Farmaceutyczny copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 www.fpn.sum.edu.pl Cena 24,50 zł Miesięcznik Przegląd Naukowy IC Value - Current 4,55 MNiSW 6 ROK VII (XI) Nr 7/2010 (66) Scientific Review in Pharmacy Czynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowych u chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca Proleki w terapii nowotworów. Część IV. Proleki aktywowane hipoksją 0 Metylacja DNA główny znacznik epigenetyczny komórki Porost islandzki związki czynne, aktywność biologiczna Porównanie skuteczności czynników silanizujących w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS 21 Czynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny ISSN 1425-5073 lat Substancje biologicznie aktywne i lecznicze obecne w wybranych gatunkach koniczyn 1
Redaktor Naczelny / Editor-in-Chief: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk Adres redakcji / Editorial Adress: ul. Jedności 8, 41-200 Sosnowiec, Polska / Poland Tel. +48 32 364 11 50, +48 514 342 345 Fax. + 48 32 364 11 58 E-mail: kolegium.redakcyjne@kwiecinski.pl 6 Konsultacyjna Rada Naukowa / Scientific Board Przewodniczący / Head: Prof. dr hab. Krystyna Olczyk - Sosnowiec Członkowie / Members: Prof. dr hab. Edward Bańkowski - Białystok Prof. dr Karmela Barišić - Zagreb, Chorwacja Prof. dr hab. Jerzy Brandys - Kraków Prof. dr Vitalis Briedis - Kaunas, Litwa Prof. dr hab. Elżbieta Brzezińska - Łódź Prof. dr Benito Del Castillo Garcia - Madrid, Hiszpania Prof. dr. Lionel Buéno - Toulouse, Francja Prof. dr hab. Kazimierz Głowniak - Lublin Prof. dr hab. Edmund Grześkowiak - Poznań Prof. dr Filiz Hincal - Ankara, Turcja Prof. dr. Michael Horowitz - Adelaide, Australia Prof. dr med. Kinga Howorka - AKH, UW, Wien, Austria Sekretarz Naukowy / Scientific Board Secretary: Dr n. med. Robert D. Wojtyczka E-mail: fpn@kwiecinski.pl Prof. dr hab. Renata Jachowicz - Kraków Prof. dr hab. Ewa Jagiełło-Wójtowicz - Lublin Prof. dr hab. Krzysztof Jonderko - Sosnowiec Prof. dr hab. Marcin Kamiński - Katowice Prof. dr Vesna Kuntić - Belgrade, Serbia Prof. dr hab. Jan Pachecka - Warszawa Prof. dr hab. Jerzy Pałka - Białystok Prof. dr hab. Janusz Pluta - Wrocław Prof. dr hab. Janusz Solski - Lublin Prof. dr Hiroshi Suzuki - Tokyo, Japonia Prof. dr hab. Yanusz Wegrowski - Reims, Francja Prof. dr hab. Marek Wesołowski - Gdańsk Prof. dr Mira Zečević - Belgrade, Serbia Członkowie Kolegium Redakcyjnego / Members of Editorial Board: Dr n. farm. Paweł Olczyk Dr n. biol. Małgorzata Kępa Mgr Anna Szeremeta Mgr Agnieszka Jura Półtorak Dr n. hum. Anna Kierczak Mgr inż. Marcin Chabior Przemysław Jędrusik Wydawca / Publisher: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego 21 lat Adres Wydawcy / Publisher Adress: Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ul. Wiśniowa 25/2, 43-300 Bielsko-Biała, Polska / Poland tel. +48 33 817 28 79, fax +48 33 817 36 31 Prezes / President: dr n. med. Adam Kwieciński (Ph.D. M.D.) Marketing Manager: Opracowanie graficzne / Graphics: Skład / Technical Editor: Agnieszka Romańska Robert Cyganik Jerzy Partyka E-mail: agnieszka.romanska@kwiecinski.pl Nakład: do 7 000 egz. / Print run: up to 7000 copies Farmaceutyczny Przegląd Naukowy jest współfinansowany przez Ministerstwo Nauki i Szkolnictwa Wyższego. Scientific Review in Pharmacy is financially supported by Ministry of Science and Higher Education. Wszystkie materiały opublikowane w piśmie objęte są ochroną Prawa autorskiego. Projekty chronione są Ustawą o Prawie autorskim i pokrewnych prawach z 1994 r. (Dz. U. Nr 24, poz. 83). Redakcja zastrzega sobie prawo dostosowania nadesłanych materiałów do potrzeb pisma. Przedruki możliwe jedynie za zgodą wydawcy. Za treść materiałów reklamowych oraz listów od czytelników redakcja nie odpowiada. All published papers in Scientific Review in Pharmacy are protected by copyright laws (according to Law Gazette NO 24, item. 83). Board of Editors reserves the rights to harmonize the papers obtained to journal rules and requirements. Reprints are allowed only after Publisher agreement. Board of Editors are not responsible for advertisements and reader letters.
Zdj. Zygmunt Wieczorek Szanowni Państwo, Koleżanki i Koledzy, Drodzy Czytelnicy Nadeszły długo oczekiwane wakacje, za oknem bezchmurne niebo i upały, a do Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego napływają kolejne publikacje, co świadczy o zainteresowaniu Autorów i Czytelników naszym czasopismem, dając także nadzieję na dalszy jego rozwój i umocnienie na rynku wydawniczym. Również i Kolegium Redakcyjne intensywnie pracuje, nie ustając w działaniach na rzecz podwyższania jakości procedur redakcyjnych i wydawniczych. Nasi wspaniali Informatycy opracowali system elektronicznej rejestracji Autorów przesyłanych publikacji, umożliwiający zarazem Autorom ciągłą weryfikację statusu przedłożonych prac. Już niebawem, po niezbędnym przetestowaniu, system zostanie wprowadzony, a konieczne informacje, wraz z instrukcją, znajdą Państwo na stronie internetowej czasopisma. W bieżącym numerze Farmaceutycznego Przeglądu Naukowego znajdą Państwo artykuły o zróżnicowanej tematyce badawczej, począwszy od prac o charakterze klinicznym do tych z zakresu farmakologii, biochemii farmaceutycznej, analizy instrumentalnej i terapii monitorowanej czy farmakognozji. To bogactwo tematyki przedstawianej na łamach naszego czasopisma stanowi o jego wartości, tak bardzo cennej dla szerokiego grona adresatów tych prac. Tradycyjnie anonsujemy także nadchodzącą konferencję. Tym razem informujemy o Europejskim Sympozjum p.t.: Central European Symposium on Pharmaceutical Technology the Most Exciting European Scientific Event in Fall 2010, którego miejscem jest Graz (Austria), a które odbędzie się w dniach 16 18 wrzesień br. Szanowni Państwo, polecam lekturę zamieszczonych w niniejszym numerze prac i polecam nasze czasopismo jako źródło wiedzy o Państwa osiągnięciach, oraz jako platformę integrującą całe nasze środowisko. Życzę pełni wakacyjnego relaksu, dołączając jak zawsze serdeczne pozdrowienia, Redaktor Naczelny Prof. dr hab. Krystyna Olczyk
6 Nr 7 / 2010 Spis treści Risk factors of adverse cardiac events in patients with chronic systolic heart failure0 10 Czynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowych u chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca0 Proleki w terapii nowotworów. Część IV. Proleki aktywowane hipoksją0 15 Prodrugs in cancer therapy. Part IV. Hypoxia activated prodrugs0 Metylacja DNA główny znacznik epigenetyczny komórki0 20 DNA Methylation a major epigenetic marker of the cell0 Porost islandzki związki czynne, aktywność biologiczna 23 Iceland Moss active compounds, biological properties Porównanie skuteczności czynników silanizujących w analizie niesteroidowych leków przeciwzapalnych techniką GC/MS0 28 Comparison of the Efficiency of Silylating Agents in GC/MS Analysis of Non-steroidal Anti-inflammatory Drugs Czynnik NF-κB w fibroblastach skóry ludzkiej poddanych działaniu kamptotecyny0 33 NF-κB factor in human skin fibroblasts treated with camptothecin Substancje biologicznie aktywne i lecznicze obecne w wybranych gatunkach koniczyn 39 Biologically active and therapeutic substances from Trifolium species
TU Graz 2 nd Announcement Call for Papers Graz Tourismus Karl-Franzens-University, Graz University of Technology and Research Center Pharmaceutical Engineering are organising the: 8 th Central European Symposium on Pharmaceutical Technology Satellite Symposium: 4 th International Graz Congress for Pharmaceutical Engineering September 16-18, 2010 Graz, Austria www.cespt2010.org
