Ochrona Środowiska i Zasobów Naturalnych nr 40, 2009 r. Małgorzata Anna Jóźwiak*, Marek Jóźwiak** ZASTOSOWANIE MIKROSKOPII ELEKTRONOWEJ W BIOINDYKACJI ŚRODOWISKA USING ELECTRON MICROSCOPY IN ENVIRONMENTAL BIOINDICATION Słowa kluczowe: Transmisyjny Mikroskop Elektronowy, Skaningowy Mikroskop Elektronowy, bioindykacja, EDX (detektor energii dyspersji promieniowania rentgena). Key words: Transmission Elektron Microscope, Skaning Elektron Microscope, bioindication, EDX (Energy Dispersive X Ray Spectroscopy). In research aiming at evaluation of environmental condition and assessment of the reasons for changes in the environment, precise analytical methods are more and more frequently used. The electron microscopy is one of the tools used there among others. Using a scanning electron microscope with Energy Dispersive X-ray Spectroscopy (EDS) enables to obtain information on quality concerning morphology and elementary composition of a sample as well as information on quantity concerning concentration of particular elements in a sample during one analysis stage. Such researches are carried out in Environmental Protection and Development Section of The Jan Kochanowski University of Humanities and Sciences in Kielce. In bioaccumulators (Hypogymnia physodes (L.) Nyl. lichen) transferred to the city, the rate of accumulation of PAH and heavy metals is determined in relation to anthropopressure and the changes in cellular level are analysed with scanning and transmission electron microscope. The tests that have been performed so far make it possible to conclude that us- * Dr Małgorzata Anna Jóźwiak Samodzielny Zakład Ochrony i Kształtowania Środowiska, Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy Jana Kochanowskiego w Kielcach, ul. Świętokrzyska 15, 25-406 Kielce; tel.: 41 349 64 27; e-mail: malgorzata.jozwiak@vp.pl ** Dr hab. prof. Marek Jóźwiak Samodzielny Zakład Ochrony i Kształtowania Środowiska, Uniwersytet Humanistyczno-Przyrodniczy Jana Kochanowskiego w Kielcach, ul. Świętokrzyska 15, 25-406 Kielce; tel.: 41 349 64 27; e-mail: marjo@ujk.kielce.pl 419
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak ing transmission and scanning electron microscope allows to obtain good assessment of micro changes on the surface of thalli of analysed lichen, and inside the thalli in relation to fungus photobiont. The analysis of mutual location of algae and fungus in cross-section of thalli after exposure in the city in relation to control sample revealed a tendency for translocation of algae cells towards the top layer and outside of the thalli surface depending on the concentration of pollutants. The algae cells showed shape changes from round into plank shape, cell wall damages like cracks, numerous fungi and algae haustoria, and destruction of tylacoidal membranes in chloroplasts as well as dispersion of pyrenoglobuli occur inside the cells. 1. WPROWADZENIE Nauka dążąca do uporządkowania i pogłębiania wiedzy opierać się musi na racjonalnej i rzetelnej analizie różnorodnych procesów, zjawisk i doświadczeń. Elementarnym źródłem danych są przede wszystkim obserwacje. Ich wnikliwość jest podstawą wszelkiego poznania. Cechą dobrych obserwacji naukowych prowadzonych na różnorodnych formach życia jest możliwość powtarzalności, przy jednoczesnym zachowaniu dobrej kondycji zdrowotnej badanego organizmu. Inną istotną cechą metody obserwacji jest brak ingerencji obserwatora w przebieg badanego zjawiska lub procesu. Prowadzenie tak rozumianych badań jest możliwe przy użyciu narzędzia, jakim jest mikroskop. Rozwój