* SubDNA Zestaw do elektroforezy horyzontalnej w żelu agarozowym z chłodzeniem* Instrukcja Obsługi Numer katalogowy: 130-100 Numer katalogowy: 131-100* Aby uzys k ać pomoc techniczną (+48) 22 668 71 47
Spis treści 1. Informacje ogólne 3 1.1 Wprowadzenie 3 1.2 Skład Zestawu SubDNA 3 1.3 Specyfikacja techniczna 4 1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania 4 2. Użytkowanie Zestawu SubDNA 5 2.1 Przygotowanie aparatu do pracy oraz przeprowadzenie elektroforezy 5 3. Konserwacja aparatu 8 4. Odczynniki i przygotowanie roztworów 9 5. Diagnozowanie i usuwanie problemów 10 6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe 11 7. Warunki gwarancji 13 7.1 Formularz naprawy gwarancyjnej 13 8. Wsparcie techniczne 13
1. Informacje ogólne 1.1 Wprowadzenie Serdecznie dziękujemy za zakup Zestawu SubDNA do horyzontalnej elektroforezy kwasów nukleinowych w żelach agarozowych. Duża pojemność zbiorników z buforem elektrodowym pozwala na przeprowadzenie rozdziałów elektroforetycznych bez ryzyka denaturacji DNA przez zakwaszony lub zalkalizowany bufor. Wersja aparatu z wymiennikiem ciepła pozwala przeprowadzać rozdziały w kontrolowanej temperaturze. Oferujemy dwa rodzaje stolików do aparatu: o wymiarach 16 cm x 16 cm (5 grzebieni) lub 13 cm x 16 cm (3 grzebienie). W aparacie można jednocześnie wykonać analizę maksymalnie 64 prób. 1.2 Skład Zestawu SubDNA Aby optymalnie korzystać z Zestawu SubDNA, prosimy o zapoznanie się z elementami Zestawu SubDNA przed pierwszym zastosowaniem. 1. Komora elektroforetyczna z elektrodami 1 szt. 2. Stolik do wylewania żeli 1 szt. 3. Grzebień 1,5 mm/18 studzienek 2 szt. 4. Pokrywa komory z kablami zasilającymi 1 szt. 5. Uchwyty do mocowania grzebienia 2 szt. 6. Wymiennik ciepła* 1 szt. 7. Węże połączeniowe do wymiennika ciepła* 2 szt. 8. Instrukcja obsługi 1 szt. * w aparacie z chłodzeniem Rysunek 1. Skład Zestawu SubDNA. 3
1.3 Specyfikacja techniczna Korpus komory elektroforetycznej Pokrywa komory Stolik do wylewania żelu Kable zasilające Elektrody Wymiennik ciepła* Węże połączeniowe do wymiennika ciepła* Wymiary aparatu (d x sz x w) Maksymalne napięcie Waga PERSPEX PMMA PERSPEX PMMA PERSPEX PMMA plecionka miedzianka, izolacja silikonowa platyna szkło ceramiczne silikon 300 x 220 x 70 (mm) 300 V 1,0 kg * w aparacie z chłodzeniem 1.4 Zasady bezpiecznego użytkowania Prosimy o uważne zapoznanie się z instrukcją obsługi oraz zasadami bezpiecznego użytkowania aparatu. 1. Aparat SubDNA jest obsługiwany przez zewnętrzny zasilacz i może być potencjalnym źródłem śmiertelnego napięcia. 2. Zasilacz aparatu (nie wchodzący w skład Zestawu SubDNA), powinien zostać podłączony do uziemienia. 3. Zasilanie aparatu jest podłączone przez pokrywę z kablami zasilającymi. Przed każdym zdjęciem pokrywy aparatu należy pamiętać o wyłączeniu zasilania zasilacza elektroforetycznego. Nie podłączać aparatu bez pokrywy. 4. Aparat SubDNA powinien być obsługiwany wyłącznie przez przeszkolony personel. 5. Aparat SubDNA należy używać wyłącznie zgodnie z jego przeznaczeniem. 6. Należy używać wyłącznie dedykowanych akcesoriów. Stosowanie elementów z innych, niekompatybilnych aparatów może spowodować jego uszkodzenie i utratę ochrony gwarancyjnej. 7. Aparat SubDNA jest wykonany z tworzywa PERSPEX PMMA, który może ulec uszkodzeniu pod wpływem działania rozpuszczalników organicznych. Do mycia aparatu należy stosować wyłącznie łagodne detergenty i wodę dejonizowaną. Urządzenie jest zgodne z ustawowymi wytycznymi bezpieczeństwa Unii Europejskiej: 73/23/EEC Dyrektywa Niskonapięciowa 4
