DOZYMETRIA BIOLOGICZNA Wstęp Promieniowanie jonizujące jest stałym elementem środowiska a jego zastosowanie - częścią naszej cywilizacji. Praktycznie nie ma w nowoczesnym państwie człowieka, który nie korzystałby z tego zastosowania w swoim życiu codziennym. Wszelkiego rodzaju procedury medyczne, od zwykłego prześwietlenia płuc, aż po tomografię komputerową, czy procedury medycyny nuklearnej, energia pozyskiwana z elektrowni atomowych, czujniki dymu, defektoskopy wszystko to ma związek z promieniowaniem jonizującym. Jest ono postrzegane, i słusznie, jako szkodliwe dla zdrowia a nawet życia. Boimy się go, ponieważ czytamy o awariach elektrowni atomowych w Czarnobylu i Fukushimie. Boimy się go, ponieważ jest niewidzialne i niewyczuwalne, a więc tym groźniejsze. Potrafimy wykorzystywać promieniowanie i chronić się przed jego skutkami. Elektrownie atomowe są zabezpieczone dziesiątkami skomplikowanych systemów, które mogą zapobiegać nawet bardzo niespodziewanym zdarzeniom. Wszystkie osoby pracujące z promieniowaniem noszą dozymetry fizyczne i mają skrupulatnie sprawdzane dawki pochłonięte z częstotliwością co 3 miesiące. Potrafimy również odczytać dawkę promieniowania na podstawie zmian, jakie zostawia ona w organizmie. Taka procedura nazywa się dozymetrią biologiczną. 1. Co to jest dozymetria biologiczna? Dozymetria biologiczna pozwala określić dawkę promieniowania jonizującego na podstawie zmian spowodowanych przez nią w naszym organizmie. Najczęściej posługujemy się zmianami w materiale genetycznym limfocytów krwi obwodowej. Nie jest to jedyna możliwość, ale limfocyty maja niezaprzeczalne zalety: pobieranie ich do badania jest mało inwazyjne (tak jak zwykłe pobieranie krwi do badania), limfocyty we krwi obwodowej nie dzielą się i są zsynchronizowane w fazie G 0 cyklu komórkowego co ułatwia i zmniejsza niepewność badań dozymetrycznych, limfocyty krążą wraz z krwią po całym ciele, dzięki czemu możliwe jest odczytanie dawki, nawet kiedy promieniowanie objęło niewielki fragment ciała. Można by powiedzieć, że najlepszy dozymetr każdy zawsze nosi ze sobą. Złotym standardem dozymetrii biologicznej jest test chromosomów dicentrycznych. Wykonuje się go stymulując sztucznie do podziału limfocyty krwi obwodowej i oceniając częstość chromosomów dicentrycznych w metafazach pierwszych mitoz po napromienieniu. Dozymetrię biologiczną stosuje się na całym świecie i do tej pory oszacowano dawkę pochłoniętą w tysiącach przypadków. Bada się osoby podejrzane o narażenie na promieniowanie jonizujące związane z ich pracą w przemyśle przy obsłudze defektoskopów czy innych źródeł promieniowania gamma i rentgenowskiego, w medycynie przy obsłudze akceleratorów, cyklotronów lub generatorów izotopów promieniotwórczych, a także aparatów do radioterapii, do prześwietlania czy tomografów komputerowych, wreszcie w przemyśle jądrowym, przy obsłudze reaktorów, transporcie i obróbce paliwa. Drugą grupą osób, u których stosuje się dozymetrię biologiczną są osoby przypadkowo narażone na promieniowanie w czasie radioterapii, lub po kontakcie z otwartym źródłem promieniowania. W ostatnich latach rozważa się scenariusze ataku terrorystycznego przy użyciu tzw. brudnej bomby. Brudna bomba, czyli materiał radioaktywny np. 60 Co lub 137 Ce dołączony do
konwencjonalnego materiału wybuchowego mógłby zostać rozpylony na dużym, gęsto zaludnionym obszarze i w konsekwencji spowodować napromienienie wielu osób. Pewne i dokładne odczytanie dawki pochłoniętej przez osobę napromienioną może pomóc w doborze odpowiednich procedur medycznych w trakcie jej leczenia [1]. Dziesiątki lat pracy radiobiologów zaowocowały zrozumieniem mechanizmów działania promieniowania na ludzkie komórki, opisem i scharakteryzowaniem ostrej choroby popromiennej (ARS), a także stochastycznych (oddalonych) skutków promieniowania. Medycyna, bazując na faktach ustalonych przez biologów, wie jak postępować z osobami napromienionymi. Adekwatne do dawki i objawów fizjologicznych zastosowanie terapii cytokinami, czynnikami wzrostu, antybiotykami, a w skrajnym wypadku przeszczep szpiku kostnego pozwalają na wyleczenie pacjentów, którzy otrzymali dawki nawet w przedziale 4-6 siwertów (Sv) na całe ciało [2]. Ramka: Dawka pochłonięta jest to miara ilościowa energii promieniowania jonizującego pochłoniętego przez dany obiekt. Jest ona wyrażana w grejach (Gy): 1Gy = 1J / 1 kg. Można stosować również centygreje (cgy): 1cGy = 0,01Gy, miligreje (mgy): 1mGy = 0,001Gy, mikogreje (μgy): 1μGy = 0,000001Gy, rady: 1 rad = 1cGy = 0,01Gy. Dawka równoważna - efekty promieniowania są różne w zależności od jego rodzaju i dlatego wprowadzono ten termin. Dawka równoważna to dawka pochłonięta przemnożona przez współczynnik w R, charakterystyczny dla poszczególnych rodzajów promieniowania, np. w R dla promieniowania gamma równa się 1, a dla neutronów o energiach 0,1-2 MeV wynosi 20. Jest ona wyrażana w siwertach (Sv): 1 Sv = 1Gy * w R. Stosuje się również milisiwerty (msv): 1mSv = 0,001Sv, mikrosiwerty (μsv): 1μSv = 0,000001Sv, remy: 1 rem = 0,01 Sv. Dawka skuteczna (dawka efektywna, czy efektywny równoważnik dawki) zależy od promieniowrażliwości tkanek, bo niektóre z nich są bardziej odporne na promieniowanie, np. skóra (w T = 0,01), a inne mniej np. gruczoły płciowe (w T = 0,2). Dawka skuteczna to dawka równoważna pomnożona przez współczynnik w T, charakterystyczny dla każdej tkanki. Współczynnik w T dla całego ciała równa się 1. Jednostką dawki skutecznej również jest siwert (Sv). 2. Metody dozymetrii biologicznej Oprócz testu chromosomów dicentrycznych w dozymetrii biologicznej używanych jest wiele innych metod. W ostatnich latach przesunął się nieco akcent w definiowaniu celów dozymetrii biologicznej: istotniejsze jest, aby metody biodozymetryczne pozwalały na analizę wielu przypadków w krótkim czasie, nawet kosztem dokładności. Inną tendencją jest powstawanie fizycznych testów dozymetrycznych opartych, tak jak dozymetria biologiczna, na zmianach wywoływanych przez promieniowanie w naszym organizmie. W krótkim przeglądzie aktualnie używanych testów biodozymetrycznych oprócz wyjaśnienia, na czym one polegają zwrócę uwagę na zakres ich stosowania, możliwość użycia w dużej liczbie przypadków, a także na ich przydatność w szeroko pojętej energetyce jądrowej. TEST CHROMOSOMÓW DICENTRYCZNYCH