mikroskopii i jej wykorzystanie w badaniach laboratoryjnych określa dynamikę ewolucji metod analitycznych i jednocześnie wskazuje na postęp w badaniach nauk biologicznych i nauk o Ziemi. Od roku 1590, kiedy bracia A.J. Jansen skonstruowali pierwszy mikroskop, roli tego urządzenia badawczego trudno nie doceniać. Ulepszając go bowiem w niespełna 90 lat później (1680 r.) A. Leeuwenhoeck obserwował życie w kropli wody, a pod koniec XIX w. mikroskop stał się podstawowym narzędziem w badaniach biologicznych, co zaowocowało m.in. odkryciem membran białkowych wewnątrz komórek przez C. Golgiego. Ważnymi datami w rozwoju mikroskopii elektronowej był rok 1904 nagroda Nobla dla E. Abb ego i W. Strutta, za rozwój teorii zdolności rozdzielczej przyrządów optycznych, i rok 1906 odkrycie elektronu przez Sir Josepha J. Thomsona. 2. WYKORZYSTANIE TRANSMISYJNEGO MIKROSKOPU ELEKTRONOWEGO Od II połowy XX w. nieocenioną rolę w poznawaniu tkanek i komórek ze wszystkimi szczegółami ich budowy odgrywa transmisyjny mikroskop elektronowy, który został skonstruowany w 1935 r., przez M. Knolla i E. Ruska. W transmisyjnym mikroskopie elektronowym TEM (Transmission Elektron Microscope) wykorzystuje się pierwotną wiązkę elektronów, która przechodzi przez cienki skrawek 420
Zastosowanie mikroskopii elektronowej w bioindykacji środowiska preparatu. Obraz powstaje w wyniku ugięcia, pochłonięcia i odbicia fali elektronów od różnych jego części. Powstałe obrazy są dwuwymiarowe. Możliwości badawcze mikroskopu pozwalają na uzyskiwanie informacji o położeniu atomów i uzyskanie obrazu dyfrakcyjnego, umożliwiającego identyfikację struktur krystalicznych. W mikroskopie wyposażonym w mikroanalizator rentgenowskiej dyspersji energii (EDS) dodatkowo można dokonać analizy chemicznej składników budowy obserwowanego materiału. Badania z wykorzystaniem transmisyjnego mikroskopu elektronowego analitycznego, CM-20 f-my Philips (200 kv), autorzy niniejszego artykułu przeprowadzili w Centrum Analitycznym SGGW w Warszawie. Materiałem badawczym były komórki glonu Trebouxia sp. oraz grzybów klasy Ascomycetes, stanowiące komponenty plechy porostu Hypogymnia physodes. Prowadzone obserwacje miały na celu wykazanie różnic w strukturze badanych komórek i w strukturze ich organelli komórkowych w plechach pozyskanych z obszarów wskaźnikowo czystych i transplantowanych w obszary wysokiej antropopresji skrzyżowania ulic o dużym natężeniu ruchu samochodowego. Hypogymnia physodes jest listkowatym porostem epifitycznym, bioakumulatorem zanieczyszczeń atmosferycznych [Fałtynowicz 1995, Sawicka-Kapusta 2002]. W porostach grzyb i glon, które stanowią plechę, tworzą pod względem fizjologicznym i morfologicznym jednolitą całość (fot. 1 3). Komórki glonów są otoczone ścianą komórkową (fot. 1:10). Odgrywa ona istotną rolę w procesie powstawania haustoriów grzybowo-glonowych (fot. 2:11A, 11B). W miejscu kontaktu ściany komórkowej grzyba ze ścianą komórek glonu (fot. 3:2) może dochodzić do przebicia ściany glonowej (11B) lub też jedynie zetknięcia i oplecenia komórek glonowych przez grzyba (11A). Tak powstałe miejsca styku grzyb glon zapewniają transport i wymianę wody, minerałów i asymilatów między komponentami [Frey, Scheidegger 2002]. W okresach pogarszających się warunków środowiska obszary ściany komórkowej glonu, tworzące haustoria, mogą grubieć i izolować w ten sposób grzyba lub też grzyb może wnikać do wnętrza protoplastu glonowego. Fot. 1. Komórka glonu Trebouxia sp. ze strefy glonowej Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 1. A cell algal cell from the algal zone of the lichen Hypogymnia physodes (phot. M. A. Jóźwiak) 421
