1 Wpływ cytokinin i rodzaju eksplantatu na efektywność organogenezy pędowej lnu w różnych warunkach świetlnych kultury in vitro

1 Wpływ cytokinin i rodzaju eksplantatu na efektywność organogenezy pędowej lnu w różnych warunkach świetlnych kultury in vitro Streszczenie Aneta Adamczuk / Irena Siegień / Iwona Ciereszko Uniwersytet w Białymstoku, Wydział Biologiczno-Chemiczny Instytut Biologii, Zakład Fizjologii Roślin ul. Świerkowa 20B, 15-950 Białystok e-mail: aneta.baran5@wp.pl Badano wpływ wybranych cytokinin, rodzaju eksplantatu oraz jakości i natężenia światła na organogenezę pędową lnu (Linum usitatissimum L., odm. Szafir). Badania pokazały, że kaulogeneza indukowana na fragmentach hipokotyli była efektywniejsza niż na eksplantatach liścieni. W kulturach wyprowadzonych z bazalnych fragmentów liścieni, organogeneza była istotnie większa niż w przypadku eksplantatów pochodzących z ich części środkowej. Natomiast apikalne fragmenty liścieni (w stworzonych warunkach kultury) nie były zdolne do formowania pąków przybyszowych. Spośród przetestowanych cytokinin benzyloaminopuryna (BA) była najskuteczniejsza w indukowaniu kaulogenezy pędowej. W obecności tej cytokininy 100% eksplantatów było zdolnych do formowania pąków ze średnią liczbą około 12-16 sztuk na eksplantat pochodzący ze środkowej części hipokotyla. Najefektywniejszą regenerację pędów uzyskano w kulturach utrzymywanych w obecności światła białego, przy natężeniu wyższym niż 20 µmol m -2 s -1 (100% eksplantatów reagujących; średnia liczba pędów 12). Wyniki dotyczące wpływu promieniowania monochromatycznego na kaulogenezę sugerują, że regeneracji sprzyjało promieniowanie w zakresie niebieskim. Słowa kluczowe: cytokininy, eksplantat, kaulogeneza, promieniowanie monochromatyczne. Różnorodność biologiczna od komórki do ekosystemu. Zagrożenia środowiska a ochrona gatunkowa roślin i grzybów 11

1.1. Wstęp Len zwyczajny (Linum usitatissimum L.) stanowi cenne źródło oleju i włókien wykorzystywanych w wielu gałęziach przemysłu. Ze względu na posiadane właściwości terapeutyczne, w ostatnich latach roślina ta stała się obiektem manipulacji genetycznych w celu poprawy jej wartości odżywczych czy odporności na czynniki chorobotwórcze (Czemplik, Szopa 2009). Organogeneza w kulturach in vitro, wyrażona liczbą powstałych pędów, jest ważnym czynnikiem decydującym o powodzeniu doświadczeń związanych z transformacją roślin. Pomimo, iż badania kultur in vitro lnu trwają od ponad 30. lat, jednak nadal niewiele wiadomo o mechanizmach kontrolujących organo- i embriogenezę tego gatunku (Dedičová i in. 2000). Kierunek morfogenezy w kulturach in vitro uzależniony jest w dużym stopniu od rodzaju zastosowanych hormonów, jak też współdziałania między nimi. Koordynując wiele procesów, fitohormony mogą działać niezależnie od siebie, bądź też wzajemnie wzmacniać lub eliminować swoje efekty. Regulatorami wzrostu niezbędnymi do zainicjowania merystemów pędowych w kulturach in vitro są cytokininy (Adamczuk i in. 2012). Stosowane są zarówno cytokininy naturalne m.in. 2-izopentyloadenina (2iP), jak i syntetyczne BA. Spośród cytokinin mocznikowych w największym stopniu wykorzystywany jest tidiazuron (TDZ). Konsekwencją działania TDZ na fragmenty hipokotyli lnu było indukowanie