Tak jak pisałem wyżej, jest to klasyczny, cytogenetyczny test dozymetrii biologicznej. W stymulowanych do podziału limfocytach analizuje się częstość chromosomów policentrycznych (ryc. 1), która jest proporcjonalna do dawki. Na podstawie znalezionej w konkretnym przypadku częstości dicentryków określa się dawkę z krzywej dawka / efekt uzyskanej we wcześniejszych doświadczeniach in vitro (ryc. 2). Zalety tego testu są następujące: - jest on przeprowadzany na limfocytach krwi obwodowej; - pozwala na rozróżnienie czy dana osoba była napromieniona na całe ciało czy częściowo jest to ważne z przyczyn medycznych, gdy napromienienie ciała jest częściowe, rokowania są lepsze, ponieważ produkujący limfocyty szpik kostny nie został w całości dezaktywowany; - częstość chromosomów dicentrycznych utrzymuje się we krwi obwodowej na zbliżonym poziomie do kilku tygodni, a później wolno spada, dzięki czemu dozymetrię można przeprowadzić w rozsądnym czasie po zdarzeniu radiacyjnym; - test ten jest najczęściej używanym, najlepiej udokumentowanym i najlepiej sprawdzonym w praktyce (zwalidowanym) testem biodozymetrycznym [3]; - działa w zakresie dawek od 0,1 0,2 Sv do 5 12 Sv. Powstaje pytanie, co znaczy zakres 0,1 12 Sv? Czy jest on szeroki, czy wąski? Czy jest adekwatny do dawek otrzymywanych przez ludzi? Jeżeli popatrzymy na przykładowe wielkości dawek zamieszczone w tabeli 1, to dojdziemy do wniosku, że test dicentryków jest zbyt mało czuły do analizy dawek, które otrzymują pracownicy zawodowo narażeni na promieniowanie. Idealnie natomiast pokrywa zakres dawek wysokich, liczonych w siwertach (Sv), które powodują kłopoty zdrowotne, a nawet śmierć napromienionych osób. Spontaniczna częstość dicentryków jest bardzo niska i wynosi 1 chromosom dicentryczny na 1000 2000 komórek. Górna granica zakresu działania metody jest sprawą dyskusyjną zależy ona od wysokości dawki, po jakiej limfocyty jeszcze się dzielą. W niektórych laboratoriach jest to 5 Sv, ale w Centrum Radiobiologii i Dozymetrii Biologicznej Instytutu Chemii i Techniki Jądrowej, gdzie mam przyjemność pracować, ta granica jest wyższa niż 10 Sv; - jest on bardzo specyficzny chromosomy dicentryczne są indukowane tylko przez promieniowanie, nieliczne substancje genotoksyczne i nieliczne zmiany genetyczne. Największą wadą testu dicentrycznego jest jego pracochłonność, co ogranicza liczbę możliwych do analizy próbek i to, że jego wykonanie wymaga doświadczonego personelu. Aktualnie pracuje się nad przystosowaniem testu dicentryków do użycia na masową skalę. Proponowane są 4 możliwe drogi do osiągnięcia tego celu: obniżenie liczby liczonych komórek, czyli zwiększenie szybkości analizy kosztem dokładności [4], grupowanie laboratoriów biodozymetrycznych w funkcjonalnie działające sieci, teledozymetria, czyli analiza częstości dicentryków na wysokiej jakości zdjęciach przesyłanych do ekspertów przez internet oraz automatyzacja metody i liczenia dicentryków. W Europie trwają próby wykorzystania automatycznych mikroskopów z systemem do analizy obrazu niemieckiej firmy Metasystems (ryc. 3), co pozwoli zautomatyzować proces liczenia. W Stanach Zjednoczonych w Bethesda, Maryland, działa już laboratorium biodozymetryczne, gdzie wszystkie etapy testu dicentryków, począwszy od założenia hodowli, poprzez wykonanie preparatów, aż do liczenia częstości dicentryków są zautomatyzowane, co pozwala analizować setki przypadków tygodniowo [5].
Dawka 0,001 Sv/rok 1 msv/rok 0,0012 Sv/rok 1,12 msv/rok 0,003 Sv/rok 3,0 msv/rok 0,0035 Sv/rok 3,5 msv/rok 0,020 Sv/rok 20,0 msv/rok 1-2 Sv 1000-2000 msv 3-5 Sv 3000-5000 msv Opis Dopuszczalna dawka roczna dla osoby nie pracującej z promieniowaniem, otrzymana z innych źródeł niż medyczne i promieniowanie naturalne według polskiego prawa i zaleceń ICRP (Międzynarodowej Komisji Ochrony Radiologicznej); Średnia dawka roczna pracowników elektrowni atomowych w Korei Południowej w 1997 roku, otrzymana z innych źródeł niż medyczne i promieniowanie naturalne [6]; Średnia dawka roczna pracowników przemysłu jądrowego w USA, otrzymana z innych źródeł niż medyczne i promieniowanie naturalne [7]; Średnia dawka roczna mieszkańca Polski otrzymywana, ze źródeł medycznych i naturalnych; Średnia dawka roczna, w ciągu pięciu lat dla pracowników zawodowo narażonych na promieniowanie według ICRP (Międzynarodowej Komisji Ochrony Radiologicznej dawka nie może w ciągu pięciu lat przekroczyć 0,100 Sv, a w ciągu roku 0,050 Sv); Jeżeli dostarczona w krótkim czasie może powodować ostrą chorobę popromienną (ARS) i wymaga opieki medycznej; Półletalna dawka dla człowieka (LD50/30) umiera 50% osób w ciągu 30 dni; Tabela 1. Przykładowe wielkości dawek promieniowania. Ryc. 1. Limfocyt ludzki krwi obwodowej w trakcie mitozy. Widoczne liczne, indukowane promieniowaniem jonizującym, aberracje strzałkami zaznaczono fragmenty centryczne chromosomów, a w ramkach znajdują się chromosom dicentryczny i chromosom tricentryczny.