2. Użytkowanie Zestawu SubDNA Elektroforeza DNA w żelu agarozowym lub poliakrylamidowym jest standardową metodą pozwalającą rozdzielić, zidentyfikować lub oczyścić fragmenty DNA. Do zalet metody należy zaliczyć jej prostotę a także możliwość bezpośredniej lokalizacji fragmentów DNA w żelu przy pomocy barwnika interkalującego - bromku etydyny. Żele poliakrylamidowe stosuje się zazwyczaj do rozdziału małych fragmentów (5-500 par zasad) a ich zdolność rozdzielcza jest bardzo wysoka i pozwala rozdzielić fragmenty różniące się między sobą o 1 parę zasad (np. w trakcie elektroforezy sekwencjonującej). Rozdział w żelach poliakrylamidowych przeprowadza się w układzie pionowej elektroforezy płytowej. Przystosowane do tego rodzaju pracy są aparaty typu STANDARD 2 (101-100) i MINIPOL 2 (103-100). Żele agarozowe o różnym stężeniu stosuje się do rozdziału fragmentów DNA od 200 pz do 50 000 pz (50 kb). Większe fragmenty DNA (do 10 10 6 ) mogą być rozdzielane w żelu agarozowym metodą elektroforezy pulsacyjnej. I. Czynniki wpływające na tempo migracji DNA w żelu agarozowym 1. Masa cząsteczkowa kwasu nukleinowego Większe cząsteczki DNA migrują wolniej niż cząsteczki małe ze względu na większe opory ruchu oraz większe trudności w penetrowaniu porów żelu będącego rodzajem sita molekularnego. Tempo migracji jest odwrotnie proporcjonalne do logarytmu dziesiętnego ilości par zasad. 2. Stężenie agarozy Zwiększając stężenie agarozy zwalnia się tempo migracji DNA w żelu. Na podstawie prac doświadczalnych ustalono optymalne stężenie agarozy do rozdziałów fragmentów DNA o określonej wielkości. Dane te przedstawiono w Tabeli I. Tabela I. Optymalne stężenie agarozy w zależności od wielkości rozdzielanego DNA Wielkość cząsteczki DNA (kb) Stężenie agarozy (% w/v) 5-60 0,3 1-20 0,6 0,8-10 0,7 0,5-7 0,9 0,4-6 1,2 0,2-3 1,5 0,1-2 2,0 3. Napięcie prądu podczas elektroforezy Przy niskich napięciach tempo migracji liniowych cząsteczek kwasów nukleinowych jest wprost proporcjonalne do napięcia. Zależność ta nie obowiązuje dla dużych cząsteczek DNA rozdzielanych przy zastosowaniu wysokich napięć, dlatego też w czasie rozdziału cząsteczek większych niż 2000 pz (2 kb) nie należy stosować napięcia większego niż 5 V/cm. 4. Temperatura rozdziału Temperatura, w jakiej dokonuje się rozdziału w zakresie od 4 C do temperatury pokojowej nie wpływa w istotnym stopniu na elektroforetyczne właściwości DNA. Jednakże przeprowadzanie rozdziału w temperaturze wyższej od pokojowej wpływa na bierną dyfuzję kwasów nukleinowych w żelu, a tym samym na ostrość uzyskiwanych prążków DNA. Obniżenie temperatury podczas rozdziału gwarantuje dobrą jakość rozdziału i otrzymanie ostrych prążków. W celu przeprowadzenia elektroforezy w obniżonej temperaturze należy zastosować aparat z wymiennikiem ciepła. 5
5. Bromek etydyny Obecność bromku etydyny lub innych barwników interkalującyh w buforze elektrodowym (lub w żelu) zmniejsza prędkość przemieszczania się cząsteczek kwasów nukleinowych o około 15%. 6. Siła jonowa i skład buforu W buforze o niskiej sile jonowej DNA przemieszcza się bardzo wolno. Z kolei stosowanie buforu o dużej sile jonowej sprzyja wydzielaniu dużej ilość ciepła, które może spowodować roztopienie agarozy i denaturację DNA. Najpowszechniej stosowany jest bufor TAE. Wykaz stosowanych buforów oraz sposób ich przygotowania jest zawarty w Rozdziale 4 (Odczynniki i przygotowanie roztworów).. 