organogenezy pędowej (Gairi, Rashid 2002). Najlepsze zdolności formowania pędów na eksplantatach liścieni i hipokotyli dwóch odmian lnu (Modran i Selena) zaobserwowano natomiast na pożywkach z dodatkiem BA (Janowicz, Wojciechowski 2009). Z drugiej strony, badania Bretagne i in. (1994) wykazały, że kaulogeneza pędowa indukowana na hipokotylach lnu zachodzi intensywniej w obecności TDZ niż BA. Burbulis i in. (2005) wskazują na to, iż liczba pędów indukowanych na kalusie jest ściśle uzależniona od składu pożywki i genotypu roślin. W regeneracji wielu gatunków roślin w warunkach in vitro wykorzystywane są najczęściej eksplantaty hipokotylowe (Tavano i in. 2009). Liścienie rozwijających się młodocianych siewek mogą być czasami również odpowiednim źródłem eksplantatów, ze względu na wysoki poziom endogennych hormonów oraz zawartość związków zapasowych (Kusnetsov i in. 1994; Wilhemova i in. 2004). Wyniki wieloletnich badań nad lnem wskazują jednak na brak organogenezy pędowej na eksplantatach liścieni w warunkach in vitro (Bretagne i in. 1994), w odróżnieniu od efektywnej kaulogenezy z fragmentów hipokotyli (Yildiz i in. 2010). W ostatnich latach udało się stworzyć warunki umożliwiające kaulogenezę pędową na fragmentach liścieni w przypadku lnu włóknistego, chociaż wydajność tego procesu była niewielka (Belonogova, Raldugina 2006). 12

Światło, jako jeden z najważniejszych czynników środowiskowych, warunkujących wzrost i rozwój roślin, oddziałuje również na procesy morfogenetyczne w kulturach in vitro. Jakość i intensywność światła wpływa między innymi na formowanie i namnażanie pędów, anatomię i wielkość liścia czy na proces ryzogenezy w kulturach różnych gatunków roślin (Reuveni, Evenor 2007). W warunkach in vitro, analogicznie do warunków naturalnych, najbardziej efektywnym jest światło fotosyntetycznie aktywne (400-700 nm). U woskownicy europejskiej (Myrica gale L.) wysoka intensywność światła indukowała wytwarzanie oraz wydłużanie korzeni, jak również miała stymulujący wpływ na masę i długość pędów (Tavares i in. 1998). Natomiast w przypadku eksplantatów korzeni czosnku pospolitego (Allinum sativum L.), indukcję i proliferację kalusa warunkuje zupełny brak światła, natomiast światło ma stymulujący wpływ na organogenezę pędową (Martín-Urdíroz i in. 2004). Światło białe, czerwień i daleka czerwień wpływają stymulująco na kaulogenezę dzikiej odmiany pomidora (Lycopersicon esculentum Mill.), zaś doświetlanie światłem niebieskim powoduje spadek zdolności regeneracyjnej (Bertram, Lercari 2000). Poszukiwanie czynników usprawniających regenerację roślin w kulturach in vitro należy do aktualnych problemów badawczych, ponieważ prowadzi to do podwyższenia wydajności mikrorozmnażania wielu gatunków wykorzystywanych do różnych celów w biotechnologii roślin. W badaniach tych brane są pod uwagę uwarunkowania zewnętrzne, w których kultury są prowadzone, jak też predyspozycje samej rośliny, lub jej poszczególnych organów będących potencjalnym źródłem eksplantatów. Celem prezentowanej pracy było określenie wpływu wybranych cytokinin, rodzaju eksplantatu oraz jakości i natężenia światła na proces kaulogenezy lnu w warunkach in vitro. 