Liczba dicentryków / komórka Dawka, Gy Ryc. 2. Krzywa dawka efekt dla chromosomów dicentrycznych, uzyskana in vitro. Znając częstość dicentryków w danej próbce krwi, można odczytać dawkę promieniowania [3]. Ryc. 3. Automatyczny mikroskop Zeiss Image Z2 połączony systemem do analizy obrazu Metafer MSearch firmy Metasystems, Niemcy w Centrum Radiobiologii i Dozymetrii Biologicznej Instytutu Chemii i Techniki Jądrowej. TEST MIKROJĄDROWY Jest to drugi z klasycznych, cytogenetycznych testów biodozymetrii. W stymulowanych do podziału limfocytach blokuje się podział cytoplazmy komórek, pozwalając na podział jąder. W tak powstałych komórkach dwujądrzastych analizuje się
częstość mikrojąder, czyli kulistych tworów otoczonych błoną jądrową widocznych w cytoplazmie (ryc. 4). Mikrojądra powstają z części lub całych chromosomów w następstwie napromienienia komórek bądź działania różnych czynników chemicznych [8]. Częstość mikrojąder jest proporcjonalna do dawki w sposób liniowo kwadratowy. Dawkę promieniowania odczytuje się z częstości mikrojąder, porównując do krzywych dawka efekt uzyskanych w eksperymentach in vitro (podobnych do krzywych dla chromosomów dicentrycznych). Test mikrojądrowy ma następujące zalety: - jest przeprowadzany na limfocytach krwi obwodowej; - jest prosty; analiza częstości mikrojąder nie jest tak pracochłonna jak analiza dicentryków, nie wymaga również dużego doświadczenia; - idealnie nadaje się do automatyzacji. Do tej pory podjęto szereg prób automatyzacji testu mikrojadrowego [9]. Najbardziej zaawansowane jest oprogramowanie MnScore niemieckiej firmy Metasystems, walidowane w ramach projektu MULTIBIODOSE (wyjaśnienie w ramce) w kilku europejskich laboratoriach (ryc. 5). Automatyzacja testu mikrojądrowego daje możliwość analizy nawet setek próbek w ciągu tygodnia przez 1 laboratorium; - działa w zakresie od 0,2-0,5 Sv do 3,0 4,0 Sv. Tak jak test chromosomów dicentrycznych jest zbyt mało czuły do analizy dawek, które otrzymują pracownicy zawodowo narażeni na promieniowanie, ale pokrywa zakres dawek potencjalnie możliwych do otrzymania w razie zdarzenia radiacyjnego. Najmniejsza możliwa do oszacowania dawka jest stosunkowo wysoka, ponieważ bardzo zmienny jest spontaniczny poziom mikrojąder. Wiadomo również, że zależy on od wieku i płci. Czułość testu mikrojądrowego w zakresie niskich dawek można podnieść poprzez malowanie centromerów metodą hybrydyzacji in situ [10]. Mikrojądra powstałe spontanicznie zawierają centromery, natomiast mikrojądra indukowane przez czynniki genotoksyczne (takie jak promieniowanie) najczęściej nie zawierają centromerów. Tak więc, analiza chromosomów bez centromerów pozwala ominąć problem wysokiej i różnorodnej częstości kontrolnych mikrojąder. jądra mikrojądra Ryc. 4. Limfocyt z 2 jądrami, widoczną otaczającą je cytoplazmą i 2 indukowanymi promieniowaniem mikrojądrami.
Ryc. 5. Galeria dwujądrzastych limfocytów z mikrojądrami utworzona po przeszukaniu preparatu przez program MSearch (Metafer, Metasystems). Test mikrojądrowy nie jest idealnym biodozymetrem. Wysoka częstość spontanicznych mikrojąder, brak możliwości rozpoznania częściowego napromienienia ciała, stosunkowo wąski zakres dawek, przy których test ten dział, brak możliwości dozymetrii retrospektywnej, (ponieważ poziom mikrojąder w limfocytach krwi obwodowej szybko spada wraz z czasem), to że mikrojądra nie są specyficzne dla promieniowania, ale indukowane są również różnymi substancjami chemicznymi wszystko to powoduje znaczne ograniczenia w jego użyteczności. Ramka: MULTIBIODOSE Multidyscyplinarne narzędzie biodozymetryczne w przypadkach masowego narażenia na promieniowanie jonizujące (Multi-disciplinary biodosimetric tools to manage high scale radiological casualties) projekt współfinansowany przez Unię Europejską. Jego celem jest przeanalizowanie użyteczności szerokiego spektrum technik biodozymetrycznych i dostosowanie ich do masowego zdarzenia radiacyjnego. Projekt jest realizowany w 14 laboratoriach z 11 krajów, w tym w Polsce w Instytucie Chemii i Techniki Jądrowej w Warszawie. Link do strony projektu: http://www.multibiodose.eu/index.htm TEST OGNISK HISTONU GAMMA-H2AX Jest to nowy, bardzo obiecujący test biodozymetryczny. Polega on na szacowaniu liczby ognisk ufosforylowanych cząsteczek histonu gamma-h2ax w jądrach napromienionych limfocytów. Powstanie indukowanych promieniowaniem dwuniciowych pęknięć DNA powoduje, że histon H2AX, wchodzący w skład rdzenia nukleosomu (cząstki białkowej, na którą nawinięty jest DNA) zostaje ufosforylowany przez kinazy ATM i DNA- PK i tworzy tzw. ogniska. Ogniska histonu gamma-h2ax można wyznakować immunofluorescyjnie i obserwować pod mikroskopem (ryc. 5). Ich liczba jest proporcjonalna
do dawki promieniowania w sposób liniowy. Dawkę promieniowania odczytuje się z liczby ognisk, porównując ją do krzywej dawka-efekt uzyskanej w doświadczeniach in vitro, tak jak w przypadku testu chromosomów dicentrycznych, czy testu mikrojądrowego. Zalety testu ognisk histonu gamma-h2ax są następujące: - może być przeprowadzony na limfocytach krwi obwodowej; - potencjalnie pozwoli rozpoznawać częściowe napromienienie ciała, ale na razie nie jest to wystarczająco udokumentowane; - jest prosty w wykonaniu, wynik można uzyskać już w kilka godzin po dostarczeniu próbki krwi, co jest niemożliwe zarówno w przypadku testu chromosomów dicentrycznych, jak i testu mikrojądrowego, gdzie trzeba czekać, aż limfocyty podzielą się, co najmniej 48 godzin; - doskonale nadaje się do automatyzacji i w efekcie możliwy do zastosowania jako test przesiewowy (triage), w krótkim czasie u dużej liczby osób; - można go stosować potencjalnie w zakresie od kilku minisv do kilku Sv. To jest ogromny zakres dawek, większy niż przy teście chromosomów dicentrycznych czy teście mikrojądrowym. Problemem jest, że zakres możliwych do odczytania dawek zmienia się wraz z upływem czasu od ekspozycji, ponieważ liczba ognisk histonu zmniejsza się wraz z upływem czasu (ryc. 6). Wielkość dawki rzędu milisv jest możliwa do odczytania tylko do około 2-3 godzin po napromienieniu. Za realny zakres dawek możliwych do odczytania przy analizie automatycznej przyjmuje się, w zależności od autora, od 0,1 do 2 Sv albo od 0,6 do 2 Sv [11]. Tak więc, powyższy test również nie nadaje się do oceny dawek związanych z pracą zawodową które zazwyczaj podawane są przy małej mocy dawki, w długim czasie. Ryc. 5. Ogniska histonu gamma-h2ax - widoczne jądro limfocytu w 1 godzinę po napromienieniu i zielone ogniska histonu gamma-h2ax wyznakowane immunofluorescencyjnie. Oprócz