: RFLP (Restriction Fragment Lenght Polymorphism polimorfizm długości restrykcyjnego fragmentu), RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA losowo amplifikowany polimorficzny DNA), AFLP (Amplified Fragments Lenght Polymorphism polimorfizm długości amplifikowanego fragmentu), SSR (Simple-Sequence Repeats markery mikrosatelitarne) czy SNP (Single Nucleotid Polymorphism polimorfizm pojedynczego nukleotydu), wykorzystuje się je w analizie genomów roślinnych. Stosowane są między innymi do charakterystyki zmienności materiałów kolekcyjnych (Negi i in. 2004, Hasan i in. 2006), identyfikacji odmian (Law i in. 1998, Lombard i in. 2002), poszukiwania sprzężeń markerów z cechami ważnymi z agronomicznego punktu widzenia (Brunel i in. 1999, Snowdon i in. 2004, Collard i in. 2005, Javidfar i in. 2006, Asghari i in. 2008, Xu i in. 2008) czy tworzenia genetycznych i fizycznych map genomów (Lombard i Delourme 2001, Babula i in. 2003, Piquemal i in. 2005; Zhao i in. 2006, Bernardo 2008, Lu i in. 2008). Podobieństwo bądź zróżnicowanie genetyczne można określić na podstawie genealogii danego obiektu i informacji o pochodzeniu geograficznym, ale także analizy statystycznej danych uzyskanych z obserwacji fenotypowych oraz wyników badań molekularnych (Lefort-Buson i in. 1988). W badaniach zmienności genetycznej licznych gatunków roślin, w tym także roślin z rodzaju Brassica, stosuje się markery genetyczne wykorzystujące polimorfizm sekwencji nukleo-
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 213 tydowych łańcucha DNA. Takie badania przeprowadził Becker i in. (1995) w analizie zmienności genetycznej w obrębie odmian i linii resyntetyzowanych rzepaku ozimego. Lombard i in. (2000) za pomocą markerów AFLP scharakteryzowali odmiany rzepaku ozimego i określili ich genetyczne podobieństwo. Natomiast Seyis i in. (2003), również przy użyciu metody AFLP, zbadali nowe syntetyczne linie rzepaku oraz porównali z odmianami rzepaku jarego. Celem niniejszej pracy było porównanie przydatności dwóch technik molekularnych RAPD i AFLP do analizy dystansu genetycznego linii rzepaku ozimego oraz określenie liczebności markerów umożliwiających wystarczająco dokładne oszacowanie dystansu genetycznego. Materiał i metody Materiał do badań stanowiły linie hodowlane służące do tworzenia mieszańców F 1 CMS ogura rzepaku ozimego: trzy linie męskosterylne CMS ogura (62 MS, 65 MS, 69 MS), ich linie dopełniające (odpowiednio 62a, 65a, 69a) oraz jedna linia restorująca dla tego systemu (RR 110RJ-4-103). Męskosterylne linie CMS ogura, ich linie dopełniające oraz linia restorująca zostały wyselekcjonowane w Spółce HR Strzelce Oddział w Borowie. Markery RAPD Izolację całkowitego DNA dla każdej linii wykonano według zmodyfikowanej metody Doyle & Doyle (1990) z CTAB. Próby DNA sprawdzano pod względem jakości oraz stężenia na 0,8% żelu agarozowym w buforze TBE, stosując jako wzorzec DNA faga Lambda (λ) (stężenie 10 ng µl -1 MBI Fermentas). Analizę RAPD przeprowadzono zgodnie z metodą opracowaną przez Williams a i in. (1990) z zastosowaniem 64 10-nukleotydowych starterów (OPA-01, OPA-07, OPA-08, OPA-09, OPA-11, OPA-14, OPA-15, OPA-16, OPA-18, OPC-02, OPC- 04, OPC-09, OPC-15, OPC-18, OPD-08, OPF-01, OPF-04, OPF-06, OPF-09, OPF-14, OPF-15, OPF-20, OPG-03, OPG-04, OPG-05, OPG-11, OPG-12, OPG- 13, OPG-14, OPG-15, OPJ-07, OPK-08, OPL-12, OPN-01, OPN-02, OPN-07, OPN-13, OPN-18, OPN-20, OPP-03, OPP-05, OPP-07, OPP-08, OPP-09, OPP-11, OPP-14, OPW-02, OPW-03, OPW-05, OPW-08, OPW-09, OPW-11, OPW-13, OPW-15, OPW-19, OPW-20, OPV-07, OPY-01, OPY-02, OPY-04, OPY-05, OPY-10, OPY-13, OPY-15 Operon Technologies). Amplifikację DNA prowadzono z zastosowaniem reakcji PCR w termocyklerze Mastercykler gradient firmy Eppendorf. Produkty amplifikacji analizowano na 1,8% żelach agarozowych za pomocą elektroforezy w buforze TBE, wybarwiano w roztworze bromku etydyny (10 mg ml -1 ) i obserwowano w świetle UV. Jako wzorzec wielkości fragmentów zastosowano DNA faga λ hydrolizowany enzymami Hind III i Eco RI (MBI Fermentas).