1.2. Materiał i metody Przedmiotem badań były kultury pędowe lnu zwyczajnego (Linum usitatissimum L., typ oleisty, odm. Szafir), wyprowadzone z eksplantatów liścieni, lub hipokotyli 5-dniowych siewek, rosnące w warunkach in vitro. Nasiona lnu, otrzymane ze Stacji Hodowli Roślin w Strzelcach (woj. łódzkie) sterylizowano w 0,1% roztworze chlorku rtęci (HgCl 2 ) przez 15 minut i wykładano na szalki Petriego na podłoże agarowe 0,75% (w/v). Szalki z nasionami pozostawiano do wzrostu w kontrolowanych warunkach fitotronowych (Siegień i in. 2013). Sposób pobierania eksplantatów ze sterylnych liścieni i hipokotyli przedstawiono na Ryc. 1.1. 13

Rycina 1.1. Schematyczne przedstawienie pochodzenia badanych w pracy eksplantatów hipokotyla (a) i liścienia (b) siewki lnu: część apikalna (A), część środkowa (S), część bazalna (B) Eksplantaty hipokotyli wykładano na szalki Petriego, na pożywkę według Murashige i Skoog (MS) (Murashige, Skoog 1962), eksplananty liścieni natomiast na pożywkę zawierającą makroelementy według MS, mikroelementy i witaminy wg Gamborga (B5) (Gamborg i in. 1968), o ph = 5,7-5,9, do których dodawano 30g l -1 sacharozy i zestalano 0,75% (w/v) agarem. W celu uzyskania efektywnej indukcji pędów do pożywki zawierającej 0,05 mg l -1 kwasu 2,4 dichlorofenoksyoctowego (2,4-D) dodawano różne cytokininy: BA, TDZ i 2iP w stężeniu 1,0 mg l -1. Wpływ natężenia promieniowania oraz promieniowania monochromatycznego na procesy morfogenetyczne zbadano w kulturach wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla. Kultury poddano działaniu światła białego o natężeniu: 0, 20, 50, 90, 180 μmol m -2 s -1. W celu określenia wpływu promieniowania różnej jakości na kaulogenezę, kultury pozostawiono do wzrostu w ciemności (D) oraz w świetle białym (W), a także pod wpływem promieniowania w zakresie niebieskim (B), czerwonym (R), dalekiej czerwieni (FR) każde o natężeniu 50 μmol m -2 s -1. Promieniowanie monochromatyczne uzyskano przez zastosowanie odpowiednich filtrów (Niedźwiedź-Siegień, Lewak 1992): B (λ = 450 nm) filtr niebieski: Scenoroid nr 212; R (λ = 660 nm) filtr czerwony: Scenoroid nr 227; FR (λ = 730 nm) filtr niebieski + filtr czerwony (Coframap, Paris, France). Kultury lnu rosły w pomieszczeniu fitotronowym przez 30 dni w świetle białym, lub pod wpływem różnych jakości światła, w kontrolowanych warunkach (Siegień i in. 2013). Kontrolę stanowiły kultury rosnące w ciemności, umieszczone w pojemnikach uniemożliwiających dostęp światła. Obserwacji kultur dokonywano codziennie, licząc formujące się pędy. Ostatecznej oceny zdolności regeneracyjnych (procent eksplantatów ze zregenerowanymi pędami oraz ilości zregenerowanych pędów na eksplantacie) dokonano po 30 dniach od wyłożenia eksplantatów na pożywki. Oznaczono także świeżą i suchą masę eksplantatów. Każde doświadczenie powtarzano co najmniej dwukrotnie. Otrzymane wyniki porównywano między sobą testem t-studenta przy poziomie istotności p 0,05. Wyniki przedstawiono jako wartości średnie ±SD (odchylenie standardowe). 14