licznych wymienionych zalet, test ognisk histonu gamma-h2ax ma również swoje ograniczenia. Po pierwsze, jak już wspomniałem, liczba ognisk histonu spada w krótkim czasie od napromieniania, co powoduje, że próbka krwi musi być szybko dostarczona do laboratorium, a już po 48 godzinach poziom tego histonu wraca do wartości kontrolnych. Jako zupełnie nowy, test ten był użyty w dozymetrii tylko w kilku przypadkach; istnieje ogromna liczba protokołów proponujących, jak otrzymywać wybarwione ogniska histonu gamma-h2ax i jak oceniać ich liczbę. Nie wiadomo, czy zastosowanie różnych protokołów daje porównywalne wyniki i generalnie test czeka na standaryzację i walidację. Jednym z zadań wspomnianego wcześniej projektu MULTIBIODOSE jest stworzenie tzw. SOP (Standard Operation Procedure) oraz właśnie standaryzacja i walidacja tego testu. Być może, test ognisk histonu gamma-h2ax mógłby być użyty jako tzw. test predykcyjny, dla pracowników zawodowo narażonych na promieniowanie. Polegałby on na
tym, że próbki krwi zostają napromienione in vitro i analizuje się np. kinetykę zaniku histonu. Jeżeli u badanej osoby odbiegałaby ona od normy (średniej dla populacji) to- być może - ta osoba jest bardziej promieniowrażliwa i nie powinna pracować z promieniowaniem. Od bardzo dawna trwają poszukiwania takiej metody, pozwalającej w stosunkowo prosty sposób oszacować promieniowrażliwość osobniczą, do tej pory raczej bez sukcesu. Średnia częstość ognisk histonu gamma-h2ax na komórkę minuty Ryc. 6. Zależność liczby ognisk histonu gamma-h2ax od czasu w limfocytach ludzkich napromienionych 0,5 Gy promieniowania gamma [11]. Widać, że po 3 godzinach od napromienienia poziom histonu zbliża się do wartości kontrolnych. ANALIZA TRANSLOKACJI Translokacje są stabilnymi aberracjami chromosomowymi (ryc. 7). Indukowane są przez promieniowanie jonizujące z częstością równą dicentrykom i ich częstość jest proporcjonalna do dawki promieniowania. Jednak w odróżnieniu od dicentryków nie powodują one śmierci mitotycznej komórek i w konsekwencji ich częstość nie maleje z czasem, a więc lepiej nadają się do dozymetrii retrospektywnej (przeprowadzonej nawet wiele lat po zdarzeniu radiacyjnym). Inne zalety analizy translokacji w celach dozymetrycznych są analogiczne do zalet testu chromosomów dicentrycznych: - translokacje analizuje się w limfocytach krwi obwodowej; - test pozwala na rozróżnienie, czy dana osoba była napromieniona na całe ciało czy częściowo; - można go stosować w zakresie dawek od 0,1 0,2 Sv do 5 12 Sv. Spontaniczna częstość translokacji jest wyższa niż spontaniczna częstość dicentryków, ale na tyle niska, żeby nie mieć wpływu na dolny limit rozpoznawalnych dawek. Największą wadą analizy translokacji jest wysoka cena testu. Żeby zobaczyć translokację należy pomalować jedną, dwie, trzy bądź wszystkie pary chromosomów na różne kolory, bo chromosomy z translokacją strukturalnie nie różnią się od niezmienionych. Dopiero malowanie pozwala zidentyfikować przeniesiony fragment i rozpoznać translokację (ryc. 8). Procedura malowania chromosomów nazywa się FISH (Fluorescence In Situ Hybridization), jest dosyć skomplikowana i droga. Powoduje to, że analiza translokacji, jako test biodozymetryczny, nie jest tak często używana jak test chromosomów dicentrycznych i dzięki temu nie jest tak dobrze zwalidowana i standaryzowana.
Specjalna odmiana tego testu, analiza translokacji stabilnych powinna być testem z wyboru przy monitoringu wpływu permanentnych (dostarczanych nawet przez dziesięciolecia) niskich dawek promieniowania na genom. Jest to sytuacja osób pracujących z promieniowaniem, w tym szczególnie pracowników przemysłu jądrowego. Powinni oni co kilka lat być testowani na obecność translokacji w swoim genomie, najlepiej poprzez malowanie wszystkich chromosomów czyli tzw. procedurę mfish (ryc. 9). Dotychczas opublikowano szereg prac wykorzystujących technikę FISH i pokazujących różny wpływ niskich dawek na wieloletnich pracowników zawodowo narażonych na promieniowanie [12]. Ryc. 7. Limfocyt ludzki w trakcie mitozy, z widocznymi chromosomami. Na zielono pomalowane chromosomy 2. Widoczna translokacja wzajemna pomiędzy chromosomem 2 a chromosomem nie pomalowanym oraz jeden niezmieniony chromosom 2. Ryc. 8. Translokacja nie są widoczne jako strukturalne zmiany w chromosomach (lewa strona ryciny). Dopiero po pomalowaniu widać, że niewielka część czerwonego chromosomu jest przeniesiona na czarny chromosom, podobnie jak część czarnego chromosomu jest przyłączona do czerwonego chromosomu.
Ryc. 9. Mitoza ludzkiego limfocytu, każda para chromosomów pomalowana na inny kolor, przy pomocy techniki m-fish, dzięki czemu można analizować częstość translokacji w całym genomie. Widoczne również 3 interfazowe jądra limfocytów z pomalowanymi na różne kolory, wyodrębnionymi terytoriami chromosomowymi. PRZEDWCZESNA KONDENSACJA CHROMOSOMÓW (PCC PREMATURE CHROMOSOME CONDENSATION) Technika ta po raz pierwszy w celach dozymetrycznych została użyta po wypadku w Zakładach Przetwarzania Paliwa Jądrowego (JCO) w Tokai-mura w Japonii, gdzie 3 osoby otrzymały bardzo duże dawki promieniowania w 1999 roku [13]. Jest to technika z wyboru, kiedy przewidywane dawki pochłonięte są na tyle wysokie (> 5-10 Sv), że prawdopodobnie uniemożliwią stymulowanym limfocytom dojście do fazy mitozy. Jeżeli limfocyty zostaną zatrzymane wcześniej w cyklu komórkowym, to analiza częstości chromosomów dicentrycznych, mikrojąder czy translokacji jest niemożliwa. Dodając do hodowli pewnych substancji chemicznych inhibitorów fosfataz białkowych, takich jak kwas okadajowy czy kalikulina A, można jednak spowodować kondensację chromosomów niemal we wszystkich fazach cyklu podziału komórkowego, niezależnie od dawki promieniowania (ryc. 10). W przypadku biodozymetrii używa się limfocytów i kondensuje się chromosomy w fazie G2 i mitozie, a następnie analizuje się częstości szeroko rozumianych morfologicznych i numerycznych zmian w chromosomach, proporcjonalnych do dawki promieniowania, takich jak częstości pierścieni, liczbę dodatkowych fragmentów PCC czyli fragmentów acentrycznych nadmiarowych w stosunku do liczby chromosomów dla danego gatunku albo stosunek częstości super-długich fragmentów acentrycznych do ogólnej liczby fragmentów PCC. Zalety testu PCC są następujące: - wykonywany jest na limfocytach ludzkich; - działa w zakresie dawek od 0,1 0,2 Sv aż do nawet 40 Sv, jednak - ponieważ analiza jest żmudniejsza i trudniejsza niż w przypadku testu chromosomów dicentrycznych, stosuje się go tylko przy dużych dawkach promieniowania.