2.1 Przygotowanie aparatu i przeprowadzenie elektroforezy I. Przygotowanie żelu agarozowego 1. Złożyć poza aparatem stolik do wylewania żelu agarozowego. Dokręcić śruby tak aby czarne uszczelki unieruchomiły wkład. Włożyć grzebienie w wycięcia wkładu tak aby zęby grzebienia nie dotykały dna. 2. Przygotować odpowiednią ilość buforu elektrodowego (1 TAE lub 0,5 TBE) wystarczającą do wypełnienia komory aparatu i rozpuszczenia agarozy. Do kolbki odważyć odpowiednią do stężenia i objętości żelu ilość agarozy i uzupełnić buforem. UWAGA! Objętość mieszaniny nie powinna przekraczać ½ objętości kolbki. 3. Mieszaninę podgrzewać w kuchence mikrofalowej do momentu całkowitego rozpuszczenia agarozy. Podczas ogrzewania co kilkadziesiąt sekund wyjąć kolbę i wymieszać delikatnie zawartość. Kontrolować rozpuszczanie agarozy sprawdzając czy nie pozostają opalizujące grudki. 4. Po rozpuszczeniu agarozy mieszaninę schłodzić do około 60 C i dodać bromek etydyny tak aby stężenie końcowe wynosiło 0,5 ug/ml. UWAGA! Bromek etydyny jest silnym mutagenem. Podczas pracy należy zachować szczególną ostrożność zawsze używając środków ochrony osobistej. Wszelkie pozostałości żeli lub roztworów zawierających bromek etydyny powinny być poddawane utylizacji. 5. Schłodzoną agarozę wlać do stolika z grzebieniami tak aby grubość żelu wynosiło 3-5 mm. 6. Pozostawić żel do stężenia w temperaturze pokojowej lub w lodówce a następnie przenieść wkład z żelem do aparatu. 7. Zalać żel przygotowanym buforem elektrodowym oraz wyciągnąć grzebień. Sprawdzić czy studzienki nie zawierają pozostałości żelu agarozowego, który mógłby utrudnić nałożenie próbki. 8. Zalać żel przygotowanym buforem elektrodowym oraz wyjąć delikatnie grzebień. Sprawdzić czy studzienki nie zawierają pozostałości żelu agarozowego, który mógłby utrudnić nałożenie próbki. Wyjmowanie grzebienia po zalaniu żelu buforem zapobiega zapadaniu się studzienek. 6
II. Przeprowadzenie elektroforezy 1. Wlać do aparatu bufor elektrodowy w takiej ilości aby przykrył żel warstwą 2-3 mm cieczy. 2. Próbkę DNA wymieszaną z buforem obciążającym w stosunku 5:1 nałożyć delikatnie na żel. Szybkie naciśnięcie tłoka pipety może spowodować wypłynięcie próbki do buforu elektrodowego. 3. Po nałożeniu próbek zamknąć pokrywę aparatu uważając na prawidłowe położenie elektrod. Ułatwia to ujednolicony system oznaczania elektrod kolorami - elektroda "+" oznaczona jest kolorem czerwonym, elektroda "-" kolorem niebieskim lub czarnym. Oznaczenia dotyczą także zasilaczy elektroforetycznych oferowanych przez firmę Kucharczyk TE). UWAGA! Kwasy nukleinowe posiadają wypadkowy ładunek ujemny i przemieszczają się w kierunku elektrody dodatniej (czerwonej). 4. Jeżeli elektroforeza będzie prowadzona w aparacie SubDNA z chłodzeniem podłączyć węże i uruchomić pompę z cyrkulacją cieczy. 5. Połączyć aparat z zasilaczem i rozpocząć elektroforezę. Najczęściej elektroforezę przeprowadza się przy napięciu 120 V. 6. Gdy barwnik obciążający przemieści się na wymaganą odległość, wyłączyć aparat. ew. pompę i skontrolować rozdział DNA na transluminatorze bezpośrednio po zakończeniu. Pozostawienie żelu w aparacie na dłuższy czas może spowodować rozdyfundowanie DNA i uzyskanie gorszego obrazu rozdziału kwasów nukleinowych. 7. Jeżeli żel agarozowy nie zawierał bromku etydyny, konieczne jest wybarwienie DNA poprzez inkubację żelu w roztworze zawierającym bromek etydyny. Do barwienia żelu służą dedykowane pojemniki szklane (nr kat. 100-140 i 100-141). 7
3. Konserwacja aparatu Korpus aparatu, stolik do wylewania żelu oraz pokrywa są wykonane z materiału PERSPEX PMMA. Materiał typu PERSPEX PMMA jest podatny na uszkodzenia pod wpływem stężonych rozpuszczalników organicznych, w szczególności alkoholi. Do mycia aparatu należy używać łagodnych detergentów i wody dejonizowanej. Pozostałości żelu agarozowego lub buforu zawierającego bromek etydyny powinny być poddane utylizacji. 8