214 Alina Liersch... Markery AFLP Analizę linii rodzicielskich mieszańców F 1 metodą AFLP wykonano zgodnie z metodyką opisaną przez Vos a i in. (1995). Pierwszy etap metody AFLP to podwójne trawienie genomowego DNA za pomocą enzymów EcoRI oraz MseI. Reakcję prowadzono przez 4 godziny w temperaturze 37 o C w termocyklerze. Proces trawienia enzymami zweryfikowano na 0,8% żelu agarozowym w buforze TBE. Każdą mieszaninę reakcyjną po trawieniu enzymami restrykcyjnymi poddano reakcji ligacji adapterów do fragmentów restrykcyjnych. Każda nowo utworzona mieszanina reakcyjna zawierała obok strawionego DNA, 0,5 U ligazy faga T4 wraz z buforem oraz specjalnie zaprojektowane adaptery do AFLP (Gibco BRL, AFLP Analysis System I). Reakcję prowadzono przez 16,5 godziny w temperaturze 16 o C w termocyklerze Mastercykler gradient firmy Eppendorf. Po ligacji mieszaninę reakcyjną poddano preamplifikacji dodając do mieszaniny reakcyjnej dwa startery o sekwencjach 5 -GACTGCGTACCAATTC-A-3 i 5 -GATGAGTCCTGAGTAA-C-3 zawierające jeden selektywny nukleotyd (Gibco BRL, AFLP Analysis System I). W kolejnym etapie, określanym selektywną amplifikacją, zastosowano 23 kombinacje starterów (Gibco BRL, AFLP starter P. Kit) (tab. 1). Startery typu EcoRI (E) i typu MseI (M) zawierały 3 selektywne nukleotydy nie znakowane radioaktywnie. Produkty reakcji rozdzielano w 13,35% żelu poliakrylamidowym w buforze zawierającym 25 mm Tris i 192 mm glicyny. Żele wybarwiano metodą srebrową za pomocą zestawu Silver Stain (Kucharczyk T.E.). Dystans genetyczny Dystans genetyczny (DG) badanych obiektów oszacowano stosując miarę Nei i Li (1979), wyliczając współczynniki według wzoru: DG AB =1 2N ij /(N i +N j ), gdzie: N ij liczba wspólnych alleli obecnych zarówno w obiekcie A, jak i w obiekcie B, N i liczba alleli obecnych w obiekcie A, N j liczba alleli obecnych w obiekcie B. Dystans genetyczny rozważanych obiektów oszacowano osobno dla różnej liczby losowo wybranych markerów RAPD i AFLP oraz dla obu typów markerów łącznie. Współczynniki DG posłużyły do hierarchicznego grupowania linii metodą Warda, które przedstawiono w formie dendrogramów. Wszystkie obliczenia wykonano korzystając z pakietu statystycznego PHYLIP 3,5 (Felsenstein 1993) oraz systemu STATISTICA 7 (1997).
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 215 Tabela 1 Kombinacje starterów AFLP zastosowane w badaniach dystansu genetycznego 7 linii rzepaku ozimego AFLP primer combinations used for genetic distance analysis of 7 oilseed rape lines Kombinacja starterów Primer combinations Selektywne nukleotydy Selective nucleotides Kombinacja starterów Primer combinations Selektywne nukleotydy Selective nucleotides E1/M1 E-AAC : M-CAA E3/M3 E-ACC : M-CAG E1/M3 E-AAC : M-CAG E3/M6 E-ACC : M-CTC E1/M4 E-AAC : M-CAT E4/M4 E-ACT : M-CAT E1/M5 E-AAC : M-CTA E4/M6 E-ACT : M-CTC E1/M7 E-AAC : M-CTT E4/M7 E-ACT : M-CTT E2/M1 E-AAG : M-CAA E5/M2 E-AGG : M-CAC E2/M2 E-AAG : M-CAC E5/M3 E-AGG : M-CAG E2/M4 E-AAG : M-CAT E5/M4 E-AGG : M-CAT E2/M6 E-AAG : M-CTC E5/M5 E-AGG : M-CTA E2/M7 E-AAG : M-CTT E5/M6 E-AGG : M-CTC E3/M1 E-ACC : M-CAA E6/M7 E-ACA : M-CTT E3/M2 E-ACC : M-CAC * Stała część sekwencji starterów do amplifikacji selektywnej: E-=5'-GACTGCGTACCAATTC-3' (EcoRI starter); M-=5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' (MseI starter). Każdy starter EcoRI i MseI zawiera trzy selektywne nukleotydy na końcu 3' Core sequences for selective amplification were: E-=5'-GACTGCGTACCAATTC-3' (EcoRI primer); M-=5'-GATGAGTCCTGAGTAA-3' (MseI primer). Every primer EcoRI and MseI was designed by adding to the 3' end three randomly selected nucleotides Wyniki Spośród 64 starterów RAPD zastosowanych do badań polimorfizmu, 56 różnicowało DNA badanych linii. Uzyskano 361 produktów amplifikacji. Przy opracowywaniu wyników wzięto pod uwagę tylko te polimorficzne prążki, które były wyraźne. Po odrzuceniu mniej wyraźnych produktów amplifikacji, ostatecznie za różnicujące uznano 178 markerów. Jeden starter generował ponad 3 polimorficzne prążki. Największą liczbę markerów (8) otrzymano w reakcji ze starterem OPN-02, a najmniejszą (1) z następującymi starterami RAPD: OPA-09, OPA-16, OPC-02, OPC-09, OPG-13, OPJ-07, OPN-07, OPP-05, OPW-19, OPV-07, OPY-05. Startery OPA-14, OPC-15, OPF-14, OPF-15, OPG-12, OPN-07, OPW-03, OPW-20 nie różnicowały badanych genotypów (rys. 1). DNA badanych siedmiu linii rzepaku przeanalizowano także 23 kombinacjami starterów do AFLP (Gibco BRL) (AFLP Starter Primer Kit), z których wszystkie wykazały polimorfizm pomiędzy badanymi obiektami (tab. 1). Łącznie uzyskano 1026 produktów amplifikacji, w tym 259 różnicujących (rys. 2). Liczba polimorficznych prążków dla pojedynczej kombinacji starterów wahała się od 2 do 20.