Należy podkreślić, że metoda PCC wykonywana w limfocytach ludzkich wymaga ich uprzedniego stymulowania do podziału i efektywnie jest stosowana dopiero, kiedy komórki znajdą się w późnej fazie G2, czyli po około 45-48 godzinach hodowli. Tak więc, żeby rozpocząć przygotowywanie preparatów mikroskopowych muszą upłynąć 2 doby. Podobnie jest w przypadku testu chromosomów dicentrycznych czy analizy translokacji, a w przypadku testu mikrojąder preparaty wykonuje się nawet po 3 dobach hodowli. faza G2 faza S Ryc. 10. Limfocyty ludzkie ze skondensowanymi przez inhibitor fosfataz chromosomami w różnych fazach cyklu komórkowego: fazie S i fazie G2. W celach biodozymetrycznych używa się komórek w fazie G2 i mitozie. Istnieje możliwość zastosowania metody PCC w niestymulowanych limfocytach poddanych działaniu kinazo-zależnej cykliny B oraz kalikuliny A (metoda nazwana RICA Rapid Interphase Chromosome Assay). W tym przypadku ocenia się liczbę obszarów, na jakie podzielone są terytoria chromosomowe, widoczne dzięki hybrydyzacji in situ (FISH) w częściowo skondensowany jądrach interfazowych [14]. Zaletą tej metody jest skrócenie czasu hodowli komórek z 48 do kilku godzin, oraz łatwość jej wykonania. Zastosowanie metody pozwala istotnie skrócić czas uzyskania wyników biodozymetrii i używać jej jako testu przesiewowego (triage) u dużej liczby potencjalnie napromienionych osób. Metoda jest obiecująca, ale słabo udokumentowana (3 publikacje) i używana tylko w jednym laboratorium na świecie w AFRRI (Armed Forces Radiobiology Research Institute) w Stanach Zjednoczonych. MOLEKULARNE BIOWSKAŹNIKI NAPROMIENIENIA Nie są to jeszcze metody dozymetrii biologicznej, ale prowadzone są prace nad wykorzystaniem molekularnych biowskaźników promieniowania do tego celu. Wiadomo, że w napromienionych komórkach zmienia się poziom ekspresji pewnych grup białek, np. białek naprawy DNA, sygnalizacji tej naprawy, proto-onkogenów itp. Zmiana stężenia białek w komórce musi się wiązać ze zmianą aktywności kodujących je genów. Zwiększa się poziom transkrypcji i powstaje więcej kopii m-rna odpowiadającego tym białkom. Możliwe jest badanie zmian profilu ekspresji genów w komórce, poziomu m-rna dla poszczególnych
białek jak i poziomu samych białek (ryc. 12) i to są właśnie molekularne wskaźniki napromienienia. mikromacierze DNA DNA transkrypcja m-rna kodujące geny transkrybowane w komórce różne rodzaje i stężenia białek translacja badanie poziomu białek w komórkach czy surowicy krwi poziom m-rna dla poszczególnych białek przy pomocy RT-PCR Ryc. 12. Schemat komórki z drogą od informacji zapisanej w DNA do zsyntetyzowania białek. Po napromienieniu zmienia się poziom i wzór transkrypcji w jądrze komórkowym. Powstaje inny koktajl m-rna w cytoplazmie, a na końcu syntetyzowane są różne białka. Zarówno wzór ekspresji genów, poziom m-rna jak i poziom białek w komórce mogą służyć jako molekularne biowskaźniki napromienienia. Ryc. 13. Przykład mikromacierzy DNA. Wzór punktów odwzorowuje wzór ekspresji genów w danej tkance i jest zmieniany nawet przez niewielkie dawki promieniowania (źródło Wikipedia).
Zmiana profilu ekspresji genów badana jest przy pomocy tzw. mikromacierzy DNA (DNA microarrays). W ogromnym uproszczeniu na płytce (szkiełku) znajduje się naniesiona kolekcja fragmentów genów w postaci jednoniciowego DNA i jeżeli nakropimy na nią jednoniciowe fragmenty c-dna, przepisane z m-rna ekstrahowanego z badanych komórek, to otrzymamy mapę wszystkich genów, jakie są aktywne w badanych komórkach (ryc. 13). Można rozróżnić wolne miejsca na płytce od zapełnionych gdzie badane c-dna hybrydyzowało z DNA przyczepionym do płytki. W ten sposób można obserwować zmianę ekspresji dziesiątek tysięcy genów jednocześnie. Wiadomo, że mikromacierz po napromienieniu nawet zupełnie małymi dawkami promieniowania (rzędu milisiwertów) wygląda inaczej niż macierz przed napromienieniem. W przypadku rzeczywistej biodozymetrii nie mamy jednak dostępnej macierzy przed napromienieniem. Dodatkowo, ekspresja genów u danej osoby w danej tkance może się zmieniać w czasie pod wpływem całej gamy czynników fizjologicznych. Poza tym metoda jest słabo powtarzalna, droga i skomplikowana. Dzięki technice mikromacierzy DNA zidentyfikowano setki, jeżeli nie tysiące genów, które ulegają nadekspresji lub ich ekspresja jest zmniejszona po działaniu promieniowania. Potencjalnie każdy z tych genów mógłby być molekularnym biodozymetrem, bo zmianę jego ekspresji po napromienieniu można obserwować jako zmianę poziomu m-rna w danej tkance przy pomocy techniki RT-PCR (Real Time Polymerase Chain Reaction). Trwają prace nad wybraniem tkanki (limfocyty krwi obwodowej, surowica krwi) i odpowiednich genów, których ekspresja byłaby promieniozależna, stała dla wszystkich dawców i niezależna od mikrośrodowiska komórkowego oraz stanu fizjologicznego. Do tej pory wstępnie przebadano szereg genów np: CDKN1A, GADD45A, SENS1, BAX, DDB2 [15, 16] i uzyskano dobrze rokujące krzywe zależności dawka-efekt. Metoda jest obiecująca, bo - posiadając odpowiedni sprzęt - wynik pokazujący poziom ekspresji wybranego genu można by uzyskać po około 8 godzinach i u stosunkowo dużej liczby osób. Stężenie białka GADD45 w ekstrakcie komórek ludzkiej krwi (pg/ μl) Dawka, Gy Ryc. 14. Krzywa dawka-efekt dla stężenia białka GADD45 w napromienionych komórkach krwi, po 24 i 48 godzinach [17].