4. Odczynniki i przygotowanie roztworów UWAGA!!! Wszystkie roztwory powinny być przygotowane z użyciem wysokiej czystości wody - destylowanej lub dejonizowanej a następnie przefiltrowane. 1. Bufory elektroforetyczne Nazwa buforu Stężenie robocze Stężenie roztworu wyjściowego (składniki na 1 litr) Tris - octan (TAE) 1 0,04 M Tris - octan, 0,001 M EDTA 50 242 g Tris base 57,1 ml lodowaty kwas octowy 100 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 Tris - fosforan (TPE) 1 0,09 M Tris - fosforan, 0,002 M EDTA 10 108 g Tris base 15,5 ml 85% kwasu fosforowego Tris - boran (TBE) 0.5 0,045 M Tris - boran, 0,001 M EDTA 5 54 g Tris base 27,5 g kwas borny 20 ml 0,5M EDTA ph 8,0 Alkaliczny 1 50 mm NaOH 1 mm EDTA 10 5 ml 10 N NaOH 2 ml 0,5 M EDTA ph 8,0 2. Bufor obciążający 6x stężony 0,25% błekit bromofenolowy 0,25% xylene cyanol FF 40% (w/v) sacharoza w wodzie Bufor przechowywać w temperaturze +4 C. 9
5. Diagnozowanie i usuwanie problemów Problem Możliwa przyczyna Rozwiązanie 1. Brak migracji prążków w żelu a. Nieodpowiedni bufor elektrodowy a. Sprawdź skład i rozcieńczenie buforu 2. Dyfuzja próbek do buforu b. Zbyt niskie nastawy zasilacza elektroforetyczne -go a. Niewłaściwe obciążenie próbki b. Ustaw napięcie na 100 V a. Upewnij się, że próbka jest obciążana 6x stężonym buforem w stosunku 5:1 (5 ul próbki i 1 ul buforu obciążającego) 3. Grzanie się buforu a. Za wysokie napięcie a. Sprawdź ustawienia zasilacza. b. Zbyt wysokie stężenie buforu elektrodowego b. Rozcieńcz bufor elektrodowy o połowę 4. Brak prążków kwasu nukleinowego a. Brak lub zbyt niskie stężenie barwnika interkalującego a. Dobarwij żel kąpielą w roztworze z bromkiem etydyny b. Zbyt długa migracja próbek i ich ucieczka do buforu b. Kontroluj czas trwania rozdziału. Wyłącz zasilacz gdy niebieski barwnik będzie blisko końca żelu. 10
6. Akcesoria i wyposażenie dodatkowe Numer katalogowy Opis produktu 130-10MC 130-15MC 130-20MC Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/18 studzienek - kompatybilny z pipetą 8 kanałową Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/18 studzienek - kompatybilny z pipetą 8 kanałową Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/18 studzienek - kompatybilny z pipetą 8 kanałową 130-120 Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/10 studzienek 130-121 Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/10 studzienek 130-122 Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/10 studzienek 130-123 Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/20 studzienek 130-124 Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/20 studzienek 130-125 Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/20 studzienek 130-126 Grzebień SubDNA grubość: 1,0 mm/30 studzienek 130-127 Grzebień SubDNA grubość: 1,5 mm/30 studzienek 130-128 Grzebień SubDNA grubość: 2,0 mm/30 studzienek 130-140 Uchwyt do grzebienia SubDNA 130-N165 Saneczki na żel SubDNA o wymiarach 13 x 16 cm 130-N166 Saneczki na żel SubDNA o wymiarach 16 x 16 cm 130-N167 Stolik do wylewania żeli (z uszczelkami i pokrętłami dociskowymi) 100-140 Pojemnik z pokrywą, szklany, przezroczysty (20 x 16 x 4 cm) 100-141 Pojemnik z pokrywą, szklany, przezroczysty (16 x 12 x 4 cm) 196-100 Transluminator TFM-20V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-101 Transluminator TFM-26V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-102 