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak Fot. 2. Komórki glonu i grzyba ze strefy glonowej Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 2. A algal cell and fungal cells in the algal zone of the lichen Hypogymnia physodes (phot. M.A. Jóźwiak) Fot. 3. Komórka grzyba (A) otaczająca glon (B) porostu Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 3. One mycobiont cell (A) is closely apparssed to the alga (B) in the lichen Hypogymnia physodes (phot. M. A.Jóźwiak) W porostach heteromerycznych o budowie grzbietobrzusznej dorsowentralnej, glony są położone pod warstwą pseudoparenchymatyczną komórek grzybowych kory górnej, które są grubościenne i tworzą zwartą masę (fot. 4, 5 i 6).Przejawem przystosowania glonów do niedoborów światła jest wykształcenie ogromnego, zajmującego większość obszaru komórkowego, chloroplastu (1). W jego wnętrzu znajdują się tylakoidy (3). Błony tylakoidów chloroplastowych (3) tworzą regularnie układające się stosy, ściśle do siebie przylegające, co w istotny sposób zwiększa powierzchnię asymilacji [Armitage, Howe 2007]. Na powierzchni chloroplastu powstają obszarowe pirenoidy (8), w których są gromadzone związki organiczne. Są nimi najczęściej ciała tłuszczowe, ale również węglowodanowe i białkowe, zwane pirenoglobulami (7). Rodzaj pirenoglobuli zależy od warunków ekologicznych, w jakich znajduje się porost. Nie ma absolutnej pewności dotyczącej funkcji pirenoglobuli w porostach. 422
Zastosowanie mikroskopii elektronowej w bioindykacji środowiska Służą one prawdopodobnie najczęściej jako centrum przechowywania lipidów, są zapasami energii i wody dla grzyba [Armitage, Howe 2007, za Paveling 1973]. Zostały w nich również znalezione karotenoidy, które prawdopodobnie są przystosowaniem glonu do życia w warunkach niedoboru światła [Jacobs, Ahmadjian 1969]. Przypuszcza się również że pirenoglobule pomagają w powstawaniu tylakoidów chloroplastowych [Brown, Wilson 1968]. Wielkość chloroplastu powoduje, że obszar cytozolu komórkowego jest niewielki i ułożony peryferycznie (4), między zewnętrzną otoczką chloroplastu (5) a warstwą cytoplazmatycznej błony, zwanej plazmalemmą (6). Cytozol charakteryzuje obecność dwóch obszarów: zewnętrznego (12), określanego jako strefa magazynowania, oraz wewnętrznego cytoplazmatycznego (4), w którym lokują się mitochondria (13); obszar ten obfituje również w pęcherzyki przejrzyste, elektronowo jasne (9) i obszary z gęstym elektronowo materiałem (18). Fot. 4. Komórka grzyba z warstwy kory górnej Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 4. A cell of the fungal from the upper cortex in the lichen Hypogymnia physodes (phot. M.A. Jóźwiak) Fot. 5. Grubościenna komórka grzyba z warstwy kory górnej Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 5. Multilayered cell wall from the upper cortex in the lichen Hypogymnia physodes (phot. M.A. Jóźwiak) 423
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak Fot. 6. Grubościenne komórki pseudoparenchymatycznej kory górnej Hypogymnia physodes (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 6. Multilayered cell wall from the pseudoparenchyme upper cortex in the lichen Hypogymnia physodes (phot. M.A. Jóźwiak) Dorsowentralna, heteromeryczna plecha Hypogymnia physodes składa się z dwóch różnych pod względem budowy strzępek grzybowych (fot. 4 6): cienkościennych komórek grzyba występujących w warstwie algowej, oraz zbudowanych z grubych warstwowych ścian (2) strzępek warstwy korowej. Warstwowa ściana komórkowa