Poziom białek można mierzyć zarówno w ekstraktach z komórek (np. limfocytów), jak i surowicy krwi. Dużo prac w tym kierunku przeprowadzali naukowcy ze wspomnianego już wcześniej amerykańskiego instytutu AFRRI. Stwierdzili oni wzrost poziomu białek Ras p21 i Raf w ludzkich limfocytach krwi obwodowej po działaniu 0,1 i 0,75 Gy promieniowania X. Badali ponadto poziom różnych białek w surowicy krwi napromienionych myszy [17]. Stosowali metod ELISA, a wzrost poziomu wytypowanych białek oznaczali jako % poziomu wszystkich białek. Test ELISA z powodu jego pracochłonności i stopnia skomplikowania w żaden sposób nie może jednak służyć jako podstawa testu biodozymetrycznego. Dużo bardziej zaawansowane prace dotyczyły białka GADD45 [17]. Oznaczano jego poziom w zależności od dawki w zakresie 0-6 Gy promieniowania X, zarówno w surowicy krwi obwodowej jak i ekstrakcie komórek krwi i uzyskano obiecujące krzywe dawka efekt (ryc. 14). Dodatkowo okazało się, że metoda pozwala rozpoznać częściowe napromienienie ciała. Ważne jest też, że poziom tego białka nie oznaczano standardowo testem ELISA, ale metodą immunofluorescencyjną opierającą się technice mikrosfer Luminex, która wykorzystuje cytometr przepływowy do odczytywania wielkości sygnału. Jest ona prosta, szybka i w pełni zautomatyzowana. Choć na dzień dzisiejszy żaden z omówionych molekularnych wskaźników napromienienia nie jest jeszcze wystarczająco opracowany by mógł służyć jako test biodozymetryczny (może poza automatyczną analizą białka GADD45 w limfocytach i surowicy krwi) to wydaje się, że potencjalnie spełniają one wszystkie ku temu warunki i w najbliższej przyszłości mogą stać się konkurencja dla testów cytogenetycznych. BIODOZYMETRIA MEDYCZNA NA PODSTAWIE OBJAWÓW Wysokie dawki promieniowania mogą powodować objawy chorobowe, takie jak spadek liczby limfocytów we krwi obwodowej (od 1 Sv), wymioty (od 1 Sv), biegunka (od 4 Sv), bóle głowy (od 2 Sv), wzrost temperatury (od 2 Sv) czy utrata przytomności (od 6 Sv) [18]. Chociaż nie są to objawy specyficzne, doświadczeni lekarze, szczególnie, kiedy wiedzą, że w grę mogło wchodzić promieniowanie, mogą na ich podstawie określić, czy dana osoba została napromieniona i oszacować w przybliżeniu dawkę. Jednak co najmniej 4 powody zmniejszają atrakcyjność takiego szacunku jako biodozymetru. Po pierwsze, dolna granica metody to dawki rzędu 1-3 Gy, a więc bardzo wysokie, praktycznie spotykane tylko przy poważnych wypadkach radiacyjnych. Metoda nie nadaje się więc do oceny niskich dawek u pracowników zawodowo narażonych na promieniowanie. Po drugie, wymienione wyżej objawy chorobowe (z wyjątkiem spadku poziomu limfocytów) u jednych osób występują już po 1 Sv, a u innych dopiero po 3 Sv i różne jest ich nasilenie. Po trzecie, są to objawy niespecyficzne i mogą być wywołane z tysiąca innych powodów. I wreszcie ostatni powód zauważono, że w czasie jakichkolwiek sytuacji zbiorowego narażenia część osób, które tak naprawdę nie zostały napromienione (czy np. skażone chemicznie, bo zjawisko jest szersze) będzie miało symptomy jak po otrzymaniu dużej dawki, bądź będzie się czuło poszkodowane i domagało opieki medycznej. Są to tzw. pacjenci worried well, a występujące u nich symptomy, całkiem poważne - wymioty, biegunka, bóle głowy czy gorączka - mają podłoże psychiczne. Biodozymetria medyczna jest wpisana w tzw. triage medyczny czyli w algorytmy podziału poszkodowanych na grupy na miejscu zdarzenia w sytuacji masowego narażenia wielu osób [2]. Bardzo ważne jest ustalenie w tego typu sytuacjach, czy zdarzenie jest związane z promieniowaniem (np. atak przy użyciu brudnej bomby ). Jeżeli tak, to w przygotowanym do tego celu szpitalu powinien odbyć się kolejny triage medyczny, już ukierunkowany na rozpoznanie osób napromienionych i pobranie materiału do biodozymetrii cytogenetycznej, która ustali dokładne wysokości dawek pochłoniętych. Ustalenie wysokości dawki ma znaczenie przy doborze stosowanych procedur medycznych. Wiele różnych schematów postępowania w tego typu sytuacjach zostało przeanalizowane i opisane w
podręczniku TMT Handbook, Triage, Monitoring and Treatment of people exposed to ionising radiation following malevolent act, 2009 (więcej informacji na stronie www.tmthandbook.org). Najważniejszym z symptomów, na którym można oprzeć szacowanie dawki w szpitalu jest spadek liczby limfocytów krwi obwodowej. Wiadomo, że liczba limfocytów u zdrowej osoby waha się w granicach od 1400 do 3500 w mm 3 krwi [5]. Po napromienieniu liczba ta spada tak jak to pokazano na ryc. 15, aż do zera przy bardzo wysokich dawkach. Ryc. 15. Spadek liczby limfocytów we krwi obwodowej po 1 i 2 dniach od napromienienia całego ciała [19]. DOZYMETRIA PRZY POMOCY SPEKTROSKOPII ELEKTRONOWEGO REZONANSU PARAMAGNETYCZNEGO (EPR) Spektroskopia EPR jest techniką pozwalającą badać niesparowane elektrony (rodniki, centra paramagnetyczne) w sieci krystalicznej różnych związków chemicznych. Nawet najmniejsze dawki promieniowania wzbudzają związki chemiczne i powodują powstawanie nowych rodników, które mogą być wykrywane przy pomocy EPR. Koncentracja nowo powstałych rodników jest proporcjonalna do dawki. Ze względów technicznych dozymetrią przy pomocy EPR można przeprowadzać w hydroksyapatycie, pochodzącym ze szkliwa zębów lub kości oraz we włóknach kolagenowych z paznokci lub włosów. Do tej pory najwięcej prac dotyczyło szkliwa zębów. Zaletami dozymetrii przy użyciu spektroskopii EPR w szkliwach zębów są: - szeroki zakres wykrywanych dawek od mniej, niż 0,1 Gy do dawek nie mających znaczenia w biodozymetrii rzędu setek Gy; - wysoka powtarzalność i znikomy koszt analizy próbki (koszty zakupu sprzętu spektrometru są jednak bardzo wysokie); - sygnał EPR w hydroksyapatycie jest stały przez miliony lat, dzięki temu analizę można wykonywać w dowolnym momencie po napromienieniu (retrospektywnie); - w pewnych okolicznościach możliwe jest wykrycie częściowego napromienienia ciała. Można sobie wyobrazić sytuację, że przeprowadzamy analizę EPR w szkliwie zębów i w