Transluminator TFM-30V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 25 x 30 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-103 Transluminator TFM-40V (25 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 40 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-104 Transluminator TFML-20V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm 196-105 Transluminator TFML-26V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm 196-106 Transluminator TFML-30V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 25 x 30 cm 196-107 Transluminator TFML-40V (25 W), 302/365 nm, rozmiar pola 20 x 40 cm 196-108 Transluminator TFL-40V (25 W), 365 nm, rozmiar pola 20 x 40 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-109 Transluminator TFS-20V (25 W), 254 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-114 Transluminator M-15V (8 W), 302 nm, rozmiar pola 15 x 15 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 11
196-115 Transiluminator M-20V (8 W), 302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-116 Transiluminator M-26V (8 W), 302nm, rozmiar pola 21 x 26 cm, możliwość zmienności intensywności świecenia: wysoka, średnia, niska 196-117 Transiluminator LM-20E (8 W), 365/302 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm 196-118 Transiluminator LM-26E (8 W), 365/302 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm 196-119 Transiluminator LMS-20E (8 W), 365/302/25 nm, rozmiar pola 20 x 20 cm 196-120 Transiluminator LMS-26E (8 W), 365/302/254 nm, rozmiar pola 21 x 26 cm 12
7. Warunki gwarancji Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. gwarantuje, że dostarczony Państwu sprzęt został przetestowany i spełnia wszystkie warunki specyfikacji. Niniejsza gwarancja jest ważna przez 24 miesiące tylko wtedy, gdy produkt i jego funkcje zostały wykorzystane zgodnie z instrukcją obsługi i przeznaczeniem aparatu. Producent nie ponosi odpowiedzialności za straty lub szkody wynikające z nieprawidłowego użytkowania aparatu. Gwarancji nie podlega sprzęt, który nosi znamiona naprawy przez osoby inne niż wskazane przez firmę Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Odpowiedzialność producenta jest ograniczona do naprawy lub wymiany urządzenia, lub zwrotu kosztów zakupu. Firma Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne zastrzega sobie prawo do zmiany specyfikacji urządzenia bez wcześniejszego powiadomienia. Urządzenie powinno być obsługiwane wyłącznie przez osoby przeszkolone. 7.1 Formularz naprawy gwarancyjnej W przypadku wystąpienia awarii, uprzejmie prosimy o wypełnienie Formularza naprawy gwarancyjnej dostępnego na kolejnej stronie i skontaktowanie się z firmą Krzysztof Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne. Prosimy o zachowanie oryginalnych opakowań aparatu do czasu zakończenia okresu gwarancyjnego. 8. Wsparcie techniczne Jeżeli macie Państwo jakieś pytania dotyczące obsługi urządzenia lub dostępności akcesoriów i sprzętu uzupełniającego prosimy o kontakt z naszą Firmą. Kucharczyk Techniki Elektroforetyczne sp. z o.o. ul. Pawińskiego 5a/ blok D 02-106 Warszawa Tel. +48 22 668 71 47 Fax. +48 22 668 71 64 e-mail: info@kucharczyk 13
ZGŁOSZENIE SERWISOWE Nazwa Instytucji Adres Instytucji Osoba zgłaszająca Dane kontaktowe (tel., e-mail) Nazwa DANE URZĄDZENIA Model/nr katalogowy Numer seryjny Opis problemu/uszkodzenia Oświadczenie Niniejszym potwierdzam, że przesłane do serwisu urządzenie nie zawiera substancji chemicznych ani czynników infekcyjnych szkodliwych dla zdrowia człowieka. Data Podpis osoby zgłaszającej 14