Central European Symposium on Pharmaceutical Technology - the Most Exciting European Scientific Event in Fall 2010 Graz The Conference City With a well established reputation for being a lively place of culture, Graz became the first city in Austria to gain the accolade of being the European Capital of Culture in 2003. The unique flair of the metropolis by the river Mur was instrumental in assuring the success of the Cultural Capital project which is why Graz continues to refer to itself today as the cultural capital. An understandable title in view of its unique programme of events. Graz Tourismus The History of CESPT In the late 1980s, the initiative for Central European scientific meetings dealing with pharmaceutical technology arose as a result of the long standing collaboration between the laboratories for pharmaceutical technology of the faculties of pharmacy in Trieste, Italy and Ljubljana, Slovenia. Three round table meetings, entitled Alpe Adria Seminars on Pharmaceutical Technology, were held. As a result of this initiative the 1st Central European Symposium on Pharmaceutical Technology (CESPT) was held in October 1995 in Bled, Slovenia under the patronage of EUFEPS. Two subsequent events, in 1997 and 1999 were successfully organized in Portoroz, Slovenia. Later CESPT conferences followed in Hungary and Austria, the last meeting in 2008 was located in Ljubljana, the capital city of Slovenia. More than 200 contributions were presented and the conference was accompanied by a Satellite Symposium entitled Challenges and Opportunities in Multiparticulate Drug Delivery. A special issue of International Journal of Pharmaceutics was published from this great event. Satellite Symposium: th 4 International Graz Congress for Pharmaceutical Engineering For the forth time, the International Graz Congress for Pharmaceutical Engineering will focus on recent developments in the areas of Quality by Design, continuous processing, process understanding, modelling, pharmaceutical nanotechnology and new process analytical technology (PAT). Together with CESPT the Satellite Symposium functions not only as a platform to present research results, but also to initiate cooperations on an international level. Key Note Speakers: More Information: www.cespt2010.org Iztok Grabnar, Ljubljana, Slovenia Peter Kleinebudde, Düsseldorf, Germany Steve Hammond, Pfizer, USA Klaus Langer, Münster, Germany Claus Michael Lehr, Saarbrücken, Germany Wolfgang G. Kreyling, Helmholtz Zentrum München, Germany Thomas Rades, Dunedin, New Zealand Geza Regdon, Szeged, Hungary Barbara Rothen Rutishauser, Bern Switzerland Jonathan PK Seville, Coventry, UK Frantisek Stepanek, London, UK Werner Weitschies, Greifswald, Germany Alexander Yarin, Chicago, USA We look forward to meeting you in Graz in 2010!
Call for Papers We cordially invite you to submit papers on the following topics: Continuous Manufacturing Materials, Constitutive Behavior, Structuring Methods, Structure Functionality Relations Quality by Design Strategies and Their Impact on the Approval Process New Process Analytical Technology Advances in Powder Processing Rational Design of Novel Formulations Biopharmaceuticals Manufacturing Nano and Micro Delivery Systems Safety of Nanomaterials Gene and Protein Delivery Systems Biomaterials Novel Dosage Forms Modified Drug Release Drug Targeting Drug Dissolution, Absorption, Metabolism and Membrane Transport Bioavailability, Bioequivalence, Biosimilarity Pharmacokinetics, Pharmacodynamics and Efficacy of Drug Delivery Systems Participants are invited to submit abstracts online for oral or poster presentations before April 30, 2010. Abstracts must conform to the template (http://www.cespt2010.org/kongress_en/documents/templatecespt.doc), they have to be written in English and must be submitted online. All accepted abstracts will be published in a special issue of Scientia Pharmaceutica. Notification of acceptance: Authors will be notified about the acceptance of their abstract and the type of presentation (oral or poster) by June 30, 2010. Acceptance of your abstract constitutes your commitment to attend and present your work. Presentations: Oral presentations will be held after the plenary lectures. The time limitfor oral contribution will be 20 minutes including discussion. Posters will be exhibited during the Symposium. The panels for the poster presentation are of the following size: height 150cm, width 90cm. Registration: Early Registration Late Registration (until 30th June, 2010) (after 30th June, 2010) Academic, Industry 390 440 Students* 170 220 Social Program 40 40 *Students are requested to send a scanned copy of the confirmation letter of their student status signed by the head of the institute / dean. Fees include admission to the scientific / exhibition, coffee breaks, lunches, conference reception and symposium documentation consisting of a detailed printed program and an USB Stick containing all abstracts. The social program includes a conference dinner. Payment can be made by credit card only. Scientific Committee: Prof. Dr. István Antal, Budapest, Hungary Prof. Dr. Ubaldo Conte, Pavia, Italy Prof. Dr. Dominique Duchene, France Prof. Dr. Alexander T. Florence, United Kingdom Prof. Dr. Jelena Filipovi Gr i, Zagreb, Croatia Prof. Dr. Peter Kleinebudde, Düsseldorf, Germany Prof. Dr. Jörg Kreuter, Frankfurt, Germany Exhibition: Prof. Dr. Julijana Kristl, Ljubljana, Slovenia Prof. Dr. Miloslava Rabišková, Brno, Czech Republic Prof. Dr. Stane Sr i, Ljubljana, Slovenia Prof. Dr. Helmut Viernstein, Vienna, Austria Prof. Dr. Zuzana Vitková, Bratislava, Slovakia The Symposium will be accompanied by an industrial exhibition of products and technologies. We invite you to take the opportunity to present your company and development achievements. For further Information, please contact Roswitha.Schober@tugraz.at More Information: www.cespt2010.org
Location: The Karl Franzens University, located in Graz, Austria, is the second largest and second oldest university in Austria. Address: WWW Universitätsplatz 3 A 8010 Graz http://www.uni graz.at Accomodation: For hotels, rooms and highlights of the City of Graz, which is located close to one of the most beautiful wine regions in Europe, please visit: http://www.graztourismus.at/ Important dates: Registration: Symposium dates: 16. 18. 9. 2010 Satellite Symposium: 16. 17. 9. 2010 Abstract Submission: Abstract Acceptance: 30.4.2010 30.6.2010 Available online http://www.cespt2010.org Important addresses: President of the Symposium Univ. Prof. Dr. Andreas Zimmer Karl Franzens University Graz E mail: Andreas.Zimmer@uni graz.at Co President of the Symposium Univ. Prof. Dr. Aleš Mrhar University of Ljubljana E mail: Ales.Mrhar@ffa.uni lj.si President of the Satellite Symposium Univ. Prof. Dr. Johannes Khinast Graz University of Technology Inst. for Process and Particle Engineering Secretary of the Symposium Dr. Eva Roblegg Karl Franzens University Graz Inst. of Pharmaceutical Sciences Phone: + 43 (316) 873 7464 FAX: + 43 (316) 873 7963 Phone: +43 (316) 380 8889 FAX: +43 (316) 380 9100 E mail: Khinast@tugraz.at E mail: Eva.Roblegg@uni graz.at Organising Institutions: Karl Franzens University Graz TU Graz Graz University of Technology Research Center Pharmaceutical Engineering Co-sponsoring and supporting Organisations & Societies: APV, International Association for Pharmaceutical Technology, Germany HSPS, Hungarian Society for Pharmaceutical Sciences Hungaria A.D.R.I.T.E.L.F. Associazione Docenti e Ricercatori Italiani di Tecnologie e Legislazione Farmaceutiche, Italy ÖPhG, Österreichische Pharmazeutische Gesellschaft Austria BioNanoNet Research Association Austria Controlled Release Society German Loacal Chapter Czech Pharmaceutical Society Czech Republic European Federation for Pharmaceutical Sciences HFD, Croatian Pharmaceutical Society Croatia SFD, Slovenian Pharmaceutical Society Slovenia MFD, Macedonian Pharmaceutical Assiciation Macedonia SFS, Slovak Pharmaceutical Society Slovakia Pharmaceutical Society of Serbia Serbia Polish Pharmaceutical Society Poland Association of Pharmacists of the Federation of Bosnia and Herzegovina For more information please visit our website www.cespt2010.org