paznokciach od nóg czy rąk u danej osoby i jeżeli znajdujemy sygnał tylko w jednej z próbek, świadczy to o częściowym napromienieniu; - postuluje się, że EPR może służyć do badania niskich i dostarczanych w długim czasie dawek np. u osób zawodowo narażonych na promieniowanie, czy mieszkających na obszarze o podwyższonej promieniotwórczości naturalnej. Najmniejsza wykrywalna dawka to około 0,05 Sv. Natomiast poważną zaletą tej metody jest to, że wykrywany sygnał, w odróżnieniu od zmian cytogenetycznych (częstość dicentryków czy raczej translokacji) nie jest w żaden sposób zależny od czasu czy stanu fizjologicznego badanej osoby; - technika ta jest już dosyć dobrze udokumentowana i kilka razy zastosowana w praktyce; - jej klasyczna odmiana bazuje na analizie fragmentu zęba pobranego z organizmu i to jest jej zasadnicza wada, bo czyni ją techniką inwazyjną. Osoba postawiona przez wyborem czy woli przeprowadzić dozymetrię na próbce krwi, czy kawałku zęba z całą pewnością wybierze próbkę krwi. Jednak ostatnio konstruuje się małe, przenośne spektroskopy EPR, pozwalające przeprowadzać pomiar w warunkach polowych, bez pobierania fragmentu zęba tylko bezpośrednio w jamie ustnej setek osób w krótkim czasie i traktować go jako bardzo efektywny test przesiewowy [20]. Spektroskopia EPR przeprowadzana na skrawkach paznokci nie jest tak dobrze udokumentowana. Jej oczywistą zaletą jest nieinwazyjność, a wadą, że sygnał EPR w paznokciach jest słabszy i nie tak stabilny jak w hydroksyapatycie z zębów. DOZYMETRIA PRZY POMOCY SPEKTROSKOPII ELEKTRONOWEGO REZONANSU PARAMAGNETYCZNEGO (EPR) ORAZ TECHNIK LUMINESCENCYJNYCH (OSL OPTICALLY STIMULATED LUMINESCENCE) W WYŚWIETLACZACH I KOMPONENTACH ELEKTRONICZNYCH PRZENOŚNYCH URZĄDZEŃ ELEKTRONICZNYCH W oczywisty sposób nie jest to dozymetria biologiczna tylko fizyczna, ale ma z dozymetrią biologiczną jedną wspólną cechę. Otóż, jeżeli chodzi o czułość metody dozymetria biologiczna nie może konkurować z dozymetrią fizyczną, jednak dozymetry fizyczne w postaci różnego rodzaju plakietek - noszą i co jakiś czas mają kontrolowane tylko osoby pracujące z promieniowaniem. Tymczasem dozymetr biologiczny każdy nosi ze sobą, wszystko jedno czy są nim limfocyty krwi obwodowej, czy szkliwo zębów. Często jednak mamy przy sobie przenośne urządzenia elektroniczne: telefony komórkowe, odtwarzacze MP3 i MP4, przenośne pamięci, itd. Zatem, gdyby można było przeprowadzić dozymetrię fizyczną w tych urządzeniach to uzyskalibyśmy zarówno łatwość, szybkość i dokładność odczytu, jak i powszechność indywidualnego dozymetru. Stąd pomysł mierzenia sygnałów EPR i OSL w urządzeniach elektronicznych. Pomysł ten jest podstawą jednego z tematów w projekcie MULTIOBIODOSE. Do tej pory przeanalizowano możliwość czytania sygnału EPR w wyświetlaczach 61 modeli telefonów oraz sygnału OSL w komponentach elektronicznych tych samych telefonów. TEST PRZEBARWIEŃ W SKÓRZE (SKIN SPECLE ASSAY) I BADANIE POZIOMU BIAŁEK W OSOCZU KRWI (SERUM PROTEIN ASSAY) Żaden z testów cytogenetycznych ani biochemicznych używanych w dozymetrii biologicznej nie odtworzy dawki dostarczonej na niewielka powierzchnię ciała. Żeby taka dawka była groźna dla zdrowia czy życia, musi być wysoka. Dawki rzędu kilku grejów, które byłyby zabójcze w przypadku pochłonięcia przez całe ciało, dostarczone np. na fragment 10 cm 2 uda będą tylko drobną niedogodnością, kończącą się jakąś formą miejscowego zapalenia. Gdyby jednak pochłonięta dawka okazała się bardzo wysoka, np. rzędu 100 Gy, to wtedy pojawi się problem. Po pierwsze, taka dawka zabije wszystkie komórki w tym miejscu (skóry, naskórka, tkanek pod skórą) i spowoduje trudną do wyleczenia martwicę tkanek. Po drugie,
przez jakiś czas po napromienieniu (np. kilka tygodni, czy nawet miesięcy) może nie być żadnych niepokojących objawów, ale jeżeli dawka była odpowiednio wysoka, to martwica jest nieuchronna i powinno się wyciąć takie tkanki wcześniej i wypełnić ranę, żeby zminimalizować cierpienie i nie dopuścić do zakażenia. Odtworzeniu dawki w takich sytuacjach służy opracowany we Francji test przebarwień na skórze (SSA) [21]. Polega on na naświetlaniu skóry światłem z lasera i badaniu światła odbitego od skóry, a więc metoda jest nieinwazyjna. Promieniowanie zmienia sposób odbicia takiego światła w sposób proporcjonalny do dawki. Do tej pory na modelach zwierzęcych testowano dawki od 20 do 80 Gy. Uzupełnieniem tej metody ma być badanie ekspresji wybranych białek w surowicy krwi przy pomocy elektroforezy dwukierunkowej. Dotychczas przetestowano 34 białka wybrane za pomocą spektroskopii masowej i otrzymano obiecujące wyniki [22]. Wydaje się, że zmiany ekspresji pewnych białek w osoczu krwi są widoczne nawet po napromienieniu niewielkiego obszaru powierzchni skóry, w okresie, kiedy brak jeszcze klinicznych symptomów napromienienia. 3. Dozymetria biologiczna w Polsce Dozymetria biologiczna z powodu swojej przydatności powinna być wpisana w system reagowania w sytuacjach kryzysowych. Tak się dzieje w wielu krajach, które utrzymują specjalne jednostki zajmujące się głównie dozymetrią, w tym biologiczną np. w Niemczech Bundesamt fuer Strahlenschutz czy w Finlandii Radiation and Nuclear Safety Authority. W Polsce organem dozoru jądrowego jest między innymi Państwowa Agencja Atomistyki (PAA). Składa się ona z wielu departamentów (między innymi Centrum ds. Zdarzeń Radiacyjnych CEZAR), które odpowiadają za monitoring sytuacji radiacyjnej kraju, dozymetrię fizyczną na miejscach zdarzenia itp. Oficjalną jednostką, która przeprowadza dozymetrię biologiczną dla PAA jest Centralne Laboratorium Ochrony Radiologicznej (CLOR) w Warszawie, gdzie tą tematyka zajmuje się jedna osoba. W przypadku masowego zdarzenia radiacyjnego CLOR nie jest w stanie zapewnić dozymetrii biologicznej dla wszystkich potrzebujących. Polska jest jednym z 15 państw w Europie, gdzie funkcjonują laboratoria posługujące się metodami dozymetrii biologicznej [23]. Według mojej wiedzy, 4 instytuty w Polsce są realnie zdolne do wykonania rekonstrukcji dawki u napromienionej osoby: CLOR, Zakład Biologii Radiacyjnej i Środowiskowej Instytutu Fizyki Jądrowej PAN w Krakowie, Zakład Radiobiologii i Immunologii Instytutu Biologii Uniwersytetu im. Jana Kochanowskiego w Kielcach oraz Centrum Radiobiologii i Dozymetrii Biologicznej Instytutu Chemii i Techniki Jądrowej (ICHTJ) w Warszawie. Tylko dwa ostatnie z wymienionych zakładów dysponują nowoczesnymi, automatycznymi mikroskopami i systemami do analizy obrazu wykorzystywanymi w szybkiej dozymetrii biologicznej. Ponieważ jedno laboratorium dozymetryczne nie jest w stanie zapewnić dozymetrii przy masowym zdarzeniu radiacyjnym, istnieje potrzeba grupowania laboratoriów w funkcjonalne sieci. Na terenie Europy dzięki projektom MULTIBIODOSE oraz RENEB (Realizing the European Network in Biodosimetry) powstają właśnie funkcjonalne sieci dozymetrii biologicznej. Do tej pory w prace obu konsorcjów włączone jest tylko Centrum Radiobiologii i Dozymetrii Biologicznej ICHTJ w Warszawie. Jeżeli chodzi o Polskę, to pod koniec 2010 roku zainicjowano program Porównanie Międzylaboratoryjne" mający na celu porównanie oceny dawek pochłoniętych na podstawie częstości chromosomów dicentrycznych pomiędzy CLOR a ICHTJ i standaryzację procedury. Planowane są dalsze ćwiczenia i włączenie w nie pozostałych 2 laboratoriów: z Kielc i Krakowa. Być może, będzie to podstawa sieci biodozymetrycznej w naszym kraju.