strzępek chroni protoplast (fot. 4:14). Zwarte, ścisłe przyleganie grubościennych komórek jest nie tylko warstwą izolującą wnętrze plechy od środowiska zewnętrznego, ale także stanowi apoplastyczną drogę transportu wody grzyb grzyb oraz grzyb glon [Fray, Scheidegger 2002]. Wydaje się zatem, że grubościenność komórek grzybni chroni plechę, ale jest jednocześnie szerokimi wrotami zakażenia, zważywszy, że wraz z wodą, w postaci rozpuszczonych kationów, przez całą powierzchnię plechy wnikają do jej wnętrza zanieczyszczenia pochodzące z powietrza [Garty 2002, Garty i in. 2004]. Strukturę błony otaczającej obszar cytozolu charakteryzują liczne wpuklenia (fot. 6:16). Obszar cytoplazmatyczny w komórkach grzybowych zajmują zwykle duże mitochondria (fot. 6:15) oraz jądro z jąderkiem (fot. 5:18). Wielu autorów [Armitage, Howe 2007, Jacobs, Ahmadjian 1969] stwierdza w preparatach mikroskopowych komórek grzybowych obecność warstwowo zbudowanych ciałek o strukturze podobnej do warstw układającej się mieliny. Te wielowarstwowe ciała, przypominające mielinę zwierzęcych neuronów, wspominani autorzy stwierdzają w komórkach grzybowych porostu Xanthoria sp. Obraz mikroskopowy grzybów porostu Hypogymnia physodes ujawnia obecność tych ciał także w komórkach grzybowych Hypogymnia physodes (fot. 4:17). 424
Zastosowanie mikroskopii elektronowej w bioindykacji środowiska Fot. 7. Szczelina pseudocyfeli na powierzchni Hypogymnia physodes z widocznymi strzępkami grzyba i glonami (pow. 400x) (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 7. Crack on surface the lichen Hypogymnia physodes from fungal and alge. Magnification, x400 (phot. M.A. Jóźwiak) Obserwacje przy użyciu transmisyjnego mikroskopu elektronowego pozwoliły na ocenę tempa powstawania uszkodzeń w komórkach i ich diagnozowanie. Interpretacja tych uszkodzeń, ich wpływu na funkcjonowanie komórek w plechach porostowych to system wczesnego ostrzegania przed zagrożeniami spowodowanymi zanieczyszczeniami w bezpośrednim przełożeniu na zdrowie i życie ludzi. 3. WYKORZYSTANIE SKANINGOWEGO MIKROSKOPU ELEKTRONOWEGO Skaningowy mikroskop elektronowy (SEM Skaning Elektron Microscope) emituje wiązkę elektronów, która nie przechodząc przez preparat, odbija się od jego powierzchni. Powierzchnia ta, pokryta najczęściej złotem, emituje sygnały, które są rejestrowane za pomocą detektorów, a następnie przetwarzane na obraz próbki lub widmo promieniowania rentgenowskiego. Stosowanie różnych detektorów powoduje, że uzyskane informacje, mogą dotyczyć zarówno próbek materii stałej mineralnej, jak i biologicznej. Pozyskanie materiału z dużych obiektów biologicznych odbywa się przez tworzenie repliki powierzchni, czyli napylanie w warunkach próżni materiałem o niskiej masie cząsteczkowej, łatwo przylegającym, np. węglem, który następnie na zdjęciu nakłada się na siatkę mikroskopową. Wykonanie natomiast cienkich skrawków, po wcześniejszym utrwaleniu materiału, poddaje się kontrastowaniu. Pozyskanie materiału biologicznego z małych obiektów, np. wirusów, można badać po zastosowaniu cieniowania lub barwienia negatywnego. 425