1.3. Wyniki Pędy formowały się zarówno na eksplantatach hipokotyli, jak i liścieni, ale organogeneza była o około 20% wyższa w kulturach wyprowadzonych z hipokotyli. Niezależnie od miejsca pobrania eksplantatu (A, S, B część hipokotyla), kaulogeneza przebiegała podobnie. Obserwowano powstawanie powyżej 10 pędów na eksplantat (Tab. 1.1). W przypadku eksplantatów liścieni, pojedyncze pędy formowały się tylko z części środkowej i bazalnej liścienia (Tab. 1.1). Kultury wyprowadzone ze wszystkich części hipokotyla odznaczały się ponad dwukrotnie niższą świeżą masą w porównaniu do kultur pochodzących z eksplantatów liścieni. Kultury inicjowane z części bazalnych i środkowych liścieni, w których obserwowano organogenezę, charakteryzowały się niższą o około 40% świeżą masą niż kultury z części apikalnych, w których kaulogeneza nie nastąpiła (Tab. 1.1). Tabela 1.1. Efektywność organogenezy pędowej lnu, indukowanej na apikalnej (A), środkowej (S), bazalnej (B) części liścienia i hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce B5 (eksplantaty liścieni) i MS (eksplantaty hipokotyli) z dodatkiem BA 1,0 mg l -1 + 2,4-D 0,05 mg l -1 Rodzaj eksplantatu liścień hipokotyl % reagujących eksplantatów Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Świeża masa Sucha masa A 0 d 0 1577,0 a ± 76,0 70,0 a ± 3,1 S 13 c ± 2,1 7,0 b ± 2,2 1072,3 b ± 174,0 66,0 a ± 6,1 B 88 b ± 1,0 1,7 c ± 0,9 976,3 b ± 167,2 68,0 a ± 12,1 A 100 a 11,8 ab ± 3,0 541,7 c ± 91,5 43,6 a ± 27,2 S 100 a 16,3 a ± 2,8 518,6 c ± 147,1 30,0 b ± 10,4 B 100 a 10,8 b ± 1,4 533,3 c ± 76,0 33,1 b ± 5,3 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Wpływ cytokinin na efektywność kaulogenezy badano wykorzystując eksplantaty liścieni pochodzące z ich środkowej (S) i bazalnej (B) części. W przypadku eksplantatów hipokotyli, do dalszych badań wybrano jego środkowy (S) fragment, gdyż cechował się on największą efektywnością formowania pędów. Pojawianie się pierwszych pędów obserwowano po około 5 dniach od wyłożenia eksplantatów hipokotyli na pożywki we wszystkich wariantach doświadczenia (Tab. 1.2). Procent reagujących eksplantatów, po 30 dniach wzrostu w kulturach wyprowadzonych z fragmentów hipokotyli był podobny, niezależnie od zastosowanego regulatora 15

wzrostu. W obecności TDZ w pożywce, liczba pędów inicjowanych na pojedynczym eksplantacie była niższa niż w przypadku BA i 2iP (Tab. 1.2). Kultury pędowe, rosnące w obecności 2iP były bardziej rozwinięte, ale wykazywały oznaki starzenia (dane nieprzedstawione). Tabela 1.2. Efektywność organogenezy pędowej lnu, indukowanej na środkowej (S) części hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem 2,4-D oraz wybranych cytokinin Cytokininy [1,0 mg l -1 ] Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Początek regeneracji [dni] Świeża masa Sucha masa BA 100 a 11,8 a ± 3,0 5 497,8 b ± 69,5 36,9 ac ± 4,7 TDZ 96,0 a ± 6,4 5,4 b ± 2,2 5 616,6 a ± 25,6 43,3 a ± 3,3 2iP 88,0 b ± 11,0 10,2 a ± 1,3 5 397,9 b ± 41,1 31,1 bc ± 4,2 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Świeża i sucha masa kultur wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla, rosnących w obecności TDZ była wyższa niż w przypadku pozostałych cytokinin (Tab. 1.3). Kaulogenezy nie zaobserwowano na fragmentach liścieni rosnących na pożywce z dodatkiem 2iP (dane nieprzedstawione). Natomiast organogeneza indukowana na bazalnej części liścienia (B) była wyższa o około 90% niż w kulturach wyprowadzonych z jego środkowej (S) części oraz efektywniejsza w obecności BA niż TDZ. Tabela 1.3. Efektywność organogenezy pędowej lnu indukowanej na