Powstanie polskiej sieci biodozymetrycznej i pokazanie, że Polska jest w stanie zapewnić ochronę radiologiczną całego kraju również używając metod dozymetrii biologicznej mogłoby mieć pozytywny wpływ na społeczny odbiór rozwoju energetyki jądrowej. W przypadku jakiegokolwiek zdarzenia radiacyjnego ludzie są bardzo zainteresowani tym, jakie dawki promieniowania dostali i co to oznacza dla ich zdrowia, to zaś może zagwarantować tylko dozymetria biologiczna i utrzymywanie grupy ekspertów z tej dziedziny. Literatura: 1. Waselenko J.K., MacVittie T.J., Blakely W.F., Pesik N., Wiley A.L., Dickerson W.E., Tsu H., Confer D.L., Coleman C.D., Seed T., Lowry P., Armitage J.O., Dainiak N.: Medical Management of the Acute Radiation Syndrome: Recommendations of the Strategic National Stockpile Radiation Working Group. Annals of Internal Medicine (2004), 140, Nov 12, 1037-1051; 2. Rojas-Palma C., Liland A., Jerstad A.N., Etherington G., Perez M., Rahola T., Smith K.: TMT Handbook Triage, Monitoring and Treatment of people exposed to ionising radiation following a malevolent act. (2009); 3. Cytogenetic analysis for radiation dose assessment. Technical Report Series No 405, IAEA Vienna (2001); 4. Lloyd D.C., Edwards A.A., Moquet J.E., Guerrero-Carbajal Y.C.: The role of cytogenetics in early triage of radiation casualties. Applied Radiation and Isotopes. (2000), 52, 1107-1112; 5. Blakely W.F., Satter C.A., Prassana P.G.: Early-response biological dosimetry recommended countermeasure enhancement for mass-casualty radiological incidents and terrorism. Health Physics (2005), Nov, 89(5), 494-504; 6. Lee B.I., Kim S.I., Suh D.H., Kim J.I., Lim Y.K.: Radiation dose distribution for workers in South Korean nuclear power plants. Academy of Science, Engineering and Technology (2011), 76, 148-151; 7. Word Nuclear Association informacje ze strony internetowej (2011); 8. Fenech M.: The advantages and disadvantages of the cytokinesis-block micronucleus method. Mutation Research, (1997), 392, 11-18; 9. Rossnerova A., Spatova M., Schunck C., Sram R.J.: Automated scoring of lymphocyte micronuclei by the MetaSystems Metafer image cytometry system and its application in studies of human mutagen sensitivity and biodosimetry of genotoxin exposure. Mutagenesis, (2011), 26, 169-175; 10. Wójcik A., Kowalska M., E. Bouzyk E., Buraczewska I., Kobialko G., Jarocewicz N., Szumiel I.: Validation of the micronucleus-centromere assay for biological dosimetry. Genetics and Molecular Biology, (2000), 23, 4, 1083-1085;
11. Roch-Lefevre S., Mandina T., Voisin P., Gruel Gaetan G., Mesa J.E.G., Valente M., Bonnesoeur P., Garcia O., Voisina P., Roy L.: Quantification of c-h2ax Foci in Human Lymphocytes: A Method for Biological Dosimetry after Ionizing Radiation Exposure. Radiation Research, (2010), 174, 185 194; 12. Tawn E.J., Whitehouse C.A., Tarone R.E.: FISH chromosome aberration analysis on retired radiation workers from the Sellafield nuclear facility. Radiat Res., (2004) Sep;162(3), 249-56; 13. Hayata I., Kanda R., Minamihisamatsu M., Furokawa S., Sasaki M.: Cytogenetical dose estimation for 3 severely exposed patients in the JCO criticality accident in Tokai-mura. J Radiat Res Suppl, (2001), 42, 149-155; 14. Prasanna P.G.S., Escalada N.D., BlakelyW.F.: Induction of premature chromosome condensation by a phosphatase inhibitor and a protein kinase in unstimulated human peripheral blood lymphocytes: a simple and rapid technique to study chromosome aberrations using specific whole-chromosome DNA hybridization probes for biological dosimetry. Mutation Research, (2000), 466, 131 141; 15. Kabacik S., Mackay A., Tamber N., Manning G., Finnon P., Paillier F., Ashworth A., Bouffler S., Badie C.: Gene expression following ionising radiation: Identification of biomarkers for dose estimation and prediction of individual response Int. J. Radiat. Biol., (2011), 87, No. 2, 115 129; 16. Prasanna P.G.S., Muderhwa J.M., Miller A.C., Grace M.B., Salter C.A., Blakely W.F.: Diagnostic Biodosimetry Response for Radiation Disasters: Current Research and Service Activities at AFRRI. RTO-MP-HFM (2004); 17. Blakely W.F., Miller A.C., Muderhwa J.M., Manglapus G.L., Leidel J.M., Martinez M., Landauer M.R., Grace M.B., Prasanna P.G.S.: Development and Validation of Radiation- Responsive Protein Bioassays for Biodosimetry Applications. NATO RTG-099 (2005); 18. Diagnosis and Treatment of Radiation Injuries. Safety Report Series, No 2, IAEA, Vienna (2008); 19. European Group of Blood and Marrow Transplantation web page. (2007); 20. Swartz H., Flood A.B., Williams B., Dong R., Gui R., He X., Lesniewski P., Kmiec M., LaRciviere J., Mathews T., Raynolds T., Grinberg O., Salikhov I., Demidenko E., Nicolalde J., Wilcox D.: Electron Paramagnetic Resonance (EPR) Dosimetry for response to a largescale radiation incident. 19 th Nuclear Medical Defense Conference (2011); 21. Carvalho O., Clairac B., Benderitter M., Roy L.: Statistical speckle study to characterize scattering media: use of two complementary approaches. Optics express (2007), 15, 13817-13831; 22. Guipaud O., Holler V., Buard V., Tarlet G., Royer N., Vinh J., Benderitter M.: Timecourse analysis of mouse serum proteome changes following exposure of the skin to ionising radiation. Proteomics (2007), 7, 3992-4002;
23. Wojcik A., Lloyd D., Romm H., Roy L.: Biological dosimetry for triage of casualties in a large-scale radiological emergency:capacity of the EU member states. Radiat Prot Dosimetry. (2010), Mar;138(4), 397-401;