Farm Przegl Nauk, 2010,7, 10-14 Risk factors of adverse cardiac events in patients with chronic systolic heart failure Czynniki ryzyka niekorzystnych zdarzeń sercowych u chorych z przewlekłą skurczową niewydolnością serca Aleksander Owczarek 1, Bożena Szyguła-Jurkiewicz 2, Krzysztof Helewski 3, Karolina Klimaszewska 4, Romuald Wojnicz 3 1 Division of Statistics in Sosnowiec, Medical University of Silesia, Katowice, Poland 2 III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland 3 Department of Histology & Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland 4 Student Scientific Society, III Department of Cardiology in Zabrze, Medical University of Silesia, Katowice, Poland Abstract Chronic heart failure (HF) is an arising important medical problem. Apart from neuroendocrine system activation, it is also characterized by an inflammatory component. Pro-inflammatory cytokines exacerbate haemodynamic abnormalities, exert direct toxic effects on the heart and contribute to cachexia. A prospective study has been accomplished in the group of 164 patients with stable systolic heart failure in order to investigate the association between hypercoagulability, inflammation, NT-pro BNP and the clinical outcome. Major adverse cardiac event (MACE) experienced 43.3% of patients. Independent inflammatoryrelated risk factors of MACE in patients with HF are plasma levels of: high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen, D-dimers and NT-pro BNP. Key words: high sensitivity C-reactive protein, heart failure, risk factors, MACE Streszczenie Przewlekła niewydolność serca (HF) stanowi istotny problem medyczny. Oprócz aktywacji układu współczulnego, niewydolność serca charakteryzuje się również zwiększoną aktywnością układu odpornościowego. Krążące we krwi cytokiny prozapalne nasilają zaburzenia hemodynamiczne, wywierają bezpośredni toksyczny wpływ na serce i wtórnie przyczyniają się do wyniszczenia organizmu pacjenta. W celu oceny związku między czynnikami odzwierciedlającymi aktywność układu immunologicznego, krzepnięcia oraz NT-pro BNP a rokowaniem odległym, przeprowadzono badanie prospektywne w grupie 164 pacjentów ze stabilną skurczową niewydolnością serca. U 43.3% pacjentów wystąpiło niekorzystne zdarzenie sercowe (MACE). Niezależnymi czynnikami związanymi ze zwiększonym ryzykiem wystąpienia MACE u tych chorych okazały się stężenia w surowicy: białka C-reaktywnego wysokiej czułości, fibrynogenu, D-dimerów i NT-pro BNP. Słowa kluczowe: białko C-reaktywne wysokiej czułości, niewydolność serca, czynniki ryzyka, niekorzystne zdarzenie sercowo-naczyniowe (MACE) Introduction Cardiovascular diseases are the leading cause of morbidity, disability and premature mortality in developed countries. Chronic heart failure (HF) is an arising important medical problem. It accounts for at least 5% of admissions to general medical and geriatric wards and for almost 2% of the total healthcare expenditure (dependent on the country) [1]. It has been estimated that only in Europe HF affects 10 million people [2]. Most common causes of HF are: coronary artery disease leading to myocardial infarction (systolic dysfunction), hypertension and valvular heart disease, infections, idiopathic dilated and alcoholic cardiomyopathy [3]. Heart failure is a clinical syndrome resulting from a structural and functional cardiac disorder. It impairs the ability of the ventricle to fill with or eject blood according to the needs of the body, or precludes it from doing so in the absence of increased filling pressures. It is a multisystem disorder which is characterized by abnormalities of cardiac, skeletal muscles as well as renal function, stimulation of the sympathetic nervous system and a complex pattern of neurohormonal changes [4]. Figure 1 presents the overview of main pathophysiology pathways in HF. As heart failure advances there is a relative decline in the counter regulatory effects of endogenous vasodilators such as: nitric oxide, prostaglandin, bradykinin, atrial and brain natriuretic peptides (ANP, BNP). Other factors that play a role in the pathogenesis of HF include: the endothelin and adenosine receptor systems, vasopressin, pro-inflammatory cytokines 10
copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 (mainly: tumour necrosis factor alpha TNF-α, C-reactive protein CRP, interleukin IL-1 and IL-6) [3, 5]. Apart from neuroendocrine system activation, heart failure is characterized by an inflammatory component. The mechanisms of inflammation play an important role in the process of left ventricular remodelling including structural and functional changes of the myocardium which are not only in part responsible for the development of symptoms but also for the disease progression. Pro-inflammatory cytokines exacerbate haemodynamic abnormalities, exert direct toxic effects on the heart and contribute to cachexia [6]. Also, it has been reported that inflammation is strictly correlated with clotting activation which has clinical relevance to HF [7]. The aim of this study was to investigate the association between hypercoagulability, inflammation, NT-pro BNP and the clinical outcome MACE (rehospitalisation, death, heart transplantation), in patients with chronic systolic heart failure. Materials and methods A prospective study has been accomplished in the group of 164 patients (mostly man 83.54%) with stable systolic heart failure, selected according to criteria of inclusion and exclusion. According to the European Guidelines for heart failure management, all patients at least during three months before hospital admission, were treated with angiotensine converting enzyme inhibitor (Captopril) or angiotensine receptor antagonist (ARA), β blocker (metoprolol CR or carvedilol) in maximal tolerated doses and with patient fitted doses of digoxine, spironolactone and furosemide [8]. The study protocol was accepted by the Bioethical Committee of Silesian Medical University in Katowice: NN-043-10/95 and NN-6501-158/I/06/07; the patients gave their conscious consent to participate in the study. Inclusion criteria: stable systolic heart failure increased left ventricular end diastolic diameter LVEDd>57mm and reduced left ventricular ejection fraction LVEF<40%, lasting at least 6 months and proceeded by a 3 month optimization of outpatient pharmacology treatment. Exclusion criteria: more than 30% narrowing in the coronary arteries indicated by the coronary angiogram, active myocarditis revealed in biopsy material according to Dallas classification, chronic obstructive pulmonary disease or other respiratory diseases with the pulmonary hypertension, presence of acquired/congenital valve disease or other disorders leading to impairment of myocardial structure and functions (with the exception of relative mild or moderate mitral/tricuspid valve regurgitation), presence of clinically confirmed systemic disease, recognized cancer or ongoing oncological treatment, confirmed