środkowej (S) i bazalnej (B) części liścienia oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce B5 z dodatkiem 2,4-D oraz wybranych cytokinin Cytokininy [1,0 mg l -1 ] BA TDZ Fragment liścienia Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów /ekspl. [szt.] Początek regeneracji [dni] Świeża masa Sucha masa S 13,0 c ± 2,1 7,0 a ± 2,2 21 1072,3 ac ± 174 66,0 a ± 6,1 B 88,0 a ± 1,0 1,7 b ± 0,9 5 976,3 bc ± 167,2 68,0 a ± 12,1 S 19,0 c ± 8,5 2,1 b ± 1,2 15 1470,0 a ± 238 70,0 a ± 20,0 B 53,0 b ± 12,2 1,0 b ± 0,2 7 987,5 bc ± 159 66,2 a ± 14,0 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. 16

Świeża i sucha masa eksplantatów pochodzących z kultur liścieniowych była porównywalna. Wartości te były wyższe w kulturach pochodzących z bazalnej części liścienia, rosnących w obecności TDZ niż BA (Tab. 1.3). Najwyższą liczbą pędów odznaczały się kultury, gdy natężenie światła było wyższe niż 20 μmol m -2 s -1. Organy te były liczne (około 10 szt./ekspl.) i dobrze wykształcone, natomiast przy natężeniu 20 μmol m -2 s -1 były bardzo małe (dane nieprzedstawione) i nie przekraczały 5 sztuk na eksplantat. Kultury utrzymywane w obecności światła białego przy natężeniu wyższym niż te, które rosły na świetle o natężeniu przekraczającym 20 μmol m -2 s -1, odznaczały się najwyższą świeżą i suchą masą (Tab. 1.4). Tabela 1.4. Efektywność organogenezy pędowej lnu indukowanej na środkowej części hipokotyla oraz świeża i sucha masa eksplantatów po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem BA (1,0 mg l -1 ) + 2,4-D (0,05 mg l -1 ) przy różnym natężeniu światła białego Natężenie napromieniowania [µmol m -2 s -1 ] Reagujące eksplantaty [%] Liczba pędów/ ekspl. [szt.] Świeża masa Sucha masa 0 63 b ± 5,8 1,3 c ± 0,3 153,7 d ± 8,8 6,1 e ± 0,9 20 100 a 3,1 b ± 1,2 203,7 c ± 30,2 20,0 d ± 2,1 50 100 a 11,8 a ± 3,0 547,0 a ± 67,6 62,1 a ± 7,0 90 100 a 10,8 a ± 1,3 316,4 b ± 42,5 31,8 c ± 4,6 180 100 a 10,5 a ± 2,1 457,2 a ± 38,6 45,2 b ± 6,3 Wyniki średnie ±SD. Wartości w kolumnach oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. Organogeneza pędowa była efektywniejsza w kulturach utrzymywanych w obecności światła białego (W) i promieniowania niebieskiego (B) niż w pozostałych wariantach świetlnych doświadczenia (Ryc. 1.2A-B). Kaulogeneza mieściła się w granicach 100% w przeciwieństwie do pozostałych wariantów, gdzie była o około 20% niższa (Ryc. 1.2A). Liczba zregenerowanych pędów była o około 2,5 raza większa w kulturach w świetle białym i o około 2 razy większa w świetle niebieskim, w stosunku do liczby pędów otrzymanych w kulturach rosnących w pozostałych badanych warunkach oświetlenia (Ryc. 1.2B). 17

A 120 % reagujących eksplantatów 100 80 60 40 20 b a b b a,b 0 D W R FR B Warunki świetlne B 25 Liczba pędów/eksplantat [szt.] 20 15 10 5 b a b b a,b 0 D W R FR B Warunki świetlne Rycina 1.2. Efektywność formowania pędów przybyszowych w kulturach in vitro lnu, wyprowadzonych ze środkowej części hipokotyla, po 30 dniach wzrostu na pożywce MS z dodatkiem BA 1,0 mg l -1 + 2,4-D 0,05 mg l -1 w ciemności (D), w świetle białym (W), czerwonym (R), dalekiej czerwieni (FR) oraz niebieskim (B) każde o natężeniu 50 µmol m -2 s -1 Wyniki średnie ±SD. Wartości oznaczone różnymi literami są statystycznie istotne (p 0,05) Źródło: badania własne. 18