216 Alina Liersch... Rys. 1. Elektroforetyczny rozdział na 1,8% żelu agarozowym produktów reakcji PCR- RAPD z zastosowaniem starterów: a) OPV-07, OPA-08; b) OPD-08, OPF-09. Kolejnymi numerami oznaczono badane linie: 110RJ-4-103 (24), 62a (32), 65a (33), 69a (34), 62 MS (35), 65 MS (36), 69 MS (37), M marker wielkości DNA faga λ hydrolizowany enzymami EcoRI i HindIII; pz pary zasad 1.8% agarose gel electrophoresis of PCR- RAPD products obtained with the use of primers: a) OPV-07, OPA-08; b) OPD-08, OPF-09. Numbers indicate investigated lines: 110RJ-4-103 (24), 62a (32), 65a (33), 69a (34), 62 MS (35), 65 MS (36), 69 MS (37); M molecular size marker DNA phage λ digested with endonucleases EcoRI and HindIII; pz base pairs. W reakcji ze starterami E3/M3 i E5/M6 otrzymano najwięcej polimorficznych prążków 20. Jedna kombinacja średnio generowała 11 polimorficznych prążków. Przykładowe obrazy elektroforetyczne obu typów markerów przedstawiono na rysunkach 1 i 2. Wartości dystansu genetycznego, obliczonego na podstawie stwierdzonego polimorfizmu RAPD (178 markerów), dla poszczególnych linii były wysokie i wyniosły od 0,83 dla kombinacji 62 MS i 110RJ-4-103 do 0,93 dla kombinacji 65 MS i 110RJ-4-103 (tab. 2). Przy zastosowaniu mniejszej liczby markerów wartości dystansu
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 217 M marker wielkości DNA faga φx174 trawione enzymem BsuRI (MBI Fermentas) size marker -φx174 bacteriophage DNA digested with BsuRI enzyme (MBI Fermentas) pz pary zasad base pairs Rys. 2. Wynik analizy AFLP dla starterów: E2/M2, E3/M1, E3/M2 i E3/M3, żel 13,35%; linie oznaczone cyframi badane genotypy rzepaku ozimego: 62a (32), 65a (33), 69a (34) The result of AFLP analysis for E2/M2, E3/M1, E3/M2 and E3/M3, primers, 13.35% gel; lines marked with numbers investigated lines of winter oilseed rape: 62a (32), 65a (33), 69a (34) genetycznego dla poszczególnych kombinacji różniły się tylko nieznacznie. Wartość dystansu genetycznego linii męskosterylnych i linii dopełniających wahała się od 0,03 dla par linii 65 MS i 65a do 0,23 dla 69 MS i 69a. Niska wartość dystansu genetycznego linii męskosterylnych i ich linii dopełniających jest potwierdzeniem wcześniej wykonanych badań charakteryzujących linie CMS ogura i ich linie dopełniające. Liersch i in. (1999) wykazały, że linie CMS ogura już w pokoleniu BC 3 F 1 odnośnie większości cech nie różnią się w sposób istotny od swoich linii dopełniających, tak pod względem cech jakościowych (zawartość tłuszczu i glukozynolanów) jak i fenotypowych. Wartości dystansu genetycznego, obliczonego na podstawie polimorfizmu DNA wykazanego za pomocą 259 polimorficznych markerów AFLP, dla badanych linii rzepaku były również wysokie i wahały się od 0,66 dla pary genotypów 65 MS i 110RJ-4-103 do 0,88 dla linii 69 MS i linii restorera 110RJ-4-103. Natomiast, podobnie jak w przypadku markerów RAPD, uzyskano niskie wartości dystansu genetycznego dla linii męskosterylnych i ich linii dopełniających (0,26 do 0,38) (tab. 3), co potwierdza ich bardzo bliskie pokrewieństwo. Wraz ze wzrostem liczby analizowanych markerów AFLP wartości dystansu genetycznego zmieniały się nieznacznie (tab. 3). W tabeli 4 przedstawiono wartości DG badanych linii ocenione za pomocą markerów RAPD i AFLP łącznie. Otrzymane wyniki były zbliżone do tych uzyskanych za pomocą obu typów markerów oddzielnie. Potwierdzają to wysoce istotne współczynniki korelacji.