infectious diseases during at least 3 months prior to study entry, endocrine diseases (diabetes mellitus, hyperthyroidism and hypothyroidism, Cushing disease), advanced liver or kidney disease, alcoholic disease, planned heart transplantation. The clinical observation of patients began on admission to hospital and lasted 3 years. Patients were admitted to hospital in a stable clinical status, in order to conduct invasive and non-invasive tests, to identify the aetiology of HF and establish their future treatment (including heart transplantation). The evaluation of hs-crp was performed using the immunoturbidimetric method with a wave length of 552nm and augmentation of latex particles (Cobas Integra 800, Roche). Plasma level of NT pro BNP was measured by the Elecsys 2010 (Roche), and D dimers were assessed by the STA Compact (Roche). Statistical analysis Fig. 1. Pathophysiology pathways in chronic heart failure. Data in the tables were presented as mean ± standard deviation (SD) and median with lower and upper quartiles. Variables distribution was evaluated by the Shapiro Wilk test. Homogeneity of variances was assessed by the Levene test. Study hypotheses were verified by the t-student test for unpaired variables with nor- 11
Farm Przegl Nauk, 2010, 7 mal distribution or the U Mann Whitney test for unpaired variables without normal distribution. The univariate Cox proportional hazard analysis defined MACE hazard ratios in the 3-year follow-up. All variables found statistically significant in the univariate analysis (p<0.05) were included in the multivariate backward stepwise analysis. The results of Cox proportional hazard analysis were presented as hazard ratios with the 95% CI, Wald statistics and corresponding significance level. The survival analysis was shown with the Kaplan Meier curve. Correlations between variables were assessed with Spearman coefficients. All calculations were performed using the commercially available statistical package Statistica 8.0 and Excel MS Office. Results All 164 patient were divided into two groups: with combined end point (MACE) (N=71 [43.29%]) and without MACE (N=93 [56.71%]). Thirty one patients (18.9%) died, 5 patients (3.05%) were qualified for urgent heart transplantation, 51 patients (31.10%) were re admitted to hospital due to deterioration of heart failure symptoms. Tab. 1. Laboratory results for patients with and without major adverse cardiac events Patients: MACE + MACE 71 (43.29%) 93 (56.71%) Age [years] 45.56±10.26 46.31±10.49 47.0 (38.0-53.0) 49.0 (41.0-54.0) hs-crp [mg/l] 5.41±7.36 2.62±2.87 2.74 (1.10-5.16) 1.69 (0.93-3.01) Fibrinogen [mg/dl] 386.3±97.3 357.6±81.2 365.0 (313.0-440.0) 349.0 (301.0-413.0) D-dimers [µg/ml] 0.582±0.716 0.365±0.340 0.250 (0.220-0.620) 0.220 (0.220-0.350) Prothrombin time [s] 13.95±1.46 13.63±2.14 13.70 (13.00-14.40) 13.40 (12.80-14.10) 0.1500 Haemoglobin [mmol/l] 9.34±1.07 9.22±0.70 9.20 (8.60-9.80) 9.20 (8.80-9.70) 0.6938 Haematocrit 0.44±0.04 0.43±0.03 0.45 (0.42-0.47) 0.43 (0.42-0.46) 0.0778 RBC [x10 6 ] 4.84±0.45 4.80±0.44 4.86 (4.50-5.17) 4.78 (4.54-5.00) 0.5424 WBC [x10 3 ] 7.22±1.59 6.78±1.63 7.13 (6.00-8.46) 6.63 (5.79-7.65) 0.0749 NT-pro BNP [pg/ml] 2381±2413 1018±1181 1701 (281-3789) 620 (295-1275) <0.001 RBC red blood cells, WBC white blood cells. Tab. 2. Results of univariate and backward stepwise multivariate analysis: Cox proportional hazard and prognostic values of risk factors for MACE Parameter HR ± 95% CI Wald statistic p Univariate hs-crp [mg/l] 1.0585 1.0255 1.0927 12.35 <0.001 Fibrinogen [mg/dl] 1.0028 1.0004 1.0052 5.06 <0.05 D-dimers [µg/ml] 1.9354 1.3594 2.7555 13.42 <0.001 NT-pro BNP [ng/ml] 1.2712 1.1685 1.3830 30.76 <0.0001 Multivariate hs-crp [mg/l] 1.0402 1.0052 1.0764 5.09 <0.05 NT-pro BNP [ng/ml] 1.2439 1.1360 1.3621 22.23 <0.0001 12 Table 1 presents baseline blood test results. In univariate analysis, as risk factors for adverse cardiac events, there were identified the following pro-inflammatory markers: serum level of high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen, D- dimers and NT-pro BNP. Table 2 encloses results of the Cox proportional hazard univariate and backward stepwise multivariate analysis. Two most important risk factors for MACE are: serum level of hs-crp and NT-pro BNP. Hazard ratio of MACE may be calculated with the following formula: 0h (t, hs-crp, NT-pro BNP)=h(t) exp(0.0394 hs-crp+0.2183 NT-pro BNP) Figure 1 presents the Kaplan Meier curve of patients survival without MACE. We found the following correlations: hs-crp with NTpro BNP (0.3789; p<0.001), fibrinogen (0.5681; p<0.001) and D-Dimers (0.2051; p<0.01), NT-pro BNP with fibrinogen (0.2708; p<0.001) and D-Dimers (0.3110; p<0.001), fibrinogen with D-Dimers (0.1904; p<0.05). For HF patients whose serum level was hs-crp >1.81 mg/l 1 and NT-pro BNT>1608 pg/ml 1 compared to patients with lower levels of pro-inflammatory markers, absolute risk increase was 38.6%, attributable risk was 29% and relative risk of MACE was 2.14 (95%CI: p 1.57 2.92; χ 2 =18.38, p<0.0001). Number needed to treat, which is 0.4600 the number of patients who must receive a particular therapy to <0.05 prevent one major adverse cardiac events was 2.59. <0.05 Discussion <0.01 Both our as well as other studies suggest that immune activation plays an important role in the disease progression of chronic heart failure. C-reactive protein, which is an acute phase protein synthesised predominantly by hepatocytes under the influence of cytokines such as IL-6 and TNF-α, was defined as an independent risk factor for adverse events in patients with heart failure. CRP activates the classic complement pathway and participates in the opsonization of ligands for phagocytosis [9, 10, 11]. In the population analyzed by Alonso Matinez et al. [15], like in our study, elevated CRP was associated with increased risk of hospitalization in long term observation. Furthermore, El-Menyar showed that 1 median for all group
copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Fig. 2. Kaplan-Meier survival estimate for HF patients. patients with CRP levels higher than 0.9 mg/dl were identified ascandidates for earlier hospitalization than those with lower level of CRP. Higher levels of CRP were also related to higher rates of mortality [12]. Huang et al. examined 72 patients with HF and found that CRP level higher than 5.38 mg/l was an independent significant predictor of MACE (hazard ratio in Cox analysis HR=2.91; p<0.05) [13]. With increasing cardiac dysfunction, synthesis and release of cardiac natriuretic peptides rises incrementally in concurrence with other neurohormonal responses observed in heart failure. Similar to our study, where NT-pro BNP plasma level proved to be an independent risk factor of MACE, Olsson at al. showed that plasma concentrations of NT-pro BNP above the all-group median (1242 pg/ml) were associated with higher all-cause mortality (RR 2.77; 95% CI 2.33-3.3, p<0.001). Patients who achieved NT-pro BNP levels<400 pg/ml during follow-up had a lower subsequent mortality (RR 0.32; 95% CI 0.15-0.69, p=0.004) [14]. Richard and Troughton revealed also that the treatment of heart failure guided by NT-proBNP levels appeared to reduce cardiovascular events compared to intensive clinically guided treatment [15]. Also Jourdain et al. proved that in optimally treated HF patients, a BNP-guided strategy recued the risk of HF-related death or hospital stay for heart failure [16]. Anand et al. showed that CRP was associated with a quartile-dependent increase in mortality and morbidity even after adjustment for