1.4. Dyskusja Organogeneza pędowa z eksplantatów hipokotyli była bardziej efektywna niż z fragmentów liścieni. Wydajność procesu kaulogenezy w przypadku eksplantatów liścieniowych zależała od miejsca ich pobrania (Tab. 1.1). Podobny potencjał kaulogenezy w zależności od wykorzystywanego rodzaju eksplantatu obserwowano w kulturach rzepy jadalnej (Brassica rapa L.) (Cogbill i in. 2010). Również w kulturach psianki podłużnej (Solanum melongena L.) efektywność kaulogenezy zależała od miejsca pobrania eksplantatu (Sharma, Rajam 1995). Wykazano, że w zależności od rodzaju eksplantatu, skład hormonalny pożywki sprzyjający organogenezie pędowej lnu jest nieco odmienny (Tab. 1.2, 1.3). W przypadku kultur pochodzących z eksplantatów hipokotylowych, obecność 2iP oraz BA w pożywce sprzyjało formowaniu pędów (Tab. 1.2). W kulturach wyprowadzonych z bazalnych fragmentów liścieni organogeneza była efektywniejsza na pożywce z dodatkiem BA niż TDZ (Tab. 1.3). Generalnie BA jest uważana za najbardziej użyteczną i niezawodną cytokininę, stosowaną do indukcji pędów, co wykazano w przypadku Drymaria cordata (L.) Willd. czy kultur śliwy (Prunus microcarpa C. A. Mey.) (Ghimire i in. 2010; Nas i in. 2010). Jednak nie u wszystkich gatunków roślin BA jest dobrym regulatorem w indukcji organogenezy. W innych przypadkach stosowano TDZ, regulator o charakterze cytokininy. W kulturach in vitro żyworódki pierzastej Kalanchoë pinnata (Lam.) Pres. indukował on organogenezę pędową (Jaiswal, Sawhney 2006). Natomiast badania Burbulis i in. (2005) sugerują, iż dodatek 2iP do pożywki wspomaga efektywną indukcję organogenezy pędowej z kalusa powstającego na eksplantatach hipokotyli lnu. W niniejszych badaniach zaobserwowano jednocześnie, że świeża masa kultur była wyższa w obecności TDZ niż BA (Tab. 1.2, 1.3). Przypuszczać można, że TDZ prowadzi do zwiększenia świeżej masy przez akumulację wody, co może wpływać negatywnie na zdolności regeneracyjne eksplantatów (Paques, 1991). Wzrost kultur lnu uzależniony był również od natężenia światła białego i jakości promieniowania. Dobrze wykształcone i liczne (ponad 5 sztuk na fragmencie) pędy na eksplantatach hipokotylowych obserwowano na świetle przy natężeniu wyższym niż 20 μmol m -2 s -1 (Tab. 1.4). Podobne zależności między intensywnością światła a wytwarzaniem pąków przybyszowych wykazano u Trema orientalia L. (Samantaray i in. 1995). Obecność światła białego w trakcie wzrostu kultur sprzyjała powstawaniu większej liczby pędów na eksplantacie (Ryc. 1.2.A-B). W kulturach utrzymywanych w obecności światła białego, 100% eksplantatów było zdolnych do formowania pędów ze średnią liczbą powyżej 5 sztuk na eksplantat, natomiast 19

w ciemności ich liczba nie przekraczała 5 sztuk (Ryc. 1.2.B). Efekt działania światła na intensywniejszą indukcję i rozwój pędów mógł być konsekwencją wyższego tempa fotosyntezy (Tavares i in. 1998). Poza składnikami organicznymi dodanymi do pożywki, w eksplantatach mogły być wytwarzane inne związki organiczne, dodatkowo wzbogacające podłoże do wzrostu kultur. Światło może również wpływać na aktywność enzymów oraz syntezę hormonów i w ten sposób regulować procesy prowadzące do regeneracji. Wpływ jakości promieniowania na efektywność