Wartości dystansu genetycznego dla 7 linii rzepaku ozimego otrzymane na podstawie markerów RAPD Genetic distance value obtained for 7 lines of winter oilseed rape using RAPD molecular marker system Tabela 2 Linia Line 110RJ-4-103 62a 65a 69a 62 MS 65 MS Liczba markerów Number of markers 84 94 178 84 94 178 84 94 178 84 94 178 84 94 178 84 94 178 110RJ-4-103 62a 0,85 0,81 0,83 65a 0,88 0,96 0,92 0,72 0,81 0,76 69a 0,93 0,71 0,81 0,58 0,48 0,53 0,56 0,63 0,59 62 MS 0,74 0,91 0,83 0,24 0,16 0,2 0,67 0,67 0,67 0,62 0,42 0,51 65 MS 0,90 0,96 0,93 0,69 0,81 0,75 0,06 0,00 0,03 0,58 0,63 0,61 0,65 0,67 0,66 69 MS 0,90 0,83 0,86 0,48 0,57 0,53 0,62 0,69 0,66 0,20 0,25 0,23 0,69 0,57 0,63 0,69 0,69 0,69 Wartości dystansu genetycznego dla 7 linii rzepaku ozimego otrzymane na podstawie markerów AFLP Genetic distance value obtained for 7 lines of winter oilseed rape using AFLP molecular marker system Tabela 3 Linia Line 110RJ-4-103 62a 65a 69a 62 MS 65 MS Liczba markerów Number of markers 100 159 259 100 159 259 100 159 259 100 159 259 100 159 259 100 159 259 110RJ-4-103 62a 0,78 0,88 0,84 65a 0,80 0,69 0,73 0,53 0,54 0,53 69a 0,69 0,91 0,82 0,69 0,54 0,59 0,60 0,60 0,60 62 MS 0,82 0,65 0,71 0,25 0,42 0,35 0,53 0,69 0,62 0,73 0,59 0,64 65 MS 0,63 0,67 0,66 0,76 0,88 0,83 0,33 0,41 0,38 0,80 0,66 0,71 0,60 0,60 0,60 69 MS 0,87 0,89 0,88 0,73 0,66 0,69 0,60 0,53 0,55 0,39 0,19 0,26 0,69 0,54 0,59 0,53 0,63 0,59
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 219 Tabela 4 Wartości dystansu genetycznego dla 7 linii rzepaku ozimego otrzymane na podstawie obu typów markerów RAPD i AFLP Genetic distance value obtained for 7 lines of winter oilseed rape using RAPD and AFLP molecular marker systems Linia Line 110RJ-4-103 62a 65a 69 a 62 MS 65 MS 69 MS 110RJ-4-103 62 a 65a 69a 62 MS 65 MS 0,83 0,80 0,82 0,77 0,76 0,88 437 markerów 437 markers (RAPD + AFLP) 0,62 0,57 0,29 0,80 0,62 0,60 0,64 0,22 0,60 0,59 0,67 0,25 0,62 0,61 0,63 Współczynniki korelacji dystansu genetycznego otrzymanego dla analizowanych typów markerów przedstawiono w tabeli 5. Wskazują one na wysoką, statystycznie istotną korelację (na poziomie α = 0,01) wartości dystansu genetycznego obliczonego na podstawie 178 markerów RAPD i 259 markerów AFLP, r = 0,8036. Podobnie statystycznie istotne korelacje otrzymano dla wartości DG określonego przy różnej liczbie markerów (odpowiednio 84, 94 i 178 markerów RAPD oraz 100, 159 i 259 markerów AFLP). Proste regresji także wskazują na liniową zależność wartości DG otrzymanego za pomocą markerów RAPD i AFLP łącznie (rys. 3a) jak również bez względu na liczbę zastosowanych markerów w badaniach (84, 94 i 178 RAPD; 100, 159 i 259 AFLP) (rys. 3b, c, d). Tabela 5 Współczynniki korelacji pomiędzy wartościami dystansu genetycznego obliczonego za pomocą markerów RAPD i AFLP Correlation coefficients between genetic distance measured using RAPD and AFLP markers Liczba markerów Numbers of markers RAPD 84 1 RAPD 94 0,9118** 1 RAPD 84 RAPD 94 RAPD 178 AFLP 100 AFLP 159 AFLP 259 RAPD 178 0,9722** 0,9826** 1 AFLP 100 0,7426** 0,7133** 0,7415** 1 AFLP 159 0,7923** 0,6913** 0,7524** 0,7210** 1 RAPD178 & AFLP259 AFLP 259 0,8299** 0,7519** 0,8036** 0,8850** 0,9607** 1 RAPD178 & AFLP259 0,9497** 0,9136** 0,9502** 0,8573** 0,9002** 0,9488** 1 ** istotny na poziomie α = 0,01 significant at α = 0.01
220 Alina Liersch... RAPD 178 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 RAPD 178 Przewidywane RAPD 178 0,0 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 AFLP 259 AFLP 259 a) 178 markerów RAPD i 259 markerów AFLP 178 RAPD markers and 259 AFLP markers RAPD 178 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 RAPD 178 Przewidywane RAPD 178 0,0 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 RAPD 84 b) 178 markerów RAPD i 84 markery RAPD 178 RAPD markers and 84 RAPD markers
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 221 AFLP 259 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 AFLP 259 Przewidywane AFLP 259 0,2 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 AFLP 100 c) 259 markerów AFLP i 100 markerów AFLP 259 AFLP markers and 100 AFLP markers AFLP 159 1,0 0,9 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 AFLP 159 Przewidywane AFLP 159 0,1 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 0,9 1,0 RAPD 94 d) 159 markerów AFLP i 94 markery RAPD 159 AFLP markers and 94 RAPD markers Rys. 3a, b, c, d. Liniowa zależność pomiędzy wartościami DG obliczonego na podstawie różnej liczebności markerów RAPD i AFLP Linear regression of coefficients of variance between GD value measured using different numbers of RAPD and AFLP markers
