Czynniki, od których zależy wynik kultury in vitro: 1. Wewnętrzne (związane bezpośrednio z eksplantatem): genotyp rośliny, dawcy eksplantatu (rodzaj, gatunek, odmiana) rodzaj organu, tkanki oraz jego wielkość stopień zróżnicowania eksplantatu stan fizjologiczny rośliny dawcy eksplantatu wiek rośliny dawcy eksplantatu 2. Zewnętrzne: światło spektrum, natężenie, cykl dobowy temperatura pożywka
Funkcje pożywki: 1. Dostarcza składników do wzrostu i rozwoju ekspalantatów 2. Odbiera metabolity wtórne i substancje szkodliwe oraz je neutralizuje 3. Spełnia rolę fizycznego utrzymania
Wybór odpowiedniej pożywki musi uwzględniać: Specyfikę uprawianego obiektu (gatunek, odmiana, wymagania pokarmowe); Stopień złożoności ekspalntatu (fragmenty organów roślinnych, konkretne tkanki, zawiesina komórek, protoplasty); Cel kultury i jego zgodność z naturalnym wzorem rozwojowym uprawianego obiektu.
Najczęściej używane pożywki 1. O wszechstronnym zastosowaniu MS Murashige i Skoog, 1962; LS Linsmeier i Skoog, 1965 B5 Gamborg i in. 1968 2. Inne N6 Nitsch i Nitsch, 1969 kultura pylników K3 Kao i in. 1974 kultura protoplastów WPM Lloyd i McCown, 1981 rośliny drzewiaste
Składniki pożywki: 1. Makroelementy podawana w postaci soli rozpuszczalnych w wodzie 2. Mikroelementy podawana w postaci soli rozpuszczalnych w wodzie 3. Związki organiczne: A. Witaminy a) Kwas nikotynowy b) Pirydoksyna c) Tiamina d) M-inosytol B. Aminokwasy a) Glicyna C. Źródło węgla organicznego a) Monocukry glukoza, fruktoza b) Dwucukry sacharoza
Regulatory wzrostu: 1) Auksyny: A. Naturalne a) IAA kwas indolilo-3-octowy b) IBA kwas indolilo-3-masłowy B. Syntetyczne a) NAA kwas naftylo-1-octowy b) 2,4-D kwas 2,4-dichlorofenoksyoctowy c) 2,4,5-T kwas 2,4,5-trichlorofenoksyoctowy d) Dicamba - kwas 2-metoksy-3,6-dichlorobenzoesowy e) Picloran - kwas 4-amino-3,5,6-trichloropikolinowy 2) Cytokininy: a) Zeatyna 6-(γ-hydroksymetylo, γ-metyloalliloamino)puryna b) Kinetyna N-6-furfuryladenina (Kin) c) 6-benzyloaminopuryna (BAP) d) 2-izopentyloadenina (2iP) e) Thidiazuron - 1-fenylo-3-(1,2,3-thiadiazolo-5-ylo) mocznik
Regulatory wzrostu: 3) Gibereliny: a) Kwas giberelinowy GA 3 4) Inhibitory wzrostu: a) ABA kwas abscysynowy
Mikrorozmnażanie roślin Technika mikrorozmnażania (rozmnażania klonalnego) pozwala rozmnożyć w warunkach in vitro materiał roślinny z niewielkich fragmentów roślin, tkanek lub pojedynczych komórek i otrzymać tym sposobem dużą ilość sadzonek w stosunkowo krótkim czasie. Jako eksplantaty pierwotne wykorzystywane są tu przede wszystkim tkanki merystematyczne, składające się z młodych, szybko dzielących się komórek. Tkanki te pozbawione są patogenów grzybowych i wirusów, stąd dają początek zdrowym roślinom
Mikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne, szybkie klonowanie) Tytuł scmikrorozmnażanie (rozmnażanie klonalne, szybkie klonowanie)hematu Mikrorozmnażanie Embriogeneza somatyczna Organogeneza bezpośrednia pośrednia bezpośrednia pośrednia kultura merystemów (rozwój pąków bocznych) kultura fragmentów pędów (rozwój pąków bocznych)
Mikrorozmnażanie in vitro Rozmnażanie cennych materiałów występujących w nielicznych egzemplarzach; Rozmnażanie materiałów matecznych; Tworzenie klonów z materiałów mieszańcowych; Produkcja zdrowego materiału; Produkcja sadzonek in vitro;?
Embriogeneza somatyczna
Embriogeneza somatyczna sposób wegetatywnego rozmnażania roślin polegający na indukcji rozwoju zarodków somatycznych (embrioidów) z tkanki somatycznej w warunkach in vitro.
Embriogeneza somatyczna Pozwala na uniezależnienie produkcji cennego materiału siewnego od czynników klimatycznych; Umożliwia przyspieszenie tworzenia nasion u roślin charakteryzujących się długim cyklem ich produkcji; Somatyczne zarodki mogą być bezpośrednio lub po wysuszeniu i/lub otoczkowaniu wykorzystywane jako tzw. sztuczne nasiona (someseed, artifficial seed, synthetic seed).
Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - podobieństwa i różnice Embriogeneza in vivo Embriogeneza in vitro zygotyczna somatyczna gametyczna z zapłodnionej komórki jajowej apomiktyczna z komórek somatycznych kalus z mikrospor z izolowanych i połączonych gamet z niezapłodnionych komórek woreczka zalążkowego
Etapy embriogenezy
Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - podobieństwa W procesie somatycznej embriogenezy roślin dwuliściennych występują podobne stadia rozwojowe takie jak wczesno-, środkowo- i późnoglobularne, wczesno- i późnosercowate torpedy i liścieniowe.
Embriogeneza somatyczna i zygotyczna - 1. Zarodki zygotyczne in vivo rozwijają się w woreczku zalążkowym w wyniku fuzji gamet. 2. Zarodki zygotyczne podczas rozwoju w stadium wczesnoglobularnym rozwijają suspensor, który zanika w stadium torpedy lub pozostaje w stadium szczątkowym. 3. Globularne stadia zarodków zygotycznych są mniejsze niż somatycznych. 4. Merystem wierzchołkowy zarodków zygotycznych jest lepiej rozwinięty. różnice 1. Zarodki somatyczne rozwijają się w warunkach in vitro bezpośrednio lub pośrednio z komórek eksplantatu pierwotnego. 2. Zarodki somatyczne nie mają suspensora. 3. Globularne stadia zarodków somatycznych są większe niż zygotycznych. 4. Merystem wierzchołkowy zarodków somatycznych jest słabiej rozwinięty.
5. Zarodki zygotyczne wytwarzają jeden liścień (rośliny jednoliścienne) lub dwa liścienie (rośliny dwuliścienne). 6. Rozwojowi zarodka zygotycznego towarzyszy rozwój bielma. 7. Zarodki zygotyczne otoczone są zawsze okrywą nasienną. 8. Rozwój zygotycznego zarodka kończy się powolnym odwodnieniem, które powoduje stopniową redukcję metabolizmu, zatem wraz z utrata wody z tkanek nasienia zarodek przechodzi w stan spoczynku. 5. Zarodki somatyczne wytwarzają dwa i więcej liścieni i często są one drobne. 6. W rozwoju zarodka somatycznego nie ma procesu tworzenia się bielma. 7. Zarodki somatyczne nie są okryte okrywą nasienną, stąd nie ma stadium liścieniowego w postaci laski. 8. Zarodki somatyczne naturalnie nie przechodzą procesu uśpienia, kiełkują przedwcześnie. 9. Zarodki somatyczne produkują takie same materiały zapasowe jak zygotyczne, ale w innym czasie i w innych ilościach.
Geneza zarodków powstających w wyniku embriogenezy somatycznej: 1. Pojedyncza komórka zarodek 2. Pojedyncza komórka PEM zarodek
Embriogeneza somatyczna
Pojedyncza komórka zarodek Większość zarodków somatycznych wywodzi się bezpośrednio z pojedynczej komórki. Jest to możliwe, gdy eksplantatami są zarodki zygotyczne, komórki ośrodka, synergidy lub epiderma liścieni.
Pojedyncza komórka PEM zarodek Pojedyncza komórka dzieląc się doprowadza do wytworzenia niewielkiej grupy komórek zwanej proembriogeniczną masą komórek PEM (ang. pre-embryogenic mass). Cechą charakterystyczną komórek tworzących PEM jest to, że nie rozłączają się po podziałach i wszystkie komórki wchodzące w skład pojedynczego PEM-u uczestniczą w formowaniu jednego lub kilku zarodków somatycznych. Jest to możliwe w przypadku zawiesin komórkowych, kultur kalusa lub protoplastów.
Bezpośrednia embriogeneza somatyczna Zarodki somatyczne formują się bezpośrednio tylko z tych komórek roślinnych, które są kompetentne już w momencie izolowania z rośliny macierzystej, czyli z proembriogenicznie zdeterminowanych komórek PEDCs (ang. preembryogenically determined cells) - komórek predysponowanych do różnicowania zarodków. PEDCs charakteryzują się małymi rozmiarami, stosunkowo gęstą cytoplazmą, małymi wakuolami, dużym jądrem z wyraźnymi jąderkami oraz plastydami z ziarnami skrobi. Cechują się dużą aktywnością podziałową i metaboliczną.
Bezpośrednia embriogeneza somatyczna Po przeniesieniu na pożywkę PEDCs następuje wyzwolenie naturalnych zdolności embriogennych komórek i rozpoczynają się intensywne podziały komórkowe. Bodźcem wyzwalającym proces embriogenezy bezpośredniej jest głównie egzogenna auksyna. eksplantat (zawiera PEDCs) zarodek