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak Cieniowanie pokrywa badaną próbę wyparowującym metalem ciężkim, pochodzącym z punktowego źródła, podczas gdy barwienie negatywne uwidacznia obrys cząsteczek przez ich zatapianie w materiale gęstym elektronowo. Prędkość skanowania jest dobierana przez operatora, zależy od rozdzielczości obrazu i może wynosić od kilku sekund do kilkudziesięciu minut. Uzyskany obraz oglądanego obiektu widziany jest jako trójwymiarowy. Mikroskop może być dodatkowo wyposażony w EDX (Energy Dispersive X Ray Spectroscopy), który służy do oznaczania składu chemicznego w badanym mikroobszarze. Uzyskana analiza może być analizą punktową, przedstawiać rozkład pierwiastków wzdłuż zadanej linii lub też przyjmować postać mapy rozkładu pierwiastków w analizowanym mikroobszarze. Przedstawione w niniejszym opracowaniu obrazy zostały wykonane na powierzchni i wewnątrz plech Hypogymnia physodes, skaningowym mikroskopem elektronowym FEI QUANTA 200, z mikroanalizatorem typu EDS, w Centrum Analitycznym SGGW. Do badania przygotowano skrawki plechy porostu po ekspozycji na skrzyżowaniu o dużym natężeniu ruchu (3200 pojazdów/godz.), wykazujące zmiany barwne (obszary wybielenia lub zbrązowienia) oraz z plechy kontrolnej (bez zmian barwnych). Analizę chemiczną punktową i obszarową wykonano na powierzchni i wewnątrz plech Hypogymnia physodes. Obserwacje plech eksponowanych w warunkach zanieczyszczonego powietrza wskazują, że na całej powierzchni gromadzą się zanieczyszczenia. Przyjmują one formy kuliste (fot.8) i wielościennych brył różnej wielkości i różnych kształtów (fot. 9 i 10). Fot. 8. Struktura kulista na powierzchnia plechy Hypogymnia physodes eksponowanej na skrzyżowaniu (pow. 10 000x) (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 8. Structure spherical on tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation. Magnification, x 10 000 (phot. M.A. Jóźwiak) 426
Zastosowanie mikroskopii elektronowej w bioindykacji środowiska Fot. 9. Struktura sferoidalna na powierzchni plechy Hypogymnia physodes (L.) Nyl. eksponowanej na skrzyżowaniu (pow. 10 000x) (fot. M.A.Jóźwiak) Phot. 9. Soild figure structure on tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation. Magnification, x 10 000 (phot. M.A. Jóźwiak) Fot. 10. Wielościenna bryła ( róża ) z powierzchni plechy Hypogymnia physodes (L.) Nyl. eksponowanej na skrzyżowaniu w I kwartale 2006 r. (pow. 2500x) (fot. M.A. Jóźwiak) Phot. 10. Multilateral clod ( rose ) on tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation. Magnification, x 2500 (phot. M.A. Jóźwiak) W składzie chemicznym plech stwierdzono Si, Al, Fe i Cu (rys.1) oraz P, Al, Si, Cu i Fe (rys. 2 i 3). W obszarach naturalnych pęknięć plechy (pseudocyfeli) zanieczyszczenia stwierdzono zarówno na strzępkach grzybni, na komórkach glonowych, jak i w przestrzeniach międzykomórkowych. Wnikają one wraz z wilgocią przez naturalne szczeliny plechy (fot. 7). Rolę pseudocyfeli w depozycji i dystrybucji zanieczyszczeń potwierdzają badania eksperymentalne Freya i Scheideggera [2002] z porostem Lobaria pulmonaria. 427
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak Rys. 1. Analiza chemiczna struktury kulistej z powierzchni plechy Hypogymnia physodes Nyl. eksponowanej na skrzyżowaniu Fig. 1. Chemical analysis of spherical structure from tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation Rys. 2. Analiza chemiczna struktury sferoidalnej z powierzchni plechy Hypogymnia physodes (L.) Nyl. eksponowanej na skrzyżowaniu Fig. 2. Chemical analysis of soild figure structure on tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation 428