222 Alina Liersch... Utworzone dendrogramy na podstawie różnej liczby markerów RAPD, AFLP i łącznie markerów RAPD + AFLP umieszczają badane genotypy w podobnym układzie. Tworzą się dwie odrębne grupy: (1) linia restorująca 110RJ-4-103 [RR], (2) składająca się z par linia męskosterylna i linia dopełniająca (rys. 4a, b, c). Wraz ze zmianą liczby zastosowanych markerów do obliczenia dystansu genetycznego: 84, 94 i 178 markerów RAPD oraz odpowiednio 100, 159 i 259 markerów AFLP, podstawowy układ dendrogramu nie zmienił się (w pracy nie zamieszczono dendrogramów, które utworzono na podstawie 84 i 94 markerów RAPD oraz 100 i 159 markerów AFLP). Wspólny dendrogram uzyskany na podstawie obydwu metod molekularnych odpowiada dendrogramom otrzymanym dla poszczególnych technik molekularnych oddzielnie (rys. 4c). Zbliżone wartości dystansu genetycznego oraz układ linii rzepaku ozimego w dendrogramie uzyskany na podstawie 84, 94 i 178 markerów RAPD oraz 100, 159 i 259 markerów AFLP wskazują na możliwość poprawnego określenia dystansu genetycznego linii rzepaku przy mniejszej liczbie markerów, a więc mniejszej liczbie użytych starterów. Dyskusja Wybór techniki analizy molekularnej zależy przede wszystkim od celu jej wykonania. W przedstawionych badaniach dotyczących dystansu genetycznego linii rzepaku ozimego zastosowano dwa systemy RAPD i AFLP oparte na łańcuchowej reakcji polimerazy. (Polymerase Chain Reaction PCR). Systemy te różnią się zarówno skutecznością wykrywania polimorfizmu w analizowanym materiale, liczbą wygenerowanych polimorficznych markerów oraz stopniem powtarzalności uzyskanych wyników. Obydwie techniki molekularne obok innych typów markerów, takich jak izoenzymy, RFLP, a także SSR i SNP, były z powodzeniem stosowane w analizie podobieństwa/dystansu genetycznego u Brassicaceae (Saunders i in. 2001, Barth i in. 2002, Negi i in. 2004, Teklewold i Becker 2006, Ofori i in. 2008). W przeprowadzonych badaniach 7 genotypów rzepaku ozimego stosując metodę RAPD wygenerowano 49,3% polimorficznych fragmentów DNA, natomiast w metodzie AFLP 25,2%. We wcześniejszych badaniach Liersch (2005) w analizie 18 linii rodzicielskich mieszańców F 1 CMS ogura otrzymała 61,0% polimorfizmu dla markerów RAPD i 34,5% dla markerów AFLP. Russell i in. (1997) w badaniach zmienności genetycznej w obrębie Hordeum vulgare uzyskali odpowiednio 66,3% polimorfizmu dla techniki RAPD i 46,8% dla AFLP. W przeprowadzonych badaniach dla pojedynczego startera lub kombinacji starterów otrzymano średnio 3 polimorficzne markery RAPD i 11 markerów AFLP. Russell i in. (1997) oraz Simoniuc i in. (2002) potwierdzają, że pomimo iż procent polimorfizmu jest niższy w przypadku markerów AFLP, są one skuteczniejsze w analizie zróżnicowania
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 223 a) b) c) Rys. 4. Dendrogramy dystansu genetycznego 7 linii rzepaku ozimego otrzymanego za pomocą markerów molekularnych RAPD i AFLP Dendrograms of GD 7 lines winter oilseed rape using the RAPD and AFLP marker systems a) 178 markerów RAPD 178 RAPD markers b) 259 markerów AFLP 259 AFLP markers c) 178 markerów RAPD + 259 markerów AFLP 178 RAPD markers + 259 AFLP markers genetycznego ze względu na dużą liczbę wykrywanych polimorficznych fragmentów DNA w pojedynczym genotypie. Matuszczak (2002) wykazał, że metoda AFLP pozwala osiągnąć większą wydajność uzyskiwania markerów dla segregującej populacji linii DH rzepaku ozimego, ponadto charakteryzuje się ona lepszą powtarzalnością w porównaniu z metodą RAPD. Lombard i in. (2000) podkreślili,