other significant predictors of HF mortality and morbidity, including BNP. Compared with patients in the lowest quartile of CRP, the adjusted risk of mortality and first morbid event were increased by 1.5 in the highest CRP quartile. Moreover, patients who had both CRP and BNP levels above the all-group median values (3.23 mg/l and 960 pg/ml respectively) had twice (2.14 in our study) the risk of MACE of those with levels of both markers below the median [9]. In group of 306 clinically stable patients with non-ischemic HF, Lamblin et al. obtained hs-crp and BNP as independent risk factors, in multivariable Cox proportional hazard analysis. Hazard ratio for hs-crp>3 mg/l was 1.05 (95% CI: 0.52-2.11, p=0.89) and for BNP>38 pmol/l was 3.26 (95% CI: 1.19-8.98; p<0.05) [17]. In univariate analysis, fibrinogen and D-dimers reflecting the activation of coagulation system were also identified as independent risk factors of MACE in patients with heart failure. Experimental studies report increased indexes of inflammation and coagulation system activation in chronic heart failure [7]. In our study, like in the studies of Alehagen et al. [18] and Marcucci et al. [7], D-dimers level in patients who underwent cardiac event was elevated. Kannel et al. showed that there is an independent contribution of fibrinogen to cardiovascular disease in general, even on adjustment for coexistent risk factors. Fibrinogen enhances the risk of cardiovascular disease in hypertensives, diabetics, and cigarette smokers [19]. Patients with HF and cachexia have an increased hepatic fibrinogen synthesis rate related to the level of C-reactive protein [20, 21]. Furthermore, HF patients with a severely impaired haemodynamic situation showed elevated levels of fibrinogen compared to patients with a moderately impaired haemodynamic situation [22]. Moreover, we also confirmed that higher level of fibrinogen serum concentration strongly (positively) corresponds with hs-crp level. Conclusions Independent risk factors of major adverse cardiac events in patients with chronic systolic heart failure are plasma levels of: high sensitivity C-reactive protein, fibrinogen, D-dimers and NT-pro BNP; Patients with high plasma levels of hs-crp and NT-pro BNP should be selected for more sophisticated prognostic evaluation to determine whether alternative therapeutic strategies such as aggressive pharmacological treatment, cardiac transplantation or LV assist devices are needed. References 1. Bundkirchen A, Schwinger R. Epidemiology and economic burden of chronic heart failure. Eur Heart J, 2004; 6: D57-D60. 2. Mitkowski P. Heart failure an epidemic of XXI century. Choroby serca i naczyń, 2004; 1(1): 43-50. 13
Farm Przegl Nauk, 2010, 7 3. McMurray JJ, Pfeffer MA. Heart failure. The Lancet, 2005; 365: 1877-1886. 4. Jackson G, Gibbs CR, Davies MK, Lip GYH. ABC of heart failure. Patophysiology, 2000; 320: 167-170. 5. Matsumori A. Role of inflammation in heart failure. Int J Cardiol, 2008; 125: 10-11. 6. Anker SD, van Haeling S. Inflammatory mediators in chronic heart failure: an overview. Heart, 2004; 90: 464-470. 7. Marucci R et al. Markers of hypercoagulability and inflammation predict mortality in patients with heart failure. J Thromb Haemost, 2006; 4: 1017-1022. 8. The Task Force on Heart Failure of the European Society of Cardiology (ESC) developed in collaboration with the Heart Failure Association of the ESC (HFA). ESC Guidelines Desk Reference. Compendium of abridged ESC guidelines, 2008; Section XV, Heart Failure: 313-338. 9. Anand IS et al. C-reactive protein in heart failure: prognostic value and the effect of valsartan. Circulation, 2005; 112: 1428-1434. 10. Guliz K, Gokhan E, Kilic T, et al. Elevated level of high sensitivity C-reactive protein is important in determining prognosis in chronic heart failure. Med Sci Monit, 2010; 16(3): 156 161. 11. Alonso Martinez JL, Llorente Diez B, Echegaray Agara M, et al. C reactive protein as a predictor of improvement and readmission in heart failure. Eur J Hear Fail, 2002; 4: 331 336. 12. El-Menyar A. Cytokines and Myocardial Dysfunction: State of the Art. J Card Fail, 2008; 14: 61-74. 13. Huang WP, Yin WH, Jen HL, et al. C-reactive protein levels in chronic congestive heart failure. Acta Cardiol Sin, 2004; 20: 7-14. 14. Olsson LG, Swedberg K, Cleland J, Spark PA, Komajda M, Metra M, et al. Prognostic importance of plasma NTpro BNP in chronic heart failure in patients treated with a beta-blocker: results from the Carvedilol Or Metoprolol European Trial (COMET) trial. Eur J Heart Fail, 2007; 9(8): 795-801. 15. Richard M, Troughton RW. NT-proBNP in heart failure: therapy decisions and monitoring. Eur J Heart Fail, 2004; 6: 351-354. 16. Jourdain P, Jondeau G, Funck F, Gueffet P, Le Helloco A, Donal E, et al. Plasma brain natriuretic peptide-guided therapy to improve outcome in heart failure. JACC, 2007; 49(16): 1733-1739. 17. Lamblin N, Mouquet F, Hennache B, Joel D, Susen S, Bauters Ch, et al. High-sensitivity C-reactive protein: potential adjunct for risk stratification in patients with stable congestive heart failure. Eur Jeart J, 2005; 26: 2245-2250. 18. Alehagen U, Dahlstrom U, Lindahl TL, et al. Elevated D dimer level is an independent risk factor for cardiovascular death in out patients with symptoms compatible with heart failure. Thromb Haemost, 2004; 92: 1250-1258. 19. Kannel WB, D Agostino RB, Belanger AJ. Update on fibrinogen as a cardiovascular risk factor. Ann Epidemiol, 1992; 2(4): 457-66. 20. Witte KKA, et al. Fibrinogen synthesis is increased in cachectic patients with chronic heart failure. Int J Cardiol, 2008; 129(3): 363-367. 21. Ferketich AK, Binkley PF. Heart failure and inflammation: results from the third national health and nutrition examination survey (NHANES III). Cardiac Failure, 2004; 10(4): 93. 22. Hoffmeister A, et al. Plasma viscosity and fibrinogen in relation to haemodynamic findings in chronic congestive heart failure. Eur J Heart Fail, 1999; 1: 293-295. data otrzymania pracy: 15.02.2010 r. data akceptacji do druku: 21.06.2010 r. Corresponding author: Eng. Aleksander Owczarek, Ph.D. Division of Statistics, Department of Instrumental Analysis Medical University of Silesia 30 Ostrogórska S. 41-200 Sosnowiec Mobile: +48 0 501 357 068 tel.: +48 32 364 13 32 e-mail: aowczarek@sum.edu.pl 14
Farm Przegl Nauk, 2010,7, 15-19 copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Proleki w terapii nowotworów. Część IV. Proleki aktywowane hipoksją Prodrugs in cancer therapy. Part IV. Hypoxia activated prodrugs Andrzej Stańczak, Marta Szumilak Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego Uniwersytetu Medycznego w Łodzi Streszczenie Większość stosowanych obecnie leków przeciwnowotworowych charakteryzuje wysoka toksyczność systemowa i brak wybiórczości względem tkanki nowotworowej. Jednym ze sposobów zwiększania skuteczności terapii i ograniczania jej toksyczności jest projektowanie proleków. Nowoczesne proleki przeciwnowotworowe tzw. Tumor Activated Prodrugs projektuje się w oparciu o ciągle rosnącą wiedzę na temat budowy i funkcji tkanki nowotworowej. Szereg jej cech np. hipoksja, obecność specyficznych antygenów, bądź receptorów, czy wadliwy system naczyniowy, stanowi punkt uchwytu umożliwiający selektywne dostarczenie i aktywację proleku w obrębie guza. Poniższy artykuł skupia się na prolekach aktywowanych hipoksją, które podlegają bioredukcyjnej aktywacji za pośrednictwem specyficznych enzymów obecnych w niedotlenionych komórkach nowotworowych. W obrębie tej grupy proleków wyróżnia się: chinony, związki o strukturze N-tlenku oraz