organogenezy pędowej lnu był niewielki i przejawiał się zasadniczo stymulacją tego procesu przez światło niebieskie (B) (Ryc. 1.2A-B). Promieniowanie to, zaabsorbowane przez odpowiednie fotoreceptory (m.in. kryptochromy), mogło inicjować ciąg zdarzeń prowadzących między innymi do ekspresji genów zaangażowanych w regulację procesów fotomorfogenetycznych. Mogło to skutkować nieco bardziej efektywną kaulogenezą. Natomiast w przypadku petunii ogrodowej (Petunia hybryda hort. ex Vilm), organogeneza pędowa była stymulowana przez promieniowanie w zakresie czerwieni (Reuveni, Evenor 2007). Podsumowując, w przeprowadzonych badaniach wykazano zależność między rodzajem i pochodzeniem eksplantatu oraz wykorzystaną do procesów regeneracyjnych cytokininą. W porównaniu do wcześniejszych badań prowadzonych głównie na odmianach lnu włóknistego (Belonogova, Raldugina 2006; Janowicz, Wojciechowski 2009), udało się uzyskać organogenezę pędową na eksplantatach liścieni odmiany Szafir lnu oleistego. Zaobserwowano stymulujący efekt działania światła białego i promieniowania w zakresie niebieskim na organogenezę pędową. Przedstawione wyniki mogą być pomocne w badaniach nad uzyskaniem efektywniejszej organogenezy lnu. Podziękowania Aneta Adamczuk jest beneficjentem projektu Stypendia dla doktorantów województwa podlaskiego. Projekt jest współfinansowany w 85% ze środków Europejskiego Funduszu Społecznego, 7,5% ze środków budżetu państwa, 7,5% ze środków budżetu województwa podlaskiego. Realizowany w ramach Programu Operacyjnego Kapitał Ludzki 2007-2013, Działanie 8.2. Transfer wiedzy, Poddziałanie 8.2.2. Regionalne Strategie Innowacji. 20

Literatura Adamczuk A., Siegień I., Ciereszko I. 2012. Roślinne kultury in vitro charakterystyka i zastosowania. Edukacja Biologiczna i Środowiskowa, 4: 38-46. Belonogova M. A., Raldugina G. N. 2006. Shoot regeneration from cotyledon explants of fibre flax (Linum usitatissimum L.) and their subsequent rooting. Russ. J. Plant Physiol., 53: 501-506. Bertram L., Lercari B. 2000. Phytochrome A and phytochrome B1 control the acquisition of competence for shoot regeneration in tomato hypocotyl. Plant Cell Rep., 19: 604-609. Bretagne B., Chupeau M., Chupeau Y., Fouilloux G. 1994. Improved flax regeneration from hypocotyls using thidiazuron as a cytokinin source. Plant Cell Rep., 14: 120-124. Burbulis N., Blinstrubiene A., Venskutoniene E., Katauskye L. 2005. Organogenesis in callus cultures of Linum usitatissimum L. Acta Univ. Latv., 691: 129-135. Cogbill S., Faulcon T., Jones G., McDaniel M., Harmon G., Blackmon R., Young M. 2010. Adventitious shoot regeneration from cotyledonary explants of rapid cycling fast plants of Brassica rapa L. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 101: 127-133. Czemplik M., Szopa J. 2009. Optimizing biomedical and industrial products development based on flax. CAB Reviews: Perspectives in Agriculture. Veterinary Science, Nutrition and Natural Resources, 4: 062. Dedičová B., Hricová A., Šamaj J., Obert B., Bobák M., Pret ová A. 2000. Shoots and embryo-like structures regenerated from cultured flax (Linum usitatissimum L.) hypocotyls segments. J. Plant Physiol., 157: 327-334. Gairi A., Rashid A. 2002. In vitro stimulation of shoot buds on hypocotyls of Linum seedlings, by flooding and ethereal treatment of cultures. Plant Sci., 163: 691-694. Gamborg O. L., Miller R. A., Ojima K. 1968. Nutrient requirements of suspension cultures of soybean root cells. Exp. Cell Res., 50: 151-158. Ghimire B. K., Seong E. S., Goh E. J., Kim N. Y., Kang W. H., Kim E. H., Yu C. Y., Chung I. M. 2010. High-frequency direct shoot regeneration from Drymaria cordata Willd. leaves. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 100: 209-217. Jaiswal S., Sawhney S. 2006. Modulation of TDZ-induced morphogenetic responses by antiauxin TIBA in bud-bearing foliar explants of Kalanchoe pinnata. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 86: 69-76. Janowicz J., Wojciechowski A. 2009. Ocena zdolności regeneracyjnych dwóch odmian lnu (Linum usitatissimum L.) w kulturach in vitro. Rośliny Oleiste, 30: 35-49. Kusnetsov V. V., Oelmuller R., Sarwat M. I., Porfirova S. A., Cherepneva G. N., Herrmann R. G., Kulaeva O. N. 1994. Cytokinins, abscisic acid and light affect accumulation of chloroplast protein in Lupinus luteus cotyledons without notable effect on steady-state mrna level. Planta, 124: 318-327. 21

Martín-Urdíroz N., Garrido-Gala J., Martin J., Barandiaran X. 2004. Effect of light on the organogenic ability of garlic using a one-step in vitro system. Plant Cell Rep., 22: 721-724. Murashige T., Skoog F. 1962. A revised medium for rapid growth and bio-assays with tobacco tissue cultures. Physiol. Plant., 15: 473-497. Nas M. N., Bolek Y., Sevgin N. 2010. The effects of explant and plant cytokinin type on regeneration of Prunus microcarpa. Sci. Hort., 126: 88-94. Niedźwiedź-Siegień I., Lewak S. 1992. Involvement of high irradiance response in photoinhibition of white clover seed germination at low water potential. Physiol. Plant., 86: 293-296. Paques M. 1991. Vitrification and micropropagation: causes, remedies and prospects. Acta Hort., 289: 283-290. Reuveni M., Evenor D. 2007. On the effect of light on shoot regeneration in petunia. Plant Cell Tiss. Organ Cult., 89: 49-54. Samantaray S., Rout G. R., Das R. 1995. An in vitro study on organogenesis in Trema orientalis (Blume) Linn. Plant Science 105: 87-94. Sharma P., Rajam M. V. 1995. Genotype explant and position effects on organogenesis and somatic embryogenesis in eggplant (Solanum melongena L.). J. Exp. Bot., 46: 136-141. Siegień I., Adamczuk A., Wróblewska K. 2013. Light affects in vitro organogenesis of Linum usitatissimum L. and its cyjanogenic potential. Acta Physiol. Plant., 35: 781-789. Tavano E.C.R., Stipp L.C.L., Muniz F.R., Mourão Filho F.A.A., Mendez B.M.J. 2009. In vitro organogenesis of Citrus volkameriana and Citrus aurantium. Bio. Plant., 53: 395-399. Tavares F., Abreu I., Salema R. 1998. Regeneration of the actinorhizal plant Myrica gale L. from epicotyl explants. Plant Sci., 135: 203-210. Wilhemova N., Prochazkova D., Macháčková L., Vagner M., Srbova M. 2004. The role of cytokinins and ethylene in bean cotyledon senescence. The effect of free radicals. Biol. Plant., 4: 523-529. Yildiz M., Ozcan S., Telci C., Day S., Ozat H. 2010. The effect of drying and submersion pretreatment on adventitious shoot regeneration from hypocotyls explants of flax (Linum usitatissimum L.). Turk. J. Bot., 34: 323-328. 22