224 Alina Liersch... że w badaniach odmian rzepaku ozimego i jarego, technika AFLP wykazuje wyższy poziom polimorfizmu markerów w porównaniu do innych systemów markerowych. Pomimo procentowo niższego poziomu polimorfizmu, system molekularny AFLP pozwala na wykrycie większej liczby polimorficznych loci na pojedynczym żelu, w konsekwencji obserwowanie zmienności wielu markerów przy mniejszej liczbie testowanych starterów. Wolko i in. (1999) porównując kilka systemów markerowych wskazują na niską powtarzalność markerów RAPD w porównaniu z wysoką powtarzalnością markerów AFLP i SSR. Jednakże wydaje się, że 178 markerów RAPD pozwoliło na prawidłowe oszacowanie dystansu genetycznego badanych genotypów. Przy wyborze starterów RAPD i AFLP do analiz kierowano się umieszczeniem i częstością ich występowania na mapie genetycznej rzepaku opracowanej przez Lombard i Delourme (2001). Jednocześnie w metodzie RAPD każdy genotyp analizowano w dwóch powtórzeniach, a pod uwagę brano tylko te markery, których obraz był bardzo wyraźny. Halldén i in. (1994) podkreślili, że wraz ze wzrostem liczby różnicujących markerów w analizie DG następuje obniżenie wariancji w jej ocenie, a prawdopodobieństwo błędu w technice RAPD zależy od liczby polimorficznych markerów. Jones i in. (1997) porównali wyniki analiz molekularnych RAPD, AFLP, SSR według standardowego protokołu, identycznego materiału roślinnego. Wykazali, że najniższą powtarzalnością charakteryzowała się technika RAPD, natomiast markery AFLP i SSR są technikami o bardzo dużym stopniu powtarzalności. W przedstawionej pracy uzyskano wysoką korelację dla wartości dystansu genetycznego 7 genotypów rzepaku ozimego otrzymanego na podstawie markerów RAPD i AFLP (r = 0,80), jak również dla wartości DG obliczonego przy różnej liczebności obu typów markerów zastosowanych w badaniach (tab. 5, rys. 3a, b, c, d). Dos Santos i in. (1994) w badaniach 45 genotypów Brassica oleracea uzyskali korelację wartości podobieństwa genetycznego wyznaczonego na podstawie markerów RFLP i RAPD równą 0,745. Simoniuc i in. (2002) analizując zróżnicowanie genetyczne 21 odmian Pisum sativum stwierdzili wysoką korelację wyników badań markerami RAPD i AFLP (r = 0,79). Również wysokie, istotne statystycznie korelacje pomiędzy wartościami DG dla tropikalnych linii kukurydzy obliczonymi na podstawie markerów RFLP, AFLP i SSR uzyskali Garcia i in. (2004). Dendrogramy otrzymane dla markerów molekularnych RAPD, markerów AFLP i obu typów markerów łącznie są podobne. Nie stwierdzono także istotnych różnic pomiędzy dendrogramami utworzonymi przy różnej liczbie polimorficznych markerów użytych do analiz. W literaturze liczni autorzy badali podobieństwo/dystans genetyczny różnych gatunków roślin uprawnych, a także porównywali dendrogramy otrzymane za pomocą kilku typów markerów molekularnych dla znacznie liczebniejszych populacji niż w prezentowanej pracy. Jain i in. (1994) u gorczycy sarepskiej (Brassica juncea L.) nie obserwowali istotnych różnic między dendrogramami otrzymanymi za pomocą markerów RAPD na podstawie różnej liczby
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 225 produktów amplifikacji (200, 300 oraz 595). Dos Santos i in. (1994) w badaniach genotypów Brassica oleracea stwierdzili, że dendrogramy utworzone za pomocą markerów RAPD i RFLP wykazywały pewne różnice. Nakajima i in. (1998) w badaniach marchwi (Daucus carota L.) oraz Simoniuc i in. (2002) u grochu (Pisum sativum L.) wykazali także różnice w przyporządkowaniu analizowanych genotypów na dendrogramach otrzymanych za pomocą markerów RAPD i AFLP. Autorzy wskazują ponadto, że przyczyną różnic w dendrogramach otrzymanych za pomocą markerów AFLP i RAPD jest sposób analizowania genomu. Markery AFLP oparte są na enzymach restrykcyjnych, a w związku z tym generują polimorficzne fragmenty DNA w innych partiach genomu niż markery typu RAPD. Natomiast według cytowanych autorów dendrogram oparty łącznie na markerach RAPD i AFLP wykazuje największą zgodność z genealogią analizowanego materiału. Otrzymane w pracy wyniki badań nad oceną dystansu genetycznego linii hodowlanych rzepaku ozimego są zbieżne z uzyskanymi przez innych autorów dla różnych gatunków roślin i wskazują na przydatność do tego typu badań zarówno metody RAPD jak i AFLP. Wnioski Badania wykazały możliwość zastosowania obydwu typów (RAPD i AFLP) markerów molekularnych do analiz zmienności genetycznej linii rzepaku ozimego. Opisane w pracy typy markerów charakteryzują się dobrym poziomem polimorfizmu i powtarzalnością wyników. Otrzymane wysokie współczynniki korelacji wykazały, że istnieje istotna zbieżność pomiędzy wartościami dystansu genetycznego obliczonego na podstawie markerów RAPD i AFLP, jak również możliwe jest wykonanie prawidłowej oceny DG przy niższej liczebności markerów, zarówno RAPD jak i AFLP. Uzyskane wyniki mogą być wykorzystane przez hodowców, ułatwiając im dokonanie wyboru rodzaju i liczby markerów pozwalających na ocenę dystansu genetycznego pomiędzy liniami hodowlanymi rzepaku.