związki nitroaromatyczne. Słowa kluczowe: proleki, leki przeciwnowotworowe, proleki aktywowane hipoksją, reduktaza NADPH:CYP450 Abstract Most currently used anticancer drugs are characterized by high systemic toxicity and lack of tumor selectivity. One way to increase effectiveness of treatment and reduce its toxicity is prodrug design. Advanced anticancer prodrugs so-called Tumor Activated Prodrugs are designed on the basis of ever-growing knowledge of the structure and function of tumor tissue. Several of its features such as: hypoxia presence of specific antigens or receptors, vascular system failure or can be the targets allowing the selective delivery and activation of prodrugs within the tumor. This work describes active targeting strategy which is based on differences in cell surface antigen or receptor expression between normal and tumor tissue. The following article focuses on hypoxia-activated prodrugs which are bioreductively activated via particular enzymes present in hypoxic tumor cells. This group of prodrugs include: quinones, N-oxides and nitroaromatics. Key words: prodrugs, anticancer drugs, hypoxia activated prodrugs, NADPH:CYP450 reductase Wprowadzenie Komórki guzów litych często charakteryzuje znaczne niedotlenienie. Wynika ono ze źle wykształconego, nieefektywnego systemu naczyniowego, który nie jest w stanie zapewnić komórkom nowotworowym odpowiedniej podaży tlenu i składników odżywczych. Niedotlenienie guza stanowi istotny problem z punktu widzenia efektywności terapii i przyszłych rokowań. Stanowi sygnał do ekspresji genów zaangażowanych w progresję procesu nowotworowego (m. in. nasilenie procesu angiogenezy), zwiększa częstość mutacji i ryzyko przerzutów. Niedotlenione komórki guzów litych są oporne na radioterapię, ponieważ jej efekt cytotoksyczny zależy od obecności tlenu w komórce. Klasyczna chemioterapia także jest często nieskuteczna. Czynnikami odpowiedzialnymi za oporność na chemioterapię są m. in. zbyt duża odległość od naczyń krwionośnych, które dostarczają leki (co uniemożliwia osiągnięcie stężenia terapeutycznego w miejscu działania), obniżone tempo podziałów komórkowych (wynikające po części z niedostatecznej po- daży składników odżywczych), utrata wrażliwości na apoptozę aktywowaną białkiem p53 oraz up-regulacja genów zaangażowanych w powstawanie oporności wielolekowej np. genów kodujących glikoproteinę P [1-4]. Jednak hipoksja stanowi także unikalna cechę komórek guzów litych, odróżniającą je od większości komórek zdrowych i może stanowić dogodny punkt uchwytu terapii celowanej, po raz pierwszy zaproponowanej na początku lat 70-tych przez zespół prof. Sartorell ego. Większość proleków aktywowanych hipoksją podlega bioredukcyjnej aktywacji za pośrednictwem specyficznych enzymów obecnych w niedotlenionych komórkach. Uwolnienie aktywnego leku może nastąpić także pod wpływem niskiego ph, będącego efektem gromadzenia się produktów przemiany materii w obrębie guza [1-4]. Warunkiem wybiórczego działania proleków na komórki hipoksyczne jest ich wysokie powinowactwo do reduktaz katalizujących przeniesienie jednego elektronu. Mechanizm selektywnej aktywacji obejmuje kilka etapów: w pierwszym (odwracalnym) (rys. 1A) następuje przeniesienie jednego 15
Farm Przegl Nauk, 2010, 7 Ryc. 1. Mechanizm selektywnej bioredukcyjnej aktywacji proleków. elektronu i powstaje produkt przejściowy, który w warunkach tlenowych, panujących w zdrowych komórkach, jest przekształcany z powrotem do nieaktywnego proleku, zaś w warunkach niedoboru tlenu następują dalsze etapy jego redukcji do cytotoksycznego metabolitu (rys. 1B). Jeśli prolek ma także powinowactwo do reduktaz, takich jak DTdiaforaza (DTD), katalizujących jednoczesne przeniesienie dwóch elektronów, wówczas jego selektywność wobec komórek hipoksycznych zostaje znacznie upośledzona, bowiem nie jest możliwa reoksydacja produktu przejściowego w warunkach tlenowych do nieaktywnego proleku [1-5]. Z punktu widzenia budowy chemicznej, w obrębie proleków aktywowanych hipoksją wyróżnia się pochodne chinonu, związki o strukturze N-tlenku, oraz związki nitroaromatyczne. Chinony 16 Pierwszym lekiem z tej grupy, stosowanym w terapii nowotworów, była mitomycyna C (1) (rys. 2). Początkowo wykorzystywano jej właściwości alkilujące. Dalsze badania wykazały, że niedotlenienie komórek przyspiesza jej aktywację, która odbywa się pod wpływem reduktazy NADPH/ cytochrom P450 (CPR). Powstający anionorodnik semichinonu posiada zdolność tworzenia wiązań kowalencyjnych z DNA, co skutkuje działaniem cytotoksycznym wobec komórek nowotworowych. Warto zauważyć, że rodnik semichinonu w warunkach tlenowych ulega reoksydacji do chinonu, co powinno czynić go selektywnym wobec komórek hipoksycznych. Niestety związek ten ulega również bioredukcyjnej aktywacji przez reduktazy aktywne w warunkach tlenowych np. DT-diaforazę (DTD), co negatywnie wpływa na selektywność tego związku wobec komórek hipoksycznych [6, 7]. Dalsze poszukiwania związków selektywnych wobec komórek hipoksycznych doprowadziły do otrzymania porfiromycyny (2) (rys. 2), etylowanej pochodnej mitomycyny C, która w badaniach przedklinicznych wykazywała znacznie zwiększoną cytotoksyczność wobec komórek hipoksycznych, wynikającą ze zmniejszonego powinowactwa wobec DTD, preferencyjnej aktywacji przez reduktazy przenoszące jeden elektron oraz zwiększonego wychwytu przez komórki hipoksyczne. Badania kliniczne mające na celu porównanie aktywności porfiromycyny i mitomycyny C, w połączeniu ze standardową radioterapią, nie wykazały korzyści ze stosowania porfiomycyny, co spowodowało zaniechanie dalszych badań nad jej wykorzystaniem w terapii nowotworów [6]. Innym przedstawicielem tej grupy związków jest apazichinon (EO9) (3) (rys. 2), pochodna indolochinonu, aktywowana w warunkach hipoksji pod wpływem CPR. Związek ten jest także substratem dla DTD, co może mieć negatywny wpływ na selektywność EO9. Mechanizm działania apazichinonu polega na uszkadzaniu struktury DNA przez powstający w wyniku redukcji rodnik EO9. Badania kliniczne z udziałem tego związku wykazały jego niską toksyczność wobec komórek szpiku kostnego, krótki okres półtrwania i niską zdolność penetracji w głąb guza, co niekorzystnie odbiło się na jego aktywności przeciwnowotworowej. Ze względu na niekorzystny profil farmakokinetyczny tej substancji, efekt terapeutyczny został osiągnięty dopiero w chwili jego bezpośredniego podania do komórek nowotworowych [6-9]. Bioredukcyjne właściwości chinonów zostały także użyte w konstruowaniu cząsteczek uwalniających, w wyniku redukcji, związki alkilujące. Przykładem może być tutaj prolek (4) (rys. 2), który w wyniku laktonizacji zredukowanej formy hydrochinonu uwalnia cząsteczkę melfalanu [3]. Związki o strukturze N-tlenku Jednym z przedstawicieli tej grupy związków jest antrachinon AQ4N (banoksantron) (5) (rys. 3), zawierający dwa alifatyczne ugrupowania N-tlenkowe. Związek ten jest w warunkach hipoksji redukowany do metabolitu AQ4, analogu mitoksantronu, o wysokim powinowactwie do DNA i zdolność inhibicji aktywności topoizomerazy II. Związek ulega bioaktywacji głównie pod wpływem enzymów cytochromu P450 m. in. CYP1A1, CYP2B6 i CYP3A4 [3, 6, 11, 10]. Banoksantron badany in vivo, jako pojedynczy lek nie wywierał znaczącego efektu przeciwnowotworowego. Wywołanie w komórkach efektu hipoksji znacznie nasiliło jego aktywność cytotoksyczną [11]. Zastosowanie terapii łączonej z naświetlaniem lub innymi chemioterapeutykami, takimi jak: cyklofosfamid, cisplatyna, czy tiotepa także powodowało znaczną inhibicję wzrostu komórek nowotworowych [6, Ryc. 2. Pochodne chinonu jako proleki.
copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 Ryc. 3. Proleki o strukturze N-tlenku. 7, 11, 12]. Badania kliniczne wykazały niską toksyczność systemową tego związku (wynikającą z braku aktywności wobec komórek normotlenowych) oraz korzystne właściwości farmakokinetyczne [13]. Cenną cechą tego proleku okazała się zdolność przenikania przez barierę krew-mózg, co pozwala wykorzystać ten związek w terapii celowanej nowotworów mózgu [6, 7]. Przykładem N-tlenku heteroaromatycznego jest tirapazamina (6) (rys. 3). Od lat 80-tych stanowi związek wiodący w grupie proleków aktywowanych hipoksją. Wykazuje wysoką selektywność wobec komórek o niskim stężeniu tlenu. W pierwszej fazie aktywacji ulega jednoelektrodowej redukcji pod wpływem CPR do rodnika tirapazaminy, który w warunkach tlenowych ulega reoksydacji do nietoksycznej pierwotnej formy proleku, zaś w warunkach niedoboru tlenu ulega dalszym przemianom, w wyniku których powstają rodniki uszkadzające DNA. TPZ ulega aktywacji w warunkach znacznie słabszego niedotlenienia, co czyni ją aktywną cytotoksycznie wobec komórek, w których poziom hipoksji jest niewystarczający do bioaktywacji innych związków bioredukcyjnych, ale powoduje ich oporność na radioterapię [6]. Jednakże krótki okres półtrwania rodnika, a także jego niska zdolność dyfuzji do otaczających komórek hamuje powstawanie bystander effect [2, 6, 7] i czyni komórki anoksyczne opornymi na TPZ (TPZ nie dociera do nich, ponieważ jest szybciej aktywowana w komórkach o wyższym stężeniu tlenu) [6, 14]. TPZ uwrażliwia komórki nowotworowe na radioterapię [15], a także nasila działanie przeciwnowotworowe innych chemioterapeutyków, takich jak: cisplatyna, melfalan, cyklofosfamid, karmustyna, bleomycyna, doksorubicyna, taksol, karboplatyna, paklitaksel i 5-fluorocytozyna [16-19]. Badania kliniczne z udziałem TPZ są prowadzone od 1994 roku. Najczęściej notowanym działaniem niepożądanym była neutropenia. Niehematologiczne objawy toksyczności TPZ obejmowały: nudności, wymioty, biegunkę i wysypkę [6, 7]. Fazy II i III badań klinicznych obejmowały badanie cytotoksyczności TPZ wobec szerokiej gamy nowotworów w skojarzeniu z innymi chemioterapeutykami (cisplatyną, winorelbiną, 5-fluorocytozyną, gemcytabiną, paklitakselem, karboplatyną) i radioterapią. Dla przykładu badania III fazy TPZ w kombinacji z cisplatyną, na pacjentach z zaawansowanym niedrobnokomórkowym rakiem płuc, wykazały znacznie silniejszą odpowiedź komórek nowotworowych na leczenie i co istotne, zwiększało szansę pacjentów na przeżycie [20]. Tirapazamina jest także wykorzystywana jako prolek w konstruowaniu strategii GDEPT regulowanej hipoksją. Koncepcja zakłada dostarczenie, za pośrednictwem wektora adenowirusowego, enzymu kodującego reduktazę P450, którego ekspresja jest regulowana stężeniem czynnika wzbudzanego hipoksją HIF-1. (HIF-1 to czynnik transkrypcyjny, który w warunkach hipoksji indukuje transkrypcję szeregu genów, przez co reguluje różne procesy biologiczne, odpowiedzialne za przystosowanie się komórki do warunków obniżonego stężenia tlenu [21]) Tym samym w hipoksycznych komórkach nowotworowych, za pośrednictwem HIF-1, następuje nasilona ekspresja genu kodującego enzym, co w konsekwencji prowadzi do znacznego wzmożenia bioredukcyjnej aktywacji proleku (TPZ) i powstawania toksycznych metabolitów [22]. Związki nitroaromatyczne Pochodne 2-nitroimidazolu są grupą związków o selektywnym wobec komórek hipoksycznych mechanizmie działania. W warunkach niedotlenienia ulegają nieodwracalnej, wieloetapowej bioredukcji do aktywnych produktów, które mają zdolność niszczenia komórek nowotworowych. Pierwszy etap tego procesu (jednoelektronowa redukcja) jest w warunkach normotlenowych odwracalny, co czyni tę grupę leków wybiórczymi wobec komórek hipoksycznych [6, 7]. Pierwszym związkiem z tej grupy był misonidazol (7) (rys 4), który miał zdolność uwrażliwiania tkanki nowotworowej na radioterapię. Wykazano, że nasilał on działanie cytotoksyczne promieniowania nawet wówczas, gdy podawany był po naświetlaniu komórek nowotworowych, co wykluczało go, jako związek uwrażliwiający na radioterapię i wskazywało na inny mechanizm działania związany z hipoksją komórek nowotworowych. Dalsze badania w obrębie tej grupy związków doprowadziły do otrzymania RSU1069 (8) (rys. 4), dwufunkcyjnego związku alkilującego aktywowanego przez reduktazę P450R, o właściwościach uwrażliwiających komórki nowotworowe na radioterapię, który został wycofany z dalszych badań ze względu na wysoką cytotoksyczność wobec układu pokarmowego [6, 7]. Ciekawą grupą związków o właściwościach bioredukcyjnych są pochodne iperytu dinitrobenzamidu. Przedstawicielem tej grupy związków jest CB1954, 5-(1-azyrydynylo)- 2,4-dinitrobenzamid (9) (rys. 5), wykorzystywany jako prolek w strategii VDEPT. Związek ten, w przeciwieństwie do gancyklowiru i 5-fluorouracylu, jest aktywny wobec komórek niedzielących się. Pod wpływem nitroreduktazy Ryc. 4. Wybrane pochodne 2-nitroimidazolu. 17
Farm Przegl Nauk, 2010, 7 Ryc. 5. Szlak przemian CB1954. E. coli (NTR), kodowanej przez gen nfsb, dostarczany do komórek nowotworowych za pośrednictwem wektora retrowirusowego lub adenowirusowego, ulega redukcji do pochodnej hydroksyloaminy (10) (rys. 5), z której w wyniku dalszych przemian metabolicznych powstaje dwufunkcyjny czynnik alkilujący 5-(1-azyrydynylo)-4-N-acetoksy-2- nitrobenzamid (11) (rys. 5), powodujący letalne uszkodzenia DNA komórek nowotworowych. Istotną cechą metabolitu jest jego zdolność dyfuzji do komórek sąsiadujących, w których nie nastąpiła ekspresja genu kodującego NTR (bystander effect). Nie mniej istotny jest fakt, że nie istnieje ludzki homolog nitroreduktazy bakteryjnej, zaś CB1954 nie jest dobrym substratem dla ludzkiej DT-diaforazy, co czyni ten związek wybiórczym wobec komórek wykazujących ekspresję genu kodującego nitroreduktazę [6, 7, 23, 24]. Podsumowanie Ostatnie lata przyniosły znaczący postęp prac nad prolekami aktywowanymi hipoksją. Nieustannie prowadzi się badania mające na celu dokładne poznanie procesów zachodzących w niedotlenionej komórce nowotworowej, które służą zwiększaniu siły i wybiórczości działania już istniejących proleków, a także stanowią podstawę projektowania nowych o ulepszonym profilu terapeutycznym. Najbardziej obiecującym związkiem tej grupy wydaje się tirapazamina, która podlega obecnie intensywnym badaniom klinicznym. Piśmiennictwo 1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. Brown JM, Wilson WR. Exploiting Tumour Hypoxia In Cancer Treatment. Nature Rev 2004; 4: 4437-4447. Denny WA. The role of hypoxia-activated prodrugs in cancer therapy. Lancet Oncol 2000; 1: 25-29. Avendano C, Menendez CJ. Medicinal Chemistry of Anticancer Drugs. Elsevier B.V. Oxford 2008. Melillo G. Targeting hypoxia cell signaling for cancer therapy. Cancer Met Rev 2007; 26: 341 352. Wang B, Siahaan T, Soltero R. Drug delivery: Principles and Applications. John Wiley & Sons Inc. Hoboken, New Jersey 2005. McKeown SR, Cowen R L, Williams KJ. Bioreductive Drugs: from Concept to Clinic. Clin Oncol 2007; 19: 427-442. Błaszczak-Świątkiewicz K, Mikiciuk-Olasik E. Rola hipoksji w postępach w diagnostyce i terapii chorób nowotworowych. Wiad Chem 2008; 62: 1066-1089. 8. Liia D. i wsp. Stability experiments in human urine with EO9 (apaziquone): A novel anticancer agent for the intravesical treatment of bladder cancer. J Pharm Biomed Anal 2007; 43: 285 292. 