Zastosowanie mikroskopii elektronowej w bioindykacji środowiska Z punktu widzenia analiz preparatów biologicznych skaningowy mikroskop elektronowy obarczony jest wadą. Każda przygotowana próba, która zachowuje własności kleiste, płynne lub jest żelem, musi wcześniej podlegać zamrożeniu w ciekłym azocie, liofilizacji i napyleniu złotem lub platyną. Obecnie problemy te rozwiązuje skaningowy mikroskop elektronowy środowiskowy ESEM (Environmental Skaning Electrone Microscope). Skaningowy mikroskop elektronowy środowiskowy jest przeznaczony do badań komórek roślinnych i zwierzęcych, bakterii, żywności, polimerów, włókien naturalnych i syntetycznych oraz leków. Innowacyjność ESEM polega na możliwości oglądu mikroskopowego w obecności pary wodnej, CO 2 lub azotu, w warunkach ciśnienia zbliżonego do ciśnienia atmosferycznego, co zapewnia system próżniowy w ESEM, bez konieczności uprzedniego suszenia i napylania próbek. Rys. 3. Analiza chemiczna wielościennej bryły ( róża ) z powierzchni plechy Hypogymnia physodes (L.) Nyl. eksponowanej na skrzyżowaniu Fig. 3. Chemical analysis of Multilateral clod ( rose ) on tallus surface the lichen Hypogymnia physodes on street crossing transplantation 4. ZAKOŃCZENIE Mikroskopy elektronowe znalazły zastosowanie w różnych dziedzinach nauki i techniki. Zbudowano wiele ich typów, m.in. takie, które pozwalają wizualizować rozkład pola elektrycznego i magnetycznego na powierzchni ciał stałych w obszarach o wymiarach kilku mikrometrów oraz mikroskop jonowy, w którym wiązkę elektronów zastąpiono wiązką jonów. 429
Małgorzata Anna Jóźwiak, Marek Jóźwiak W badaniach środowiskowych dzięki mikroskopii elektronowej można badać budowę wewnętrzną elementów składowych komórki roślinnej, zwierzęcej i bakterii, otrzymywać obrazy bakteriofagów i wirusów, dużych molekuł, a nawet obraz ułożenia atomów w sieci krystalicznej. Możliwe jest także badanie pyłów respirabilnych pochodzenia antropogenicznego wraz z zdeponowanymi na ich powierzchni wielopierścieniowymi węglowodorami aromatycznymi i metalami ciężkimi, co pozwala na coraz dokładniejszą ocenę stopnia zanieczyszczenia środowiska. Wobec tak dużych możliwości wykorzystywania mikroskopów elektronowych bardzo ważne jest opracowanie metod i technik obserwacji. Pozanaukowym, ale nie mniej ważnym powodem wykorzystania mikroskopu elektronowego, jest kształcenie studentów. Posiadanie przez studentów umiejętności wykorzystywania nowoczesnego sprzętu zwiększa ich konkurencyjność na rynku pracy, stanowi również istotny element kształtowania postaw innowacyjnych potrzebnych we współczesnej nauce. PIŚMIENNICTWO Armitage M.H., Howe G.F. 2007. The ultrastucture of lichen cells supports creation, not macroevolution, CRSQ vol. 44, No 1: 40 53. Brown R.M., Wilson R. 1968: Electron mikroscopy of lichen Physcia aipolia (Ehrh.). J. of Phytology 4: 230 240. Fałtynowicz W.1995. Wykorzystanie prorostów do oceny zanieczyszczenia powietrza. Centrum Edukacji Ekologicznej Wsi, Krosno: 141. Frey B., Scheidegger Ch. 2002. Preparative techniques for low temperature scanning electron microscopy of lichens, I. Kranner, R. Beckett, A. Varma (eds.) Protocols in Lichenology culturing, biochemistry, ecophysiology and use in biomonitoring, Springer, Berlin: 118 132. Garty J. 2002. Biomonitoring heavy metal pollution with Lichens, W: I. Kranner, R.P. Beckett, A.K. Varma (Eds.) Protocols in Lichenology, Springer, Berlin: 458 482. Garty J., Levin T., Lehr H., Tomer S., Hochman A. 2004. Interactive Effects of UV-B Radiation and Chemical Contamination on Physiological Parameters in the Lichen Ramalina lacer, J. Atmos. Chem. 49: 267 289. Jacobs J.B., Ahmadjian V. 1969. The ultrastructure of lichens. I. A general survey. Journal of Phycology 5: 227 240. Sawicka-Kapusta K., Zakrzewska M. 2002. Zanieczyszczenie powietrza w Świętokrzyskim Parku Narodowym w latach 1991 2001 na podstawie biowskaźnika Hypogymnia physodes. Regionalny Monitoring Środowiska Przyrodniczego, 3/02: 83 86. 430