226 Alina Liersch... Literatura Asghari A., Mohammadi S.A., Moghaddam M., Shokuhiam A.A. 2008. Identification of SSR and RAPD markers associated with QTLs of winter survival and related traits in Brassica napus L. African Journal of Biotechnology, 7: 897-903. Babula D., Kaczmarek M., Barakat A., Delseney M., Quiros C.F., Sadowski J. 2003. Chromosomal mapping of Brassica oleracea based on ESTs from Arabidopsis thaliana complexity of the comparative map. Mol. Genet. Genomics, 268: 656-665. Barth S., Melchinger A.E., Lübberstedt T.H. 2002. Genetic diversity in Arabidopsis thaliana L. Heynh. Investigated by cleaved amplified polymorphic sequence (CAPS) and inter-simple sequence repeat (ISSR) markers. Molecular Ecology, 11: 495-505. Becker H., Engqvist G.M., Karlsson B. 1995. Comparison of rapeseed cultivars and resynthesized line based on allozyme and RFLP markers. Theor. Appl. Genet., 91: 62-67. Bernardo R. 2008. Molecular markers and selection for complex traits in plants: Learning from the last 20 years. Crop Science, 48: 1649-1664. Brunel D., Froger N., Pelletier G. 1999. Development of amplified consensus genetic markers (ACGM) in Brassica napus from Arabidopsis thaliana sequences of known biological function. Genome, 42: 387-402. Collard B.C.Y., Jahufer M.Z.Z., Brouwer J.B., Pang E.C.K. 2005. An introduction to markers, quantitative trait loci (QTL) mapping and marker-assisted selection for crop improvement: The basic concepts. Euphytica, 142: 169-196. Dos Santos J.B., Nienhuis P., Skroch J., Tivang J., Slocum M.K. 1994. Comparison of RAPD and RFLP genetics markers in determining genetic similarity among Brassica oleracea L. genotypes. Theor. Appl. Genet., 87: 909-915. Doyle J.J., Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus, 12: 13-15. Felsenstein J. 1993. PHYLIP (Phylogeny Inference Package) version 3.5c. Distributed by the author. Department of Genetics, University of Washington, Seattle. Garcia A.A.F., Benchimol L.L., Barbosa A.M.M., Geraldi I.O., Souza Jr. C.L., de Souza A.P. 2004. Comparison of RAPD, RFLP, AFLP, and SSR markers for diversity studies in tropical maize inbred lines. Genetic and Mol. Biology, 27, 4: 579-588. Halldén C., Nilsson N-O., Rading I.M., Säll T. 1994. Evaluation of RFLP and RAPD markers in a comparison of Brassica napus breeding lines. Theor. Appl. Genet., 88: 123-128. Hasan M., Seyis F., Badani A.G., Pons-Kühnemann., Friedt W., Lühs and Snowdon R.J. 2006. Analysis of genetic diversity in the Brassica napus L. gene pool using SSR markers. Genetic Resources and Crop Evolution, 53 (4): 793-802. Jain A., Bhatia S., Banga S.S., Prakash S., Lakshmikumaran M. 1994. Potential use of random amplified polymorphic DNA (RAPD) technique to study the genetic diversity in Indian mustard (Brassica juncea) and its relationship to heterosis. Theor. Appl. Genet., 88: 123-128. Javidfar F., Ripley V.L., Roslinsky V., Zeinali H., Abdmishani C. 2006. Identification of molecular markers associated with oleic and linolenic acid in spring oilseed rape (Brassica napus). Plant Breeding, 125: 65-71. Jones C.J., Edwards K.J., Castaglione S., Winfield M.O., et all. 1997. Reproducibility testing of RAPD, AFLP and SSR markers in plants by a network of European laboratories. Molecular Breeding, 3: 381-390.