9. Schellens JHM i wsp. Phase I and Pharmacologic Study of the Novel Indoloquinone Bioreductive Alkylating Cytotoxic Drug E09. J Natl Cancer Inst 1994; 86: 906-912. 10. Loadman PM i wsp. A Preclinical Pharmacokinetic Study of The Bioreductive Drug AQ4N. Drug Metab Disp 2001; 29: 422 426. 11. Patterson LH, McKeown SR. AQ4N: a new approach to hypoxia activated cancer chemotherapy. Br J Cancer 2000; 83: 1589 1593. 12. Patterson LH i wsp. Enhancement of chemotherapy and radiotherapy of murine tumours by AQ4N, a bioreductively activated antitumor agent. Br J Cancer 2000; 82: 1984 1990. 13. Lalani AS i wsp. Selective Tumor Targeting by the Hypoxia Activated Prodrug AQ4N Blocks Tumor Growth and Metastasis in Preclinical Models of Pancreatic Cancer. Clin Cancer Res 2007; 13:2216-2225. 14. 15. 16. 17. 18. 19. 20. Hicks KO i wsp. Multicellular Resistance to Tirapazamine is Due to Restricted Extravascular Transport: A Pharmacokinetic/Pharmacodynamic Study in HT29 Multicellular Layer Cultures. Cancer Res 2003; 63: 5970 5977. Sum BG i wsp. Tirapazamine-induced Cytotoxicity and DNA Damage in Transplanted Tumors: Relationship to Tumor Hypoxia. Cancer Res 1997; 57: 2922-2928. Holden SA i wsp. Enhancement of Alkylating Agent Activity by SR-4233 in the FSaIIC Muraine Fibrosarcoma. J Natl Cancer Inst 1992; 84: 187 193. Dorie MJ, Brown JM. Tumor-specific, schedule-depen- dent interaction between Tirapazamine (SR 4233) and Cisplatin. Cancer Res 1993; 53: 4633-4636. Langmuir VK. i wsp. Synergistic Interaction between Tirapazamine and Cyclophosphamide in Human Breast Cancer Xenografts Cancer Res 1994; 54: 2845-2847. Emmenegger U. Low-Dose Metronomic Daily Cyclo- phosphamide and Weekly Tirapazamine: A Well-Tolerated Combination Regimen with Enhanced Efficacy That Exploits Tumor Hypoxia. Cancer Res 2006; 66, 1664-1674. Talbot D. Tirapazamine Plus Cisplatin Versus Cisplatin in Advanced Non Small-Cell Lung Cancer: A Report of the International CATAPULT I Study Group. J Clin Oncol 2000; 18: 1351-1359. 18
copyright 2010 Grupa dr. A. R. Kwiecińskiego ISSN 1425-5073 21. Mantur M, Wojszel J. Cząsteczki adhezyjne oraz ich udział w procesie zapalnym i nowotworowym. Pol Merk Lek 2008; 24: 177-180. 22. Md.Taufiq-Ur-Rahman Tirapazamine and gene-directed enzyme prodrug therapy of cancer. Indian J Pharmacol 2004; 36: 332. 23. McNeish IA i wsp. Gene directed enzyme prodrug therapy for cancer. Adv Drug Deliv Rev 1997; 26: 173 184. 24. Chung-Faye G. Virus-directed, Enzyme Prodrug Therapy with Nitroimidazole Reductase: A Phase I and Pharmacokinetic Study of its Prodrug, CB1954. Clin Cancer Res. 2001; 7: 2662-2668. data otrzymania pracy: 15.02.2010r. data akceptacji do druku: 9.04.2010r. Adres do korespondencji: Andrzej Stańczak Zakład Farmacji Szpitalnej Wydziału Farmaceutycznego UM w Łodzi, ul. Muszyńskiego 1, 91-151 Łódź tel. 0 42 677 92 52 e-mail: andrzej.stanczak@umed.lodz.pl 19
Farm Przegl Nauk, 2010,7, 20-22 Metylacja DNA główny znacznik epigenetyczny komórki DNA Methylation a major epigenetic marker of the cell Olga Smagacz, Aleksandra Moździerz, Anna Rzepecka-Stojko, Jerzy Stojko, Małgorzata Juszko-Piekut, Magdalena Wyszyńska, Justyna Kaźmierczak Zakład Higieny, Bioanalizy i Badania Środowiska Wydział Farmaceutyczny z Oddziałem Medycyny Laboratoryjnej Śląski Uniwersytet Medyczny w Katowicach Streszczenie Procesy epigenetyczne wpływają na ekspresję genów nie naruszając sekwencji DNA. Do podstawowych modyfikacji epigenetycznych, obok zmian struktury chromatyny, zaliczana jest metylacja DNA. Metylacja DNA jest procesem przyłączania grup metylowych do atomu węgla cytozyny, w obrębie dinukleotydu CpG. Produktem tej reakcji jest 5-metylocytozyna, nazywana czasem piątym podstawowym składnikiem DNA. W ustalaniu wzoru metylacji udział biorą enzymy z grupy metylotransferaz. W warunkach fizjologicznych 70-80% dinukleotydów CpG zawiera grupę metylową. Istnieją również regiony, które na wszystkich etapach rozwoju i we wszystkich typach tkanek są chronione przed metylacją - wyspy CpG. Konsekwencją zmian informacji epigenetycznej są zaburzenia w transkrypcji i syntezie białka, będące czynnikami mającymi udział w patogenezie wielu chorób. Defekty metylacji DNA są zmianami odwracalnymi. Można zatem poprzez celowaną aktywację bądź inhibicję regulować poziom ekspresji genów. Zmapowanie miejsc metylacji DNA i poznanie mechanizmów współtowarzyszących temu procesowi daje nadzieję na znalezienie technik umożliwiających leczenie chorób nowotworowych, schorzeń o podłożu alergicznym, immunologicznym czy - jak wskazują najnowsze badania - być może także tych, o podłożu genetycznym. Słowa kluczowe: epigenetyka, metylacja DNA, 5-metylocytozyna, wyspy CpG Abstract Epigenetic processes influence gene expression without altering DNA sequence. DNA methylation, together with chromatin remodelling, forms the basis for epigenetic modification. DNA methylation denotes addition of methyl groups to the cytosine carbon atom within CpG dinucleotide. It results in formation of 5-Methylcytosine, also referred to as 5 th basic DNA element. Enzymes of methyltransferase group contribute to methylation patterns set-up. In physiological environment 70-80% of CpG dinucleotide have methyl groups. There are also regions, so called CpG Islands, which are protected from methylation in all types of tissues. Alterations in epigenetic information result in abnormalities in transcription and protein synthesis, which contributes to pathogenesis in a variety of diseases. DNA methylation defects are reversible changes. Therefore, by intentional activation or inhibition, it is possible to regulate gene expression. Mapping of DNA methylation regions and identifying the mechanism accompanying this process raise hopes for finding new treatment techniques for cancerous diseases, allergy and immunityrelated diseases and possibly, as recent studies has shown, for genetic disorders. Key words: epigenetics, DNA methylation, 5-methylcytosine, CpG islands Metylacja DNA obok przebudowy struktury chromatyny, indukowanej zmianami w obrębie białek histonowych, zaliczana jest do podstawowych mechanizmów epigenetycznych. Owe mechanizmy umożliwiają dziedziczenie, mimo iż nie towarzyszą im zmiany w układzie nukleotydów DNA. W odróżnieniu od zmian o podłożu genetycznym, epigeneza charakteryzuje się odwracalnością [1]. Obecnie trwają badania, mające na celu wykorzystanie tej właściwości, a tym samym dające nadzieje na odkrycie nowych metod terapeutycznych. Prawdopodobnie miałyby one zastosowanie w leczeniu chorób alergicznych, immunologicznych, metabolicznych, a przede wszystkim chorób nowotworowych [1-3]. Pierwszym zjawiskiem o podłożu epigenetycznym, ukazującym złożoność tego procesu, było odkrycie H. J. Műllera z 1930 roku. Obiektem badań była linia Drosophila, której oczy zabarwione były w sposób mozaikowy. Odpowiedzialny za tę cechę, okazał się gen, który co pewien czas ulegał spontanicznej inaktywacji, ale co istotne, bez zmian w sekwencji DNA. Ponadto, jeśli ów proces raz zaistniał, gen pigmentu pozostał nieaktywny we wszystkich komórkach potomnych [4]. Proces metylacji DNA Jedną z cech wyróżniających eukariotyczne DNA, jest stosunkowo wysoka zawartość 5-metylocytozyny, produktu reakcji metylacji kwasu deoksyrybonukleinowego. 20