Możliwości zastosowania markerów molekularnych... 227 Law J.R., Donini P., Koebner R.M.D., Reeves J.C., Cooke R.J. 1998. DNA profiling and plant variety registration. III: The statistical assessment of distinctness in wheat using amplified fragment length polymorphisms. Euphytica, 102: 335-342. Lefort-Buson M., Hebert Y., Damerval C. 1988. Les outils d' évaluation de la divérsité génétique et phénotypique. Agronomie, 8 (3): 173-178. Liersch A. 2005. Wpływ zmienności genetycznej na efekt heterozji u rzepaku ozimego (Brassica napus L. var. oleifera). Rozprawa doktorska, Instytut Hodowli i Aklimatyzacji Roślin, Poznań. Liersch A., Bartkowiak-Broda I., Krótka K. 1999. Charakterystyka linii CMS ogura rzepaku ozimego i ich linii rekurencyjnych. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XX (2): 311-324. Lombard V., Baril C.P., Dubreuil P., Blouet F., Zhang D. 2000. Genetic relationships and fingerprinting of rapeseed cultivars by AFLP. Crop Sci., 40: 1417-1425. Lombard V., Delourme R. 2001. A consensus linkage map for rapeseed (Brassica napus L.): construction and integration of three individual maps from DH populations Theor. Appl. Genet., 103: 491-507. Lombard V., Tireau B., Blouet F., Zhang D., Baril C.P. 2002. Usefulness of AFLP markers to estimate varietal homogeneity of rapeseed inbred line varieties in the context of plant registration and protection. Euphytica, 125: 121-127. Lu G., Cao J., Yu X., Xiang X., Chen H. 2008. Mapping QTLs for root morphological traits in Brassica rapa L. based on AFLP and RAPD markers. J. Appl. Genet., 49 (1): 23-31. Matuszczak M. 2002 Zastosowanie metody AFLP do analizy DNA rzepaku ozimego. Rośliny Oleiste Oilseed Crops, XXIII (2): 255-265. Nakajima Y., Oeda K., Yamamoto T. 1998. Characterization of genetic diversity of nuclear and mitochondrial genomes in Daucus varieties by RAPD and AFLP. Plant Cell. Reports, 17: 848-853. Negi M.S., Sabharwal V., Bhat S.R., Lakshmikumaran M. 2004. Utility of AFLP for the assessment of genetic diversity within Brassica nigra germplasm. Plant Breeding, 123: 13-16. Nei M., Li W. 1979. Mathematical model for studying genetic variation in terms of restriction endonucleases. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 76: 5256-5273. Ofori A., Becker H.C., Kopisch-Obuch F.J. 2008. Effect of crop improvement on genetic diversity in oilseed Brassica rapa (turnip rape) cultivars, detected by SSR markers. J. Appl. Genet., 49 (3): 207-212. Piquemal J., Cinquin E., Couton F., Rondeau C., Seignoret E., Doucet I., Perret D., Villeger M.J., Vincourt P., Blanchard P. 2005. Construction of an oilseed rape (Brassica napus L.) genetic map with SSR markers. Theor. Appl. Genet., 111: 1514-1523. Russell J.R., Fuller J.D., Macaulay M., Hatz B.G., Jahoor A., Powell W., Waugh R. 1997. Direct comparison of levels of genetic variation among barley accessions detected by RFLPs, AFLPs, SSRs and RAPDs. Theor. Appl. Genet., 95: 714-722. Saunders J.A., Pedroni M.J., Penrose L.D.J., Fist A.J. 2001. AFLP analysis of opium poppy. Crop Sci., 41: 1596-1601. Seyis F., Snowdon R.J., Lühs W., Friedt W. 2003. Molecular characterisation of novel resynthesised rapeseed (B. napus L.) lines and analysis of their genetic diversity in comparison to spring rapeseed cultivars. Plant Breeding, 122: 473-478. Simoniuc D., Uptmoor R., Friedt W., Ordon F. 2002. Genetic diversity and relationships among pea cultivars revealed by RAPDs and AFLPs. Plant Breeding, 121: 429-435. Snowdon R.J., Friedt W. 2004. Molecular markers in Brassica oilseed breeding: current status and future possibilities. Plant Breeding, 123: 1-8.
228 Alina Liersch... Stanisz A. 2007. Przystępny kurs statystyki. Analizy wielowymiarowe. StatSoft, tom 3, Kraków. Teklewold A., Becker H.C. 2006. Comparison of phenotypic and molecular distances to predict heterosis and F 1 performance in Ethiopian mustard (Brassica carinata A. Braun). Theor. Appl. Genet., 112: 752-759. Vos P., Hogers R., Sleeker M., Reijans M., Lee T., Homes M., Freiters A., Pot J., Peleman J., Kuiper M., Zabeau M. 1995. AFLP: a new concept for DNA fingerprinting. Nucl. Acids Res., 23: 4404-4414. Williams J.G.K., Kubelik A.R., Livak K.J., Rafalski J.A., Tingey S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucl. Acids Res., 18: 6531-6535. Wolko B., Irzykowska L., Święcicki W.K. 1999. AFLP i SSR systemy markerowe przydatne w hodowli roślin. Postępy Nauk Rolniczych, 2: 59-71. Xu Y., Crouch J.H. 2008. Marker assisted selection in plant breeding: from publications to practice. Crop Science, 48: 391-407. Zhao J., Becker H.C., Zhang D., Zhang Y., Ecke W. 2006. Conditional QTL mapping of oil content in rapeseed with respect to protein content and traits related to plant development and grain yield. Theor. Appl. Genet., 113: 33-38.